Пастки vegf і їх терапевтичні застосування

1. Ізольована молекула нуклеїнової кислоти, що кодує злитий поліпептид, який складається з компонентів R1R2 і мультимеризуючого компонента (МС), який являє собою амінокислотну послідовність довжиною від 1 до 15 амінокислот, яка має щонайменше один залишок цистеїну, де R1 означає компонент рецептора фактора росту ендотеліальних клітин судин (VEGF), що являє собою Igдомен 2 Flt-1, що являє собою амінокислоти 27126 SEQ ID NO: 8 або 27-129 SEQ ID NО: 10, і R2 означає Ig-домен 3 Flk-1, що являє собою амінокислоти 127-228 SEQ ID NО: 8 або 130-231 SEQ ID NO: 10. 2. Ізольована молекула нуклеїнової кислоти за п. 1, де мультимеризуючий компонент (МС) вибраний із групи, що складається з ХСХС, ACGC і СРРС. 3. Ізольована молекула нуклеїнової кислоти за п. 1, в якій мультимеризуючим компонентом є амінокислотна послідовність довжиною 1-15 амінокислот з 1-2 залишками цистеїну. 4. Злитий поліпептид, здатний зв'язувати фактор росту ендотеліальних клітин судин (VEGF), що кодується молекулою нуклеїнової кислоти за пп. 13. 5. Злитий поліпептид за п. 4, що має aмiнoкиcлотнy послідовність SEQ ID NO: 26, 27 або 28. 2 (19) 1 3 Винахід належить до злитих поліпептидів, здатних зв'язувати фактор росту ендотеліальних клітин судин (VEGF), представників сімейства VEGF, і варіанти сплайсингу з конкретними необхідними характеристиками, а також до терапевтичних способів застосування. У першому аспекті відмітною ознакою винаходу є молекула нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий поліпептид, що містить компоненти рецепторів (R1R2)X і/або (R1R3)Y, де R1 означає компонент рецептора фактора росту ендотеліальних клітин судин (VEGF) у вигляді Ig-домену 2 Flt-1 (Flt1D2), R2 означає компонент рецептора VEGF у вигляді Ig-домену 3 Flk-1 (Flk1D3) і R3 означає компонент рецептора VEGF у вигляді Ig-домену 3 Flt-4 (FltlD3 або R3), і де Х≥1 і Y≥1. У пов'язаному другому аспекті відмітною ознакою винаходу є мономерна пастка VEGF або злитий поліпептид, який містить компоненти рецептора VEGF (R1R2)X і/або (R1R3)Y, де Х≥1, Y≥1 і R1, R2 і R3 мають значення, визначені вище. Компоненти рецептора VEGF R1, R2 і R3 можуть бути безпосередньо зв'язані один з одним або зв'язані за допомогою однієї або декількох спейсерних послідовностей. У одному конкретному варіанті мономерна пастка VEGF являє собою (R1R2)x, де Х=2. У більш конкретному варіанті мономерною пасткою VEGF є SEQ ID NО:24 або її функціонально еквівалентний амінокислотний варіант. Винахід належить до мономерної пастки VEGF, що головним чином складається з компонентів рецептора VEGF (R1R2)X і/або (R1R3)Y і їх функціонально еквівалентних амінокислотних варіантів. У третьому аспекті відмітною ознакою винаходу є ізольована молекула нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий поліпептид, що містить компоненти рецептора VEGF (R1R2)X і/або (R1R3)Y і компонент, який є партнером в злитті (FP), вибраний з групи, яка складається з мультимеризуючого компонента (МС), сироваткового білка або молекули, здатної зв'язувати сироватковий білок. У переважному варіанті FP є мультимеризуючим компонентом (МС), здатним взаємодіяти з мультимеризуючим компонентом в іншому злитому поліпептиді з утворенням мультимерної структури, наприклад димеру або тримеру. Найбільш переважно, МС вибраний з групи, яка складається з (і) мультимеризуючого компонента, який містить область (Собласть), що розщеплюється, (іі) укороченого мультимеризуючого компонента, (ііі) амінокислотної послідовності довжиною від 1 до приблизно 200 амінокислот, що має щонайменше один залишок цистеїну, (iv) лейцинової блискавки, (ν) мотиву спіральної петлі, (vi) coil-coil мотиву і (vii) домену імуноглобуліну. Крім того пропонуються злиті поліпептиди, що по суті складаються з (R1R2)X і/або (R1R3)Y і FP. У переважному варіанті злитий поліпептид по суті складається з (R1R2)X і МС. У четвертому аспекті відмітною ознакою винаходу є злитий поліпептид, що містить компоненти рецептора VEGF (R1R2)X і/або (R1R3)Y і FP, які описані вище. Компоненти рецептора можуть бути розташовані в різному порядку, наприклад (R1R2)x-FP; (R1R2)X-FP-(R1R2)X; FP-(R2R1)X і т.д. Компоненти злитого поліпептиду можуть бути без 90657 4 посередньо зв'язані один з одним, або зв'язані за допомогою спейсерної послідовності. У п'ятому аспекті відмітною ознакою винаходу є пастка VEGF, яка містить мультимер з двох або більше злитих поліпептидів, що складаються з компонентів рецептора VEGF (R1R2)X і/або (R1R3)Y і FP, де компонент FP є мультимеризуючим компонентом (МС), що містить С-область. Собласть може бути природного походження або штучною і може знаходиться в будь-якій точці в мультимеризуючому компоненті і функціонує, забезпечуючи розщеплення вихідного МС до укороченого МС. Пастка VEGF, яка складається з двох або більш злитих поліпептидів, що маютьщонайменше один укорочений МС, називається «укороченою міні-пасткою». С-область може бути утворена в МС за допомогою інсерції, делеції або мутації так, щоб був утворений ферментативно або хімічно розщеплюваний сайт. С-область може бути утворена в будьякому МС і в будь-якому положенні в МС; переважно С-область утворюють в повнорозмірному домені Fc або його фрагменті або домені СН3. Собласть може бути сайтом, що розщеплюється ферментом, таким як тромбін, фіцин, пепсин, матрилізин або пролідаза, або що розщеплюється хімічно, наприклад мурашиною кислотою або СuСl2. У шостому пов'язаному аспекті відмітною ознакою винаходу є укорочена міні-пастка VEGF, яка є мультимерним білком, що містить два або більше злитих поліпептиди, що складаються з (R1R2)X і/або (R1R3)Y і мультимеризуючого компонента, який укорочений розщепленням вихідного МС, що містить С-область (tMC). У сьомому аспекті відмітною ознакою винаходу є злитий поліпептид, який складається з компонентів рецептора VEGF (R1R2)X і/або (R1R3)Y і МС, де МС являє собою амінокислотну послідовність довжиною від 1 до приблизно 200 амінокислот, що містить щонайменше один залишок цистеїну, де щонайменше один залишок цистеїну здатний утворювати дисульфідний зв'язок із залишком цистеїну, присутнім в МС іншого злитого поліпептиду (сМС). У переважному варіанті сМС являє собою амінокислотну послідовність довжиною 1-50 амінокислот, яка містить щонайменше один залишок цистеїну. У більш переважному варіанті сМС є амінокислотною послідовністю довжиною 1-15 амінокислот, яка містить щонайменше один залишок цистеїну. У ще більш переважному варіанті сМС являє собою амінокислотну послідовність довжиною 1-10 амінокислот, яка містить 1-2 залишки цистеїну. Ілюстрація даного варіанта винаходу показана в SEQ ID NО:27, що має сигнальну послідовність (1-26), за якою ідуть компоненти R1 (27-129) і R2 (130-231), і далі іде послідовність з дев'яти амінокислот, яка закінчується залишком цистеїну. У іншому варіанті, показаному в SEQ ID NО:28, за сигнальною послідовністю (1-26) ідуть компоненти R1 (27-129) і R2 (130-231), за якими іде послідовність з шести амінокислот, яка закінчується залишком цистеїну. У восьмому аспекті відмітною ознакою винаходу є міні-пастка VEGF, яка містить мультимер з 5 90657 6 двох або більше злитих поліпептидів, що складабілка клітиною-хазяїном, і витягання одержаного ються з (R1R2)X і/або (R1R3)Y і сМС. У більш конктаким чином злитого поліпептиду. ретному варіанті міні-пастка є димером. ІлюстраПастки VEGF згідно з винаходом терапевтично цією даного варіанта міні-пастки згідно з застосовні для лікування будь-якого захворювання винаходом є димер злитого поліпептиду, показаабо стану, який поліпшується, стає ослабленим ного в SEQ ID NО:2, в якому кожний злитий поліабо пригніченим при видаленні, інгібуванні або пептид (R1R2-cMC) має молекулярну масу 23,0кД і зменшенні кількості VEGF. Неповний список конкрІ 9,22. ретних станів, які поліпшуються при інгібуванні або У іншому варіанті сМС має 4 амінокислоти в зменшенні кількості VEGF, включає наприклад довжину і включає два залишки цистеїну, напринебажане просочування плазми або проникність клад ХСХС (SEQ ID NО:3). У одному ілюстративсудин, небажаний ріст кровоносних судин, наприному прикладі даного варіанта винаходу мініклад, такий як в пухлині, набряк, пов'язаний із запастка складається з компонентів рецептора VEGF пальними захворюваннями, такими як псоріаз або згідно з винаходом і сМС складається з ACGC артрит, включаючи ревматоїдний артрит; астму; (SEQ ID NО:4). Одним ілюстративним прикладом генералізований набряк, пов'язаний з опіками; даного варіанта міні-пастки згідно з винаходом є асцит і плевральний випіт, пов'язаний з пухлинадимер злитого поліпептиду, показаного в SEQ ID ми, запаленням або травмою; хронічне запалення NО:5, в якому кожний мономер має молекулярну дихальних шляхів; астму; синдром капілярного масу 23,2кД і рІ 9,22. Інший ілюстративний приквитоку; сепсис; хворобу нирок, пов'язану з підвилад даного варіанта винаходу показаний в SEQ ID щеним просочуванням білка; аденокарциному NО:26, що має сигнальну послідовність (1-26), за проток підшлункової (PDAC) залоза і очні захвоякою ідуть компоненти R1 (27-129) і R2 (130-231) з рювання, такі як пов'язана з віком дегенерація жоподальшою послідовністю з дев'яти амінокислот, втої плями і діабетична ретинопатія. Міні-пастка яка закінчується СРРС. VEGF зокрема застосовна для лікування захворюУ всіх варіантах пастки VEGF згідно з винаховань очей і як допоміжний засіб при операціях на дом (включаючи укорочену міні-пастку VEGF, мініочах, включаючи операцію з приводу глаукоми; і пастки VEGF і мономерні міні-пастки VEGF) сигналікування внутрішньоочних пухлин, наприклад, льна послідовність (S) може бути включена на таких як увеальна меланома, ретинобластома, за початку (або на N-кінці) злитого поліпептиду згідно допомогою доставки в склоподібне тіло. з винаходом. Сигнальна послідовність може бути Відповідно в десятому аспекті відмітною ознанативною для клітини, рекомбінантної або синтекою винаходу є терапевтичний спосіб лікування тичної. Якщо сигнальна послідовність зв'язана з Nпов'язаного з VEGF захворювання або стану, який кінцем першого рецепторного компонента, то зливключає введення пастки VEGF згідно з винахотий поліпептид може бути позначений, наприклад, дом суб'єкту, що страждає на пов'язане з VEGF як S-(R1R2)X. захворювання або стан. Хоч будь-якого ссавця Компоненти злитого поліпептиду можуть бути можна лікувати терапевтичними способами згідно безпосередньо зв'язані один з одним, або можуть з винаходом, суб'єктом переважно є хвора людибути зв'язані за допомогою спейсерів. У конкретна, що страждає або схильна до ризику розвитку них варіантах один або декілька рецепторних комстану або захворювання, яке може бути поліпшепонентів і/або компонентів, які є партнерами в не, ослаблене, інгібоване або піддане лікуванню злитті, в злитому поліпептиді безпосередньо зв'япасткою VEGF. зані один з одним без спейсерів. У інших варіантах У одинадцятому аспекті відмітною ознакою один або декілька рецепторних компонентів і/або винаходу є способи діагностики і прогнозування, а компонентів, які є партнерами в злитті, зв'язані за також набори для виявлення, кількісного аналізу допомогою спейсерів. і/або стеження за VEGF з використанням мініВинахід належить до векторів, які містять мопасток згідно з винаходом. лекули нуклеїнової кислоти згідно з винаходом, У дванадцятому аспекті відмітною ознакою включаючи експресуючі вектори, що містять молевинаходу є фармацевтичні композиції, які містять кулу нуклеїнової кислоти, функціонально зв'язану пастку VEGF згідно з винаходом з фармацевтично з послідовністю регуляції експресії. Винахід, крім прийнятним носієм. Такі фармацевтичні композиції того, належить до систем хазяїн-вектор для одерможуть містити пастку з димерного злитого поліжання злитого поліпептиду, які містять експресуюпептиду або нуклеїнові кислоти, що кодують зличий вектор у відповідній клітині-хазяїні; до систем тий поліпептид. Міні-пастки згідно з винаходом хазяїн-вектор, в яких придатною клітиноюзнаходять конкретні застосування при станах, при хазяїном є бактеріальна, дріжджова клітини, клітияких потрібна пастка VEGF із зниженим часом нана комах, клітина ссавців; клітина Е. соІі або клітипівжиття в сироватці (наприклад, більш швидкий на COS або СНО. Крім того пропонуються пастки кліренс) і/або підвищеним проникненням в тканині VEGF згідно з винаходом, модифіковані ацетилювнаслідок меншого розміру. Конкретні застосуванванням або петлюванням. Способи ацетилювання ня міні-пастки VEGF включають, наприклад, заабо пегилювання білка добре відомі в даній галузі. хворювання, при яких бажане локальне введення У пов'язаному дев'ятому аспекті відмітною в конкретну тканину або клітину. Прикладами такоознакою винаходу є спосіб одержання пастки го стану є офтальмологічні хвороби ока. VEGF згідно з винаходом, який включає культивуІнші об'єкти і переваги стануть очевидними вання клітини-хазяїна, трансфікованої вектором, при ознайомленні з наступним докладним описом. що містить послідовність нуклеїнової кислоти згідПеред тим як ознайомитися з описом способів, но з винаходом, в умовах, придатних для експресії які запропоновані, потрібно розуміти, що даний 7 90657 8 винахід не обмежено описаними конкретними сполоти згідно з винаходом можуть кодувати компособами і експериментальними умовами, як такі ненти рецепторів дикого типу R1, R2 і/або R3 або способи і умови можуть варіювати. Також потрібно їх функціонально еквівалентні варіанти. Варіанти розуміти, що термінологія, що використовується в амінокислотної послідовності рецепторних комподаному описі застосовується тільки з метою опису нентів R1, R2 і/або R3 пасток згідно з винаходом конкретних варіантів і не призначена для обметакож можуть бути одержані внаслідок створення ження, оскільки об'єм даного винаходу буде обмемутацій в кодуючих молекулах нуклеїнових кислот. жений тільки прикладеною формулою винаходу. Такі варіанти включають, наприклад, делеції або У використовуваному в даному описі і приклаінсерції або заміни амінокислотних залишків в аміденій формулі винаходу значенні форми однини нокислотній послідовності R1, R2 і/або R3. Може включають посилання на множину, якщо контекст бути здійснена будь-яка комбінація делеції, інсерчітко не диктує зворотне. Таким чином, наприклад ції і заміни, щоб одержати кінцеву конструкцію, за посилання на «спосіб» включає один або декілька умови, що кінцева конструкція володіє здатністю способів і/або стадій вказаного в даному описі тизв'язувати і інгібувати VEGF. пу і/або тих, які стануть очевидними фахівцям в Указані молекули нуклеїнових кислот вбудоданій області при читанні даного опису і т.д. вують у вектор, який здатний експресувати злитий Якщо не обумовлено особливо, всі технічні і поліпептид при введенні у відповідну клітинунаукові терміни, що використовуються в даному хазяїна. Відповідні клітини-хазяїни включають, але описі, мають таке ж значення, яке звичайно розуне обмежені вказаним, клітини бактерій, дріжджів, міється фахівцем в галузі, до якої даний винахід комах і ссавців. Можна застосовувати будь-які належить. Хоч на практиці або при перевірці даноспособи, відомі фахівцеві в даній галузі, для вбуго винаходу можуть бути використані будь-які сподовування фрагментів ДНК у вектор, щоб сконстсоби і речовини, схожі або еквівалентні речовируювати експресуючі вектори, що кодують злитий нам, вказаним в даному описі, описані переважні поліпептид згідно з винаходом, під контролем сигспособи і речовини. Всі публікації, що згадуються в налів регуляції транскрипції/трансляції. даному описі, включені в нього у вигляді посиланЕкспресія молекул нуклеїнової кислоти згідно з ня, щоб описати способи і/або речовини в зв'язку з винаходом може регулюватися другою послідовніякими цитовані публікації. стю нуклеїнової кислоти так, щоб молекули ексЗагальний опис пресувалися в хазяїні, трансформованому молеВинахід належить до пастки VEGF, здатної кулою рекомбінантної ДНК. Наприклад експресія зв'язувати і інгібувати активність VEGF, яка є моможе регулюватися будь-яким промоторномером або мультимером одного або декількох ним/енхансерним елементом, відомим в даній газлитих поліпептидів. Молекули згідно з винаходом лузі. Промотори, які можна використати для регузв'язують і інгібують біологічну активність VEGF ляції експресії химерних поліпептидних молекул, і/або фізіологічну реакцію або відповідь. Опис завключають без обмеження довгий кінцевий повтор снованих на рецепторі VEGF антагоністичних пас(Squinto et al. (1991) Cell 65:1-20); область ранньоток VEGF Flt1D2.Flk1D3.Fc∆Cl(a) (SEQ IDNO:7-8) і го промотору SV40, промотор CMV, M-MuLV, проVEGFRlR2-Fc∆Cl(a) (SEQ ID NО:9-10) дивись в мотор тимідинкінази, регуляторні послідовності РСТ WO/0075319, зміст якої включений в даний гена металотіоніну; прокаріотичні експресуючі векопис у вигляді посилання в повному об'ємі. тори, такі як промотор Ь-лактамази або промотор Міні-пастка згідно з винаходом менша, ніж поtac (дивись також Scientific American (1980) 242:74внорозмірна пастка, приблизно 50-60кД в порів94); промоторні елементи дріжджів або інших гринянні з 120кД вихідної пастки, і включає мономерні бів, такі як промотор Gal 4, ADH, PGK, промотор пастки, що складаються головним чином з доменів лужної фосфатази і області регуляції тканинносрецепторів VEGF (R1R2)X, (R1R3)Y або їх комбінапецифічної транскрипції, одержані з таких генів, як цій, пастки, утворені відщеплюванням частини еластаза І. вихідної мультимерної пастки, яка має компонент, Експресуючі вектори, здатні реплікуватися в що є партнером в злитті, який являє собою мульбактерійному або еукаріотичному хазяїні, що містимеризуючий компонент (МС), що містить обтять молекули нуклеїнової кислоти згідно з виналасть розщеплення (С-область); або зв'язуванням ходом, використовують для трансфекції хазяїна і залишку цистеїну або амінокислотної послідовностаким чином для керування експресією таких нукті, що містить один або декілька залишків цистеїну, леїнових кислот, щоб одержати злитий поліпептид з доменами рецепторного компонента або між згідно з винаходом, який утворює пастки, здатні доменами рецепторного компонента. У конкретних зв'язуватися з VEGF. Трансфіковані клітини моваріантах міні-пастка згідно з винаходом має можуть тимчасово або переважно конститутивно і лекулярну масу менше 60кД, як виміряно за допопостійно експресувати пастки VEGF згідно з винамогою SDS-ПААГ-аналізу, більш переважно прибходом. лизно 50кД, ще більш переважно приблизно 20Пастки згідно з винаходом можуть бути очи30кД, або приблизно 25кД, і здатна зв'язувати щені будь-яким способом, який забезпечує подаVEGF з афінністю, порівнянною з повнорозмірною льше утворення стабільної біологічно активної вихідною пасткою, описаною в PCT/US00/14142. пастки. Наприклад, але не з метою обмеження, Конструкції нуклеїнової кислоти і експресія фактори можуть бути витягнуті з клітин або у виДаний винахід належить до конструкції молегляді розчинних білків, або у вигляді тіл включенкул нуклеїнової кислоти, кодуючих окремий злитий ня, з яких їх можна екстрагувати кількісно 8М гідполіпептид, здатний зв'язувати VEGF, або мульрохлоридом гуанідинію і діалізом (дивись, тимерні пастки VEGF. Молекули нуклеїнової киснаприклад, патент США No.5663304). Щоб додат 9 90657 10 ково очистити фактори можна використати звивключеного в даний опис у вигляді посилання. чайну іонообмінну хроматографію, хроматографію Послідовність спейсера може містити одну або на основі гідрофобної взаємодії, хроматографію із декілька амінокислот, зв'язаних в природі з рецепоберненою фазою або гель-фільтрацію. торним компонентом, або може являти собою доКомпоненти рецептора VEGF дану послідовність, що використовується для поКомпоненти рецептора VEGF в міні-пастках силення експресії злитого поліпептиду, VEGF складаються з Ig-домену 2 Flt-1 (FltlD2) (R1), забезпечення спеціальних потрібних сайтів, що Ig-домену 3 Flk-1 (Flk1D3) (R2) (разом, R1R2), і/або представляють інтерес, забезпечення можливості R1 і Ig-домену 3 Flt-4 (Flt1D-3) (R3) (разом R1R3). для утворення складаючими доменами оптимальМається на увазі, що термін «Ig-домен» Flt-1, Flt-4 них третинних структур і/або для посилення взаєабо Flk-1 охоплює не тільки повний домен дикого модії компонента з його молекулою-мішенню. У типу, але також його варіанти з інсерціями, делеодному варіанті спейсер містить одну або декілька ціями і/або замінами, які по суті зберігають функціпептидних послідовностей між одним або декільональні властивості інтактного домену. Фахівцеві в кома компонентами, які містять 1-100 амінокислот, даній галузі без великих зусиль буде зрозуміло, переважне 1-25. що можуть бути одержані численні варіанти вказаУ більш конкретних варіантах R1 являє собою них вище Ig-доменів, які будуть зберігати по суті амінокислоти 27-126 SEQ ID NО:8 або 1-126 SEQ такі ж функціональні властивості, як і домен дикого ID NО:8 (включаючи сигнальну послідовність 1-26); типу. або амінокислоти 27-129 SEQ ID NО:10, або 1-129 Мається на увазі, що термін «функціональні SEQ ID NО:10 (включаючи сигнальну послідовеквіваленти» при використанні з посиланням на ність в положенні 1-26). У більш конкретних варіаR1, R2 або R3, охоплює домен R1, R2 або R3 щонтах R2 являє собою амінокислоти 127-228 SEQ найменше з однією зміною, наприклад делецією, ID NО:8 або амінокислоти 130-231 SEQ ID NО:10. приєднанням і/або заміною, який зберігає по суті У більш конкретних варіантах R3 являє собою амітакі ж функціональні властивості, як і домен R1, R2 нокислоти 127-225 SEQ ID NO:13 (без сигнальної або R3 дикого типу, тобто по суті еквівалентне послідовності). У тому випадку, коли наприклад R2 зв'язування з VEGF. Буде зрозуміло, що можуть помішують на N-кінці злитого поліпептиду, може бути зроблені різні амінокислотні заміни в R1, R2 бути бажано, щоб сигнальна послідовність переабо R3, не відходячи від суті винаходу відносно дувала рецепторному компоненту. Рецепторний здатності вказаних рецепторних компонентів зв'якомпонент(и), пов'язаний з мультимеризуючим зувати і інактивувати VEGF. Функціональні властикомпонентом, крім того може містити спейсерний вості пасток згідно з винаходом можна визначити компонент, наприклад послідовність GPG з амінобудь-яким відповідним скринінговим аналізом, кислот 229-231 SEQ ID NО:7. Компоненти, які є відомим в даній галузі для вимірювання необхідної партнерами в злитті, і мультимеризуючі компоненхарактеристики. Приклади таких аналізів описані в ти Партнером в злитті є будь-який компонент, який експериментальному розділі нижче, які дозволяпосилює функції злитого поліпептиду. Таким чиють визначати зв'язувальні властивості пасток для ном, наприклад, партнер в злитті може посилюваVEGF (Kd), а також час їх напівжиття у разі дисоціти біологічну активність злитого поліпептиду, доації комплексу пастка-ліганд (Т1/2). Інші аналізи, помагати його продукуванню і/або витяганню, або наприклад зміна здатності специфічно зв'язуватипосилювати фармакологічну властивість або фарся з VEGF, можна виміряти в аналізі скріплення макокінетичний профіль злитого поліпептиду, наVEGF конкурентного типу. Модифікації властивосприклад, за допомогою збільшення його часу напітей білка, таких як термостабільність, гідрофобвжиття в сироватці, проникності в тканини, ність, чутливість до протеолітичної деградації або забезпечення відсутності імуногенності або забезтенденція до агрегації, можуть бути виміряні спопечення стабільності. У переважних варіантах собами, відомими фахівцям в даній галузі. партнер в злитті вибраний з групи, яка складаєтьКомпоненти злитого поліпептиду можуть бути ся з мультимеризуючого компонента, сироватковобезпосередньо зв'язані один з одним або можуть го білка або молекули, здатної зв'язувати сироватбути зв'язані за допомогою спейсерів. Загалом, ковий білок. термін «спейсер» (або лінкер) означає одну або У тому випадку, коли партнер в злитті є сиродекілька молекул, наприклад нуклеїнових кислот ватковим білком або його фрагментом, він вибраабо амінокислот, або непептидних залишків, таких ний з групи, яка складається з -1як поліетиленгліколь, які можуть бути вбудовані микроглобулина, AGP-1, орозомукоїду, -1-кислого між одним або декількома складаючими доменаглікопротеїну, зв'язуючого вітамін D білка (DBP), ми. Наприклад, спейсерні послідовності можуть гемопексину, сироваткового альбуміну людини бути використані для забезпечення потрібного (hSA), трансферину, феритину, афаміну, гаптогсайта, що представляє інтерес, між компонентами лобіну, -фетопротеїну тироглобуліну, -2-Н8для полегшення обробки. Спейсер також може глікопротеїну, (3-2-глікопротеїну, гіалуронанзв'язубути введений, щоб посилити експресію злитого вального білка, синтаксину, C1R, ланцюга C1q, поліпептиду клітиною-хазяїном, щоб зменшити зв'язуючого галектин 3-Мас2 білка, фібриногену, стеричні перешкоди, так щоб компонент міг прийполімерного рецептора Ig (PIGR), -2мати свою оптимальну третинну структуру і/або макроглобуліну, білка, що транспортує сечовину, відповідним чином взаємодіяти зі своєю молекугаптоглобіну, IGFBP, фагоцитарних рецепторів лою-мішенню. Спейсери і способи ідентифікації макрофагів, фібронектину, гіантину, Fc, -1необхідних спейсерів дивись, наприклад, в роботі антихімотрипсину, -1-антитрипсину, антитромбіну George et al. (2003) Protein Engineering 15:871-879, III, аполіпопротеїну A-1, аполіпопротеїну В, β-2 11 90657 12 мікоглобуліну, церулоплазміну, компонента компастка може бути продуктом повного і часткового плементу С3 або С4, інгібітору естерази СІ, Срозщеплення вихідної пастки. реактивного білка, цистатину С і білка С. В більш МС, що містить С-область, може являти собою конкретному варіанті партнер в злитті вибраний з будь-який МС, здатний взаємодіяти з іншим МС з утворенням структури більш високого порядку, групи, яка складається з -1-мікроглобуліну, AGPнаприклад димеру або тримеру. С-область може 1, орозомукоїду, -1-кислого глікопротеїну, зв'язубути створена в МС в будь-якому необхідному ючого вітамін D білка (DBP), гемопексину, сироваположенні. У світлі інструкцій, представлених в ткового альбуміну людини (hSA), афаміну і гаптогприкладах нижче, фахівець в даній галузі зможе лобіну. Включення компонента, що є партнером в вибрати необхідний сайт для створення С-області злитті, може при бажанні продовжувати час напівна основі потрібних властивостей одержуваних в життя злитого поліпептиду згідно з винаходом в результаті укорочених пасток, наприклад молекусироватці. Дивись, наприклад, патенти США лярної маси, мономерної або димерної структури і No.6423512, 5876969, 6593295 і 6548653, спеціат.д. льно включені в даний опис у вигляді посилання в У конкретному варіанті С-область являє собою повному об'ємі, відносно прикладів поліпептиду, сайт розщеплення тромбіном (LVPRGS) (SEQ ID злитого з сироватковим альбуміном. hSA широко NО:6), вбудований в домен Fc∆Cl після N-кінцевої розподілений в організмі, особливо в кишечнику і послідовності СРРС (SEQ ID NО:1). У даному вакомпонентах крові, і грає важливу роль в підтримці ріанті конструкція повнорозмірної вихідної пастки осмолярності і об'єму плазми. Він повільно вивоVEGF експресується в клітині у вигляді Fcдиться з печінки і у людей звичайно має час напіміченого білка, забезпечуючи таким чином уловвжиття in vivo 14-20 днів (Waldmann et al. (1977) лювання і очищення, наприклад, з використанням Albumin, Structure Function and Uses; Pergamon колонки з білком А. Після утворення димеру і коPress; pp.255-275). валентного скріплення по одному або обома заУ тому випадку, коли партнером в злитті є молишками цистеїну послідовності СРРС (SEQ ID лекула, здатна зв'язувати сироватковий білок, моNО:1) димер піддають впливу тромбіном в умовах, лекула може бути синтетичною малою молекулою, при яких відщеплюються один або обидва домени ліпідом або ліпосомою, нуклеїновою кислотою, Fc∆Cl, так що утворюються укорочені димерні мінівключаючи синтетичну нуклеїнову кислоту, таку як пастки, що мають молекулярну масу приблизно аптомер, пептидом або олігосахаридом. Крім того, 50кД - 90кД, і володіють афінністю по відношенню молекула може бути таким білком, як, наприклад, до VEGF, порівнянної з афінністю вихідної пастки. Fc R1, Fc R2, Fc R3, полімерний рецептор Ig Фахівець в даній галузі може регулювати умови (PIGR), ScFv і інші фрагменти антитіл, специфічні розщеплення, щоб переважно утворювати продукт по відношенню до сироваткового білка. часткового розщеплення або продукт повного роУ тому випадку, коли партнером в злитті є музщеплення, при цьому варіант умов розщеплення льтимеризуючий компонент (МС), він являє собою вибирають на основі потреби в конкретному пробудь-яку природну або синтетичну послідовність, дукті, що володіє конкретними властивостями, здатну взаємодіяти з іншим МС з утворенням такими як молекулярна маса. структури більш високого порядку, наприклад диУ конкретному варіанті С-область є сайтом ромеру, тримеру і т.д. Відповідні МС можуть включазщеплення тромбіном (LVPRGS) (SEQ ID NО:6), ти лейцинову блискавку, включаючи домени лейвбудованим в домен FcACl на N-кінці по відноцинової блискавки, одержані з c-jun або c-fos; шенню до послідовності СРРС (SEQ ID NО:1). Піспослідовності, одержані з константних областей ля утворення димеру і ковалентного скріплення по легких ланцюгів каппа або лямбда; синтетичні поодному або обом залишкам цистеїну послідовності слідовності, такі як мотиви спіраль-петля-спіраль СРРС (SEQ ID NО:1) димер піддають впливу тро(Muller et al. (1998) FEBS Lett. 432:45-49), coil-coil мбіну в умовах, при яких виникають один або обимотиви і т.д., або інші загальноприйняті мультимедва домени Fc∆Cl і утворюються укорочені моноризуючі домени, відомі в даній галузі. У деяких мерні міні-пастки. Мономерна укорочена мініваріантах злитий компонент містить домен, одерпастка, утворена таким чином, містить рецепторжаний з імуноглобуліну, наприклад з IgG, IgM або ний компонент, невеликий фрагмент Fc і має розIgA людини. У конкретних варіантах одержаний з мір приблизно 25кД, і проявляє знижену афінність імуноглобуліну домен може бути вибраний з групи, по відношенню до VEGF в порівнянні з укороченою яка складається з Fc-домену IgG, важкого ланцюга химерною пасткою і повнорозмірною вихідною IgG і легкого ланцюга IgG. Fc-домен IgG може бути пасткою. Показано, що подібна мономерна пастка, вибраний з ізотипів IgGl, IgG2, IgG3 і IgG4, а також одержана у вигляді рекомбінантного білка, має KD будь-якого алотипу в кожній групі ізотипів. У одноприблизно 1нМ. му прикладі пастки VEGF згідно з винаходом муСтворення міні-пасток VEGF льтимеризуючим компонентом є Fc-домен IgG4 В одному варіанті винахід належить до міні(SEQ ID N0:29). пасток VEGF, які мають один або декілька доменів Створення укорочених міні-пасток VEGF рецепторних компонентів (R1R2)X і/або (R1R3)Y, У одному варіанті пастки згідно з винаходом де Х≥1, Y≥1 і R1, R2 і R3 мають значення, визнаукорочену міні-пастку VEGF, що містить два або чені вище, і необов'язково партнер в злитті, який більше злитих поліпептиди згідно з винаходом, переважно є доменом МС, який являє собою амістворюють, піддаючи вихідну пастку, яка має МС, нокислотну послідовність довжиною від 1 до прибщо містять С-область, впливу умов, при яких відлизно 200 амінокислот, що містить щонайменше щеплюються один або декілька МС, що містять Содин залишок цистеїну, де щонайменше один заобласть. Одержана в результаті укорочена міні 13 90657 14 лишок цистеїну здатний утворювати дисульфідний дихальних шляхів. Крім того, передбачалося, що зв'язок із залишком цистеїну, присутнім в МС іншоVEGF робить внесок в набряк тканини при астмі. го злитого поліпептиду (сМС). сМС може знаходиІншим захворюванням, пов'язаним з підвищетися на N-кінці або С-кінці злитого поліпептиду або ним рівнем VEGF, є аденокарцинома протоків підміж двома доменами рецепторних компонентів. У шлункової залози (PDAC). Зазначена злоякісна одному конкретному варіанті цистеїн додають до пухлина часто має осередок посиленої проліфеС-кінця компонента рецептора VEGF, наприклад рації ендотеліальних клітин і часто надекспресує R1R2C, який дозволяє злитому поліпептиду утвоVEGF (Ferrara (1999) J. Мої. Med. 77:527-543). рювати ковалентні димери за допомогою утворенPDAC є причиною більше 20% смертельних випаня ковалентного дисульфідного зв'язку між залишдків внаслідок злоякісних пухлин шлунковоком цистеїну на С-кінці одного злитого поліпептиду кишкового тракту, що робить дане захворювання і залишком цистеїну на С-кінці іншого злитого почетвертим з найбільш поширених причин пов'язаліпептиду. У даному ілюстративному прикладі мініної зі злоякісними пухлинами смертності в США і пастка є димером злитого поліпептиду, показаного інших промислово розвинених країнах. Експерив SEQ ID NО:2, де кожний злитий поліпептид ментальні дані свідчать про важливу роль VEGF в (RlR2-cMC або R1R2С) має молекулярну масу розвитку злоякісної пухлини підшлункової залози, приблизно 23,0кД. таким чином, інгібітор VEGF є ефективним як теУ іншому варіанті сМС є послідовністю 4 амірапевтичний засіб для ослаблення росту пухлини нокислот (ХХХХ) (SEQ ID NО:11), де X означає всередині підшлункової залози і регіональних і будь-яку амінокислоту і послідовність містить щодистальних метастазів. найменше один залишок цистеїну. У конкретному Менша за розміром неглікозильована мініваріанті сМС додають до С-кінця домену рецептопастка, експресована в Е. соІі (приклад 4), глікозирного компонента. У більш конкретному варіанті льована міні-пастка, експресована в клітинах СНО послідовність з 4 амінокислот являє собою ACGC (приклад 5), або заснована на рецепторі мономер(SEQ ID NО:4) і сМС утворює два дисульфідні на пастка (приклад 6) має оптимізовані характеризв'язки із залишками цистеїну, присутніми у другостики для локальної/інтравітреальної доставки, му злитому поліпептиді. Як показано нижче (табтобто більш короткий час напівжиття в сироватці лиця 2), обидві наведені як приклад міні-пастки для більш швидкого кліренсу і мінімізації небажавиявляють афінність по відношенню до VEGF, ного системного впливу. Крім того, внаслідок свого порівнянну з афінністю вихідної пастки. меншого розміру міні-пастка має здатність прониТерапевтичні застосування кати через внутрішню обмежувальну мембрану Міні-пастки VEGF згідно з винаходом терапев(ILM) в око і дифундувати через склоподібне тіло тично застосовні для лікування будь-якого захводо сітківки/пігментного епітеліального шару сітківки рювання або стану, який поліпшується, ослаблю(RPE), що допоможе лікувати хворобу сітківки. ється, придушується або запобігається при Крім того, міні-пастку можна використати для ловидаленні, інгібуванні або зменшенні кількості кального введення при лікуванні такої очної хвоVEGF. Необмежувальний список конкретних староби, як неоваскуляризація судинної оболонки нів, що поліпшуються інгібуванням або зменшенока, діабетичний макулярний набряк, проліфераням кількості VEGF, включає клінічні стани, які тивна діабетична ретинопатія, неоваскуляризація характеризуються надмірною проліферацією енрогівки/відторгнення трансплантата. Крім того, дотеліальних клітин судин, проникністю судин, міні-пастку можна застосовувати в будь-якій ситунабряком або запаленням, такі як набряк головноації, коли потрібне тимчасове (короткочасне) блого мозку, пов'язаний з ушкодженням, інсультом кування VEGF, наприклад, щоб уникнути хронічноабо пухлиною; набряк, пов'язаний із запальними го впливу блокади VEGF, наприклад при лікуванні захворюваннями, такими як псоріаз або артрит, псоріазу. включаючи ревматоїдний артрит; астму; генераліСерйозною проблемою, що призводить до незований набряк, пов'язаний з опіками; асцит і плесприятливого кінця після операції з приводу глаувральний випіт, пов'язаний з пухлинами, запаленкоми, є раннє запалення і ангіогенез, а також дуже ням або травмою; хронічне запалення дихальних швидке загоєння рани. Відповідно пастки VEGF шляхів; синдром капілярного витоку; сепсис; хвозгідно з винаходом можуть бути ефективно викоробу нирок, пов'язану з підвищеним просочуванристані як ад'юванти при оперуванні глаукоми, ням білка; і очні захворювання, такі як пов'язана з щоб запобігти ранньому гем- і лімфангіогенезу і віком дегенерація жовтої плями і діабетична ретирекрутуванню макрофагів до фільтраційної подушнопатія. ки після операції з приводу глаукоми і поліпшити Композиції згідно з винаходом терапевтично результат операції. застосовні для лікування широкої безлічі захворюКомбінована терапія вань, пов'язаних з підвищеними рівнями VEGF. У численних варіантах пастка VEGF може бути Наприклад, запалення з аномальним підвищенням введена в комбінації з одним або декількома доТh2 і ремоделюваня дихальних шляхів характерні датковими сполуками або терапевтичними засодля патогенезу астми (дивись наприклад Elias et бами, включаючи другу молекулу пастки VEGF, al. (1999) J. Clin. Invest. 104:1001-6). Підвищені хемотерапевтичний засіб, хірургію, катетерні прирівні VEGF виявлені в тканинах і біологічних зразстрої і опромінення. Комбінована терапія включає ках пацієнтів з астмою, які прямо корелюють з акв себе введення одного фармацевтичного дозовативністю захворювання (Lee et al. (2001) J. Allergy ного препарату, який містить пастку VEGF, і одноClin. Immunol. 107:1106-1108) і зворотно корелюго або декількох додаткових засобів; а також ввеють з діаметром дихальних шляхів і чутливістю дення пастки VEGF і одного або декількох 15 90657 16 додаткових засобів в своїх окремих фармацевтичнідамін; мітогуазон; мітоксантрон; мопідамол; нітних дозованих препаратах. Наприклад, пастка ракрин; пентостатин; фенамет; пірарубіцин; подоVEGF і цитотоксичний засіб, хемотерапевтичний філінова кислота; 2-етилгідразид; прокарбазин; засіб або інгібуючий ріст засіб можуть бути введені PSK®; разоксан; сизофіран; спірогерманій; тенуапацієнту разом в одному дозованому препараті, зонова кислота; триазиквон; 2,2',2"такому як комбінований препарат, або кожний затрихлортриетиламін; уретан; віндезин; дакарбасіб може бути введений у вигляді окремого дозозин; маномустин; мітобронітол; мітолактол; піпобваного препарату. У тому випадку, коли викорисроман; гацитозин; арабінозид («Аrа-С»); циклофотовують окремі дозовані препарати, VEGFсфамід; тіотепа; таксани, наприклад паклітаксел специфічний злитий поліпептид згідно з винахо(Taxol®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, і дом і один або декілька додаткових засобів модоцетаксел (Taxotere®; Aventis Antony, France); жуть бути введені одночасно або в окремі періоди хлорамбуцил; гемцитабін; 6-тіогуанін; меркаптопучасу зі зсувом, наприклад послідовно. рин; метотрексат; аналоги платини, такі як цисплаТермін «цитотоксичний засіб» в значенні, що тин і карбоплатин; вінбластин; платина; етопозид використовується в даному описі, належить до (VP-16); іфосфамід; мітоміцин С; мітоксантрон; речовини, яке інгібує або запобігає функціонуванвінкристин; вінорелбін; навелбін; новантрон; теніню клітин і/або спричиняє руйнування клітин. Мапозид; дауноміцин; аміноптерин; кселода; ібандється на увазі, що термін включає радіоактивні ронат; СРТ-11; інгібітор топоізомерази RFS 2000; ізотопи (наприклад, І131, І125, Y90 і Re186), хемотерадифторметилорнітин (DMFO); ретіноєва кислота; певтичні засоби і токсини, такі як ферментативно еспераміцини; капецитабін; і фармацевтично приактивні токсини з бактерій, грибів, рослин або твайнятні солі, кислоти або похідні будь-кого з вказарин або їх фрагменти. них вище засобів. Також в дане визначення вклю«Хемотерапевтичним засобом» є хімічна спочені антигормональні засоби, які діють, регулюючи лука, застосовна для лікування злоякісної пухлини. або інгібуючи дію гормонів на пухлини, такі як анПриклади хемотерапевтичних засобів включають тиестрогени, включаючи, наприклад, тамоксифен, алкілуючі агенти, такі як тіотепа і циклофосфамід ралоксифен, інгібуючі ароматазу 4(5)-імідазоли, 4(Cytoxan®); алкілсульфонати, такі як бусульфан, гідрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, імпросульфан і піпосульфан; азиридини, такі як LY117018, онапристон і тореміфен (Fareston); і бензодопа, карбоквон, метуредопа і уредопа; етиантиандрогени, такі як флутамід, нілутамід, бікаленіміни і метилмеламіни, включаючи альтреталутамід, леупролід і госерелін; і фармацевтично мін, триетиленмеламін, триетиленфосфорамід, прийнятні солі, кислоти або похідні будь-кого з триетилентіофосфорамід і триметилолмеламін; вказаних вище засобів. азотисті іприти, такий як хлорамбуцил, хлорнафа«Інгібуючий ріст засіб» при використанні в дазин, хлорфосфамід, естрамустин, іфосфамід, мехному описі належить до сполуки або композиції, лоретамин, гідрохлорид оксиду мехлоретаміну, яка інгібує ріст клітини, особливо клітини злоякісмелфалан, новембіхін, фенестерин, преднімустин, ної пухлини, або in vitro, або in vivo. Приклади інгітрофосфамід, урациловий іприт; нітрозосечовини, буючих ріст засобів включають засоби, які блокутакі як кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, лоють проходження клітинного циклу (в іншій фазі, мустин, німустин, ранімустин; антибіотики, такі як відмінній від S-фази), такі як засоби, які індукують аклациноміцин, актиноміцин, аутраміцин, азасезатримку в G1 і затримку в М-фазі. Класичні блорин, блеоміцини, кактиноміцин, каліхеаміцин, какатори фази Μ включають алкалоїди барвінку (вінрабіцин, карміноміцин, карзинофілін, хромоміцини, кристин і вінбластин), Taxol® і інгібітори топоізодактиноміцин, даунорубіцин, деторубіцин, 6-діазомерази II, такі як доксорубіцин, епірубіцин, 5-оксо-L-норлейцин, доксорубіцин, епірубіцин, даунорубіцин, етопозид і блеоміцин. Вказані засоезорубіцин, ідарубіцин, марцеломіцин, мітоміцини, би, які затримують G1, також розповсюджуються мікофенолова кислота, ногаламіцин, оливоміцини, на затримку S-фази, наприклад ДНК-алкілуючі пепломіцин, потфіроміцин, пуроміцин, квеламіцин, агенти, такі як тамоксифен, преднізон, дакарбазин, родорубіцин, стрептонігрин, стрептозоцин, тубермехлоретамін, цисплатин, метотрексат, 5цидин, убенімекс, зиностатин, зорубіцин; антимефторурацил і аrа-С. таболіти, такі як метотрексат і 5-фторурацил (5Способи введення FU); аналоги фолієвої кислоти, такі як деноптерин, Винахід належить до способів лікування, які метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги включають в себе введення суб'єкту ефективної пурину, такі як флударабін, 6-меркаптопурин, тіакількості пастки VEGF згідно з винаходом. У переміприн, тіогуанін; аналоги піримідину, такі як анциважному аспекті пастка значною мірою очищена табін, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цита(наприклад, по суті не містить речовин, які обмерабін, дидезоксиуридин, доксифлуридин, жують її дію або дають небажані побічні ефекти). еноцитабін, флоксуридин; андрогени, такі як калуСуб'єктом переважно є ссавець і найбільш перестерон, пропіонат дромостанолону, епітіостанол, важно людина. мепітіостан, тестолактон; антиадренальні засоби, Відомі різні системи доставки, які можуть бути такі як аміноглютетимід, мітотан, трилостан; повикористані для введення засобу згідно з винахоповнювач фолієвої кислоти, такий як фолінова дом, наприклад інкапсулювання в ліпосоми, мікрокислота; ацеглатон; глікозид альдофосфаміду; частинки, мікрокапсули, рекомбінантні клітини, амінолевулінова кислота; амсакрин; бестрабуцил; здатні експресувати сполуку, опосередкований бісантрен; едатраксат; дефофамін; демекольцин; рецепторами ендоцитоз (дивись наприклад Wu діазиісвон; елфорнітин; ацетат еліптинія; етоглюand Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432), консцид; нітрат галію; гідроксисечовину; лентинан; лотруювання нуклеїнової кислоти у вигляді частини 17 90657 18 ретровірусного або іншого вектора і т.д. Способи частинки, яка може бути введена в око, наприклад введення можуть бути ентеральними або паренміж оком і віком або в кон'юнктивальний мішечок, теральними і включають без обмеження інтрадерде вивільняється пастка VEGF. Вивільнення з тамальний, внутрішньом'язовий, внутрішньочерекої частки звичайно відбувається до рогівкової винний, внутрішньовенний, підшкірний, оболонки або через слізну рідину, або безпосереінтраназальний, внутрішньоочний і пероральний дньо до самої рогівки, з якою тверда частинка звиспособи. Сполуки можуть бути введені будь-яким чайно знаходиться в прямому контакті. Тверді часзручним способом, наприклад, за допомогою інфутинки, придатні для імплантації в око звичайно зії або болюсної ін'єкції, шляхом всмоктування головним чином складаються з біозруйновний або через епітеліальні або шкірно-слизові вистильні небіозруйновний полімерів. Водний розчин і/або (наприклад слизову оболонку ротової порожнини, суспензія можуть бути в формі очних крапель. Неслизову оболонку прямої кишки і кишечнику і т.д.), обхідна доза активного агента може бути виміряна і можуть бути введені разом з іншими біологічно введенням відомої кількості крапель в око. Наприактивними агентами. Введення може бути системклад, у разі об'єму краплі 25мкл введення 1-6 краним або локальним. Введення може бути термінопель буде доставляти 25-150мкл композиції. вим або хронічним (наприклад, щодня, щотижня, Водна суспензія або розчин/суспензія, застощомісяця і т.д.) або в комбінації з іншими засобасовні при практичному здійсненні способів згідно з ми. Також може бути застосоване легеневе ввевинаходом, можуть містити один або декілька подення, наприклад, з використанням інгалятора або лімерів як суспендуючих агентів. Застосовні полірозпилювача, і препарат з агентом для аерозолю. мери включають водорозчинні полімери, такі як У іншому варіанті активний агент може бути полімери целюлози, і водонерозчинні полімери, доставлений у везикулах, зокрема ліпосомах, в такі як перехреснозшиті карбоксилвмісні полімери. системі контрольованого вивільнення або в насосі. Водна суспензія або розчин/суспензія згідно з даУ іншому варіанті, коли активним агентом згідно з ним винаходом переважно є в'язкими або мукоадвинаходом є нуклеїнова кислота, що кодує білок, гезивними або ще більш переважно як в'язкими, нуклеїнова кислота може бути введена in vivo, щоб так і мукоадгезивними. підтримувати експресію білка, що кодується нею, У іншому варіанті композиція, застосовна при за допомогою конструювання її у вигляді частини практичному здійсненні способів згідно з винаховідповідного вектора для експресії нуклеїнової дом, є желатинізованою in situ водною композицікислоти і введення його таким чином, щоб він став єю. Така композиція містить желатинізуючий агент внутрішньоклітинним, наприклад, використовуючи в концентрації, ефективній для стимулювання геретровірусний вектор (дивись, наприклад, патент леутворення при контакті з оком або з слізною США No.4980286), прямою ін'єкцією або викорисрідиною. Відповідні желатинізуючі агенти включатовуючи бомбардування мікрочастинками, або ють, але не обмежені вказаним, термоотверджупокривання ліпідами, або за допомогою рецептовані полімери. Термін «желатинізуючий in situ» в рів клітинної поверхні або трансфікуючих агентів, значенні, що використовується в даному описі або шляхом введення його у зв'язку з пептидом, включає не тільки рідини з низькою в'язкістю, які подібним гомеобоксу, який, як відомо, проникає в утворюють гелі при контакті з оком або слізною ядро (дивись, наприклад, Joliot et al., 1991, Proc. рідиною, але також включає більш в'язкі рідини, Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868) і т.д. Альтернатакі як напіврідкі і тиксотропні гелі, які мають значтивно нуклеїнова кислота може бути введена всеною мірою підвищену в'язкість або густину гелю редину клітини і включена в ДНК клітини-хазяїна при введенні в око. для експресії за допомогою гомологічної рекомбіСпособи діагностики і скринінгу нації. Пастки VEGF згідно з винаходом можна викоУ конкретному варіанті може бути бажаним ристати діагностично і/або в способах скринінгу. введення фармацевтичних композицій згідно з Наприклад, пастка може бути використана для винаходом локально в необхідну для лікування спостереження за рівнями VEGF під час клінічного область; вказане можна здійснити, наприклад, без дослідження, щоб оцінити ефективність лікування. обмеження за допомогою локальної інфузії під час У іншому варіанті способи і композиції згідно з даоперації, місцевим застосуванням, наприклад, за ним винаходом використовують для відбору індидопомогою ін'єкції, за допомогою катетера або з відуумів для введення в клінічне дослідження, щоб допомогою імплантату, при цьому імплантат є поідентифікувати людей, що мають, наприклад, дуже ристим, непористим або гелеподібним матеріависокий або дуже низький рівень VEGF. Пастки лом, включаючи мембрани, такі як силіконові мемможна використати в способах, відомих в даній брани, волокна або промислові замінники шкіри. галузі, пов'язаних з локалізацією і активністю Композиція, застосовна при практичному здійVEGF, наприклад, при візуалізації, вимірюванні сненні способів згідно з винаходом може бути рійого рівнів у відповідних фізіологічних зразках, в диною, що містить агент згідно з винаходом в роздіагностичних способах і т.д. чині, в суспензії або і в тому і в іншому. Термін Пастки згідно з винаходом можна використати «розчин/суспензія» належить до рідкої композиції, в скринінговому аналізі in vivo і in vitro, щоб оцінити в якій перша частина активного агента присутня в кількість присутнього незв'язаного VEGF, наприрозчині, а друга частина активного агента присутклад в скринінговому способі для ідентифікації ня в формі частинок в суспензії в рідкому матриксі. агентів, що тестуються, здатних знижувати ексРідка композиція також включає гель. Рідка компопресію VEGF. Більш широко пастки згідно з виназиція може бути водною або в формі мазі. Крім ходом можна використовувати в будь-якому аналітого, композиція може приймати форму твердої 19 90657 20 зі або способі, в якому потрібне кількісне вимірюрату, фосфату, бікарбонату, сульфату, тіосульфавання і/або виділення VEGF. ту або бісульфату. Фармацевтичні композиції Кількість пастки, яка буде ефективною у разі її Даний винахід також належить до фармацевтерапевтичного запланованого застосування можтичних композицій, які містять міні-пастку VEGF на визначити стандартними клінічними способами, згідно з винаходом. Такі композиції містять теразаснованими на даному описі. Крім того, необов'япевтично ефективну кількість однієї або декількох зково можна використати аналізи in vitro, що доміні-пасток і фармацевтично прийнятний носій. помагають ідентифікувати оптимальні межі доз. Термін «фармацевтично прийнятний» означає Загалом, відповідні межі доз для внутрішньовенносхвалений регулюючим відомством федерального го введення звичайно становлять приблизно 50уряду або уряду штату або вказаний в фармако5000 мікрограм активної сполуки на кілограм маси пейному списку США або іншій загальновизнаній тіла. Відповідні межі доз для інтраназального ввефармакопеї для застосування на тваринах, і більш дення звичайно складають приблизно від 0,01пг/кг конкретно на людині. Термін «носій» належить до маси тіла до 1мг/кг маси тіла. Ефективні дози морозріджувача, ад'юванту, ексципієнта або наповжуть бути екстрапольовані на основі кривих дозонювача, з яким вводять терапевтичний засіб. Тавої залежності, одержаних в тесті-системах in vitro кими фармацевтичними носіями можуть бути стеабо в моделях на тваринах. рильні рідини, такі як вода і масла, включаючи Для системного введення терапевтично ефекмасла з нафти, масла і олії тваринного, рослиннотивна доза може бути спочатку визначена в аналіго або синтетичного походження, такі як арахісова зах in vitro. Наприклад, доза може бути розроблеолія, соєва олія, мінеральне масло, кунжутна олія і на в моделях на тваринах, щоб досягнути меж тому подібні. Відповідні фармацевтичні ексципієнциркулюючої концентрації, які включають IC50, вити включають крохмаль, глюкозу, лактозу, сахарозначену в культурі клітин. Таку інформацію можна зу, желатин, солод, рис, борошно, крейду, силікавикористати для більш точного визначення доз, гель, стеарат натрію, моностеарат гліцерину, прийнятних для людини. Вихідні дози також можна тальк, хлорид натрію, сухе знежирене молоко, оцінити на основі даних in vivo, наприклад, в могліцерин, пропіленгліколь, воду, етанол і тому поделях на тваринах, використовуючи способи, які дібне. Композиція при бажанні також може містити добре відомі в даній галузі. Фахівець в даній галузі невеликі кількості зволожувачів або емульгаторів, без великих зусиль може оптимізувати введення або агентів для забуферення рН. Вказані композилюдині на основі даних, одержаних на тваринах. ції можуть мати форму розчинів, суспензій, емульДозова кількість і інтервал можна коректувати сії, таблеток, пілюль, капсул, порошків, препаратів індивідуально, щоб забезпечити рівні сполук в тривалого вивільнення і тому подібні. Приклади плазмі, які є достатніми для підтримки терапевтивідповідних фармацевтичних носіїв описані в чного ефекту. У разах локального введення або «Remington's Pharmaceutical Sciences», E.W. вибіркового поглинання ефективна локальна конMartin. центрація сполук може бути не пов'язана з концеМіні-пастка VEGF згідно з винаходом може бунтрацією в плазмі. Фахівець в даній галузі зможе ти приготована у вигляді нейтральної або сольової оптимізувати терапевтично ефективні локальні форми. Фармацевтично прийнятні солі включають дози без надмірного експериментування. солі, утворені з вільними аміногрупами, такі як Кількість сполуки, що вводиться, звичайно, солі, одержані з соляної, фосфорної, оцтової, щабуде варіювати в залежності від суб'єкта, що підвлевої, винної кислот і т.д., і солі, утворені з вільдається лікуванню, маси суб'єкта, тяжкості хвороними карбоксильними групами, такі як солі, одерби, способу введення і рішення лікаря. Терапію жані з гідроксидами натрію, калію, амонію, можна повторювати періодично поки симптоми кальцію, заліза, ізопропіламіном, триетиламіном, виявляються або навіть коли вони не реєструють2-етиламіноетанолом, гістидином, прокаїном і т.д. ся. Терапія може проводитися окремо або в комбіКрім того, водні композиції, застосовні для нації з іншими лікарськими засобами. практичного здійснення способів згідно з винахоТрансфекція клітин і генна терапія дом, мають сумісні з оком рН і осмотичний тиск. Даний винахід належить до застосування нукОдин або декілька прийнятних для очей агентів леїнових кислот, що кодують злитий поліпептид для коректування рН і/або буферних агентів мозгідно з винаходом, для трансфекції клітин in vitro і жуть бути введені в композицію згідно з винахоin vivo. Вказані нуклеїнові кислоти можуть бути дом, включаючи кислоти, такі як оцтова, борна, вбудовані в будь-який з ряду добре відомих вектолимонна, молочна, фосфорна і соляна кислоти; рів для трансфекції клітин-мішеней і організмів. основи, такі як гідроксид натрію, фосфат натрію, Нуклеїнові кислоти трансфікують в клітини ex борат натрію, цитрат натрію, ацетат натрію і лакvivo і in vivo за допомогою взаємодії вектора і клітат натрію; і буфери, такі як цитрат/декстроза, бітини-мішені. Композиції вводять (наприклад, за карбонат натрію і хлорид амонію. Такі кислоти, допомогою ін'єкції в м'яз) суб'єкту в кількості, дососнови і буфери вводять в кількості, необхідній татній, щоб викликати терапевтичну відповідь. для підтримки рН композиції в прийнятних для ока Кількість, адекватну для здійснення вказаного, межах. Одна або декілька прийнятних для ока совизначають як «терапевтично ефективну дозу або лей можуть бути включені в композицію в кількості, кількість». достатній для доведення осмотичного тиску комУ іншому аспекті винахід належить до способу позиції до прийнятних для ока меж. До таких солей зниження рівнів VEGF у людини або іншої твариналежать солі, що мають катіони натрію,калію або ни, який включає в себе трансфекцію клітини нукамонію і аніони хлориду, цитрату, аскорбату, болеїновою кислотою, що кодує злитий поліпептид 21 90657 22 згідно з винаходом, при цьому нуклеїнова кислота експресований в клітинах СНО, мали порівнянну містить промотор, що індукується, функціонально афінність скріплення для VEGF, як і повнорозмірна зв'язаний з нуклеїновою кислотою, що кодує зливихідна пастка. Приклад 6, крім того, ілюструє мотий поліпептид або міні-пастку. Способи генної номерну пастку VEGF, що складається з (R1R2)2, терапії при лікуванні або профілактиці хвороби яка здатна зв'язувати і інгібувати VEGF. У прикладі людини дивись, наприклад, у Van Brunt (1998) 7 описана конструкція міні-пастки VEGF (SEQ ID Biotechnology 6:1149-1154. NО:26), що має високу афінність скріплення VEGF Набори в порівнянні з повнорозмірною пасткою (SEQ ID Винахід також належить до предметів виробNО:10). ництва, що містять пакувальний матеріал і фарІнші відмітні ознаки винаходу будуть очевидмацевтичний засіб, який знаходиться в пакувальними в ході подальшого опису зразкових варіантів, ному матеріалі, при цьому фармацевтичний засіб які наведені для ілюстрації винаходу і не признамістить щонайменше одну пастку VEGF, що склачені для його обмеження. дається з двох або більше злитих поліпептидів Приклади згідно з винаходом, і пакувальний матеріал містить Наступні приклади наведені з тим, щоб предетикетку або вкладиш в упаковку, на якому указаставити фахівцям в даній галузі повне розкриття і но, що VEGF-специфічний злитий поліпептид моопис того, як одержувати і застосовувати способи і жна застосовувати для лікування опосередкованокомпозиції згідно з винаходом, і не призначені для го VEGF захворювання або стану. обмеження об'єму того, що автори винаходу розгТрансгенні тварини лядають як свій винахід. Були зроблені зусилля Винахід включає трансгенних тварин, відміндля того, щоб забезпечити точність відносно виконих від людини, які експресують пастку згідно з ристовуваних числових значень (наприклад, кільвинаходом. Трансгенна тварина може бути одеркостей, температури і т.д.), але потрібно брати до жана введенням нуклеїнової кислоти в чоловічий уваги деякі експериментальні помилки і відхиленпронуклеус заплідненої яйцеклітини, наприклад ня. Якщо не обумовлено особливо, частини є часмікроін'єкцією, ретровірусною інфекцією, і забезтинами по масі, молекулярна маса являє собою печенням можливості для розвитку яйцеклітини у середню молекулярну масу, температура наведепсевдовагітної приймальної самиці. Будь-які регуна в градусах по Цельсію і тиск є атмосферним ляторні або інші послідовності, що застосовуються або близьким до атмосферного. в експресуючих векторах, можуть утворювати часПриклад 1 тину трансгенної послідовності. ТканинноспецифіКонструкція Fit1D2.Flk1D3.Fc∆Cl(a) чна регуляторна послідовність(ті) можуть бути Конструкція вихідної пастки VEGF оперативно зв'язані з трансгеном, щоб керувати Flt1D2.Flk1D3.Fc∆Cl(a) (SEQ ID NО:7-8), експресією трансгену в конкретних клітинах. ТранVEGFR1R2.Fc∆Cl(a) (SEQ ID NО:9-10) і сгенна тварина, відмінна від людини, що експреFlt1D2.VEGFR3D3.Fc∆Cl(a) (SEQ ID N0:12-13) десує злитий поліпептид або міні-пастку згідно з витально описана в публікації РСТ WO/0075319, находом, придатна для безлічі застосувань, спеціально включеній в даний опис у вигляді повключаючи застосування як засобів одержання силання в повному об'ємі. Також в WO/0075319 такого злитого поліпептиду. Крім того, трансген описані способи конструювання і експресії консможе бути поміщений під контроль промотору, що трукцій нуклеїнової кислоти, що кодують пастки індукується так, щоб експресію злитого поліпептиVEGF, способи реєстрації і вимірювання скріпленду або міні-пастки можна було регулювати, наприня пастки VEGF з VEGF, способи визначення стеклад, введенням малої молекули. хіометрії скріплення VEGF з використанням аналіКонкретні варіанти зу ВІАсоге і фармакокінетичні аналізи. У описаних нижче експериментах створювали Приклад 2 менші за розміром пастки VEGF і досліджували їх Розщеплена тромбіном димерна міні-пастка здатність зв'язувати VEGF. Такі міні-пастки переVEGF важно використовуються в конкретних застосуванКонструкцію VEGFR1R2.Fc∆CI(a) (SEQ ID нях. Наприклад, деякі стани або захворювання NО:9-10) модифікували інерцією сайта розщеппереважно можна лікувати за допомогою локальлення тромбіном після СРРС (SEQ ID NО:1) доменого введення пастки VEGF до конкретного органу Fc. Очищену пастку VEGF (5мкг) інкубували з на, тканини або клітини, а не системним введентромбіном (Novagen) в 20мМ тріс-НСІ, рН 8,4, ням. У одному ілюстративному прикладі міні50мМ NaCl, 2,5мМ СаСІ2 протягом 16 година при пасток згідно з винаходом створювали меншу за 37°С. Контролі включали білок для контролю розрозміром пастку VEGF прямим розщепленням дищеплення (ССР) і білок вихідної пастки VEGF, інмеризованої пастки VEGF, що має область розкубований без тромбіну. SDS-ПААГ-аналіз (трісщеплення (С-область), створену в домені Fc (пригліциновий 4-20% гель; 5мкг білка на доріжку) підтклад 2). Укорочена пастка виявляла порівнянну вердив правильне розщеплення (результати не афінність по відношенню до VEGF і час напівжиття показані). як і повнорозмірна вихідна пастка. У прикладах 3-5 Визначення афінності. Kd зв'язування кожної описана конструкція злитого поліпептиду, що має пастки VEGF з WEGF165 визначали, як описано в компонент рецептора VEGF і мультимеризуючий WO/0075319, для вихідної пастки VEGF, нерозщекомпонент, що складається з одного або двох запленої пастки VEGF, що містить сайт розщеплення лишків цистеїну. Вимірювання афінності показали, тромбіном («нерозщеплена пастка VEGF»), розщо неглікозильований злитий поліпептид, експрещепленої міні-пастки VEGF і рекомбінантної мосований в Е. соїі або глікозильований поліпептид, номерної R1R2-myc myc his. Більш конкретно зда 23 90657 24 тність пасток блокувати VEGF165-залежне фосфосигналу рецептором, встановивши, що одна молерилування рецептора визначали, використовуючи кула димерної пастки здатна блокувати одну мопервинні ендотеліальні клітини людини (HUVEC). лекулу VEGFi65 людини. Таким чином, висока VEGF165 інкубували в присутності різних концентафінність скріплення пастки VEGF у відношенні рацій пасток, що тестуються і суміш додавали до VEGF приводить до утворення комплексу, який HUVEC, щоб стимулювати фосфорилування тирозапобігає взаємодії VEGF з рецепторами клітинної зину VEGFR2. При субстехіометричних концентповерхні. Еквівалентні результати одержали у разі раціях пастки VEGF, незв'язаний VEGF індукував ідентичних експериментів по інгібуванню фосфофосфорилування рецептора. Однак при молярнорилування для вихідної пастки VEGF, нерозщепму відношенні 1:1 або більше пастки VEGF до ліленої пастки VEGF і розщепленої міні-пастки ганду спостерігали повне блокування передачі VEGF. Результати показані в таблиці 1. Таблиця 1 Пастка Вихідна пастка VEGF Нерозщеплена пастка VEGF Розщеплена міні-пастка VEGF Мономер R1R2-myc myc his Кінетична швидкість дисоціації (1/сек.) 5,51×10-5±0,94% 4,93×10-5±0,70% 5,46×10-5±0,62% 6,74×10-3±0,38% Приклад 3 Конструкція плазмід, що кодують міні-пастки VEGF Міні-пастки VEGF конструювали з попередника вихідної пастки VEGF, VEGFR1R2. Fc∆Cl(a) (SEQ ID NО:9-10), в якому три амінокислоти гліциналанін-пролін служили як лінкер між Flk1D3 і Fc∆Cl(a). Дану плазміду рТЕ115 використали для конструювання міні-пасток VEGF оскільки лінкерна послідовність ДНК містила послідовність упізнавання ендонуклеазної рестрикції Srf І, що полегшувало конструювання пастки VEGF. У всіх інших відношеннях пастка VEGF, що кодується рТЕ115, ідентична пастці VEGF VEGFR1R2.Fc∆Cl(a) (SEQ ID NО:9-10), детально описаної в публікації РСТ WO/0075319. Конструювали дві міні-пастки VEGF з доменами для мультимеризації, що складаються або з одного залишку цистеїну (R1R2С) (SEQ ID NО:2), або амінокислот ACGC (SEQ ID NО:4) (R1R2ACGC) (SEQ ID NО:5), рецепторних компонентів, що додаються до С-кінця, Flt1D2.Flk1D3. Обидві одержані конструкції здатні утворювати гомодимерні молекули, стабілізовані однією (R1R2С) або двома (R1R2ACGC) міжмолекулярними дисульфідними зв'язками. Плазміду рТЕ517 одержували видаленням фрагмента довжиною 690п.о., викликаного розщепленням ДНК рТЕІ 15 з допомогою Srf І і Not І, і вбудовуванням фрагмента синтетичної ДНК, утвореного відпалом олігонуклеотидів R1R2NC (SEQ ID N0:14) і R1R2CC (SEQ ID NО:15). Одержана в результаті плазміда кодує R1R2C, яка складається з доменів FltlD2.FlklD3, за якими іде залишок цистеїну (SEQ ID NО:23). Подібним чином одержували плазміду рТЕ518 видаленням фрагмента довжиною 690п.о., викликаного розщепленням ДНК рТЕ115 з допомогою Srf І і Not І, з подальшим лігуваннням фрагмента синтетичної ДНК, утвореного відпалом олігонуклеотидів R1R2NACGC (SEQ ID NО:16) і R1R2CACGC (SEQ ID NО:17). Одержана в результаті плазміда кодує R1R2ACGC, яка складається з доменів Flt1D2.Flk1D3, за якими ідуть амінокислоти ACGC (SEQ ID NО:25). Також конструювали плазміди для керування експресією вказаних міні-пасток в Е. соІі. Викорис Т1/2 (год.) 3,5 3,9 3,53 0,028 тали праймери R1R2N-Ncol (SEQ ID NО:18) і R1R2CNotl (SEQ ID NО:19), щоб ампліфікувати фрагмент ДНК рТЕ115, який кодує амінокислоти з G30 по К231 відносно вихідної пастки VEGF (SEQ ID NО:10). Ампліфікація даної послідовності приводила до злиття вихідного кодону метіоніну на 5'кінці і злиття кодону цистеїну з подальшим стопкодоном на 3'-кінці (SEQ ID NО:2). Потім одержаний фрагмент ДНК клонували в сайтах Nco І і Not І експресуючої плазміни Ε. coli pRG663, одержуючи pRG1102, так щоб експресія R1R2C була залежна від транскрипції з промотору Φ1.1 фага Т7. Індукція генної експресії з pRG1102 приводить до накопичення R1R2cys в цитоплазмі штаму-хазяїна Е. coli RFJ238. Подібним чином праймери R1R2NNcol (SEQ ID NО:18) і R1R2ACGC-Notl (SEQ ID NО:20) використали для ампліфікації фрагмента ДНК з рТЕ115, який кодує амінокислоти з G30 по К231 (SEQ ID NО:10), одержуючи в результаті злиття вихідного кодону метіоніну на 5'-кінці і злиття кодонів ACGC (SEQ ID NО:4) з подальшим стопкодоном на 3'-кінці (SEQ ID NО:5). Потім одержаний фрагмент клонували в сайтах Nco І і Not І експресуючої плазміди Е. coli pRG663 одержуючи pRGl 103, так щоб експресія R1R2ACGC залежала від транскрипції з промотору Φ1.1. фага Т7. Індукція генної експресії як з pRG1102, так і з pRG1103 приводила до накопичення R1R2C або R1R2ACGC відповідно в цитоплазмі штаму-хазяїна Е. coli RFJ238. Приклад 4 Очищення і характеристика міні-пасток VEGF з Е. coli І RlR2c і R1R2acgc експресували у вигляді цитоплазматичних білків в Е. coli і очищали одним і тим же способом. Індукція промотору Φ1.1 фага Т7 або в pRG1102, або в pRG1103 в Е. coli К12 штаму RFJ238 приводила до накопичення білка в цитоплазмі. Після індукції клітини збирали центрифугуванням, ресуспендували в 50мМ тріс-НСІ, рН 7,5, 20мМ EDTA і лізували пропущенням через гомогенізатор для клітин Niro-Soavi. Тільця включення збирали з лізованих клітин центрифугуванням, один раз промивали дистильованої Н20, потім розчиняли в 8М гуанідиній-НСІ, 50мМ тріс-НСІ, рН 8,5, 100мМ сульфіті натрію, 10мМ тетратіонаті 25 90657 26 натрію і інкубували при кімнатній температурі прокції, що містять RlR2c, об'єднували, концентрували тягом 16 годин. Просвітлений надосад фракціонуі наносили на колонку Superdex 200, зрівноважену вали на колонці S300, зрівноваженій 6М гуанідині50мМ тріс-НСІ, рН 7,5, 150мМ NaCl. Фракції, що єм-НСІ, 50мМ тріс-НСІ, рН 7,5. Фракції, що містять містять димер міні-пастки, збирали і об'єднували. R1R2C об'єднували і діалізували проти 6М сечовиЗа допомогою SDS-ΠΑΑΓ визначили молекулярну ни, 50мМ тріс-НСІ, рН 7,5. Діалізований білок розмасу очищеної міні-пастки, що становить приблизбавляли до 2М сечовини, 50мМ тріс-НСІ, рН 8,5, но 46кД. 2мМ цистеїн, потім повільно перемішували протяПроводили аналіз ВІАсоге (як описано в гом 7 днів при 4°С. Підданий рефолдингу білок WO/0075319), щоб визначити афінність пастки по діалізували проти 50мМ тріс-НСІ, рН 7,5, потім відношенню до VEGF, і результати показали, що наносили на колонку з SP-сефарозою, зрівноваміні-пастки R1R2С і R1R2ACGC мали афінність до жену 50мМ тріс-НСІ, рН 7,5, і елюювали градієнVEGF, порівнянну з афінністю повнорозмірної пастом NaCl від 0 до 1М в 50мМ тріс-НСІ, рН 7,5. Фратки VEGF (таблиця 2). Таблиця 2 Пастка Пастка VEGF R1R2C R1R2ACGC Кінетична швидкість дисоціації (1/сек.) 4,23×10-5 3,39×10-5 3,41×10-5 Приклад 5 Експресія міні-пасток VEGF в СНО К1 Експресія міні-пасток VEGF, що кодуються рТЕ517 і рТЕ518 залежить від транскрипції з промотору CMV-MIE людини і приводить до секреції міні-пасток в культуральне середовище при експресії в клітинах СНО. При експресії у вигляді секретованих білків в СНО К1 обидві міні-пастки виявляли в кондиціонованих середовищах, і визначення їх молекулярної маси в SDS-ΠΑΑΓ свідчило, як і очікувалося, що білки були глікозильовані. Аналіз в SDS-ΠΑΑΓ також показав, що міні-пастки здатні утворювати гомодимерні молекули, стабілізовані міжмолекулярним дисульфідним зв'язком(ами) між С-кінцевими цистеїнами. Зокрема міні-пастка R1R2C ефективно утворювала ковалентні димери при експресії у вигляді секретованого білка в клітинах СНО. Приклад 6. Конструювання і експресія одноланцюгової міні-пастки VEGF Також конструювали міні-пастку VEGF, в якій не потрібний домен для мультимеризації (SEQ ID NО:24). Дану міні-пастку конструювали безпосереднім злиттям одного домену Flt1D2.Flk1D3 (R1R2) (амінокислоти 30-231 SEQ ID NО:24) з другим доменом Flt1D2.Flk1D3 (R1R2) (амінокислоти 234435 SEQ ID NО:24) за допомогою лінкера Gly-Pro між рецепторними доменами тандема (амінокислоти 232-233 SEQ ID NО:24). Щоб сконструювати ген, що кодує тандемні домени Flt1D2.Flk1D3, синтезували фрагмент ДНК (Blue Heron Biotechnology), який кодував один до Т1/2 (год.) 4,53 5,68 5,65 мен Flt1D2.Flk1D3, який мінімізував гомологію ДНК з ДНК, що кодує домен Flt1D2.Flk1D3, виявленої в рТЕ115. Одержаний синтезований фрагмент ДНК клонували у вигляді фрагмента Srf I-Not І в сайтах Srf I-Not І рТЕ115, щоб одержати рТЕ570, яка експресує міні-пастку VEGF R1R2-R1R2 з промотору CMV-МІЕ. Коли дану плазміду трансфікують в клітини СНО К1 міні-пастка VEGF R1R2-R1R2 накопичується в культуральному середовищі. Приклад 7 Конструювання і експресія міні-пастки VEGF Міні-пастку VEGF конструювали, як описано вище, безпосереднім злиттям одного домену Flt1D2.Flk1D3 (R1R2) (амінокислоти 30-231 SEQ ID NO:26) з С-кінцевою послідовністю з дев'яти амінокислот, що закінчується СРРС. Коли таку плазміду трансфікують в клітини СНО К1 міні-пастка VEGF з SEQ ID NО:26 секретується в культуральне середовище. Подальше очищення електрофорезом в невідновному SDS-ΠΑΑΓ, а також простий аналіз світлорозсіяння виявляли молекулу пастки з молекулярною масою приблизно 64кД. Вказана молекулярна маса свідчить, що був утворений ковалентний димер між двома злитими поліпептидами з SEQ ID NО:26. Схожі експерименти проводили з плазмідами, що кодують злиті поліпептиди з SEQ ID NO:27 і 28, і подібним чином показали, що вказані молекули утворювали гомодимерні пастки. Визначення афінності для зв'язування VEGF-165 людини з пастками EGF, що складаються з димерів з SEQ ID NО:10 і SEQ ID NО:26, показані в таблиці 3. Таблиця 3 Пастка VEGF SEQ ID NО:10 SEQ ID NО:26 SEQ ID NО:26 ka (1/Ms) 2,73×10+7 2,00×10+7 +7 2,61×10 kd (1/сек.) 1,79×10-5 6,56×10-6 -6 5,77×10 KD (M) 6,55×10-13 3,28×10-13 -13 2,21×10 27 90657 28 29 90657 30 31 90657 32 33 90657 34 35 90657 36 37 90657 38 39 90657 40 41 90657 42 43 90657 44 45 90657 46 47 90657 48 49 90657 50 51 90657 52 53 90657 54 55 90657 56 57 90657 58 59 90657 60