Спосіб визначення мікотоксинів

Спосіб визначення мікотоксинів, що включає подрібнення досліджуваного об'єкта, отримання концентрату, ведення культури інфузорій в мікроакваріум, додавання до культури інфузорій концентрату мікотоксинів, підрахунок початкової кількості мікроорганізмів, витримку мікроорганізмів у водно 3 лінійної частини температурної залежності параметрів життєдіяльності тест-культури. Цей спосіб включає складну пробопідготовку, обчислювання, побудову графіків залежності, крім того, температурний стрибок значною мірою впливає на тест-культуру і дотримання параметрів стрибку має при цьому методі визначення токсичності першочергове значення. Найбільш близьким по технічній сутності до пропонованого способу є спосіб біологічного моніторингу екологічних систем і об'єктів (Патент РФ №2009109403 МПК G01N 33/02), що використовується для різних об'єктів ветеринарно-санітарного і екологічного контролю харчових і кормових добавок, що передбачає три етапи біологічних досліджень. На першому етапі проводять визначення ступеня виживання інфузорій Paramecium caudatum протягом 2 годин, на другому етапі здійснюють аналіз приросту культури інфузорій Tetrachimena pyriformis за 24 години. По закінченні обох етапів оцінюють токсичність досліджуваних об'єктів і по результатам оцінки приймають рішення про закінчення або продовження досліджень на третьому етапі з експозицією 72 години. Після третього етапу приймають рішення про продовження досліджень іншими методами або оцінюють токсичність шляхом розрахунку виживання Paramecium caudatum та приросту Tetrachimena pyriformis на основі підрахунку кількості клітин за допомогою прибору для біологічних досліджень, а висновок про ступінь токсичності здійснюють на основі підрахунків всіх результатів досліджень. Даний спосіб вибраний як найближчий аналог. Найближчий аналог і корисна модель, що заявляється, мають такі спільні ознаки: - як тест-організмів використовують культуру інфузорій; - біологічну активність об'єкта оцінюють шляхом підрахунку кількості інфузорій, що вижили після експозиції (витримки). Найближчий аналог має наступні недоліки: - використовують три етапи для визначення дії речовини, що збільшує термін виконання дослідження; - підрахунки кількості клітин здійснюють у спеціальному приборі кілька разів, необхідність використання спеціального обладнання ускладнює завдання; - спосіб може бути використаний для сировини і матеріалів, що мають незначну вологість і не придатний для аналізу соковитої сировини; - попередня підготовка проб, що досліджуються, передбачає екстрагування в умовах, які призводять до значного розведення розчинів токсичних речовин, що може призвести до похибки в результатах. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб визначення мікотоксинів, в якому за рахунок використання інфузорій Stylonichia mytilus досягається однозначний результат щодо ступеня токсичності продовольчої сировини, матеріалів, добавок, що досліджуються, прискорення проведення тестування, а також спрощення способу тестування, тому, що не треба використовувати спеціальне обладнання. 65299 4 Поставлена задача вирішується в способі визначення мікотоксинів, що включає подрібнення досліджуваного об'єкта, отримання концентрату, ведення культури інфузорій в мікроакваріум, додавання до культури інфузорій концентрату мікотоксинів, підрахунок початкової кількості мікроорганізмів, витримку мікроорганізмів у водноацетоновому розчині концентрату мікотоксинів, підрахунок кількості мікроорганізмів, що вижили тим, що для визначення токсичності використовують інфузорії Stylonichia mytilus, при цьому спочатку екстракцію мікотоксинів здійснюють хлороформом, який випаровують на водяній бані, залишок розчиняють у водно-ацетоновій суміші при співвідношенні ацетон: вода рівному 1:(45-75), отриманий таким чином концентрат мікотоксинів додають до добової культури інфузорії Stylonichia mytilus, адаптація здійснюється на протягом 2-5 хв, потім доводять вміст мікроакваріума до половини ємності за допомогою концентрату мікотоксинів і через годину здійснюють повторний підрахунок живих інфузорій Stylonichia mytilus. У способі, що заявляється, використовується добова культура інфузорій Stylonichia mytilus, термін проведення біотестування значно скорочений, за рахунок зміни попередньої обробки досліджуваного зразку досягається концентрування аутентичного розчину підвищується точність проведення досліджень. Виживання інфузорій вираховують за формулою: N N   2   100 , де:  N  1  N - виживання, %; N1 - середня арифметична кількість інфузорій на початку досліду (за результатами не менше 5ти досліджень), шт; N2 - середня арифметична кількість живих інфузорій через 1 год. експозиції (за результатами не менше 5-ти досліджень), шт; 100 - коефіцієнт перерахунку у відсотки. Перед початком досліджень, при необхідності, визначають вид плісеневих грибів, який може продукувати мікотоксини і наявний в досліджуваній сировині (див. табл.). Приклад 1 Наважку огірків (Одеський регіон) 10,00±0,01 г подрібнювали, заливали хлороформом, об'ємом 3 15 см , проводили екстракцію 7 хв, відділяли хлороформний екстракт від твердого залишку і випарювали на водяній бані. До сухого залишку дода3 вали 1 см водно-ацетонової суміші при співвідношенні вода: ацетон 1:30 і використовували концентрат для визначення токсичності. Добову культуру інфузорій Stylonichia mytilus у кількості 3 0,02 см вносили в мікроакваріум, додавали 0,02 3 см ацетоново-водного концентрату. Через 5 хв, після адаптації тест-організмів у розчині, здійснювали підрахунок початкової кількості інфузорій, яка склала 58 особин. Через 60 хв експозиції вдруге проводили підрахунок чисельності інфузорій - 50 особин. Підраховували виживання інфузорій по формулі: N  50  100  86 % . 58   5 Результати визначення впливу різних токсикантів на Stylonichia mytilus наведені у таблиці. Приклад 2-9 65299 6 Здійснюють аналогічно прикладу 1. Дані наведені в таблиці. Таблиця Визначення токсичності продуктів метаболізму збудників мікробіологічного псування рослинної сировини в ліпорозчинній фракції № 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Кількість Кількість Stylonichia Stylonichia Виживаність Досліджуваний Мікроорганізми псування Ступінь токmytilus на поча- mytilus через 1 Stylonichia матеріал сировини сичності тку експозиції, год. експозиmytilus особин ції, особин Огірки (ОдесьНе токсичр. Penicillium 58 50 86 кий регіон) ний Змішані культури Огірки (Миколаp. Colletotrichum, 48 0 0 Токсичний ївська обл.) p. Aspergillus Змішані культури p. Aureobasidium Яблука 59 13 22,0 Токсичний p. Pullularia, p. Aspergillus Змішані культури p. Aureobasidium, Айва 61 30 49,2 Токсичний p. Pullularia, p. Aspergillus Виноград p.Phoma 58 28 48,2 Токсичний Змішані культури Груші p. Candida, 64 25 39,1 Токсичний p. Pullularia Змішані культури Томати p. Penicillium, 79 10 15,0 Токсичний p. Pullularia Змішані культури Баклажани 105 12 11,4 Токсичний p. Penicillium Змішані культури Сир p. Penicillium, 67 1 0 Токсичний p. Endomyces Комп’ютерна верстка А. Рябко Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601