Везикули, які містять епідермальний фактор росту і його композиції

Реферат: Винахід стосується везикул, що містять епідермальний фактор росту (EGF), катіонну поверхнево-активну речовину і холестерин або його похідні. Винахід також розкриває процедуру їхнього приготування на основі технології стиснутого текучого середовища (CFs). UA 113448 C2 (12) UA 113448 C2 Везикули за винаходом придатні для одержання лікарських засобів і косметичних засобів і в тканинній інженерії. UA 113448 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь техніки Даний винахід стосується галузей медицини людини і ветеринарії, косметики і тканинної інженерії, особливо галузей систем вивільнення везикулярного типу, які містять епідермальний фактор росту (EGF) у їхні композиції. Везикули за винаходом мають поліпшену терапевтичну ефективність відносно вільного EGF. Попередній рівень техніки Системи для доставки лікарського засобу на основі везикулярних систем, звичайно ліпосом, складені з амфіфільних молекул, що включають терапевтично активну речовину, становлять одну з найбільш широко використовуваних систем у фармацевтичній галузі, тому що вони забезпечують підвищену стійкість для діючого начала, підвищують його проникність через біологічні мембрани і дозволяють повільне вивільнення активного інгредієнта без потреби в повторних уведеннях. EGF є одним з основних факторів росту, що стимулює проліферацію клітин і рухливість під час тканинної регенерації. Він також допомагає підтримувати тканинний гомеостаз за допомогою регулювання епітеліальної проліферації клітин і міграції. Крім того, EGF індукує ангіогенез, що забезпечує нутритивну підтримку тканини (Hudson and McCawley, Microsc. Res. Tech. 1998, 43: 444-455; Koivisto et al., Exp. Cell Res. 2006, 312: 2791-2805; Liang et al., Wound Repair Regen. 2008, 16:691-698). Цей фактор росту має велику кількість застосувань у фармацевтичній галузі (Wong et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 2001, 18: 51-71; Girdler et al., Am. J. Clin. Oncol. 1995, 18: 403-406; Haedo et al., Rev. Esp. Enferm. Dig. 1996, 88: 409-413; Majima, Ophthalmologica 1998, 212:250-256); у косметиці (Hasegawa and Yamamoto, Mech. Ageing. Dev. 1992, 66: 107-114, Патент США № 5,618,544) і в тканинній інженерії (Christopher et al., Biomacromolecules 2011, 12: 3139-3146). Були розроблені EGF склади, які використовують різні ліпосомальні системи. Деякими прикладами є інтеграція EGF в одношарові ліпосоми, що містять фосфатидилгліцерин (PG), фосфатидилхолін (PC) і холестерин (Brown et al., Ann. Surg. 1988, 208: 788-794). Також повідомлялося про включення EGF у багатошарові ліпосоми, що містять PC, холестерин і гіалуронову кислоту (Yerushalmi, et al., Arch. Biochem. Biophys. 1994, 313: 267-273) або містять холестерин і дипальмітоїлфосфатидилхолін (DPPC) (Alemdaroğlu et al., J. Biomed. Mater. Res. A 2008, 85A: 271-283; Degim et al., Int. Wound. J. 2011, 8: 343-354). Іншим класом ліпосом, про який було повідомлено, є мультивезикулярні ліпосоми, що містять діолеїлфосфатидилхолін (DOPC), диміристоїлфосфатидилгліцерин (DMPG), холестерин і триолеїн (Li et al., Arch. Pharm. Res. 2005, 28: 988-994). Але з іншого боку повідомлялося про ліпосоми, які містять катіонні ліпіди, кон'юговані з EGF (Kikuchi et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996, 227: 666-671); покриті поліетиленгліколем (ПЕГ) ліпосоми, які також містять холестерин і діолеїлфосфатидилетаноламін (DOPE) у комбінації з PC або DPPC (Li et al., Int. J. Pharm. 2003, 258: 11-19). Також було повідомлено про ліпосоми, які містять DPPC і лізофосфатидилхолін (LPC) (Saddi et al., The Angle Orthodontist 2008, 78: 604-609; Alves et al., Life Sci. 2009, 85: 693699). EGF склади з застосуванням ліпосомальних систем також були захищені патентами, такими як патент, що розкриває гелеву композицію EGF/ліпосома, і способи, які включають утримування EGF у ліпосомах, що містять нейтральні і негативно заряджені фосфоліпіди (патент США No. 4944948); гелева композиція ліпосом і способи, що застосовують негативно заряджені ліпосоми і EGF і містять у собі негативно заряджені ліпіди, такі як: PG, PC і холестерин (міжнародна заявка на патент No. WO 9009782). Інша заявка на патент стосується топічного нанесення EGF для запобігання діабетичній ампутації стопи, і в ній застосовуються ліпосоми, що містять PC і дезоксихолат натрію. Ця заявка на патент обмежена застосуванням будь-якого типу ліпосом/ніосом EGF для місцевого лікування хронічних ішемічних ушкоджень діабетичної стопи ступенів IV і V (міжнародна заявка на патент No. WO 2007/073704). У попередньому рівні техніки не була виявлена інтеграція EGF у везикулярні системи на основі холестерину і катіонних поверхнево-активних речовин. Традиційні способи одержання ліпосом, такі як випарювання тонких плівок (Agrawal et al., J. Liposome Res. 2005, 15: 141-155), дегідратація-регідрація (Kirby and Gregoriadis, Nat. Biotechnol. 1984, 2: 979-984), заморожування-відтавання (Ristori et al., Biophys. J. 2005, 88: 535-547) і екструдування (MacDonald et al., Biochim. Biophys. Acta 1991, 1061: 297-303) мають деякі недоліки. Деякі з цих недоліків пов'язані з використанням великих кількостей розчинників, які важко елімінувати згодом, або з високими температурами, необхідними для деяких з цих способів, обмежуючи їхнім застосуванням термічно стабільних речовин. З іншого боку розмір і наноструктурування матеріалу важко контролювати, і ці способи мають низьку відтворюваність під час масштабування (багатостадійні способи). Іншою проблемою в приготуванні ліпосомальних засобів є їхня погана стійкість. 1 UA 113448 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Обробка матеріалів стиснутими текучими середовищами (CFs) або густими газами, як у рідкому, так і в суперкритичному стані, як розчинниками, мала великі очікування на академічному і промисловому рівнях, для приготування мікро- або наноструктурованих матеріалів, таких як: зернисті матеріали, везикулярні системи, композитні частинки, структуровані поверхні, і т. д., з більшою структурною гомогенністю, ніж була досягнута загальноприйнятою обробкою (Holmes et al., Chem. Eur. J. 2003, 9: 2144-2150; Cooper, Adv. Mater. 2001, 13: 1111-1114; Cooper, Adv. Mater. 2003, 15: 1049-1059 і Woods et al., J. Mater. Chem. 2004, 14: 1663-1678). CF або щільний газ є речовиною, яка при нормальних умовах тиску і температури існує у вигляді газу, але збільшенням тиску може бути конвертована в рідини або надкритичні рідкі середовища і бути використана як розчинне середовище для хімічної і матеріальної обробки. Найбільш часто застосовуваним CF є діоксид вуглецю (CO 2), який класифікується як зелений розчинник, тому що він є нетоксичним, незаймистим, легким у видаленні, не залишає залишків у частинках, є недорогим і легким в регенеруванні. З ранніх 90х розробили ряд методологій, які застосовують CFs для приготування тонкодисперсних матеріалів, з мікро-, субмікро- і нанорозмірними розмірами частинок (Jung і Perrut, J. Supercrit. Fluid, 2001, 20: 179-219). Сольватуюча сила CFs може бути модифікована температурними і композиційними змінами у випадку загальноприйнятих рідких розчинників і також за допомогою змін тиску, які переносяться в розчинах набагато швидше. Отже, ці способи осадження загалом мають можливість досягнення дуже високих ступенів пересичення в дуже короткі інтервали часу, стимулюючи нуклеацію при рості кристала і тим самим одержання мікро- або наночастинок з дуже вузьким розподілом розмірів, при цьому контролюючи внутрішню структуру і супрамолекулярну організацію. Один зі способів для одержання мікро- або наноструктурованих матеріалів з CFs є способом, який називається скидання тиску експандованого органічного розчину DELOS-SUSP (Міжнародна заявка на патент No. WO 2006/079889; патент No. EP 1843836; Cano-Sarabia et al., Langmuir 2008, 24: 2433-2437), який оснований на скиданні тиску органічного розчину попередньо експандованого за допомогою CF, або генеруючи мікро-, або нанодисперсу систему за допомогою згаданого скидання тиску. У цьому способі CF діє як співрозчинник, при цьому будучи таким, що повністю піддається змішуванню при деяких умовах тиску і температури з органічним розчином розчиненої речовини, яка повинна бути стабілізована у вигляді мікро- або нанодисперсної системи. Вказана стабілізація досягається в присутності добавок у середовище, звичайно водну, у яке відбувається скидання тиску експандованого розчину. Добавки можуть бути емульгаторами, іонними і не іонними детергентами, поверхневими агентами, колоїдними стабілізаторами і протекторами. Застосовуючи цей спосіб можуть бути отримані мікро- і/або нанодисперсні системи, такі як ліпосоми, емульсії або суспензії. Ліпосоми або везикули складені з холестерину й інших мембранних агентів, таких як фосфоліпіди і поверхнево-активні речовини, і для їхнього приготування потрібне розчинення холестерину і/або інших ліпідів у експандованому органічному розчині і скидання його тиску у водний розчин поверхневоактивної речовини. Для можливого включення активних речовин у везикули або ліпосоми за допомогою DELOSSUSP і для генерування відповідних везикул потрібно розчинити активний інгредієнт у вихідному експандованому розчині або у водному розчині, у якому здійснюється скидання тиску вказаного експандованого розчину, і в обох випадках це розчинення повинне бути здійснене в присутності ліпідів, детергентів або поверхнево-активних агентів. Серед катіонних поверхнево-активних речовин широко застосовуються у фармацевтиці і косметиці речовини типу четвертинного амонію (QUATs). У фармацевтичній галузі вони були застосовані за допомогою топічного, офтальмічного, орального, букального і назального шляхів. Раніше повідомлялося про приготування нановезикул холестерин:цетилтриметиламонію бромід (CTAB) із застосуванням технології DELOS-SUSP. Один приклад включення водорозчинних сполук за допомогою цієїтехнології описаний у джерелі "Ліпосоми й інші везикулярні системи: структурні особливості, способи приготування і застосування в наномедицині" (Progress in Molecular Biology and Translational Science, Elsevier, 2011, vol.104, pp. 1-52), де везикули холестерин:CTAB застосовані як носій для інкапсуляції і введення антибіотика гентаміцину. Необхідно підкреслити, що інкапсуляції, що надаються гентаміцину, є дуже низькими (