Спосіб одержання розчинних цукрів з генетично модифікованих рослин, що експресують ферменти, деградуючі клітинну стінку
Формула / Реферат
1. Спосіб одержання розчинних цукрів з одержаного способами генної інженерії рослинного матеріалу, який включає:
попередню обробку шляхом змішування одержаного способами генної інженерії рослинного матеріалу з перетворюючим у пульпу складом, який включає бісульфіт амонію і карбонат амонію, з утворенням суміші з рН в діапазоні від 5,0 до 10,0, де одержаний способами генної інженерії рослинний матеріал включає першу полінуклеотидну послідовність, яка кодує перший білок, і другу полінуклеотидну послідовність, що кодує другий білок, і де перший білок містить амінокислотну послідовність зі щонайменше 90 % ідентичністю з референсною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з: SEQ ID NО: 1, SEQ ID NО: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 і SEQ ID NO: 8, і другий білок містить амінокислотну послідовність зі щонайменше 90 % ідентичністю з референсною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з: SEQ ID NО: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 і SEQ ID NO: 12; і
забезпечення умов гідролізу.
2. Спосіб за п. 1, який додатково включає додавання до суміші іншого рослинного матеріалу.
3. Спосіб за п. 1, який додатково включає третю полінуклеотидну послідовність, яка кодує третій білок, вибраний із групи, що складається з: ксиланази, ендоглюканази, екзоглюканази, ферулоїлестерази, модифікованої інтеїном ксиланази, модифікованої інтеїном ендоглюканази, модифікованої інтеїном екзоглюканази і модифікованої інтеїном ферулоїлестерази; де білок, вибраний як третій білок, відрізняється від білка, вибраного як перший білок, і відрізняється від білка, вибраного як другий білок.
4. Спосіб за п. 3, де третій білок включає амінокислотну послідовність зі щонайменше 90 % ідентичністю з третьою референсною послідовністю, вибраною з групи, що складається з SEQ ID NО: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 і SEQ ID NO: 11.
5. Спосіб за п. 3, де третій білок включає амінокислотну послідовність зі щонайменше 90 % ідентичністю з референсною послідовністю SEQ ID NO: 12.
6. Спосіб за будь-яким з пп. 1 або 3, де щонайменше одна з першої полінуклеотидної послідовності, другої полінуклеотидної послідовності та третьої полінуклеотидної послідовності додатково містить першу націлювальну полінуклеотидну послідовність, яка кодує відповідний націлювальний пептид, незалежно вибраний для кожної з першої полінуклеотидної послідовності, другої полінуклеотидної послідовності або третьої полінуклеотидної послідовності з групи, що складається з: націлювального на амілопласт сигналу, націлювального на клітинну стінку пептиду, націлювального на мітохондрії пептиду, сигналу локалізації в цитозолі, націлювального на хлоропласти сигналу, націлювального в ядро пептиду і націлювального на вакуоль пептиду, де відповідний націлювальний пептид злитий з першим білком, другим білком або третім білком.
7. Спосіб за п. 6, де відповідна перша націлювальна полінуклеотидна послідовність розташована вище першої полінуклеотидної послідовності, другої полінуклеотидної послідовності або третьої полінуклеотидної послідовності, і націлювальний пептид незалежно вибраний із групи, що складається з: SEQ ID NО: 13, SEQ ID NО: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 і SEQ ID NO: 17.
8. Спосіб за п. 6, де перша націлювальна полінуклеотидна послідовність у комбінації зі щонайменше однією з першої полінуклеотидної послідовності, другої полінуклеотидної послідовності або третьої полінуклеотидної послідовності разом кодують амінокислотну послідовність зі щонайменше 90 % ідентичністю з референсною послідовністю, вибраною із групи, що складається з: SEQ ID NО: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 і SEQ ID NO: 21.
9. Спосіб за п. 6, де рослина додатково містить другу націлювальну полінуклеотидну послідовність, яка кодуює карбоксинацілювальний пептид, злитий щонайменше з одним з першого білка, другого білка або третього білка, де карбоксинацілювальний пептид незалежно вибраний із групи, що складається з: SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 і SEQ ID NO: 24.
10. Спосіб за п. 6, де рослина додатково містить другу націлювальну полінуклеотидну послідовність, яка кодує карбоксинацілювальний пептид, і де перша націлювальна полінуклеотидна послідовність і друга націлювальна полінуклеотидна послідовність у комбінації з однією з першої полінуклеотидної послідовності, другої полінуклеотидної послідовності або третьої полінуклеотидної послідовності разом кодують амінокислотну послідовність зі щонайменше 90 % ідентичністю з референсною послідовністю, вибраною з групи, що складається з: SEQ ID NО: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 і SEQ ID NО: 31.
11. Спосіб за п. 1, де бісульфіт амонію знаходиться в концентрації від 0,02 М до 0,35 М і карбонат амонію знаходиться в концентрації від 0,025 М до 0,25 М.
12. Спосіб за п. 11, де суміш має співвідношення рідини і твердої речовини, вибране з величини, що менша або дорівнює одному з 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 або 1.
13. Спосіб за п. 12, де попередня обробка включає інкубацію суміші протягом періоду, що менший або дорівнює одному з 16 годин, 15 годин, 14 годин, 13 годин, 12 годин, 11 годин, 10 годин, 9 годин, 8 годин, 7 годин, 6 годин, 5 годин, 4 годин, 3 годин, 2 годин або 1 години.
14. Спосіб за п. 13, де попередня обробка включає забезпечення температури суміші від 40 °С до 95 °С.
15. Спосіб за п. 14, який додатково включає очищення суміші механічним подрібнюванням.
16. Спосіб за п. 1, де умови гідролізу включають від 2 % до 25 % твердих речовин.
17. Спосіб за п. 16, де умови гідролізу включають інкубацію суміші протягом періоду аж до 144 годин.
18. Спосіб за п. 17, де умови гідролізу включають температуру суміші, що становить 100 °С або менше.
19. Спосіб за п. 18, де температура суміші становить 65 °С або менше.
20. Спосіб за п. 19, де температура суміші становить від 48 °С до 50 °С.
21. Спосіб за п. 18, де умови гідролізу включають рН суміші від 4,8 до 5,0.
22. Спосіб за п. 21, який додатково включає контактування суміші з ферментуючим організмом для одержання біохімічного продукту.
23. Спосіб за п. 22, де ферментуючим організмом є дріжджі, вибрані з групи, що складається з: Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Yorrowia, Spothaspora і Scheffersomyces.
24. Спосіб за п. 1, який додатково включає додавання одного або декількох екзогенних ферментів.
25. Спосіб за п. 24, де один або декілька екзогенних ферментів включають ендоглюканазу, целобіогідролазу, глікозидазу і ксиланазу.
26. Спосіб за п. 25, де один або декілька екзогенних ферментів додатково включають β-ксилозидазу.
27. Спосіб за п. 24, де один або декілька екзогенних ферментів включають целюлазу, виділену з Trichoderma reesii.
28. Одержана способами генної інженерії рослина, що включає першу полінуклеотидну послідовність, яка кодує амінокислотну послідовність зі щонайменше 90 % ідєнтичністю з першою референсною послідовністю, вибраною з групи, що складається з: SEQ ID NО: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 і SEQ ID NO: 8, та яка додатково включає другу полінуклеотидну послідовність, яка кодує амінокислотну послідовність зі щонайменше 90 % ідентичністю з другою референсною послідовністю, вибраною з групи, що складається з: SEQ ID NО: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NО:11 і SEQ ID NO: 12.
29. Одержана способами генної інженерії рослина за п. 28, яка додатково включає третю полінуклеотидну послідовність, яка кодує амінокислотну послідовність зі щонайменше 90 % ідентичністю з третьою референсною послідовністю, вибраною з групи, що складається з SEQ ID NО: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 і SEQ ID NO: 12, де SEQ ID NO, вибрана як третя референсна послідовність, відрізняється від SEQ ID NO, вибраної як друга референсна послідовність.
30. Одержана способами генної інженерії рослина за п. 28 або 29, де перша полінуклеотидна послідовність, друга полінуклеотидна послідовність або третя полінуклеотидна послідовність додатково включає націлювальну полінуклеотидну послідовність, що кодує націлювальний пептид, вибраний із групи, що складається з: націлювального на амілопласт сигналу, націлювального на клітинну стінку пептиду, націлювального на мітохондрії пептиду, сигналу локалізації в цитозолі, націлювального на хлоропласти сигналу, націлювального в ядро пептиду і націлювального на вакуоль пептиду.
31. Одержана способами генної інженерії рослина за п. 30, де націлювальний пептид вибраний із групи, що складається з: SEQ ID NО: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 і SEQ ID NO: 24.
32. Одержана способами генної інженерії рослина за п. 28 або 29, де модифікована рослина вибрана з групи, що складається з: кукурудзи, цукрової тростини, цукрового буряка, сорго, проса, міскантуса, евкаліпта, верби і тополі.
33. Одержана способами генної інженерії рослина, яка включає щонайменше одну полінуклеотидну послідовність, яка кодує амінокислотну послідовність зі щонайменше 90 % ідентичністю з послідовністю, вибраною з групи, що складається з: SEQ ID NО: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 і SEQ ID NO: 31.
34. Касета експресії, яка містить: першу полінуклеотидну послідовність, здатну гібридизуватися в умовах помірної жорсткості з нуклеїновою кислотою, що складається з першої референсної послідовності, вибраної з групи, що складається з: SEQ ID NО: 32, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 і SEQ ID NO: 39; і другу полінуклеотидну послідовність, здатну гібридизуватися в умовах помірної жорсткості з нуклеїновою кислотою, що складається з другої референсної послідовності, вибраної з групи, що складається з: SEQ ID NО: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 і SEQ ID NO: 43.
35. Касета експресії за п. 34, яка додатково містить третю полінуклеотидну послідовність, здатну гібридизуватися в умовах помірної жорсткості з третьою референсною послідовністю, вибраною з групи, що складається з: SEQ ID NО: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 і SEQ ID NO: 43, де SEQ ID NO, вибрана як третя референсна послідовність, відрізняється від SEQ ID NO, вибраної як друга референсна послідовність.
36. Касета експресії за будь-яким з пп. 34 або 35, де перша полінуклеотидна послідовність, друга полінуклеотидна послідовність або третя полінуклеотидна послідовність додатково включає націлювальну полінуклеотидну послідовність, що кодує націлювальний пептид, вибраний із групи, що складається з: націлювального на амілопласт сигналу, націлювального на клітинну стінку пептиду, націлювального на мітохондрії пептиду, сигналу локалізації в цитозолі, націлювального на хлоропласти сигналу, націлювального в ядро пептиду і націлювального на вакуоль пептиду.
37. Касета експресії за п. 36, де націлювальна полінуклеотидна послідовність вибрана з групи, що складається з: SEQ ID NО: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 і SEQ ID NO: 51.
38. Касета експресії за п. 37, яка містить полінуклеотидну послідовність, здатну гібридизуватися в умовах помірної жорсткості з нуклеїновою кислотою, що складається з референсної послідовності, вибраної з групи послідовностей, що складається з: SEQ ID NО: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SRQ ID NO: 60, SEQ ID NО: 61 і SEQ ID NO: 62.
39. Вектор експресії, який містить полінуклеотидну послідовність, здатну гібридизуватися в умовах помірної жорсткості з нуклеїновою кислотою, що складається з послідовності, вибраної з групи, що складається з: SEQ ID NО: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82 і SEQ ID NO: 83.
40. Спосіб отримання розчинних цукрів з отриманого способами генної інженерії рослинного матеріалу, що включає:
попередню обробку шляхом змішування отриманого способами генної інженерії рослинного матеріалу з перетворюючим в пульпу складом, який включає бісульфіт амонію і карбонат амонію, з утворенням суміші з рН в діапазоні від 5,0 до 9,0,
де бісульфіт амонію знаходиться в концентрації від 0,02 М до 0,18 М, і карбонат амонію знаходиться в концентрації від 0,025 М до 0,20 М, при цьому отриманий способами генної інженерії рослинний матеріал включає першу полінуклеотидну послідовність, яка кодує перший білок, і другу полінуклеотидну послідовність, яка кодує другий білок, і де перший білок містить амінокислотну послідовність зі щонайменше 90 % ідентичністю з референсною послідовністю, вибраною з групи, що складається з: SEQ ID NО: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 , SEQ ID NO: 7 і SEQ ID NO: 8, і другий білок містить амінокислотну послідовність зі щонайменше 90 % ідентичністю з референсною послідовністю, вибраною з групи, що складається з: SEQ ID NО: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 і SEQ ID NO: 12; і
забезпечення умов гідролізу.
Текст
Реферат: Винахід належить до способу одержання розчинних цукрів з модифікованих способами генетичної інженерії рослин, що експресують ферменти, деградуючі клітинну стінку. А також до касет експресії і векторів для одержання зазначених трансгенних рослин. UA 112643 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 За даною заявкою вимагається пріоритет тимчасової заявки США № 61/449769, поданої 7 березня 2011 року, яка включена в даний опис шляхом посилання в повному обсязі. Список послідовностей, наданий в електронному вигляді разом з даною заявкою за назвою "Список послідовностей", який створений 7 березня 2012 року і має розмір файла 620037 байт, включений у даний опис шляхом посилання в повному обсязі. ГАЛУЗЬ ВИНАХОДУ Даний винахід стосується способів одержання розчинних цукрів з рослин, експресуючих ферменти, деградуючі клітинну стінку, трансгенних рослин, векторів експресії, нуклеїнових кислот і білків, деградуючих клітинну стінку. РІВЕНЬ ТЕХНІКИ Лігноцелюлозна біомаса є привабливою сировиною для виробництва біопалива, хімічних реагентів і біопродуктів. Лігноцелюлозна біомаса забезпечує множину переваг, включаючи широку доступність, потенційно низьку вартість, відновлюваність і той факт, що її звичайно не вживають люди як джерело їжі (Langeveld J.W.A. et al. 2010, Crop Sci. 50:S131-S151). Для перетворення лігноцелюлозної біомаси в відновлювану енергію і біохімічні речовини, за допомогою біопроцесів здійснюють конверсію частини лігноцелюлозної біомаси в прості цукри, які конвертують у біопалива або інші біопродукти. Вартість одержання цукру шляхом біологічної конверсії є високою внаслідок витрат на попередню обробку і ферментативний гідроліз біомаси (Alvira P. et al. 2010, Bioresour. Technol. 101:4851; Abramson M. et al. 2010, Plant Science, 178:61; Daniel Klein-Marcuschamer et al. Biotechnol. Bioeng. 2012; 109:1083). Клітинні стінки рослин не піддаються ферментативному гідролізу, оскільки гетерогенність, хімічний склад і структурні ознаки полісахаридів клітинної стінки роблять їх недоступними для гідролітичних ферментів (Zhu L. et al. 2008, Bioresour. Technol. 99:3817). З цієї причини для ферментативного гідролізу потрібна попередня обробка, яка може забезпечити доступність клітинних стінок рослин. У технологіях попередньої обробки, що переважають у промисловості, як правило, використовуються жорсткі умови, такі як високі температури і крайні значення pН (Wyman C.E. et al. Bioresour. Technol. 96:1959; Mosier N. et al. 2005, Bioresour. Technol. 96:673). Ці умови викликають деградацію цукрів і приводять до зниження виходу й утворення токсичних сполук ферментації, що вимагають дорогих додаткових стадій детоксикації, розділення і нейтралізації, а також дорогого передового капітального обладнання. Витрати на попередню обробку, висока вартість навантаження екзогенними ферментами, низька швидкість гідролізу й обмежені постачання ферментів також є проблемами для комерціалізації способів, що залучають лігноцелюлозну біомасу. СУТЬ ВИНАХОДУ В одному аспекті винахід стосується способу одержання розчинних цукрів з одержаного способами генної інженерії рослинного матеріалу. Спосіб включає попередню обробку шляхом змішування одержаного способами генної інженерії рослинного матеріалу з перетворюючим у пульпу складом з одержанням суміші. Одержаний способами генної інженерії рослинний матеріал включає першу полінуклеотидну послідовність, кодуючу перший білок, вибраний із групи, що складається з: ксиланази, ендоглюканази, екзоглюканази, ферулоїлестерази, модифікованої інтеїном ксиланази, модифікованої інтеїном ендоглюканази, модифікованої інтеїном екзоглюканази і модифікованої інтеїном ферулоїлестерази. Спосіб також включає забезпечення умов гідролізу. В одному аспекті винахід стосується одержаної способами генної інженерії рослини. Одержана способами генної інженерії рослина включає першу полінуклеотидну послідовність, кодуючу амінокислотну послідовність з щонайменше 90 % ідентичністю з першою референсною послідовністю, вибраною з групи, що складається з: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 і SEQ ID NO: 11. В одному аспекті винахід стосується касети експресії. Касета експресії включає першу полінуклеотидну послідовність, здатну гібридизуватися в умовах помірної жорсткості з нуклеїновою кислотою, що складається з першої референсної послідовності, вибраної з групи, що складається з: SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 і SEQ ID NO: 39 [P77853:S158-30-108-35]. Касета експресії також включає другу полінуклеотидну послідовність, здатну гібридизуватися в умовах помірної жорсткості з нуклеїновою кислотою, що складається з другої референсної послідовності, вибраної з групи, що складається з: SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 1 UA 112643 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 41, SEQ ID NO: 42 і SEQ ID NO: 43. SEQ ID NO, вибрана як перша референсна послідовність, відрізняється від SEQ ID NO, вибраної як друга референсна послідовність. В одному аспекті винахід стосується касети експресії. Касета експресії включає полінуклеотидну послідовність, здатну гібридизуватися в умовах помірної жорсткості з нуклеїновою кислотою, що складається з референсної послідовності, вибраної з групи послідовностей, що складається з: SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61 і SEQ ID NO: 62. В одному аспекті винахід стосується вектора експресії. Вектор експресії включає полінуклеотидну послідовність, здатну гібридизуватися в умовах помірної жорсткості з нуклеїновою кислотою, що складається з послідовності, вибраної з групи, що складається з: SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82 і SEQ ID NO: 83. КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ Представлений нижче докладний опис переважних варіантів здійснення даного винаходу буде краще зрозумілим при прочитанні разом із прикладеними кресленнями. Для мети ілюстрації винаходу на кресленнях представлені варіанти здійснення, які на даний час є переважними. Однак зрозуміло, що винахід не обмежується точними представленими схемами і засобами. На ФІГ. 1 представлена принципова технологічна схема, що ілюструє стадії об'єднаної попередньої обробки і гідролізу рослинної біомаси, експресуючої ферменти, деградуючі клітинну стінку. На ФІГ. 2A, 2B проілюстровані виходи глюкози (ФІГ. 2A) і ксилози (ФІГ. 2B) з попередньо обробленої трансгенної рослини, експресуючої ксиланазу A (XynA.2015.05), і трансгенної контрольної рослини, позбавленої ксиланази A (TGC.4000.12) після ферментативного гідролізу коктейлем ферментів #5 (FCt; сірий (середній стовпчик у кожнім наборі з трьох)) або коктейлем ферментів #5, позбавленим ксиланази A (Ct-Xyn; діагональні смуги (праворуч)), або без ферментів (NCt; білий (ліворуч)). На ФІГ. 3A, 3B проілюстровані виходи глюкози (ФІГ. 3A) і ксилози (ФІГ. 3B) з попередньо обробленої трансгенної рослини, експресуючої ксиланазу B (XynB.2063.17), і попередньо обробленої контрольної рослини дикого типу (AxB) після ферментативного гідролізу коктейлем ферментів #1 (FCt; сірий (середина)) або коктейлем ферментів #1, позбавленим ксиланази (CtXyn; діагональні смуги (праворуч)), або без ферментів (NCt; білий (ліворуч)). На ФІГ. 4 проілюстровані виходи глюкози з попередньо оброблених трансгенних рослин, експресуючих ендоглюканазу (EG) після ферментативного гідролізу коктейлем ферментів #1 (FCt; сірий (середина)) або коктейлем ферментів #1, позбавленим ендоглюканази (Ct-EG (праворуч)), або без ферментів (NCt; білий (ліворуч)). На ФІГ. 4A проілюстрований вихід глюкози з трансгенних рослин, експресуючих ендоглюканазу A (EGA.2049.02 і EGA.2049.10), і трансгенної контрольної рослини, позбавленої ендоглюканази (TGC.4000.12). На ФІГ. 4B проілюстрований вихід глюкози з трансгенної рослини, експресуючої ендоглюканазу B (EGB.2042.03), і трансгенної контрольної рослини, позбавленої ендоглюканази (TGC.2004.8.02). На ФІГ. 5A-5D проілюстровані результати гідролізу для трансгенних рослин, експресуючих множину білків. На ФІГ. 5A і 5C проілюстровані виходи глюкози, а на ФІГ. 5B і 5D проілюстровані виходи ксилози з досліджуваних трансгенних рослин і трансгенних контрольних рослин при обробці коктейлем #1. На ФІГ. 5A і 5B проілюстровані результати для 1) трансгенних рослин з подвійним набором XynA/AccA/B.2096.05 і XynA/AccA/B.2096.01, що експресують ксиланазу A (XynA) і допоміжні ферменти (Acc), і 2) трансгенної контрольної рослини TGC.2004.8.02 при обробці повним коктейлем ферментів (FCt; темно-сірий (середина)), повним коктейлем, позбавленим ксиланази (FCt-Xyn; стовпчики в смужку (праворуч)), і без ферментів (NCt; білі стовпчики (ліворуч)). На ФІГ. 5C і 5D проілюстровані результати для 1) трансгенної рослини EGA/XynA.2242.09, експресуючої XynA і EGA, і 2) трансгенної контрольної рослини TGC.4000.12 при обробці повним коктейлем ферментів (FCt; темно-сірий (лівий стовпчик з чотирьох для кожного зразка)), повним коктейлем, позбавленим ксиланази (Ct-Xyn; діагональні смуги (другий ліворуч)), повним коктейлем, позбавленим ендоглюканази (Ct-EG; білий (третій ліворуч)), і повним коктейлем, позбавленим ксиланази і ендоглюканази (Ct-Xyn-EG; у клітинку (четвертий ліворуч)). На ФІГ. 6A, 6B проілюстровані виходи глюкози і ксилози, відповідно, із соломи попередньо обробленої контрольної рослини дикого типу AxB і трансгенних рослин кукурудзи XynB/EGA/CBHB.2349.56, XynB/EGA/CBHB.2349.55 і XynB/EGA/CBHA.2345.116, що експресують 2 UA 112643 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 потрійні набори білків. Виходи вимірювали після ферментативного гідролізу коктейлем ферментів Accelerase® 1500/XY (FCt; чорні стовпчики (праворуч)) у порівнянні з контрольною обробкою, позбавленою коктейлю ферментів (NCt; сірі стовпчики (ліворуч)). На ФІГ. 7A, 7B проілюстровані виходи глюкози і ксилози, відповідно, із трансгенних рослин. На ФІГ. 7A показані виходи глюкози з попередньо оброблених трансгенних рослин проса, експресуючих ксиланазу A (XynA.pv2015.3c, XynA.pv2015.4c), і попередньо обробленої рослини проса (Alamo) після ферментативного гідролізу коктейлем ферментів #1 (FCt; сірий (середина)); коктейлем #1, позбавленим ксиланази (Ct-Xyn; діагональні смуги (праворуч)); і контрольної обробки, позбавленої коктейлю ферментів (NCt; білий (ліворуч)). На ФІГ. 7B показані результати виходу ксилози з попередньо обробленої трансгенної рослини першого покоління, експресуючої ксиланазу A (XynA.2015.05.T0), трансгенної рослини другого покоління, експресуючої ксиланазу A (XynA.2015.05.T1), і попередньо обробленої трансгенної рослини, позбавленої ксиланази (TGC.4000.11) після ферментативного гідролізу коктейлем ферментів #1 (FCt; сірий (середина)); коктейлем #1, позбавленим ксиланази (Ct-Xyn; діагональні смуги (праворуч)); і контрольної обробки, позбавленої коктейлю ферментів (NCt; білий (ліворуч)). На ФІГ. 8A, 8B проілюстровані виходи глюкози і ксилози, відповідно, із двох попередньо оброблених трансгенних рослин проса, експресуючих ксиланазу A (XynA.pv2015.3c і XynA.pv2015.4c), у порівнянні з контрольною нетрансгенною рослиною проса (Alamo) після ферментативного гідролізу коктейлем ферментів #1 (FCt; сірий (середина)); коктейлем ферментів #1, позбавленим ксиланази (Ct-Xyn; діагональні смуги (праворуч)), і контрольної обробки, позбавленої коктейлю ферментів (NCt; білий (ліворуч)). На ФІГ. 9A, 9B проілюстровані виходи глюкози і ксилози, відповідно, з попередньо обробленого трансгенної рослини (iXynA.2229.110), експресуючої модифіковану інтеїном XynA (iXynA) і попередньо обробленої контрольної рослини дикого типу (AxB) після ферментативного гідролізу коктейлем ферментів #1 (FCt; сірий (середина)); коктейлем ферментів #1, позбавленим ксиланази (Ct-Xyn; діагональні смуги (праворуч)), і контрольної обробки без коктейлю ферментів (NCt; білий (праворуч)). На ФІГ. 10 проілюстрований вихід глюкози з перебігом часу після ферментативного гідролізу попередньо обробленої трансгенної рослини, експресуючої ксиланазу A (XynA.2015.5T1; зафарбований трикутник), і попередньо обробленої трансгенної рослини, експресуючої ксиланазу B (XynB.2063.17; зафарбоване коло), проти трансгенної контрольної рослини (TGC.2004.8.02; незафарбований квадрат) з використанням коктейлю ферментів #1. На ФІГ. 11 проілюстрований вихід глюкози з перебігом часу після ферментативного гідролізу попередньо обробленої трансгенної рослини (EGA.2049.10) і попередньо обробленого трансгенного контролю (TGC.4000.11) з використанням коктейлю ферментів #1 (EGA.2049.10.FCt, зафарбований квадрат; TGC.4000.11.FCt, незафарбований ромб) і коктейлю ферментів #1, позбавленого ендоглюканази (EGA.2049.10.Ct-EG, зафарбований трикутник; TGC.4000.11.Ct-EG, незафарбоване коло). На ФІГ. 12A, 12B проілюстрований вихід глюкози з перебігом часу після ферментативного гідролізу попередньо обробленої трансгенної рослини (EGA/XynA.2242.09) і попередньо обробленої трансгенної контрольної рослини (TGC.4000.11) з використанням повного коктейлю ферментів (EGA/XynA.2242.09.FCt, зафарбований квадрат; TGC.4000.11.FCt, незафарбований ромб) у порівнянні з обробкою з використанням повного коктейлю ферментів, позбавленого ендоглюканази (EGA/XynA.2242.09.Ct-EG, зафарбоване коло; TGC.4000.11.Ct-EG, незафарбоване коло на ФІГ. 12A), і повного коктейлю ферментів, позбавленого ксиланази (EGA/XynA.2242.09.Ct-Xyn, зафарбоване коло; TGC.4000.11.Ct-Xyn, незафарбоване коло). На ФІГ. 13A, 13B проілюстровані виходи глюкози і ксилози, відповідно, з перебігом часу з попередньо обробленої трансгенної рослини, експресуючої ксиланазу A і ферулоїлестеразу B (XynA/AccB.2092.103), і попередньо обробленої трансгенної контрольної рослини (TGC.4000.11) після ферментативного гідролізу повним коктейлем ферментів (XynA/AccB.2092.103.FCt, зафарбований квадрат; TGC.4000.11.FCt, незафарбований ромб) і повним коктейлем ферментів, позбавленим ксиланази (XynA/AccB.2092.103.Ct-Xyn, зафарбований трикутник; TGC.4000.11.Ct-Xyn, незафарбоване коло). На ФІГ. 14 проілюстровані виходи глюкози після ферментативного гідролізу попередньо обробленої трансгенної рослини, експресуючої наступні білки: ксиланаза B (XynB.2063.17), ендоглюканаза (EGA.2049.10), ксиланаза A і ферулоїлестераза B (XynA/Acc.B.2092.103), ксиланаза A і ендоглюканаза (EGA/XynA.2242.09), модифікована інтеїном ксиланаза A (iXynA.2229.110), у порівнянні з нетрансгенною контрольною рослиною (AxB) і трансгенною контрольною рослиною, позбавленою ферментів (TGC.4000.11). Попередню обробку проводили при температурах 65 °C (ΡΤ_65) і 75 °C (ΡΤ_75). Навантаження ферментами включає 0,2 мл 3 UA 112643 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Accellerase® 1500 або 0,1 мл Accellerase® XY на грам біомаси і 0,05 мкМ β-глюкозидазу (BGL). Стовпчики над кожною з груп попередньої обробки PT_65 і PT_75 відповідають даним для трансгенних і контрольних рослин наступним чином зліва направо: AxB; TGC.4000.11; XynA.2015.05T1; XynB.2063.17; XynA/AccB.2092.103; iXynA.2229.110; EGA.2049.10 і XynA/EGA.2242.09. На ФІГ. 15 проілюстровані виходи глюкози після ферментативного гідролізу попередньо обробленого трансгенного проса (EGC.2253.4b, зафарбоване коло) і проса дикого типу (Alamo, незафарбований квадрат) коктейлем ферментів #5. Температури попередньої обробки: 65 °C, 75 °C і 95 °C. На ФІГ. 16A, 16B проілюстрований ефект температури попередньої обробки і часу на вихід глюкози (ФІГ. 16A) і ксилози (ФІГ. 16B) після ферментативного гідролізу попередньо обробленої трансгенної рослини, експресуючої ендоглюканазу і ксиланазу A (EGA/XynA.2342.105; чорні стовпчики (праворуч)), і попередньо обробленої контрольної рослини (TGC.2342.01; сірі стовпчики (ліворуч)). На ФІГ. 17A, 17B проілюстрований ефект температури попередньої обробки на вихід глюкози (ФІГ. 17A) і ксилози (ФІГ. 17B) з попередньо оброблених трансгенних рослин EGA/XynA.2242.09.01 і EGA/XynA.2242.09.07, експресуючих ендоглюканазу A і ксиланазу A, і контрольних рослин: AxB дикого типу і трансгенна TGC.4000.11. На ФІГ. 18 проілюстрований ефект зниження навантаження зовнішніх ферментів на виходи глюкози з попередньо оброблених трансгенних рослин XynA.2015.05T1 (зафарбоване коло), XynB.2063.17 (зафарбований трикутник) і контрольної рослини TGC.2004.8.04 (зафарбований квадрат) після гідролізу при знижуваному навантаженні ферментом: повний коктейль #1 (FCt), 75 % повний коктейль #1 (0,75 FCt), 50 % повний коктейль #1 (0,50 FCt), 25 % повний коктейль #1 (0,25 FCt), 10 % повний коктейль #1 (0,10 FCt), і без ферментів (0 FCt). На ФІГ. 19 проілюстрований ефект зниження навантаження зовнішніх ферментів на вихід глюкози з трансгенних рослин XynE/EGC/CBHA.2339.03, XynE/EGC/CBHA.2339.04 і XynE/EGC/CBHA.2339.05 і контрольної рослини BxA. Попередню обробку проводили з використанням 0,17M бісульфіту амонію і карбонату амонію (pН 8,1) при 75 °C, при співвідношенні рідини і твердої речовини, що дорівнює 10, протягом 16 годин. Ферментативний гідроліз проводили при вмісті твердих речовин приблизно 2 % без ферментів (NCt; білий (ліворуч)), з 20 % повним коктейлем (0,2 FCt; сірий (середина)) і з повним коктейлем Accellerase® 1500/XY при 0,2 мл/0,1 мл на грам соломи (FCt; чорний (праворуч)) при 50 °C і pН 5,0 протягом 3 діб. На ФІГ. 20A, 20B проілюстрований вихід глюкози і ксилози, відповідно, з попередньо оброблених рослин, експресуючих ксиланазу A і ендоглюканазу (XynA/EGA.2309.54 і XynA/EGA2309.107), у порівнянні з попередньо обробленою нетрансгенною контрольною рослиною (BxA) після ферментативного гідролізу при повному навантаженні коктейлем ферментів Accelerase®1500/XY (FCt; чорний (праворуч)), 20 % навантаженні коктейлем (0,2 FCt; сірий (середина на ФІГ. 20A і праворуч на ФІГ. 20B)) і без ферментів (NCt; білий (ліворуч на ФІГ. 20A)). На ФІГ. 21A, 21B проілюстрований ефект зниження навантаження зовнішніми ферментами на вихід глюкози (ФІГ. 21A) і ксилози (ФІГ. 21B) із трансгенних рослин EGA/XynA.2242.09.16, CBHA.2069.01.03 і контрольної рослини TGC.4000.11 після ферментативного гідролізу повним коктейлем при 0,2 мл Accellerase® 1500 на грам соломи + 0,1 мл Accellerase® XY на грам соломи (FCt;), 80 % повним коктейлем: 0,16 мл Accellerase® 1500 на грам соломи + 0,08 мл Accellerase® XY на грам соломи (0,8 FCt), 60 % повним коктейлем: 0,12 мл Accellerase® 1500 на грам соломи + 0,06 мл Accellerase® XY на грам соломи (0,6 FCt), 40 % повним коктейлем: 0,08 мл Accellerase® 1500 на грам соломи + 0,04 мл Accellerase® XY на грам соломи (0,4 FCt), 20 % повним коктейлем: 0,04 мл Accellerase® 1500 на грам соломи + 0,02 мл Accellerase® XY на грам соломи (0,2 FCt) і без ферментів (OFCt). На ФІГ. 22 проілюстроване продукування етанолу при одночасному оцукрюванні і ферментації (SSF) попередньо оброблених трансгенних рослин EGA.2049.10 і EGA/XynA.2242.09 проти контрольних рослин з використанням 1) коктейлів ферментів Accellerase® 1500 і Accellerase® XY; і 2) штами дріжджів Saccharomyces cerevisiae D5A. На ФІГ. 23 проілюстроване розчинення біомаси в розрахунку на зниження маси в трансгенній рослині, експресуючій екзоглюканазу CBHA (CBHA.2069.3.17; білий), і контрольній рослині дикого типу (AxB; сірий). На ФІГ. 24A, 24B проілюстрований вихід оцтової кислоти (HAc) з нетрансгенної контрольної рослини (AxB; ФІГ. 24A) і трансгенної рослини, експресуючої екзоглюканазу CBHA 4 UA 112643 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (CBHA.2063.3.17; ФІГ. 24B). Обробку проводили при 75 °C протягом 16 годин (білий (ліворуч)); 85 °C протягом 7 годин (стовпчики в смужку (у середині)) і 95 °C (у клітинку (праворуч)). На ФІГ. 25A, 25B проілюстрований вихід продуктів деградації цукрів гідроксиметилфурфуралю (HMF) і фурфуралю з нетрансгенної контрольної рослини (AxB; ФІГ. 25A) і трансгенної рослини, експресуючої екзоглюканазу CBHA (CBHA.2063.3.17). Обробка, зазначена для білих стовпчиків, стовпчиків у смужку або у клітинку, була наступною зліва направо: білий, HMF_75 °C протягом 16 годин; у смужку, HMF_85 °C протягом 7 годин; у клітинку, HMF_95 °C протягом 16 годин; у смужку, фурфураль_95 °C протягом 16 годин). На ФІГ. 26 проілюстрований вихід ксилози з трансгенної рослини, експресуючої ксиланазу B окремо (XynB.2063.15), трансгенної рослини, експресуючої ксиланазу A і два допоміжних ферменти A і B (XynA/AccA/B.2096.1), і нетрансгенної контрольної рослини (WT AxB) після попередньої обробки 0,17M бісульфітом амонію і карбонатом амонію (BSC; pН 8,1) і аутогідролізу. Вихід ксилози оцінювали для ксилози як мономера (чорний (праворуч)) і ксилози як олігосахариду (сірий (ліворуч)). На ФІГ. 27 проілюстровані виходи ксилози з двох трансгенних рослин, експресуючих ксиланазу B, ендоглюканазу і CBHB (XynB/EGA/CBHB.2349.56 і XynB/EGA/CBHB.2349.55), трансгенної рослини, експресуючої ксиланазу B, ендоглюканазу і CBHA (XynB/EGA/CBHA.2345.116), і нетрансгенної контрольної рослини (AxB) після попередньої обробки 0,17M бісульфітом амонію і 0,165M карбонатом амонію (BSC; pН 8,1) і аутогідролізу. На ФІГ. 28A, 28B проілюстровані виходи глюкози і ксилози, відповідно, з попередньо оброблених трансгенних рослин з використанням Accellerase® XY. EGA/XynA.2242.09T1 (зафарбоване коло) одночасно експресувала ендоглюканазу і ксиланазу A, і трансгенна контрольна рослина являла собою TGC.4000 (зафарбований квадрат). На ФІГ. 28C, 28D представлені, відповідно, виходи глюкози і ксилози з XynB/EGA/CBHB.2349.55 (незафарбоване коло), XynB/EGA/CBHB.2349.229 (зафарбований трикутник, вершиною нагору) і XynB/EGA/CBHB.2349.56 (зафарбований трикутник, вершиною вниз), кожна з яких одночасно експресувала ендоглюканазу A, ксиланазу B і целобіогідролазу B, і iXynA.2329.14, що експресувала модифіковану інтеїном ксиланазу A, і контрольної рослини дикого типу AxB. ДОКЛАДНИЙ ОПИС ПЕРЕВАЖНИХ ВАРІАНТІВ ЗДІЙСНЕННЯ Визначену термінологію використовують в подальшому описі тільки для зручності і не для обмеження. Слова "правий", "лівий", "верх" і "низ" позначають напрямки на кресленнях або у конкретних прикладах, на які наводиться посилання. Форму однини, як використовують у формулі винаходу й у відповідних частинах опису, визначають як таку, що включає один або декілька зі згадуваних об'єктів, якщо немає інших конкретних указань. Вираз "щонайменше один" з наступним переліком двох або більше об'єктів, таким як "A, B або C", означає будь-який окремий з A, B або C, а також будь-яку їх комбінацію. Варіанти здійснення в рамках даного винаходу передбачають технології для експресії набору білків, деградуючих клітинну стінку (CWD), у рослині. Білки CWD можуть являти собою ферменти CWD або модифіковані форми ферментів CWD. Модифіковані форми можуть являти собою модифіковані інтеїном білки CWD. Рослина може являти собою кукурудзу, сорго, просо або іншу рослину. Варіанти здійснення в рамках даного винаходу передбачають збирання рослинної біомаси з білками CWD у рослині для застосування як сировини для одержання цукру. При експресії ферментів у рослині рослина використовується як "фабрика" замість мікробної ферментації для одержання промислових ферментів CWD. Ця стратегія має перевагу, яка полягає в доставці білків безпосередньо в сировину біомаси для продукування ферментованих цукрів. Для біомаси трансгенної рослини з гідролітичними ознаками може не вимагатися жорстка попередня обробка з метою підвищення доступності целюлози клітинної стінки для екзогенних ферментів. Експресія різних класів білків CWD в одній рослині може забезпечити низьковитратну основу цукрів для виробництва біопалива біохімічних речовин. Варіанти здійснення в рамках даного винаходу передбачають способи продукування розчинних цукрів з використанням м'якої хімічної попередньої обробки лігноцелюлозної біомаси, що походить з рослин, модифікованих способами генетичної інженерії так, щоб вони включали один або декілька типів білка CWD. Один варіант здійснення передбачає спосіб одержання розчинних цукрів з одержаного способами генної інженерії рослинного матеріалу. Спосіб може включати попередню обробку одержаного способами генної інженерії рослинного матеріалу шляхом змішування з перетворюючим у пульпу складом, формуючи суміш. Одержаний способами генної інженерії рослинний матеріал може включати першу полінуклеотидну послідовність, кодуючу перший білок. Перший білок може являти собою фермент CWD. Перший білок може являти собою 5 UA 112643 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 модифікований інтеїном фермент CWD. Перший білок може являти собою ксиланазу, ендоглюканазу, екзоглюканазу, ферулоїлестеразу, модифіковану інтеїном ксиланазу, модифіковану інтеїном ендоглюканазу, модифіковану інтеїном екзоглюканазу або модифіковану інтеїном ферулоїлестеразу. Перший білок може бути здатний здійснювати гідроліз компонента одержаного способами генної інженерії рослинного матеріалу. Є здатним гідролізувати компонент означає, що перший білок каталізує гідроліз компонента в умовах гідролізу. У випадку модифікованого інтеїном першого білка, наявність здатності гідролізувати компонент означає, що після видалення сплайсингом інтеїну з пептиду білок може гідролізувати компонент в умовах гідролізу. Крім того, спосіб може включати надання умов гідролізу. Умови гідролізу можуть бути придатні для гідролізу компонента. Одержаний способами генної інженерії рослинний матеріал, крім того, може включати другу полінуклеотидну послідовність, кодуючу другий білок. Другий білок може являти собою білок CWD. Другий білок може являти собою модифікований інтеїном білок CWD. Другий білок може являти собою ксиланазу, ендоглюканазу, екзоглюканазу, ферулоїлестеразу, модифіковану інтеїном ксиланазу, модифіковану інтеїном ендоглюканазу, модифіковану інтеїном екзоглюканазу або модифіковану інтеїном ферулоїлестеразу. Білок, вибраний як другий білок, може являти собою білок, відмінний від білка, вибраного як перший білок. Другий білок може бути здатний здійснювати гідроліз компонента одержаного способами генної інженерії рослинного матеріалу. Є здатним гідролізувати компонент означає, що другий білок каталізує гідроліз компонента в умовах гідролізу. У випадку модифікованого інтеїном другого білка, наявність здатності гідролізувати компонент означає, що, після видалення інтеїну сплайсингом з пептиду, білок може гідролізувати компонент в умовах гідролізу. Одержаний способами генної інженерії рослинний матеріал, крім того, може включати третю полінуклеотидну послідовність, кодуючу третій білок. Третій білок може являти собою білок CWD. Третій білок може являти собою модифікований інтеїном білок CWD. Третій білок може являти собою ксиланазу, ендоглюканазу, екзоглюканазу, ферулоїлестеразу, модифіковану інтеїном ксиланазу, модифіковану інтеїном ендоглюканазу, модифіковану інтеїном екзоглюканазу або модифіковану інтеїном ферулоїлестеразу. Білок, вибраний як третій білок, може відрізнятися від білка, вибраного як перший білок. Білок, вибраний як третій білок, може відрізнятися від білка, вибраного як другий білок. Третій білок може бути здатний гідролізувати компонент одержаного способами генної інженерії рослинного матеріалу. Є здатним гідролізувати компонент означає, що третій білок каталізує гідроліз компонента в умовах гідролізу. У випадку модифікованого інтеїном третього білка, наявність здатності гідролізувати компонент означає, що, після видалення інтеїну сплайсингом з пептиду, білок може гідролізувати компонент в умовах гідролізу. Одержаний способами генної інженерії рослинний матеріал належить до трансгенної рослини, потомства трансгенної рослини, низхідного родича трансгенної рослини або частини будь-якого з вищевказаних. Одержаний способами генної інженерії рослинний матеріал може включати фермент, деградуючий клітинну стінку, що не зустрічається в природі в рослині, або ген, кодуючий його. Одержаний способами генної інженерії рослинний матеріал може являти собою трансгенну рослину, експресуючу білок CWD, або будь-яку частину трансгенної рослини. Одержаний способами генної інженерії рослинний матеріал може являти собою будь-яку трансгенну рослину, експресуючу модифіковану форму білка CWD, або будь-яку частину трансгенної рослини. Трансгенна рослина може являти собою рослину будь-якого типу. Тип трансгенної рослини може являти собою, але не обмежуватися ними, кукурудзу, цукровий буряк, цукрову тростину, сорго, просо, міскантус, евкаліпт, вербу або тополю. Одержаний способами генної інженерії рослинний матеріал може являти собою цілу трансгенну рослину або частини рослини. Частини можуть являти собою, але не обмежуватися ними, листи, стебла, квітки, бруньки, пелюстки, зав'язі, плоди або насіння. Одержаний способами генної інженерії рослинний матеріал може являти собою калюс із трансгенної рослини. Одержаний способами генної інженерії рослинний матеріал може бути таким, що регенерував з частин трансгенної рослини або рослин. Одержаний способами генної інженерії рослинний матеріал може являти собою продукт статевого схрещування першої трансгенної рослини і другої трансгенної рослини або нетрансгенної рослини, де рослина-продукт зберігає полінуклеотидну послідовність, введену в першу трансгенну рослину. Трансгенна рослина може являти собою будь-яку з трансгенних рослин, передбачених у рамках даного винаходу. Трансгенна рослина може включати будь-який вектор, касету експресії або виділену нуклеїнову кислоту або їх фрагмент. Змішування одержаного способами генної інженерії рослинного матеріалу з перетворюючим у пульпу складом можна проводити за допомогою будь-якого комбінування одержаного 6 UA 112643 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 способами генної інженерії рослинного матеріалу з перетворюючим у пульпу складом. Змішування можна проводити шляхом струшування. Перетворюючий у пульпу склад може являти собою речовину, яка руйнує лігнін, що зв'язує одне з одним лігноцелюлозні волокна в лігноцелюлозному рослинному матеріалі. Речовина може руйнувати лігнін без суттєвої деградації лігноцелюлозних волокон. Попередня обробка може приводити до часткового вивільнення ферментів, експресованих у модифікованих способами генетичної інженерії рослинах, і часткової деградації лігніну в лігноцелюлозному рослинному матеріалі. Спосіб може включати активацію білка CWD до, у ході або після попередньої обробки. Спосіб може включати активацію білка CWD до, у ході або після забезпечення умов гідролізу. Активований білок CWD може являти собою перший білок, другий білок або третій білок, або будь-який додатковий фермент, що здійснює процесинг лігноцелюлози. Білок CWD можна модифікувати так, щоб він включав інтеїн. Інтеїн може бути злитий з ферментом CWD на кінці ферменту або у ферменті. Інтеїн може бути індукований до сплайсингу шляхом надання умов індукції. Умови індукції можуть являти собою конкретну температуру суміші. Умови індукції можуть являти собою температуру, забезпечену до, у ході або після однієї зі стадій попередньої обробки або забезпечення гідролізу. Модифіковані інтеїном ферменти й умови індукції сплайсингу інтеїнів, які можна використовувати як умови активації, описані в заявці США 10/886393, поданій 7 липня 2004 року, і PCT/US10/55746, поданій 5 листопада 2010 року, і PCT/US10/55669, поданій 5 листопада 2010 року, і PCT/US10/55751, поданій 5 листопада 2010 року, що включені в даний опис як посилання у повному обсязі. Компонент може являти собою будь-яку частину, для якої бажаний процесинг. Компонент може являти собою лігноцелюлозний матеріал. Компонент може являти собою субстрат для будь-якого білка CWD, наведеного в даному описі. Компонент може являти собою субстрат для ксиланази, ендоглюканази, екзоглюканази, ферулоїлестерази. Компонент може являти собою частину, що включає субстрат для будь-якого білка CWD, наведеного в даному описі. Компонент може являти собою частину, що включає субстрат для ксиланази, ендоглюканази, екзоглюканази, ферулоїлестерази. Спосіб також може включати додавання іншого рослинного матеріалу до, у ході або після змішування, попередньої обробки або надання умов гідролізу. Інший рослинний матеріал може являти собою будь-яку рослинну біомасу, целюлозний або лігноцелюлозний матеріал, відмінний від одержаного способами генної інженерії рослинного матеріалу. Інший рослинний матеріал може бути з установки по переробці біомаси. Інший рослинний матеріал може включати залишки лісівництва і сільськогосподарські залишки. Залишки лісівництва і сільськогосподарські залишки можуть являти собою, але не обмежуватися ними, кукурудзяну солому, макуху, пшеничну солому, відходи деревини, деревні обрізки, макулатуру і муніципальні тверді відходи (MSW). Інший рослинний матеріал може являти собою будь-яку енергетичну сільськогосподарську культуру. Енергетична сільськогосподарська культура може являти собою, але не обмежуватися ними, просо, сорго, цукровий буряк, цукрову тростину, міскантус і тополю. Полінуклеотидна послідовність, кодуюча перший білок, другий білок, третій білок або будьякий додатковий фермент, може бути функціонально зв'язана з регуляторною послідовністю. У цьому контексті, функціонально зв'язаний означає, що регуляторний елемент передає свою функцію полінуклеотидній послідовності. У випадку регуляторного елемента, що являє собою промотор, промотор здатний контролювати експресію з полінуклеотидної послідовності, коли вони функціонально зв'язані. У випадку регуляторного елемента, що є термінатором, термінатор здатний здійснювати термінацію транскрипції з полінуклеотидної послідовності. Необмежувальні приклади регуляторних елементів представлені нижче. Щонайменше один з першого білка, другого білка або третього білка може являти собою, але не обмежуватися ними, фермент, вибраний з XynA: бета-1,4-ксиланаза 229B з Dictyoglomus thermophilum (номер доступу Uniprot P77853); XynB: ендо-1,4-бета-ксиланаза з Thermomyces lanuginosus (номер доступу Uniprot О43097); EGA: ендо-бета-1,4-ендоглюканаза з Nasutitermes takasagoensis (номер доступу Uniprot О77044); EGB: ендо-бета-1,4-ендоглюканаза з Acidothermus cellulolyticus (номер доступу Uniprot P54583); AccA: ферулоїлестераза A з Apergillus niger (номер доступу Uniprot О42807); AccB: ферулоїлестераза B з Aspergillus niger (номер доступу Uniprot Q8WZI8); AccA/B: ферулоїлестераза A і ферулоїлестераза B з Aspergillus niger, EGC: ендо-бета-1,4-ендоглюканаза з Rhodothermus marinus (номер доступу Uniprot О33897); P40942: бета-1,4-ксиланаза з Clostridium stercorarium F9 (номер доступу Uniprot P40942); P40943: бета-1,4-ксиланаза з Geobacillus stearothermophilus T-6 (Bacillus stearothermophilus; номер доступу Uniprot P40943); О30700: бета-1,4-ксиланаза з Bacillus sp. 7 UA 112643 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 NG-27 (номер доступу Uniprot О30700); CBHA: целобіогідролаза A з Clostridium thermocellum (номер доступу Uniprot О68438); CBHB: целобіогідролаза B (SYT BD22308); або XynE: ксиланаза (EU591743). Перший білок може включати, по суті складатися або складатися з амінокислотної послідовності з щонайменше 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або 100 % ідентичністю з референсною послідовністю, вибраною з групи, що складається з: SEQ ID NO: 1 [WT P77853], SEQ ID NO: 2 [AnfaeA], SEQ ID NO: 3 [AnfaeB], SEQ ID NO: 4 [NtEGm], SEQ ID NO: 5 [EU591743], SEQ ID NO: 6 [О43097], SEQ ID NO: 7 [P77853:T134-100-101], SEQ ID NO: 8 [P77853:S158-30-108-35], SEQ ID NO: 9 [О33897], SEQ ID NO: 10 [О68438] і SEQ ID NO: 11 [P54583]. Перший білок може включати, по суті складатися або складатися з амінокислотної послідовності з щонайменше 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або 100 % ідентичністю з референсною послідовністю SEQ ID NO: 12 [BD22308]. Другий білок може включати, по суті складатися або складатися з амінокислотної послідовності з щонайменше 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або 100 % ідентичністю з другою референсною послідовністю, вибраною з групи, що складається з: SEQ ID NO: 1 [WT P77853], SEQ ID NO: 2 [AnfaeA], SEQ ID NO: 3 [AnfaeB], SEQ ID NO: 4 [NtEGm], SEQ ID NO: 5 [EU591743], SEQ ID NO: 6 [О43097], SEQ ID NO: 7 [P77853:T134-100-101], SEQ ID NO: 8 [P77853:S158-30-108-35], SEQ ID NO: 9 [O33897], SEQ ID NO: 10 [O68438] і SEQ ID NO: 11 [P54583]. Другий білок може включати, по суті складатися або складатися з амінокислотної послідовності з щонайменше 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або 100 % ідентичністю з референсною послідовністю SEQ ID NO: 12 [BD22308]. Третій білок може включати, по суті складатися або складатися з амінокислотної послідовності з щонайменше 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 97, 98, 99 або 100 % ідентичністю з третьою референсною послідовністю, вибраною з групи, що складається з SEQ ID NO: 1 [WT P77853], SEQ ID NO: 2 [AnfaeA], SEQ ID NO: 3 [AnfaeB], SEQ ID NO: 4 [NtEGm], SEQ ID NO: 5 [EUS91743], SEQ ID NO: 6 [О43097], SEQ ID NO: 7 [P77853:T134-100-101], SEQ ID NO: 8[P77853:S158-30-108-35], SEQ ID NO: 9 [O33897], SEQ ID NO: 10 [O68438] і SEQ ID NO: 11 [P54583]. Третій білок може включати, по суті складатися або складатися з амінокислотної послідовності з щонайменше 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або 100 % ідентичністю з референсною послідовністю SEQ ID NO: 12 [BD22308]. Щонайменше одна з першої полінуклеотидної послідовності, другої полінуклеотидної послідовності або третьої полінуклеотидної послідовності може додатково включати першу націлюючу полінуклеотидну послідовність, кодуючу відповідний націлюючий пептид. Для одержаного способами генної інженерії рослинного матеріалу, позбавленого третьої полінуклеотидної послідовності, перша націлююча полінуклеотидна послідовність може бути включена в щонайменше одну з першої полінуклеотидної послідовності або другої полінуклеотидної послідовності. Для одержаного способами генної інженерії рослинного матеріалу, позбавленого другої полінуклеотидної послідовності і третьої полінуклеотидної послідовності, перша націлююча полінуклеотидна послідовність може бути включена в першу полінуклеотидну послідовність. Кожен відповідний націлюючий пептид може бути незалежно вибраний для кожної з першої, другої або третьої полінуклеотидної послідовності. Націлюючий пептид може бути злитим з першим білком, другим білком або третім білком. Кожен відповідний націлюючий пептид може бути незалежно вибраний з, але не обмежуючись ними, націлюючого на амілопласт сигналу, націлюючого на клітинну стінку пептиду, націлюючого на мітохондрії пептиду, сигналу локалізації в цитозолі, націлюючого на хлоропласти сигналу, націлюючого в ядро пептиду і націлюючого на вакуоль пептиду. Перший націлюючий полінуклеотид може бути розташований вище першої полінуклеотидної послідовності, другої полінуклеотидної послідовності або третьої полінуклеотидної послідовності. Націлюючий пептид може мати щонайменше 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, або 100 % ідентичність з однією з SEQ ID NO: 13 [BAASS], послідовності алейрону ячменю SEQ ID NO: 14 [HVAlePS], SEQ ID NO: 15 [PR1a], SEQ ID NO: 16 [послідовність гамма-зеїну xGZein27ss-02] або SEQ ID NO: 17 [Glu B4SP]. Перша націлююча полінуклеотидна послідовність у комбінації з однією з першої полінуклеотидної послідовності, другої полінуклеотидної послідовності або третьої полінуклеотидної послідовності разом можуть кодувати амінокислотну послідовність із щонайменше 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або 100 % ідентичністю з референсною послідовністю, вибраною з групи, що складається з: SEQ ID NO: 18 [BAASS:P77853], SEQ ID NO: 19 [BAASS:O33897], SEQ ID NO: 20 [HVAlePS:NtEGm] і SEQ ID NO: 21 [BAAS:P77853:S158-30-108-35]. 8 UA 112643 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Щонайменше одна з першої полінуклеотидної послідовності, другої полінуклеотидної послідовності або третьої полінуклеотидної послідовності, крім того, може включати другу націлюючу полінуклеотидну послідовність, кодуючу карбоксинацілюючий пептид. Для одержаного способами генної інженерії рослинного матеріалу, позбавленого третьої полінуклеотидної послідовності, друга націлююча полінуклеотидна послідовність може бути включена в щонайменше одну з першої полінуклеотидної послідовності або другої полінуклеотидної послідовності. Для одержаного способами генної інженерії рослинного матеріалу, позбавленого другої полінуклеотидної послідовності і третьої полінуклеотидної послідовності, друга націлююча полінуклеотидна послідовність може бути включена в першу полінуклеотидну послідовність. Карбоксинацілюючий пептид може бути вибраний з, але не обмежуючись ними, послідовності, що має щонайменше 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або 100 % ідентичність з однією з SEQ ID NO: 22 [SEKDEL], укороченої SEQ ID NO: 23 [KDEL] або послідовності, що визначає вакуолярне сортування ячменю SEQ ID NO: 24 [HvVSD-01]. Карбоксинацілюючий пептид може бути злитий із щонайменше одним з першого білка, другого білка або третього білка. Щонайменше один з першого білка, другого білка або третього білка може бути наданий без націлюючого пептиду для накопичення в цитоплазмі. Перша націлююча полінуклеотидна послідовність і друга націлююча полінуклеотидна послідовність у комбінації з однією з першої полінуклеотидної послідовності, другої полінуклеотидної послідовності або третьої полінуклеотидної послідовності разом можуть кодувати амінокислотну послідовність з щонайменше 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або 100 % ідентичністю з референсною послідовністю, вибраною з групи, що складається з: SEQ ID NO: 25 [BAASS:AnfaeB:SEKDEL], SEQ ID NO: 26 [BAASS:AnfaeA:SEKDEL], SEQ ID NO: 27 [PR1a:NtEGm:SEKDEL], SEQ ID NO: 28 [BAASS:P77853:T134-100-101:SEKDEL], SEQ ID NO: 29 [HvAleSP:NtEGm:SEKDEL], SEQ ID NO: 30 [BAASS:O43097:SEKDEL] і SEQ ID NO: 31 [xGZein27ss-02:BD22308:HVVSD-01]. Щонайменше одна з першої, другої або третьої полінуклеотидної послідовності може кодувати "варіант" білка CWD. Амінокислотна послідовність варіанта білка CWD може відрізнятися делеціями, вставками, замінами амінокислотних послідовностей або іншими модифікаціями білка CWD. Варіант білка CWD може зберігати біологічну активність білка CWD. Зберігати біологічну активність, як використовують у рамках винаходу, означає, що варіант має щонайменше 60 % активності білка CWD, з якого він походить. Активність ксиланази можна оцінювати в аналізі з використанням субстрату Xylazyme AX, як розкрито в даному описі в підрозділі прикладу 1 даного опису за назвою "Аналіз ферментів соломи". Активність ендоглюканази можна оцінювати з використанням субстрату Cellazyme, як розкрито в даному описі в підрозділі прикладу 1 даного опису за назвою "Аналіз ферментів соломи". Активність екзоглюканази можна оцінювати з використанням флуоресцентного 4-метилумбеліферил-b-Dлактопіранозиду (4-MU), як описано в Harrison M.D. et al. 2011, "Accumulation of recombinant cellobiohydrolase and endogluconase in the leaves of mature transgenic sugar cane", Plant Biotechnology Journal, 9:884-896, включеній в даний опис як посилання в повному обсязі. Активність ферулоїлестерази можна оцінювати з використанням аналізу з використанням міченого pNP ферулату як субстрату (як описано в Hegde S. et al. 2009, "Single-step synthesis of 4-nitrophenyl ferulate for spectrophotometric assay of feruloyl esterases", Analytical Biochemistry, 387(1):128-129). Представлені вище випробування активності ксиланази, ендоглюканази, екзоглюканази або ферулоїлестерази можна використовувати для визначення того, чи є послідовність з менше ніж 100 % ідентичністю з деградуючою CWD білковою послідовністю, розкритою в даному описі, варіантом деградуючого CWD білка. Амінокислотну послідовність варіантів білка CWD, розкритих у даному описі, можна модифікувати відносно білка CWD, виходячи з подібності в гідрофобності, гідрофільності, розчинності, полярності амінокислотних залишків. Варіанти білка CWD, розкриті в даному описі, можуть відрізнятися після посттрансляційних модифікацій. Посттрансляційна модифікація, що забезпечує відмінність, може являти собою, але не обмежуватися ними, глікозилування, ацетилювання або фосфорилування. Варіант може бути одержаний за допомогою будь-яких засобів. Варіант може бути розроблений за допомогою сайт-направленного мутагенезу або ненаправленого мутагенезу. Для створення мутантів білка CWD, розкритого в даному описі, можна використовувати ПЛР зі зниженою точністю, і будь-який з аналізів, описаних вище, можна використовувати для оцінки того, чи є мутант варіантом. Варіанти здійснення включають щонайменше один з першого білка, другого білка або третього білка, або їх варіантів, злитий з варіантами щонайменше одного з націлюючого пептиду або карбоксинацілюючого пептиду. Варіанти націлюючого пептиду або 9 UA 112643 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 карбоксинацілюючого пептиду будуть націлювати білок, з яким вони злиті, у ту ж область, що і референсна послідовність націлюючого пептиду або карбоксинацілюючого пептиду. Варіанти інтеїну можуть бути надані в першому білку, другому білку або третьому білку. Варіант інтеїну може видалятися шляхом сплайсингу з білка, з яким він злитий. Визначення процентної ідентичності двох амінокислотних послідовностей або двох послідовностей нуклеїнових кислот може включати вирівнювання і порівняння амінокислотних залишків або нуклеотидів у відповідних положеннях у двох послідовностях. Якщо всі положення в двох послідовностях зайняті ідентичними амінокислотними залишками або нуклеотидами, тоді послідовності називають ідентичними на 100 %. Процентну ідентичність можна вимірювати за допомогою алгоритму Smith Waterman (Smith T.F., Waterman M.S. 1981, "Identification of Common Molecular Subsequences", J. Mol. Biol. 147:195-197, що включена в даний опис як посилання в повному обсязі). В одному варіанті здійснення полінуклеотидна послідовність, кодуюча білок, що має менше ніж 100 % ідентичність з цитованою амінокислотною референсною послідовністю, може кодувати варіант білка, що має референсну амінокислотну послідовність. В одному варіанті здійснення білок, що має менше ніж 100 % ідентичність з цитованою референсною амінокислотною послідовністю, може являти собою варіант білка, що має референсну амінокислотну послідовність. В одному варіанті здійснення полінуклеотидна послідовність, кодуюча білок, що має менше ніж 100 % ідентичність з білком, кодованим цитованою референсною послідовністю нуклеїнової кислоти, може кодувати варіант білка, кодованого референсною послідовністю. Посилаючись на ФІГ. 1, проілюстрований спосіб одержання розчинних цукрів з одержаного способами генної інженерії рослинного матеріалу. На ФІГ. 1 представлена схема технологічного процесу для об'єднаної попередньої обробки і гідролізу одержаного способами генної інженерії рослинного матеріалу. Одержаний способами генної інженерії рослинний матеріал або одержаний способами генної інженерії рослинний матеріал, змішаний з іншим рослинним матеріалом, можна додавати через подавальний пристрій 10 у реактор 20 для хімічної попередньої обробки і ферментативного розрідження; тобто способу конверсії твердої лігноцелюлозної біомаси в розріджений стан, придатний для подальшої обробки і гідролізу. У реакторі 20 одержаний способами генної інженерії рослинний матеріал або одержаний способами генної інженерії рослинний матеріал, змішаний з іншим рослинним матеріалом, можна змішувати з перетворюючим у пульпу складом. Перетворюючий у пульпу склад може включати щонайменше одну частину, що має іон, вибраний із групи, що складається з: сульфіту, бісульфіту, сульфату, карбонату, гідроксиду й оксиду. Щонайменше одна частина може додатково включати, але не обмежуватися ними, протиіон, вибраний із групи, що складається з: амонію, натрію, магнію і кальцію. Щонайменше одна частина може являти собою 2сіль. Сіль може являти собою, але не обмежуватися ними, сульфіт (SO 3 ), бісульфіт (HSO3 ), 2оксид (O ) і гідроксид (OH ). Сіль може включати протиіон. Протиіон може являти собою, але не + 2+ + 2+ + обмежуватися ними, натрій (Na ), кальцій (Ca ), водень, калій (K ), магній (Mg ) і амоній (NH4 ). Перетворюючий у пульпу склад може включати щонайменше одне з оксиду кальцію (CaО), вапна або гідроксиду кальцію (Ca(OH)2), гашеного вапна. В одному варіанті здійснення перетворюючий у пульпу склад може включати щонайменше один з бісульфіту амонію і карбонату амонію. Бісульфіт амонію може бути в концентрації від 0,02 до 0,35M, і карбонат амонію може бути в концентрації від 0,025 до 0,25M. Перетворюючий у пульпу склад можна змішувати з одержаним способами генної інженерії рослинним матеріалом або одержаним способами генної інженерії рослинним матеріалом, змішаним з іншим рослинним матеріалом, при оптимальному співвідношенні рідини і твердої речовини в суміші. Суміш може мати співвідношення рідини і твердої речовини, вибране з величини, що менше або дорівнює одному з 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 або 1, або будь-якої іншої величини в діапазоні між будь-якими двома з зазначених вище (включаючи граничні значення). Наприклад, співвідношення рідини і твердої речовини може являти собою величину, меншу ніж будь-яке ціле або неціле число, вибране з від 3 до 7. Співвідношення рідини і твердої речовини може дорівнювати 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 або 1, або будь-якій величині в діапазоні між будь-якими двома з зазначених вище величин (включаючи граничні значення). Наприклад, співвідношення рідини і твердої речовини може являти собою будь-яке ціле або неціле число в діапазоні від 3 до 7. Попередня обробка може включати інкубацію суміші протягом будь-якого періоду часу. Попередня обробка може включати інкубацію суміші протягом аж до 16 годин. Інкубацію можна проводити протягом більш тривалих або більш коротких періодів часу. Попередня обробка 10 UA 112643 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 може включати інкубацію суміші протягом періоду часу, що менше або дорівнює одному з 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 або 1 години. Попередня обробка може включати забезпечення температури суміші від 40 °C до 95 °C. Температура суміші від 40 °C до 95 °C може дозволяти руйнування або видалення частин лігніну в лігноцелюлозному матеріалі в суміші без інактивації гідролітичних ферментів. Попередня обробка може включати забезпечення температури суміші 55 °C, 65 °C, 75 °C, 95 °C, менше 55 °C, менше 65 °C, менше 75 °C, менше 95 °C, менше 100 °C, від 40 °C до 55 °C, від 40 °C до 65 °C, від 40 °C до 75 °C, від 40 °C до 95 °C, від 40 °C до менше ніж 100 °C, від 55 °C до 65 °C, від 55 °C до 75 °C, від 55 °C до 95 °C, від 55 °C до менше ніж 100 °C, від 65 °C до 75 °C, від 65 °C до 95 °C, від 65 °C до менше ніж 100 °C, від 75 °C до 95 °C, від 75 °C до менше ніж 100 °C або від 95 °C до менше ніж 100 °C. Попередня обробка може включати забезпечення pН суміші в діапазоні від 5,0 до 10. Попередня обробка може включати забезпечення pН суміші в діапазоні від 6,5 до 8,5. Забезпечуване значення pН суміші може складати 5,0, 5,5, 6,0, 7,0, 7,5, 8,0, 9,0, 9,5 або 10, або pН у діапазоні між будь-якими двома з зазначених вище величин pН (включаючи граничні значення). pН суміші в ході попередньої обробки може залежати від типу використовуваної хімічної речовини і/або типу використовуваного рослинного матеріалу. Забезпечення pН суміші може включати додавання модифікуючої pН хімічної речовини. Модифікуюча pН хімічна речовина може являти собою кислоту або луг. Наприкінці стадії попередньої обробки суміш може включати рослинний матеріал, що частково деградував, і рідку фазу, називану частковим фільтратом, що може включати хімічні речовини з перетворюючого в пульпу складу і низьку концентрацію ферменту або ферментів CWD, що вивільняються з одержаного способами генної інженерії рослинного матеріалу. Спосіб може включати відділення часткового фільтрату від твердих речовин частково деградованого рослинного матеріалу в сепараторі 30. Розділення можна здійснювати різними шляхами. Розділення можна досягати шляхом осадження, фільтрації або центрифугування часткового фільтрату. Спосіб може включати щонайменше одне зі збирання або рециркуляції щонайменше частини часткового фільтрату в множинних раундах попередньої обробки. Після видалення часткового фільтрату концентрація твердих речовин у суміші може збільшуватися і вона може являти собою будь-яке ціле число або неціле число в діапазоні від 2 % до 15 % (мас./об.) або будь-який діапазон у межах двох цілих величин з діапазону від 2 % до 15 % (мас./об.). Спосіб може включати промивання попередньо обробленого одержаного способами генної інженерії рослинного матеріалу будь-якою придатною рідиною. Рідина може являти собою деіонізовану воду. Рідину можна видаляти центрифугуванням. Крім того, спосіб включає очищення за допомогою механічного подрібнювання, яке проводять в очисному пристрої 40, відомим способом, таким як, але не обмежується ними, дефібрилювання, помел або дроблення. Спосіб може включати перенесення очищеної попередньо обробленої біомаси в ємність 50 для оцукрювання. Гідроліз ферментом CWD, вивільненим з одержаного способами генної інженерії рослинного матеріалу, може відбуватися в ємності 5 для оцукрювання. Забезпечення умов гідролізу може включати доведення суміші до рівня твердих речовин 225 %, до рівня, що дорівнює будь-якому цілому або нецілому числу в межах від 2 % до 25 % твердих речовин (включаючи граничні значення), або до рівня, що дорівнює будь-якому цілому або нецілому числу в діапазоні між двома цілими числами в межах від 2 % до 25 % твердих речовин. Забезпечення умов гідролізу може включати інкубацію суміші протягом періоду часу аж до 144 годин, періоду часу, вибраного з будь-якого цілого або нецілого числа аж до 144 годин, або періоду часу в межах діапазону між будь-якими двома цілими числами від нуля й аж до 144 годин. Забезпечення умов гідролізу може включати забезпечення температури суміші 100 °C або менше, 65 °C або менше, 50 °C або менше, від 48 °C до 50 °C, від 48 °C до 65 °C, від 48 °C до менше ніж 100 °C або від 48 °C до 100 °C. Забезпечення умов гідролізу може включати забезпечення pН у діапазоні від 4,8 до 5,0, pН 4,8, pН 4,9 або pН 5,0. Можна вибирати щонайменше одне з температури, pН або часу обробки, виходячи зі специфічної активності ферменту CWD в одержаному способами генної інженерії рослинному матеріалі. Якщо одержаний способами генної інженерії рослинний матеріал включає множину ферментів CWD, умови, оптимальні для щонайменше одного з експресії, попередньої обробки або гідролізу кожним з множини ферментів CWD, можуть бути забезпечені послідовно. Умови гідролізу можуть включати забезпечення pН, оптимального для активності одного ферменту, а потім іншого pН, оптимального для активності іншого ферменту. Умови гідролізу можуть включати коректування температури в різні періоди часу для оптимальної активності кожного 11 UA 112643 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ферменту. Наприклад, для ксиланази може вимагатися інші температура або pН, ніж для ендоглюканази. Спосіб може включати додавання одного або декількох екзогенних ферментів до щонайменше одного з одержаного способами генної інженерії рослинного матеріалу, іншого рослинного матеріалу або суміші. Екзогенні ферменти можна додавати до, у процесі або після попередньої обробки. Екзогенні ферменти можна додавати до, у процесі або після забезпечення умов гідролізу. Екзогенні ферменти можна додавати в ємність 50 для оцукрювання. Один або декілька екзогенних ферментів можуть бути надані в коктейлі ферментів. Коктейль ферментів може включати один або декілька ферментів CWD. CWD, передбачений в одному варіанті здійснення в рамках даного винаходу, може являти собою, але не обмежуватися ними, фермент, що здійснює деградацію лігніну, фермент, що здійснює деградацію целюлози, або фермент, що здійснює деградацію геміцелюлози. Фермент CWD, передбачений в одному варіанті здійснення в рамках даного винаходу, може являти собою, але не обмежуватися ними, фермент, вибраний із глікозидаз, ксиланаз, целюлаз, ендоглюканаз, екзоглюканаз, целобіогідролаз, β-ксилозидаз, ферулоїлестераз і амілаз. Коктейль ферментів може включати целюлазу, виділену з Trichoderma reesii. Коктейль ферментів можна придбавати у постачальника. Коктейль ферментів може являти собою, але не обмежуватися ними, TM Accellerase 1000, Accellerase® 1500 і Accellerase® XY, доступні від Genencor International (Rochester, NY). Коктейль ферментів може являти собою Cellic. Коктейль ферментів може включати різні класи ферментів CWD. Можуть бути забезпечені оптимальні умови для різних класів ферментів CWD. Наприклад, температуру, pН і час обробки для гідролізу можна коректувати в процесі здійснення способу для забезпечення оптимальних умов для різних ферментів у коктейлі. Умови гідролізу можуть включати знижене навантаження зовнішніми ферментами, включеними в коктейль ферментів. Знижене навантаження може включати склади, що мають менше або позбавлені білка або білків CWD, експресованих в одержаному способами генної інженерії рослинному матеріалі. Наприклад, якщо трансгенна рослина експресує ксиланазу і ендоглюканазу, ці ферменти можна усувати з коктейлю ферментів, складеного для гідролізу одержаного способами генної інженерії рослинного матеріалу, що має трансгенну рослину. Ефективність гідролізу можна оцінювати шляхом вимірювання розчинності рослинного матеріалу. Способи вимірювання розчинності рослинного матеріалу відомі в даній галузі і можуть включати визначення концентрацій моносахаридів і дисахаридів, наприклад за допомогою високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ). Як розкрито в розділі "Приклади" даного опису, ВЕРХ можна проводити з використанням бінарного насоса Shimadzu LC-20 AD із програмним забезпеченням LC solutions (Shimadzu, Kyoto, Японія) і концентрацію цукру можна визначати з використанням колонки для визначення цукрів Aminex HPX-87P (Bio-Rad Laboratories). Доступні інші способи вимірювання розчинності рослинного матеріалу, наприклад, шляхом визначення зменшення маси, видалення лігніну або деацетилювання в попередньо обробленому рослинному матеріалі. Крім того, спосіб може включати контактування суміші і/або продуктів гідролізу з ферментуючим організмом з одержанням біохімічного продукту. Після ферментативного гідролізу розчинні цукри можна виділяти і використовувати для продукування біохімічного продукту. Альтернативно в способі можна проводити одночасне оцукрювання і ферментацію розчинних цукрів у біохімічний продукт. Біохімічний продукт може являти собою, але не обмежуватися ними, бутан, бутандіол, бутадієнт, бутанол, ізобутанол, пропан, пропандіол, пропіл, пропанол, ізопропанол, метан, метанол, етанол, фенол, гліцерин, етилен, толуол, етил, бензол, стирол, ксилол, етиленгліколь, оксид етилену, мурашину кислоту, діоксид вуглецю, формальдегід, ацетальдегід, ацетон, вітамін, етан, пентан, гексан, гептан, октан, бензол, оцтову кислоту, сорбіт, арабініт, бурштинову кислоту, фумарову кислоту, яблучну кислоту, фурандикарбонову кислоту, аспарагінову кислоту, глукарову кислоту, глутамінову кислоту, ітаконову кислоту, левулінову кислоту, гідроксибутиролактон, гліцерин, сорбіт, ксиліт, арабініт, глюконову кислоту, молочну кислоту, малонову кислоту, пропіонову кислоту, лимонну кислоту, аконітинову кислоту, ксилонову кислоту, фурфураль, левоглюкозан, аланін, пролін, лізин, серин або треонін (див. Werpy T. and Petersen G., Top Value Added Chemicals From Biomass, Volume 1, Results of Screening for Potential Candidates from Sugars and Synthesis Gas, August 2004, Report, PNNL & NREL, що включена в даний опис як посилання в повному обсязі). Спосіб може включати одночасне оцукрювання і ферментацію розчинних цукрів з одержанням етанолу. Одночасне оцукрювання і ферментація для одержання етанолу можуть включати надання Saccharomyces cerevisiae D5A до, у процесі або після попередньої обробки або забезпечення умов гідролізу. 12 UA 112643 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Конверсію цукрів у бажані біохімічні продукти можна проводити за допомогою будь-якого придатного ферментуючого організму. Ферментуючий організм можна вибирати, виходячи з бажаного біохімічного продукту. Ферментуючим організмом можуть бути дріжджі. Дріжджі можуть являти собою, але не обмежуватися ними, одні з Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Yarrowia, Spathaspora або Scheffersomyces ssp. Ферментуючим організмом може бути бактерія. Бактерія може являти собою, але не обмежуватися ними, Zymomonas, Escherichia, Bacillus, Lactobacillus або Clostridium ssp. Ферментуючий організм може являти собою організм дикого типу або модифікований способами генетичної інженерії рекомбінантний організм. Варіант здійснення включає одержану способами генної інженерії рослину, що включає першу полінуклеотидну послідовність, кодуючу перший білок. Перший білок може являти собою білок CWD. Перший білок може являти собою модифікований інтеїном білок CWD. Перший білок може являти собою будь-який білок, описаний відносно способу продукування розчинних цукрів з одержаного способами генної інженерії рослинного матеріалу. Перший білок може включати, по суті складатися або складатися з амінокислотної послідовності з щонайменше 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або 100 % ідентичністю з першою референсною послідовністю, вибраною із групи, що складається з: SEQ ID NO: 1 [WT P77853], SEQ ID NO: 2 [AnfaeA], SEQ ID NO: 3 [AnfaeB], SEQ ID NO: 4 [NtEGm], SEQ ID NO: 5 [EU591743], SEQ ID NO: 6 [O43097], SEQ ID NO: 7 [P77853:T134-100-101], SEQ ID NO: 8 [P77853:S158-30108-35], SEQ ID NO: 9 [O33897], SEQ ID NO: 10 [O68438] і SEQ ID NO: 11 [P54583]. Перший білок може включати, по суті складатися або складатися з амінокислотної послідовності з щонайменше 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або 100 % ідентичністю з референсною послідовністю SEQ ID NO: 12 [BD22308]. Одержана способами генної інженерії рослина, крім того, може включати другу полінуклеотидну послідовність, кодуючу другий білок. Другий білок може являти собою фермент CWD. Другий білок може являти собою модифікований інтеїном білок CWD. Другий білок може являти собою будь-який білок, описаний відносно способу одержання розчинних цукрів з одержаного способами генної інженерії рослинного матеріалу. Другий білок може включати, по суті складатися або складатися з амінокислотної послідовності з щонайменше 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або 100 % ідентичністю з другою референсною послідовністю, вибраною з групи, що складається з: SEQ ID NO: 1 [WT P77853], SEQ ID NO: 2 [AnfaeA], SEQ ID NO: 3 [AnfaeB], SEQ ID NO: 4 [NtEGm], SEQ ID NO: 5 [EU 591743], SEQ ID NO: 6 [O43097], SEQ ID NO: 7 [P77853:T134-100-101], SEQ ID NO: 8 [P77853:S158-30-108-35], SEQ ID NO: 9 [O33897], SEQ ID NO: 10 [O68438], SEQ ID NO: 11 [P54583] і SEQ ID NO: 12 [BD22308]. SEQ ID NO, вибрана як друга референсна послідовність, може відрізнятися від SEQ ID NO, вибраної як перша референсна послідовність. Одержана способами генної інженерії рослина, крім того, може включати третю полінуклеотидну послідовність, кодуючу третій білок. Третій білок може являти собою фермент CWD. Третій білок може являти собою модифікований інтеїном білок CWD. Третій білок може являти собою будь-який білок, описаний відносно способу одержання розчинних цукрів з одержаного способами генної інженерії рослинного матеріалу. Третій білок може включати, по суті складатися або складатися з амінокислотної послідовності з щонайменше 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або 100 % ідентичністю з третьою референсною послідовністю, вибраною з групи, що складається з: SEQ ID NO: 1 [WT P77853], SEQ ID NO: 2 [AnfaeA], SEQ ID NO: 3 [AnfaeB], SEQ ID NO: 4 [NtEGm], SEQ ID NO: 5 [EU591743], SEQ ID NO: 6 [O43097], SEQ ID NO: 7 [P77853:T134-100-101], SEQ ID NO: 8 [P77853:S158-30-108-35], SEQ ID NO: 9 [O33897], SEQ ID NO: 10 [O68438], SEQ ID NO: 11 [P54583] і SEQ ID NO: 12 [BD22308]. SEQ ID NO, вибрана як третя референсна послідовність, може відрізнятися від SEQ ID NO, вибраної як перша референсна послідовність. SEQ ID NO, вибрана як третя референсна послідовність, може відрізнятися від SEQ ID NO, вибраної як друга референсна послідовність. Щонайменше одна з першої полінуклеотидної послідовності, другої полінуклеотидної послідовності або третьої полінуклеотидної послідовності в одержаній способами генної інженерії рослині може додатково включати першу націлюючу полінуклеотидну послідовність, кодуючу відповідний націлюючий пептид. Для одержаної способами генної інженерії рослини, позбавленої третьої полінуклеотидної послідовності, перша націлююча полінуклеотидна послідовність може бути включена в щонайменше одну з першої полінуклеотидної послідовності або другої полінуклеотидної послідовності. Для одержаної способами генної інженерії рослини, позбавленої другої полінуклеотидної послідовності і третьої полінуклеотидної послідовності, перша націлююча полінуклеотидна послідовність може бути включена в першу полінуклеотидну послідовність. Відповідний націлюючий пептид може бути незалежно вибраний з, але не обмежуючись ними, націлюючого на амілопласт сигналу, 13 UA 112643 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 націлюючого на клітинну стінку пептиду, націлюючого на мітохондрії пептиду, сигналу локалізації в цитозолі, націлюючого на хлоропласти сигналу, націлюючого в ядро пептиду і націлюючого на вакуоль пептиду. Кожен відповідний націлюючий пептид може бути злитий з відповідним першим білком, другим білком або третім білком. Націлюючий пептид може мати щонайменше 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або 100 % ідентичність з однією з SEQ ID NO: 13 [BAASS], SEQ ID NO: 14 [HvAleSP], SEQ ID NO: 1 [PR1a] 5, SEQ ID NO: 16 [xGZein27ss-02] або SEQ ID NO: 17 [GluB4SP]. Щонайменше одна з першої полінуклеотидної послідовності, другої полінуклеотидної послідовності або третьої полінуклеотидної послідовності в одержаній способами генної інженерії рослині може додатково включати другу націлюючу полінуклеотидну послідовність, кодуючу карбоксинацілюючий пептид. Для одержаної способами генної інженерії рослини, позбавленої третьої полінуклеотидної послідовності, друга націлююча полінуклеотидна послідовність може бути включена в щонайменше одну з першої полінуклеотидної послідовності або другої полінуклеотидної послідовності. Для одержаного способами генної інженерії рослини, позбавленої другої полінуклеотидної послідовності і третьої полінуклеотидної послідовності, друга націлююча полінуклеотидна послідовність може бути включена в першу полінуклеотидну послідовність. Карбоксинацілюючий пептид може бути вибраний з, але не обмежуючись ними, послідовності, що має щонайменше 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або 100 % ідентичність з однією з SEQ ID NO: 22 [SEKDEL], укороченої SEQ ID NO: 23 [KDEL] або SEQ ID NO: 24 [послідовність, що визначає вакуолярне сортування ячменю HvVSD-01]. Карбоксинацілюючий пептид може бути злитий щонайменше з одним з першого білка, другого білка або третього білка. Одержана способами генної інженерії рослина може включати щонайменше одну полінуклеотидну послідовність, кодуючу амінокислотну послідовність, що включає, по суті складається з або складається з послідовності з щонайменше 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або 100 % ідентичністю з послідовністю, вибраною з групи, що складається з: SEQ ID NO: 18 [BAASS:P77853], SEQ ID NO: 19 [BAASS:O33897], SEQ ID NO: 20 [HVAlePS:NtEGm], SEQ ID NO: 21 [BAASS:P77853:S158-30-108-35], SEQ ID NO: 25 [BAASS:AnfaeB:SEKDEL], SEQ ID NO: 26 [BAASS:AnfaeA:SEKDEL], SEQ ID NO: 27 [PR1a:NtEGm:SEKDEL], SEQ ID NO: 28 [BAASS:P77853:T134-100-101:SEKDEL], SEQ ID NO: 29 [HvAleSP:NtEGm:SEKDEL], SEQ ID NO: 30 [BAASS:O43097:SEKDEL] і SEQ ID NO: 31 [xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD-01]. Одержана способами генної інженерії рослина може включати щонайменше одну амінокислотну послідовність, що включає, по суті складається або складається з послідовності з щонайменше 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або 100 % ідентичністю з послідовністю, вибраною з групи, що складається з: SEQ ID NO: 18 [BAASS:P77853], SEQ ID NO: 19 [BAASS:O33897], SEQ ID NO: 20 [HVAlePS:NtEGm], SEQ ID NO: 21 [BAASS:P77853:S15830-108-35], SEQ ID NO: 25 [BAASS:AnfaeB:SEKDEL], SEQ ID NO: 26 [BAASS:AnfaeA:SEKDEL], SEQ ID NO: 27 [PR1a:NtEGm:SEKDEL], SEQ ID NO: 28 [BAASS:P77853:T134-100-101:SEKDEL], SEQ ID NO: 29 [HvAleSP:NtEGm:SEKDEL], SEQ ID NO: 30 [BAASS:O43097:SEKDEL] і SEQ ID NO: 31 [xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD-01]. Одержана способами генної інженерії рослина може являти собою трансгенну рослину, нащадка трансгенної рослини, низхідного родича трансгенної рослини або будь-яку частину зазначених вище. Одержана способами генної інженерії рослина може включати білок CWD, що не зустрічається в природі в рослині, або ген, кодуючий його. Білок CWD може являти собою модифікований інтеїном білок CWD. Трансгенна рослина може являти собою рослину будьякого типу. Тип трансгенної рослини може являти собою кукурудзу, цукрову тростину, цукровий буряк, сорго, просо, міскантус, евкаліпт, вербу або тополю. Трансгенну рослину можна створювати відомими способами для експресії ферменту CWD або білка CWD у будь-якій формі. Рослину можна створювати за допомогою опосередковуваної Agrobacterium трансформації з використанням вектора, що включає полінуклеотидні послідовності, кодуючі фермент. Трансгенну рослину можна створювати іншими способами трансформації рослин, наприклад бомбардуванням частинками або прямим захопленням ДНК. Трансгенна рослина може включати будь-яку виділену нуклеїнову кислоту, амінокислотну послідовність, касету експресії або вектор, розкриті в даному описі. В одному варіанті здійснення передбачена касета експресії, що включає щонайменше одну з першої полінуклеотидної послідовності, другої полінуклеотидної послідовності або третьої полінуклеотидної послідовності, які кодують, відповідно, перший білок, другий білок і третій білок. Будь-який один або декілька з першого білка, другого білка або третього білка можуть 14 UA 112643 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 являти собою білок CWD. Будь-який один або декілька з першого білка, другого білка або третього білка можуть являти собою модифікований інтеїном білок CWD. Будь-який один або декілька з першого білка, другого білка або третього білка можуть являти собою один з білків, описаних відносно способу продукування розчинних цукрів з одержаного способами генної інженерії рослинного матеріалу або одержаних способами генної інженерії рослин. Будь-який один або декілька з першого білка, другого білка або третього білка можуть являти собою ксиланазу, ендоглюканазу, екзоглюканазу, ферулоїлестеразу, модифіковану інтеїном ксиланазу, модифіковану інтеїном ендоглюканазу, модифіковану інтеїном екзоглюканазу або модифіковану інтеїном ферулоїлестеразу. Білок, вибраний як другий білок, може відрізнятися від білка, вибраного як перший білок. Білок, вибраний як третій білок, може відрізнятися від білка, вибраного як перший білок. Білок, вибраний як третій білок, може відрізнятися від білка, вибраного як перший білок. Білок, вибраний як третій білок, може відрізнятися від білка, вибраного як другий білок. Щонайменше одна з першої полінуклеотидної послідовності, другої полінуклеотидної послідовності або третьої полінуклеотидної послідовності, кодуючої білок CWD у касеті експресії, може бути модифікована вставкою послідовності нуклеїнової кислоти, кодуючої інтеїн. Модифікований інтеїном полінуклеотид може кодувати модифікований інтеїном білок з модифікованою функцією. Модифікована функція може являти собою інактивацію білка CWD, поки інтеїн залишається злитим з білком CWD або в білку CWD. Можна індукувати сплайсинг інтеїну в модифікованому інтеїном білку у форму немодифікованого інтеїном білка. Умови індукції сплайсингу можуть являти собою, але не обмежуватися ними, забезпечення визначеної температури. Забезпечувана температура може являти собою температуру, яку забезпечують в умовах щонайменше одного з попередньої обробки або гідролізу, описаних відносно способу продукування розчинних цукрів з одержаного способами генної інженерії рослинного матеріалу. Умови індукції можуть являти собою будь-які інші умови індукції, що відповідають вибраному інтеїну. Модифікований інтеїном білок може являти собою iXynA: тобто модифіковану інтеїном XynA. Модифікований інтеїном білок може являти собою модифіковану інтеїном P77853. Модифікований інтеїном білок може являти собою P77853:T134-100-101 або P77853:S158-30108-35. Один або декілька з першого білка, другого білка або третього білка в касеті експресії може включати, по суті складатися або складатися з амінокислотної послідовності з щонайменше 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 96, 97, 98, 99 або 100 % ідентичністю з референсною послідовністю, вибраною з групи, що складається з: SEQ ID NO: 1 [WT P77853], SEQ ID NO: 2 [AnfaeA], SEQ ID NO: 3 [AnfaeB], SEQ ID NO: 4 [NtEGm], SEQ ID NO: 5 [EU 591743], SEQ ID NO: 6 [O43097], SEQ ID NO: 7 [P77853:T134-100-101], SEQ ID NO: 8 [P77853:S158-30-108-35], SEQ ID NO: 9 [O33897], SEQ ID NO: 10 [O68438] і SEQ ID NO: 11 [P54583]. Один або декілька з першого білка, другого білка або третього білка можуть включати, по суті складатися або складатися з амінокислотної послідовності з щонайменше 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 98, 99 або 100 % ідентичністю з референсною послідовністю SEQ ID NO: 12 [BD22308]. Щонайменше одна з першої полінуклеотидної послідовності, другої полінуклеотидної послідовності або третьої полінуклеотидної послідовності в касеті експресії може додатково включати першу націлюючу полінуклеотидну послідовність, кодуючу відповідний націлюючий пептид. Для експресуючої конструкції, позбавленої третьої полінуклеотидної послідовність, перша націлююча полінуклеотидна послідовність може бути включена в щонайменше одну з першої полінуклеотидної послідовності або другої полінуклеотидної послідовності. Для експресуючої конструкції, позбавленої другої полінуклеотидної послідовності і третьої полінуклеотидної послідовності, перша націлююча полінуклеотидна послідовність може бути включена в першу полінуклеотидну послідовність. Кожен відповідний націлюючий пептид може бути незалежно вибраний для кожної з першої полінуклеотидної послідовності, другої полінуклеотидної послідовності або третьої полінуклеотидної послідовності. Націлюючий пептид може бути злитий з першим білком, другим білком або третім білком. Кожен відповідний націлюючий пептид може бути незалежно вибраний з, але не обмежуючись ними, націлюючого на амілопласт сигналу, націлюючого на клітинну стінку пептиду, націлюючого на мітохондрії пептиду, сигналу локалізації в цитозолі, націлюючого на хлоропласти сигналу, націлюючого в ядро пептиду і націлюючого на вакуоль пептиду. Перший націлюючий полінуклеотид може бути розташований вище першої полінуклеотидної послідовності, другої полінуклеотидної послідовності або третьої полінуклеотидної послідовності. Націлюючий пептид може мати щонайменше 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 97, 98, 99 або 100 % ідентичність одній з BAASS (SEQ ID NO: 13), послідовності алейрону ячменю HVAlePS (SEQ ID NO: 14), PR1a (SEQ ID NO: 15), послідовності гамма-зеїну xGZein27ss-02 (SEQ ID NO: 16) або GluВ4SP (SEQ ID NO: 15 UA 112643 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 17). Перша націлююча полінуклеотидна послідовність у комбінації з однією з першої полінуклеотидної послідовності, другої полінуклеотидної послідовності або третьої полінуклеотидної послідовності разом можуть кодувати амінокислотну послідовність з щонайменше 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або 100 % ідентичністю з референсною послідовністю, вибраною з групи, що складається з: SEQ ID NO: 18 [BAASS:P77853], SEQ ID NO: 19 [BAASS:O33897], SEQ ID NO: 20 [HVAlePS:NtEGm] і SEQ ID NO: 21 [BAAS:P77853:S158-30-108-35]. Щонайменше одна з першої полінуклеотидної послідовності, другої полінуклеотидної послідовності або третьої полінуклеотидної послідовності в касеті експресії може, крім того, включати другу націлюючу полінуклеотидну послідовність, кодуючу карбоксинацілюючий пептид. Для експресуючої конструкції, позбавленої третьої полінуклеотидної послідовності, друга націлююча полінуклеотидна послідовність може бути включена в щонайменше одну з першої полінуклеотидної послідовності або другої полінуклеотидної послідовності. Для експресуючої конструкції, позбавленої другої полінуклеотидної послідовності і третьої полінуклеотидної послідовності, друга націлююча полінуклеотидна послідовність може бути включена в першу полінуклеотидну послідовність. Карбоксинацілюючий пептид може бути вибраний з, але не обмежуючись ними, послідовності, що має щонайменше 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або 100 % ідентичність з однією з SEKDEL (SEQ ID NO: 22), укороченої KDEL (SEQ ID NO: 23) або послідовності, що визначає вакуолярне сортування ячменю HvVSD-01 (SEQ ID NO: 24). Карбоксинацілюючий пептид може бути злитий із щонайменше одним з першого білка, другого білка або третього білка. Касета експресії може бути організована так, щоб щонайменше один з першого білка, другого білка або третього білка був наданий без націлюючого пептиду для накопичення в цитоплазмі. У касеті експресії перша націлююча полінуклеотидна послідовність і друга націлююча полінуклеотидна послідовність у комбінації з однією з першої полінуклеотидної послідовності, другої полінуклеотидної послідовності або третьої полінуклеотидної послідовності разом можуть кодувати амінокислотну послідовність з щонайменше 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або 100 % ідентичністю з референсною послідовністю, вибраною з групи, що складається з: SEQ ID NO: 25 [BAASS: AnfaeB: SEKDEL], SEQ ID NO: 26 [BAASS:AnfaeA:SEKDEL], SEQ ID NO: 27 [PR1a:NtEGm:SEKDEL], SEQ ID NO: 28 [BAASS:P77853:T134-100-101:SEKDEL], SEQ ID NO: 29 [HvAleSP:NtEGm:SEKDEL], SEQ ID NO: 30 [BAASS:O43097:SEKDEL] і SEQ ID NO: 31 [xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD-01]. Варіанти здійснення включають касету експресії, кодуючу щонайменше один з першого білка, другого білка або третього білка або їх варіанти, злиті з варіантами щонайменше одного з націлюючого пептиду або карбоксинацілюючого пептиду. В одному варіанті здійснення полінуклеотидна послідовність, яка кодує білок у касеті експресії і має менше ніж 100 % ідентичність з цитованою референсною амінокислотною послідовністю, може кодувати варіант білка, що має референсну амінокислотну послідовність. В одному варіанті здійснення білок, що має менше ніж 100 % ідентичність з цитованою референсною амінокислотною послідовністю, може являти собою варіант білка, що має референсну амінокислотну послідовність. В одному варіанті здійснення полінуклеотидна послідовність, кодуюча білок, що має менше ніж 100 % ідентичність з білком, кодованим цитованою референсною послідовністю нуклеїнової кислоти, може кодувати варіант білка, кодований референсною послідовністю. У касеті експресії щонайменше одна з першої полінуклеотидної послідовності, другої полінуклеотидної послідовності або третьої полінуклеотидної послідовності може бути здатна гібридизуватися з референсною послідовністю, кодуючою білок CWD або модифікований інтеїном білок CWD в одних з умов низької, помірної або високої жорсткості. Щонайменше один з першого, другого або третього полінуклеотидів може бути здатний гібридизуватися в одних з умов низької, помірної або високої жорсткості з нуклеїновою кислотою, що складається з референсної послідовності, вибраної з групи, що складається з: SEQ ID NO: 32 [WT P77853], SEQ ID NO: 33 [AnfaeA], SEQ ID NO: 34 [AnfaeB], SEQ ID NO: 35 [NtEGm], SEQ ID NO: 36 [EU591743], SEQ ID NO: 37 [O43097], SEQ ID NO: 38 [P77853:T134-100-101], SEQ ID NO: 39 [P77853:S158-30-108-35], SEQ ID NO: 40 [O33897], SEQ ID NO: 41 [O68438], SEQ ID NO: 42 [P54583] і SEQ ID NO: 43 [BD22308]. Касета експресії може включати полінуклеотидну послідовність, здатну гібридизуватися в одних з умов низької, помірної або високої жорсткості з нуклеїновою кислотою, що складається з референсної послідовності, вибраної з групи послідовностей, що складається з: SEQ ID NO: 52 [BAASS:P77853], SEQ ID NO: 53 [BAASS:O33897], SEQ ID NO: 54 [HVAlePS:NtEGm], SEQ ID NO: 55 [BAASS:P77853:S158-30-108 16 UA 112643 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 35], SEQ ID NO: 56 [BAASS:AnfaeB:SEKDEL], SEQ ID NO: 57 [BAASS:AnfaeA:SEKDEL], SEQ ID NO: 58 [PR1a:NtEGm:SEKDEL], SEQ ID NO: 59 [BAASS:P77853:T134-100-101:SEKDEL], SEQ ID NO: 60 [HvAleSP:NtEGm:SEKDEL], SEQ ID NO: 61 [BAASS:O43097:SEKDEL] і SEQ ID NO: 62 [xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD-01]. Касета експресії в рамках даного винаходу може включати регуляторний елемент. В одному варіанті здійснення передбачений вектор, що включає будь-яку виділену нуклеїнову кислоту, полінуклеотидну послідовність або касету експресії, розкриті в даному описі. Варіанти здійснення в рамках даного винаходу включають плазміду, хромосому, мітохондріальну ДНК, пластидну ДНК, вірус або фрагмент нуклеїнової кислоти, що має щонайменше одну касету експресії, розкриту в даному описі, включену у них. Один з варіантів здійснення стосується вектора для експресії білків CWD у рослині. Один варіант здійснення стосується вектора для трансформації рослин. Вектор для трансформації рослин може являти собою, але не обмежуватися ними, вектор T-ДНК, бінарний вектор або вектор-коінтеграт. Вектор для трансформації може включати будь-яку виділену нуклеїнову кислоту, полінуклеотидну послідовність або касету експресії, розкриті в даному описі. Один з варіантів здійснення включає вектор експресії, що включає полінуклеотидну послідовність, здатну гібридизуватися в одних умовах з умов низької, помірної або високої жорсткості з нуклеїновою кислотою, яка складається з послідовності, що включає, по суті складається з або складається з послідовності, вибраної з групи, що складається з: SEQ ID NO: 63 [pAG 2015], SEQ ID NO: 64 [pAG2048], SEQ ID NO: 65 [pAG2049], SEQ ID NO: 66 [pAG2063], SEQ ID NO: 67 [pAG2069], SEQ ID NO: 68 [pAG2091], SEQ ID NO: 69 [pAG2092], SEQ ID NO: 70 [pAG2096], SEQ ID NO: 71 [pAG2201], SEQ ID NO: 72 [pAG2229], SEQ ID NO: 73 [pAG2233], SEQ ID NO: 74 [pAG2234], SEQ ID NO: 75 [pAG2242], SEQ ID NO: 76 [pAG2252], SEQ ID NO: 77 [pAG2253], SEQ ID NO: 78 [pAG2309], SEQ ID NO: 79 [pAG2310], SEQ ID NO: 80 [pAG2339], SEQ ID NO: 81 [pAG2342], SEQ ID NO: 82 [pAG2345] і SEQ ID NO: 83 [pAG2349]. Один з варіантів здійснення включає вектор експресії, який включає полінуклеотидну послідовність, що має щонайменше 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або 100 % ідентичність з послідовністю, вибраною з групи, що складається з: SEQ ID NO: 63 [pAG2015], SEQ ID NO: 64 [pAG2048], SEQ ID NO: 65 [pAG2049], SEQ ID NO: 66 [pAG2063], SEQ ID NO: 67 [pAG2069], SEQ ID NO: 68 [pAG2091], SEQ ID NO: 69 [pAG2092], SEQ ID NO: 70 [pAG2096], SEQ ID NO: 71 [pAG2201], SEQ ID NO: 72 [pAG2229], SEQ ID NO: 73 [pAG2233], SEQ ID NO: 74 [pAG2234], SEQ ID NO: 75 [pAG 2242], SEQ ID NO: 76 [pAG2252], SEQ ID NO: 77 [pAG2253], SEQ ID NO: 78 [pAG2309], SEQ ID NO: 79 [pAG2310], SEQ ID NO: 80 [pAG2339], SEQ ID NO: 81 [pAG2342], SEQ ID NO: 82 [pAG2345] і SEQ ID NO: 83 [pAG2349]. Способи гібридизації й умови жорсткості відомі в даній галузі й описані в наступних книгах: Molecular Cloning, T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, і Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Siedman, J.A. Smith, K. Struhl, Volume 1, John Wiley & Sons, 2000, що включені в даний опис як посилання в повному обсязі. Умови помірної жорсткості можуть бути наступними: фільтри, навантажені зразками ДНК, попередньо обробляють протягом 2-4 годин при 68 °C у розчині, що містить 6× цитратний сольовий буфер (SSC; Amresco, Inc., Solon, OH), 0,5 % додецилсульфат натрію (SDS; Amresco, Inc., Solon, OH), 5× розчин Денхардта (Amresco, Inc., Solon, OH) і денатуровану сперму лосося (Invitrogen Life Technologies, Inc. Carlsbad, CA). Гібридизацію проводять у тому ж розчині з наступними модифікаціями: 0,01M EDTA (Amresco, Inc., Solon, OH), 100 мкг/мл ДНК сперми 6 32 лосося і 5-20 × 10 cpm P-мічених або флуоресцентно мічених зондів. Фільтри інкубують у суміші для гібридизації протягом 16-20 годин, а потім промивають протягом 15 хвилин у розчині, що містить 2×SSC і 0,1 % SDS. Промивальний розчин заміняють для другого промивання розчином, що містить 0,1×SSC і 0,5 % SDS, і інкубують протягом додаткових 2 годин при температурі від 20 °C до 29 °C нижче Tm (температура плавлення в°C). Tm + + + Tm=81,5+16,61Log10([Na ]/(1,0+0,7[Na ]))+0,41(%[G+C])-(500/n)-P-F. [Na ] = молярна концентрація іонів натрію. %[G+C] = відсоток основ G+C у послідовності ДНК. N = довжина послідовності ДНК у основах. P = поправка температури на % не відповідних пар основ (~1 °C на 1 % невідповідність). F = поправка на концентрацію формаміду (=0,63 °C на 1 % формамід). Фільтри експонують для проявлення в пристрої для візуалізації або за допомогою радіоавтографії. Умови низької жорсткості належать до умов гібридизації при низьких + температурах, наприклад від 37 °C до 60 °C, і другого промивання з більш високою [Na ] (аж до 0,825M) і при температурі від 40 °C до 48 °C нижче Tm. Висока жорсткість належить до умов + гібридизації при високих температурах, наприклад більше 68 °C, і другого промивання з [Na ] = від 0,0165 до 0,0330M при температурі від 5 °C до 10 °C нижче Tm. 17 UA 112643 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Один варіант здійснення стосується виділеної послідовності нуклеїнової кислоти, яка має послідовність, що гібридизується в одних з умов низької, помірної або високої жорсткості з нуклеїновою кислотою, що складається з послідовності, вибраної з SEQ ID NO: 32 [WT P77853], SEQ ID NO: 33 [AnfaeA], SEQ ID NO: 34 [AnfaeB], SEQ ID NO: 35 [NtEGm], SEQ ID NO: 36 [EU591743], SEQ ID NO: 37 [O43097], SEQ ID NO: 38 [P77853:T134-100-101] і SEQ ID NO: 39 [P77853:S158-30-108-35], SEQ ID NO: 40 [O33897], SEQ ID NO: 41 [O68438], SEQ ID NO: 42 [P54583] і SEQ ID NO: 43 [BD22308], SEQ ID NO: 52 [BAASS:P77853], SEQ ID NO: 53 [BAASS:O33897], SEQ ID NO: 54 [HVAlePS:NtEGm], SEQ ID NO: 55 [BAASS:P77853:S158-30-10835], SEQ ID NO: 56 [BAASS: AnfaeB: SEKDEL], SEQ ID NO: 57 [BAASS:AnfaeA:SEKDEL], SEQ ID NO: 58 [PR1a:NtEGm:SEKDEL], SEQ ID NO: 59 [BAASS:P77853:T134-100-101:SEKDEL], SEQ ID NO: 60 [HvAleSP:NtEGm:SEKDEL], SEQ ID NO: 61 [BAASS:O43097:SEKDEL] і SEQ ID NO: 62 [xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD-01], SEQ ID NO: 63 [pAG2015], SEQ ID NO: 64 [pAG2048], SEQ ID NO: 65 [pAG2049], SEQ ID NO: 66 [pAG2063], SEQ ID NO: 67 [pAG2069], SEQ ID NO: 68 [pAG2091], SEQ ID NO: 69 [pAG2092], SEQ ID NO: 70 [pAG2096], SEQ ID NO: 71 [pAG2201], SEQ ID NO: 72 [pAG2229], SEQ ID NO: 73 [pAG2233], SEQ ID NO: 74 [pAG2234], SEQ ID NO: 75 [pAG 2242], SEQ ID NO: 76 [pAG2252], SEQ ID NO: 77 [pAG2253], SEQ ID NO: 78 [pAG2309], SEQ ID NO: 79 [pAG2310], SEQ ID NO: 80 [pAG2339], SEQ ID NO: 81 [pAG2342], SEQ ID NO: 82 [pAG2345] і SEQ ID NO: 83 [pAG2349], або послідовності, комплементарної їй. Один варіант здійснення стосується фрагмента будь-якої з описаних вище виділених нуклеїнових кислот. Фрагмент може являти собою зонд або праймер для гібридизації. Зонд або праймер може мати будь-яку довжину. Зонд або праймер може мати довжину 6, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 або 50 нуклеотидів, або він може мати довжину в діапазоні між будь-якими з двох зазначених вище довжин (включаючи граничні значення). Фрагмент може мати довжину, меншу ніж повна довжина, і/або він може включати заміни або делеції в порівнянні з цитованою референсною послідовністю. Фрагмент може являти собою варіант цитованої референсної послідовності. Пептид, кодований фрагментом, може мати довжину, меншу ніж повна довжина, і/або він може включати заміни або делеції в порівнянні з амінокислотною послідовністю, кодованою цитованою референсною послідовністю. Пептид з довжиною, меншою ніж повна довжина, може являти собою варіант амінокислотної послідовності, кодований цитованою референсною послідовністю. Касету експресії можна одержувати рекомбінантним шляхом відомими способами. Касета експресії може включати серію певних елементів нуклеїнової кислоти, що дозволяють транскрипцію конкретної нуклеїнової кислоти в клітині рослини або тканині рослини. Касета експресії може включати полінуклеотидну послідовність, кодуючу білок. Білок може являти собою фермент CWD або модифікований інтеїном фермент CWD. Фермент CWD може бути вибраний зі списку ферментів CWD, що складається з: ксиланаз, ендоглюканаз, екзоглюканаз, ксилозидаз, глюкозидаз і ферулоїлестераз. Полінуклеотидна послідовність у касеті експресії, виділеній нуклеїновій кислоті, векторі або будь-якій іншій конструкції ДНК, розкритій в даному описі або використовуваній в способі, наданому в даному описі, може бути функціонально зв'язана з одним або декількома регуляторними елементами. Включений регуляторний елемент може являти собою промотор. Промотор може являти собою конститутивний промотор, що забезпечує транскрипцію полінуклеотидних послідовностей всюди в рослині в більшості клітин, тканин і органів і протягом багатьох, але не обов'язково всіх, стадій розвитку. Промотор може являти собою індуцибельний промотор, що ініціює транскрипцію полінуклеотидних послідовностей, тільки коли на нього впливає конкретний хімічний стимул або стимул навколишнього середовища. Промотор може бути специфічним для конкретної стадії розвитку, органа або тканини. Тканиноспецифічний промотор може бути здатний ініціювати транскрипцію в конкретній тканині рослини. Рослинна тканина, на яку може бути націлений тканиноспецифічний промотор, може являти собою, але не обмежуватися ними, стебло, листи, трихоми, пиляки або насіння. Конститутивний промотор, розкритий у даному описі, може являти собою промотор убіквітину 3 рису (OsUbi3P) або промотор актину 1 рису. Можна використовувати інші відомі конститутивні промотори і вони включають, але не обмежуються ними, промотор вірусу мозаїки цвітної капусти (CAMV) 35S, промотор вірусу жовтої кучерявості листів цеструму (CMP) або коротку версію CMP (CMPS), промотор малої субодиниці Rubisco (рибулозо-1,5-біфосфаткарбоксилази/оксигенази) і промотор убіквітину кукурудзи. Тканиноспецифічний промотор може включати специфічний для насіння промотор. Специфічний для насіння промотор може являти собою, але не обмежуватися ними, промотор GluB4 рису або промотор зеїну кукурудзи. Іншим регуляторним елементом, що може бути наданий, є послідовність термінатора, яка термінує транскрипцію. Послідовність термінатора може бути включена на 3’-кінці елемента транскрипції касети 18 UA 112643 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 експресії. Термінатор може походити з різних генів рослин. Термінатор може являти собою послідовність термінатора з генів нопалінсинтази або октопінсинтази Agrobacterium tumefaciens. Вектори, що включають касету експресії, розкриту в даному описі, також можуть включати додаткові генетичні елементи як ділянки множинного клонування для полегшення молекулярного клонування і селективні маркери для полегшення селекції. Селективний маркер, що може бути включений у вектор, може являти собою ген фосфоманозоізомерази (PMI) з Escherichia coli, що надає трансформованій клітині здатність утилізувати манозу для росту. Селективні маркери, що можуть бути включені у вектор, включають, але не обмежуються ними, ген неоміцинфосфотрансферази (npt), що надає стійкість до канаміцину, ген гігроміцинфосфотрансферази (hpt), що надає стійкість до гігроміцину, і ген енолпірувілшикімат3-фосфатсинтази, що надає стійкість до гліфосату. В одному варіанті здійснення вектор можна конструювати так, щоб він включав полінуклеотидні послідовності, кодуючі множину ферментів CWD. Вектор, представлений у даному описі, може додатково включати полінуклеотидну послідовність, призначену для пригнічення гена або генів у рослині. Вектор експресії можна вводити в придатні клітини-хазяїни, тканини, органи і/або організми. Придатними хазяїнами можуть бути двосім'ядольні (дводольні) або односім'ядольні (однодольні) рослини. Додаткові варіанти здійснення в рамках даного винаходу можуть бути одержані шляхом доповнення одного з варіантів здійснення одним або декількома елементами з будь-якого одного або декількох інших варіантів здійснення, розкритих у даному описі, і/або шляхом заміни одного або декількох елементів з одного варіанта здійснення одним або декількома елементами з одного або декількох інших варіантів здійснення, розкритих у даному описі. Додаткові варіанти здійснення в рамках даного винаходу можуть бути описані, посилаючись на будь-який один із прикладених пунктів формули винаходу після п. 1, і шляхом прочитання вибраного пункту формули винаходу так, щоб він залежав від будь-якого одного або декількох попередніх пунктів формули винаходу. ПРИКЛАДИ Наступні необмежувальні приклади надані для ілюстрації конкретних варіантів здійснення. Варіанти здійснення можуть бути доповнені однією або декількома деталями з одного або декількох прикладів, наведених нижче, і/або один або декілька елементів з варіанта здійснення можуть бути замінені одним або декількома деталями з одного або декількох прикладів, наведених нижче. Приклад 1. Матеріали і способи Вектори Конструкція вектора, розкритого в даному описі, основана на проміжній плазміді pSB11, доступній від Japan Tobacco і описаній в міжнародних заявках № PCT/US10/55746, поданій 5 листопада 2010 року, PCT/US10/55669, поданій 5 листопада 2010 року, і PCT/US10/55751, поданій 5 листопада 2010, що включені в даний опис як посилання в повному обсязі. У короткому викладі, плазміду pSB11, використовувану для клонування, кон'югують з акцепторним вектором pSB1, обеззброєною Ti-плазмідою, шляхом гомологічної рекомбінації з використанням ділянок cos і ori, присутніх як у pSB11, так і в pSB1. Вбудований вектор містить гени вірулентності, такі як virB, virC і virG, необхідні для перенесення T-ДНК, і його можна використовувати для трансформації рослин. Базовий вектор для трансформації включає касету експресії, що містить ген man A, кодуючий PMI, під контролем промотору CMPS, пізніше замінюваного промотором OsUbi3P. Цей базовий вектор використовували для одержання векторів, наведених нижче, які використовували для трансформації рослин і експресії ферментів, деградуючих клітинну стінку, у рослинах: 1) pAG2015(SEQ ID NO: 63): OsUbi3P:P77853; 2) pAG2048 (SEQ ID NO: 64): OsUbi3P:HvAleSP:NtEGm між промотором Ubi3 рису, злитим з вакуолею; 3) pAG2049 (SEQ ID NO: 65): OsUbi3P:HvAleSP:NtEGm:SEKDEL; 4) pAG2063 (SEQ ID NO: 66): OsUbi3P:BAASS:O43097:SEKDEL; 5) pAG2069 (SEQ ID NO: 67): OsUbi3P:O68438; 6) pAG2091 (SEQ ID NO: 68): OsUbi3P:BAASS:AnfaeA:SEKDEL+OsUbi3P:BAASS:P77853; 7) pAG2092 (SEQ ID NO: 69): OsUbi3P:BAASS:AnfaeB:SEKDEL+OsUbi3P:BAASS:P77853; 8) pAG2096 (SEQ ID NO: 70): OsUbi3P:BAASS:AnfaeA:SEKDEL+OsUbi3P:BAASS:AnfaeB:SEKDEL+OsUbi3P:BAASS:P77853; 9) pAG2201 (SEQ ID NO: 71): OsUbi3P:ZmUBQm:P77853; 19 UA 112643 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 10) pAG2229 (SEQ ID NO: 72): OsUbi3P:BAASS:P77853:T134-100-101:SEKDEL (модифікована інтеїном ксиланаза); 11) pAG2233 (SEQ ID NO: 73): OsUbi3P:P77853:S158-30-108-35; 12) pAG2234(SEQ ID NO: 74): OsUbi3P:BAASS:P77853:S158-30-108-35; 13) pAG2242 (SEQ ID NO: 75): OsUbi3P:PR1aSP:NtEGm:SEKDEL+OsUbi3P:ZmUBQm:P77853; 14) pAG2252 (SEQ ID NO: 76): OsUbi3P:O33897 (ендоглюканаза); 15) pAG2253 (SEQ ID NO: 77): OsUbi3P:BAASS:O33897; 16) pAG2309 (SEQ ID NO: 78): OsUbi3P:HvAleSP:NtEGm+OsUbi3P:P77853; 17) pAG2310 (SEQ ID NO: 79): OsUbi3P:EU591743 (ксиланаза); 18) pAG2339 (SEQ ID NO: 80): OsUbi3P:O68438+OsUbi3P:BAASS:O33897+OsUbi3P:EU591743; 19) pAG2342 (SEQ ID NO: 81): OsUbi3P:HvAleSP:NtEGm:SEKDEL+OsUbi3P:P77853; 20) pAG2345 (SEQ ID NO: 82): OsUbi3P:O68438+OsUbi3P:HvAleSP:NtEGm:SEKDEL+OsUbi3P:BAASS:O43097:SEKDEL; 21) pAG2349 (SEQ ID NO: 83): ZmUbilP:ZmKozak:xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD01+OsUbi3P:HvAleSP:NtEGm:SEKDEL+OsUbi3P:BAASS:O43097:SEKDEL; 22) pAG2042 (SEQ ID NO: 84): P54583 (ендоглюканаза EGB). Одержання трансгенних рослин кукурудзи Способи трансформації кукурудзи і проса описані в міжнародних заявках № PCT/US10/55746, поданій 5 листопада 2010 року, PCT/US10/55669, поданій 5 листопада 2010 року, PCT/US10/55751, поданій 5 листопада 2010 року, і Gray et al. 2011, Plant Biotech. J. 9:1100, усі з який включені в даний опис як посилання в повному обсязі. У короткому викладі, ембріогенний калюс з кукурудзи дикого типу AxB інокулювали клітинами Agrobacterium LBA4404, що містять відповідну плазміду для трансформації. Опосередковувану Agrobacterium трансформацію незрілих ембріонів кукурудзи проводили, як описано раніше (Negrotto D. et al. 2000, Plant Cell. Rep. 19:798; Ishida Y. et al. 1996, Nat. Biotech. 14:745). Касети експресії для генів ферментів клонували в ділянки KpnI-EcoRI вектора pAG2004 (SEQ ID NO: 85) з одержанням проміжного вектора, здатного рекомбінувати з вектором pSB1 у схрещуванні з трьома батьківськими організмами в Agrobacterium tumefaciens штаму LBA4404 з використанням методик, описаних раніше (Ishida Y. et al. 1996, Nat. Biotech. 14:745; Hiei Y. et al. 1994, Plant J. 6:271; Hiei Y. and Komari T. 2006, Plant Cell Tissue Organ Cult. 85:27; Komari T. et al. 1996, Plant J. 10:165). Вихідні рослини кукурудзи (Zea mays культиварів HiII, A188 або B73) вирощували в теплиці при 16 годинах денного світла при 28 °C. Незрілі зиготичні ембріони виділяли з зерен і інокулювали розчином Agrobacterium, які містили гени, що представляють інтерес. Після інокуляції незрілі ембріони вирощували в процесі культивування тканин протягом 10-12 тижнів. З добре розвинених паростків з листами і коренями брали зразки для аналізу способом ПЛР для ідентифікації трансгенних рослин, які містять гени, що представляють інтерес. Позитивні по ПЛР і укорінені рослини промивали водою, щоб змити агарове середовище, і пересаджували в ґрунт і вирощували в теплиці для одержання насіння і соломи. Конкретні трансгенні рослини позначені в даному описі за допомогою позначення ферменту (наприклад, "P77853", "P40942", "О30700", "NtEGm" і т. д.) або трансгенного контролю (наприклад, "TGC" і т. д.), з наступним числом у тисячах, що позначає плазміду, використану для одержання трансгенної рослини (наприклад, "2014", "2015", "2229", "2092" і т. д.). Іноді додані додаткові символи, але позначення і) ферменту або контролю і ii) плазміди зрозуміло в контексті. Згадувані плазміди позначають як pAGXXXX. Наприклад, позначення "2229", "2252", "2253", "2092", "2096" або "2042" у назві трансгенної рослини означає, що трансгенна рослина була одержана шляхом трансформації за допомогою "pAG2229", "pAG2252", "pAG2253", "pAG2092", "pAG2096" або "pAG2042", відповідно. Може бути наведене посилання на включені послідовності, позначені назвами плазмід, для визначення послідовностей, використаних для одержання конкретної трансгенної рослини. Для одержання трансгенних рослин проса, насіння з Panicum virgatum, cv. Alamo використовували для ініціації ліній ембріогенного калюсу, надалі використаних для трансформації з використанням Agrobacterium LBA4404, що містить плазміду pSB1. Присутність гена, що представляє інтерес, підтверджували способом ПЛР з використанням специфічних для гена праймерів. Наступні трансгенні рослини, експресуючі фермент CWD або ферменти CWD, і контрольні рослини використовували для об'єднаної попередньої обробки і гідролізу: 1) рослина кукурудзи дикого типу, використана як негативні контролі (AxB; BxA); 2) рослини кукурудзи, трансформовані порожнім вектором, використані як негативні контролі (TGC.4000.12; TGC.4000.11; TGC.2004.8.02; TGC.2004.8.04; TGC.2243.01); 20 UA 112643 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 3) трансгенна рослина кукурудзи XynA.2015.05, одержана шляхом трансформації pAG2015 і експресуюча ксиланазу XynA (P77853); 4) трансгенна рослина кукурудзи другого покоління XynA.2015.5T1, одержана шляхом трансформації pAG2015 і експресуюча ксиланазу XynA (P77853); 5) трансгенна рослина кукурудзи XynB.2063.17, одержана шляхом трансформації pAG2063 і експресуюча ксиланазу XynB (O43097); 6) трансгенні рослини кукурудзи EGA.2049.02 і EGA.2049.10, одержані шляхом трансформації pAG2049 і експресуючі ендоглюканазу EGA (NtEG); 7) трансгенна рослина кукурудзи EGB.2042.03, одержана шляхом трансформації pAG2042 і експресуюча ендоглюканазу EGB (P54583); 8) трансгенна рослина кукурудзи EGC.2253.4b, одержана шляхом трансформації pAG2253 і експресуюча ендоглюканазу EGC (O33897); 9) трансгенна рослина кукурудзи EGA/XynA.2242.09, одержана шляхом трансформації pAG2242 і експресуюча ендоглюканазу EGA (NtEG) і ксиланазу XynA (P77853); 10) трансгенна рослина кукурудзи другого покоління від рослини 9, вище, називана EGA/XynA.2242.09.16T1 і експресуюча ендоглюканазу EGA (NtEG) і ксиланазу XynA (P77853); 11) трансгенна рослина кукурудзи XynA/AccB.2092.103, одержана шляхом трансформації pAG2092 і експресуюча ксиланазу XynA (P77853) і ферулоїлестеразу B з Aspergillus niger; 12) трансгенні рослини кукурудзи XynA/AccA/B.2096.01 і XynA/AccA/B.2096.05, одержані шляхом трансформації pAG2096 і експресуючі ксиланазу XynA (P77853), ферулоїлестеразу A з Aspergillus niger і ферулоїлестеразу B з Aspergillus niger; 13) трансгенна рослина кукурудзи CBHA.2069.3.17, одержана шляхом трансформації pAG2069 і експресуюча екзоглюканазу CBH (O68438); 14) трансгенні рослини проса XynA.pv2015.3c і XynA.pv2015.4c, одержані шляхом трансформації pAG2015 і експресуючі ксиланазу XynA (P77853); 15) трансгенна рослина кукурудзи iXynA.2229.110, одержана шляхом трансформації pAG2229 і експресуюча модифіковану інтеїном ксиланазу XynA (P77853); 16) трансгенні рослини кукурудзи XynA/EGA.2309.54 і XynA/EGA.2309.107, одержані шляхом трансформації pAG2309 і експресуючі XynA (P77853), ендоглюканазу EGA (NtEGm); 17) трансгенна рослина кукурудзи XynA/EGA.2342.105, одержана шляхом трансформації pAG2342 і експресуюча XynA (P77853) і EGA (NtEGm); 18) трансгенні рослини кукурудзи XynE/EGC/CBHA.2339.03, XynE/EGC/CBHA.2339.04 і XynE/EGC/CBHA.2339.05, одержані шляхом трансформації pAG2339 і експресуючі XynE (EU591743), ендоглюканазу EGC (O33897) і CBHA (O68438); 19) трансгенна рослина кукурудзи XynB/EGA/CBHA.2345.116, одержана шляхом трансформації pAG2345 і експресуюча XynB (O43097), ендоглюканазу EGA (NtEGm) і CBHA (O68438); 20) трансгенні рослини кукурудзи XynB/EGA/CBHB.2349.55 і XynB/EGA/CBHB.2349.56, одержані шляхом трансформації pAG2349 і експресуючі XynB (O43097), ендоглюканазу EGA (NtEG), CBHB (BD22308) і ZmUbilP:ZmKozak:xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD-01:NosT. Солома з рослин Солому зібраної в теплиці кукурудзи сушили в циркуляторі повітря при 37 °C протягом 1-2 тижнів. Після висушування солому нарізали вручну на фрагменти 1,0-1,5 дюйма (2,5-3,75 см), а потім подрібнювали з використанням млина UDY (Model 014, UDY Corporation, Fort Collins, CO) з 0,5-мм ситом. Одержання екстрактів білків рослин Окремі подрібнені зерна або 20 мг подрібненої соломи ресуспендували в буфері для екстракції білка, що включає 100 мМ фосфат натрію (pН 6,5), етилендіамінтетраоцтову кислоту (EDTA; 1 мМ), Triton X-100 (0,1 %, об./об.) і фенілметансульфонілфторид (PMSF; 0,1 мМ). Ресуспендовані зразки тканини ретельно перемішували, а потім нерозчинний матеріал осаджували центрифугуванням. Рідину супернатанту, що містить розчинний білок, переносили в нову пробірку. Хімічні реагенти і ферменти Стандарти цукрів (глюкоза, ксилоза, арабіноза, галактоза, маноза і целобіоза) придбавали від Acros Organics (Morris Plains, NJ). Всіінші хімічні реагенти, використані в цьому іспиті, придбавали від Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Усі з ендоглюканази (C8546), β-глікозидази (49291) і ендоксиланази (X2753) для одержання власного коктейлю придбавали від Sigma (St. Louis, MO). Целобіогідролазу (CBHI) (EC 3.2.1.91) і β-ксилозидазу (EC 3.2.1.37) придбавали від Megazyme (Wicklow, Ірландія). Accellerase® 1500 і Accellerase® XY були люб'язними 21 UA 112643 C2 5 10 15 20 25 30 подарунками Genencor International (Rochester, NY). Дріжджі Saccharomyces cereuisiae штаму D5A придбавали в American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA). Аналізи ферментів соломи Білок екстрагували з 15 мг соломи в 500 мкл буфера для екстракції (100 мМ натрійфосфатний буфер, pН 6,5; NaOAc, pН 4,5; або Tris, pН 8,0, EDTA (10 мМ), і Triton X-100 (0,1 %) після інкубації протягом 30 хвилин при кімнатній температурі. Солому осаджували центрифугуванням. Супернатант збирали і переносили в нову пробірку Eppendorf. Для аналізів ферментів 50 мкл екстракту білків ресуспендували в буфері. Як правило, буфер включав Xylazyme у 100 мМ фосфаті Na, pН 6,5, або Cellazyme у 100 мМ NaOAc, pН 4,5. Таблетки Xylazyme AX або Cellazyme використовували відповідним чином для кожної пробірки в аналізі ферментів. Реакційні суміші інкубували при температурі аналізу (звичайно приблизно 50-60 °C, залежно від досліджуваного ферменту) доти, поки в рідині супернатанту не ставав помітним синій колір. Кількість синього барвника кількісно визначали шляхом вимірювання поглинання реакційної суміші при 590 нм. Контролі для цієї реакції включали одержані за допомогою мікроорганізмів ферменти й екстракти з рослин дикого типу. Субстрати для гідролізу також можна визначати з використанням кон'югованого з AZCL субстрату (Megazyme) замість таблеток Xylazyme AX і Cellazyme. Використання кон'югованого з AZCL субстрату дозволяє оптимізацію як досліджуваного об'єму соломи, так і концентрації субстрату. Виявлення активності ксиланази Розчинні білки аналізували з використанням Xylazyme AX (Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ірландія) як субстрату у реакційних сумішах об'ємом 0,5 мл при 50 °C у буфері HEPES (100 мМ, pН 8,0) для BSX або у фосфаті натрію (100 мМ, pН 6,5) для XynВ. Для зупинення реакцій Xylazyme AX, до реакційних сумішей додавали 1 мл 2 % (мас./об.) Tris-основи. Нерозчинний матеріал з реакції Xylazyme AX осаджували центрифугуванням, і поглинання реакційної суміші в 100 мкл супернатанту вимірювали в трьох екземплярах спектрофотометрично при 590 нм. Для кількісного визначення рівнів накопичення BSX або XynВ будували калібрувальні криві шляхом інкубації відомих кількостей очищених, одержаних з мікроорганізмів BSX або XynВ, розведених у буфері для аналізу, з таблетками Xylazyme AX, одночасно з аналізом з Xylazyme AX, у якому використовувався матеріал трансгенних рослин. У таблиці 1 нижче продемонстрована активність ферментів, виявлена в трансгенних рослинах. Як зазначено, активність ферменту була виявлена для декількох ксиланаз, ендоглюканаз, целобіогідролаз і ферулоїлестераз. Для кожної трансгенної події виявлену активність ферментів також підтверджували за допомогою вестерн-блотингу. "N/A" стосується ще не проведеного аналізу. 35 22 UA 112643 C2 5 10 15 Аналіз вуглеводного складу біомаси Перед аналізом вуглеводного складу 3,0 г висушеної повітрям подрібненої соломи в двох екземплярах кип'ятили зі зворотним холодильником з 90 % (об./об.) етанолом з використанням скляної системи екстракції Soxhlet (Fisher Scientific, Pittsburg, PA) для видалення екстрагованих етанолом матеріалів згідно зі стандартами NREL (NREL/TP-510-42619). Екстракти, що містять етанол, упарювали у вакуумі з використанням роторного випарника, обладнаного водяною банею, установленою на 40 °C (Heidolph LR4000 G5B, IL USA). Склад екстракту визначали по масі твердих речовин у колбі після сушіння в сушильній шафі при 50 °C протягом 48 годин. Солому, що не містить екстракту, піддавали двостадійному кислотному гідролізу (NREL/TP510-42618), спочатку гідролізуючи при 30 °C за допомогою 1,5 мл 72 % (об./об.) H2SO4 на 0,160,18 г (повітряно-суха маса) протягом 60 хв., а потім при 121 °C протягом 1 години з додаванням 42,0 мл води. Після кислотного гідролізу додавали гідроксид натрію і гідроксид кальцію для доведення pН до значення від 4,0 до 9,0 і всі зразки фільтрували через 0,2-мкм PVDF-фільтри (Fisher Scientific, Pittsburg, PA) для аналізу за допомогою високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ). Об'єднаний спосіб з помірною попередньою обробкою й оцукрюванням 23 UA 112643 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Щоб оцінити ефект експресованих рослиною ферментів CWD на гідроліз соломи, був розроблений об'єднаний спосіб, що включає м'яку попередню обробку з наступним ферментативним гідролізом без промивання біомаси між стадіями/детоксикації. В об'єднаному процесі усунуті які-небудь стадії промивання/розділення/детоксикації і він дозволяє інтегровану попередню обробку й одночасний процес оцукрювання і ферментації (SSF). Помірна попередня обробка. Була розроблена ефективна м'яка попередня обробка, яка може досягти деяких ефектів попередньої обробки біомаси, але не інактивує гідролітичні ферменти в рослині. Хімічним реагентом для попередньої обробки була суміш 0,02-0,18M бісульфіту амонію і 0,025-0,20M карбонату амонію з pН від 5,0 до 9,0, переважно близько 8,10. Для оцінки гідролізу соломи рослини, 20,0 мг подрібненої кукурудзяної соломи додавали в 2-мл мікроцентрифужні пробірки з хімічним розчином для попередньої обробки зі співвідношенням рідини і твердої речовини (L/S), що складає 10 або менше (переважно 3-6). Суміш для попередньої обробки інкубували в пристрої для струшування при 350 об./хв. і температурі 40 °C-95 °C протягом 0-16 годин. Для подрібненої і неподрібненої соломи, після механічного очищення або дефібрилювання йшла попередня обробка хімічними реагентами. Далі попередньо оброблений матеріал піддавали ферментативному гідролізу без промивання між стадіями. Ферментативний гідроліз. Попередньо оброблену солому піддавали ферментативному гідролізу в полібуфері Бріттона-Робінсона (40 мМ фосфат, 40 мМ ацетат, 40 мМ борат) з азидом натрію. Ферментативний гідроліз проводили при вмісті твердих речовин 2 % (мас./об.), pН 4,9, 50 °C у пристрої для струшування New Brunswick (New Brunswick Scientific, New Jersey, США) при 250 об./хв. протягом різних періодів часу (0-144 годин). Як коктейль #1 додавали 0,5 мкМ ендоглюканазу, 0,1 мкМ целобіогідролазу (CBHI), 0,05 мкМ β-глікозидазу і 0,5 мкМ ендоксиланазу в розрахунку на 10,0 мг соломи з реакційним об'ємом 1 мл. Коктейль 5# являв собою коктейль #1 з додаванням 0,1 мкМ β-ксилозидази. У сукупності, паралельно проводили три типи ферментативного гідролізу: без коктейлю ферментів (NCt), повний коктейль ферментів (FCt) і коктейль ферментів, позбавлений експресованого в рослині ферменту (Ct-PE), наприклад коктейль ферментів, позбавлений ендоксиланази (Ct-Xyn) або ендоглюканази (CtEG), або обох з них (Ct-EG-Xyn), залежно від ферменту, експресованого в рослинах. Accellerase® 1500 додавали в кількості 0,2 мл/г сухої маси і Accellerase® XY додавали в кількості 0,1 мл/г сухої маси. Виходи глюкози і ксилози (% від теоретичної величини) виражали як відсоток загального вмісту глюкози і ксилози в кожному субстраті. Планки похибки на прикладених кресленнях являють собою стандартне відхилення від середнього значення в повтореннях аналізу. Одночасне оцукрювання і ферментація (SSF) Інокулят одержували шляхом вирощування штаму дріжджів Saccharomyces cerevisiae D5A до OD600 0,5 у YPD (10 г/л дріжджового екстракту, 20 г/л пептону і 20 г/л декстрози) при 30 °C і 250 об./хв. Клітини збирали центрифугуванням (3000 g протягом 5 хв.) і ресуспендували в 1X YP (10 г/л дріжджового екстракту і 20 г/л пептону). Експерименти SSF проводили в двох екземплярах у 250-мл скляних колбах Ерленмейєра з робочим об'ємом 50 мл, що містили 3,0-4,0 г (маса сухої речовини) попередньо обробленої біомаси, буфер Бріттона-Робінсона, 10 × YP (100 г/л дріжджового екстракту і 200 г/л пептону), інокулят і гідролітичні ферменти. Колби закривали гумовою пробкою з повітряною пробкою. Експерименти починали шляхом додавання дріжджового інокуляту і ферментів (Accellerase® 1500 у кількості 10 FPU/г маси сухої речовини і Accellerase® XY у кількості 0,1 мл/г маси сухої речовини), і інкубували при 35 °C і 120 об./хв. протягом 7 діб. Узяття зразків проводили через 0, 24, 48, 72, 144 і 168 годин і аналізували відносно етанолу і цукрів. Аналіз ферментованих цукрів і етанолу Зразки гідролізату нагрівали при 90 °C протягом 20 хв., а потім центрифугували при 10000 g, після чого супернатанти очищали, пропускаючи через 0,20-мкм PVDF-фільтри (каталожний номер: 09-910-13, Fisher Scientific, Pittsburg, PA). Концентрації моносахаридів і дисахаридів визначали високоефективною рідинною хроматографією (ВЕРХ) з використанням бінарного насоса Shimadzu LC-20 AD із програмним забезпеченням LC solutions (Shimadzu, Kyoto, Японія). Концентрації цукрів визначали з використанням колонки для цукрів Aminex HPX-87P (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), що діє при 0,6 мл/хв. і 80 °C з дегазованою водою як рухомою фазою. Концентрацію етанолу у ферментаційному бульйоні аналізували з використанням кислотної колонки Aminex HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), що діє при 0,6 мл/хв., 60 °C з 0,004M сірчаною кислотою як рухомою фазою. Площі піків для всіх зразків, проаналізованих за допомогою детектора RI (RID 10AD), інтегрували і величини порівнювали зі стандартними кривими для кількісного визначення. 24 UA 112643 C2 5 Приклад 2. Аналіз вуглеводного складу соломи з рослин Солому з трансгенних рослин охарактеризовували з точки зору її складу структурних вуглеводів і вмісту цукрів для дослідження яких-небудь значних змін, викликаних генетичною модифікацією. У таблиці 2 представлені результати аналізу структурних вуглеводів з узятих випадковим чином зразків випадків трансгенної і нетрансгенної кукурудзи і проса. Вміст глюкану і ксилану з набору трансгенних рослин, як експресуючих один або декілька ферментів CWD, так і позбавлених трансгену, що кодує фермент CWD (трансгенний контроль TGC), є подібним з контрольними рослинами дикого типу (AxB). Таблиця 2 Вміст глюкану і ксилану в трансгенних рослинах (експресуючі CWD або TGC) проти нетрансгенних рослин дикого типу (AxB) Солома з рослин Контролі у вигляді кукурудзи дикого типу Контролі у вигляді трансгенної кукурудзи Трансгенна кукурудза з ферментами # випадків (n) Глюкан (г/100 г соломи) Ксилан (г/100 г соломи) 4 31,51±0,33 17,12±0,66 8 30,16±1,02 15,99±1,14 18 31,40±1,52 16,59±1,34 10 15 20 25 30 35 40 45 T-критерій Стьюдента для даних, представлених у таблиці 2, показує відсутність значимих відмінностей у кількості глюкану між випадками трансгенної кукурудзи, експресуючої ферменти CWD, і кукурудзою дикого типу AxB, або між випадками трансгенної кукурудзи, експресуючої ферменти CWD, і трансгенними контрольними випадками, що не експресують фермент CWD, зі значенням P 0,90 і 0,14, відповідно. Відповідні значення P, виходячи з t-критерію, для вмісту ксилану, складають 0,57 і 0,36, відповідно. Таким чином, експресія ферментів у рослинах забезпечує можливість одержання не тільки недорогих ферментів, але також сировини біомаси з гідролітичними ознаками для недорогого продукування ферментованих цукрів. Приклад 3. Ефект експресованих рослиною ферментів CWD на гідроліз біомаси Методологія оцінки гідролізу біомаси рослин Однією з цілей експресії ферментів CDW у рослинах є усунення або зниження важкості умов хімічної попередньої обробки для переробки лігноцелюлозної біомаси. Для оцінки ефектів експресованих рослиною ферментів CWD на гідроліз біомаси був розроблений об'єднаний процес з помірною хімічною попередньою обробкою (pН 5,0-9,0, 55 °C протягом 16 годин) з наступним ферментативним гідролізом (pН 4,9, 50 °C протягом 72 годин) без промивання між стадіями, і він був вибраний як стандартна методика для початкового скринінгу соломи з рослин. У цьому способі для оцінки використовували власні коктейлі ферментів (коктейль #1 і коктейль #5). Власний коктейль являє собою комбінацію індивідуальних ферментних компонентів, що дозволяє виключення кожного з компонентів, залежно від типу ферменту(ів), експресованого в рослині. Для кожної соломи з трансгенної рослини і соломи з рослини дикого типу або трансгенної контрольної рослини, паралельно проводили наступну обробку для ферментативного гідролізу: без коктейлю ферментів (NCt), повний коктейль (FCt) і коктейль, позбавлений ферменту, експресованого в рослині (Ct-PE; наприклад, коктейль, позбавлений ксиланази (Ct-Xyn), коктейль, позбавлений ендоглюканази (Ct-EG), або коктейль, позбавлений як ксиланази, так і ендоглюканази (Ct-Xyn-EG)). Для визначення того, який фермент або ферменти підтримують високу ефективність гідролізу, два критерії використовували для оцінки характеристик обробки трансгенних випадків, експресуючих ферменти CWD, при початковому скринингу: 1) загальний вихід цукрів після гідролізу повним коктейлем (FCt) (висота (1) на ФІГ. 2A, 2B); 2) відмінність у виході цукрів між способами гідролізу, що залучають повний коктейль (FCt) і коктейль ферментів без ферменту, що експресується в рослині (Ct-PE) (висота (2) на ФІГ. 2A, 2B). Загальна одержана кількість цукрів (висота (1)) після обробки є критерієм, який необхідно враховувати, оскільки це прямо впливає на вихід кінцевих продуктів, продуктивність і операційні витрати. За допомогою експресії в рослинах ферментів CWD було продемонстровано, що експресуючі ферменти трансгенні рослини досягали кращого загального гідролізу, ніж контрольна рослина, у тих же умовах обробки, що продемонстровано за допомогою загальних 25 UA 112643 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 виходів глюкози і ксилози на ФІГ. 2. Другий критерій - відмінність у виході цукрів між FCt і Ct-PE (висота (2)), відображує ефект експресованих рослиною ферментів на гідроліз. Було виявлено, що, при використанні цих трансгенних рослин як сировини біомаси, зовнішні ферменти в коктейлі ферментів можуть бути частково або повністю замінені ферментом CWD або ферментами CWD, експресованими в трансгенних рослинах, при досягненні подібного або рівного гідролізу, на що вказувала менша зміна або відсутність відмінностей у виході цукрів між гідролізом FCt і Ct-PE (ФІГ. 2B). Оцінка гідролізу соломи з рослин З використанням двох критеріїв селекції, зазначених вище, проводили ферментативний гідроліз зразків соломи за допомогою власного коктейлю для скринінгу ефективності різних трансгенних рослин кукурудзи, експресуючих ферменти CWD. Виходячи з результатів цього скринінгу, були ідентифіковані випадки трансгенних рослин з найкращою ефективністю, і вони включали експресуючі ксиланазу трансгенні рослини XynA.2015.05 і XynB.2063.17; експресуючі ендоглюканазу трансгенні рослини EGA.2049.10 і EGB.2042.03 і трансгенні рослини, експресуючі множину ферментів XynA/AccA/B.2096.01, XynA/AccB.2092.103, EGA/XynA.2242.09, XynB/EGA/CBHA.2345.116, XynB/EGA/CBHB.2349.55 XynB/EGA/CBHB.2349.56 і XynB/EGA/CBHB.2349.229. На ФІГ. 2 проілюстрований вихід глюкози (ФІГ. 2A) і ксилози (ФІГ. 2B) після гідролізу матеріалу з трансгенної рослини, експресуючої ксиланазу A (XynA; XynA.2015/05), і трансгенної контрольної рослини TGC.4000.12, яка не експресує фермент CWD (TGC.4000.12). Дані по виходу цукрів із трансгенного випадку XynA.2015.05 і трансгенного контролю після ферментативного гідролізу за допомогою FCt (власний коктейль #5), NCt і Ct-Xyn (власний коктейль #5, позбавлений ксиланази A) оцінювали з використанням описаних вище критеріїв селекції. Було показано, що величина загального виходу глюкози після обробки FCt (критерій 1) є більш високою, ніж різниця величин виходу глюкози між обробками FCt і Ct-Xyn (критерій 2) як для XynA.2015.05, так і для TGC.4000.12. Величина загального виходу глюкози і ксилози для всіх обробок була більш високою для трансгенного випадку XynA.2015.05, ніж для контрольної рослини TGC.4000.12. Цікаво, що відмінність у виходах глюкози і ксилози після обробки повним коктейлем ферментів і коктейлем ферментів без експресованої рослиною ксиланази A була дуже невеликою. Виходячи з цих результатів, ксиланаза A, експресована в рослині, була практично настільки ж ефективна відносно гідролізу соломи рослин, як і ксиланаза A, надана в повному коктейлі. Виходячи з критеріїв вибору 1 і 2, трансгенний випадок XynA.2015.05, показаний на ФІГ. 2, був ідентифікований як добре здійснюючий гідроліз. Рослини, експресуючі ксиланазу Відомо, що ксилан є переважною геміцелюлозою у твердій деревині, сільськогосподарських залишках, біомасі і багаторічних травах. Ксилан являє собою гетерополімерний біополімер, що складається з повторюваного кістяка ксилози з β-1,4-зв'язками, із приєднаними до нього групами гілок, і він може бути зшитим з лігніном ароматичними складними ефірами (Dodd D. and Cann I.O. 2009, Glob Change Biol. Bioenergy, 1:2). Руйнування й усунення ксилану сприяє гідролізу целюлози до ферментованих цукрів. У типовому коктейлі гідролітичних ферментів ксиланази є основним класом ферментів CWD, необхідним для гідролізу полімерів геміцелюлози, оскільки вони відіграють ключову роль у забезпеченні більшої доступності целюлози для ферментативного гідролізу. Посилаючись на ФІГ. 3B, ФІГ. 5B-5D і ФІГ. 7B, випадки трансгенних рослин, експресуючі XynA або XynB (XynB.2063.17, XynA/Acc/A/B.2096.01 і XynA.2015.05T1), продемонстрували на 29,80-172,1 % більш високу конверсію при гідролізі CtXyn, ніж контрольні рослини, що вказує на поліпшений ефект ксиланази, експресованої у рослинах, на гідроліз ксилану біомас. Аналогічно, ці трансгенні рослини також демонструють на 50,1-93,5 % більш високу конверсію глюкану при гідролізі Ct-Xyn, ніж контрольні рослини. На ФІГ. 3A, 3B проілюстровані виходи глюкози (ФІГ. 3A) і ксилози (ФІГ. 3B) з попередньо обробленої тканини трансгенної рослини, експресуючої ксиланазу B (XynB.2063.17), і контролю дикого типу (AxB) після гідролізу власним коктейлем #1 (FCt), коктейлем #1, позбавленим ксиланази B (Ct-Xyn), і без коктейлю (NCt). Результати обробки Ct-Xyn продемонстрували на 63,2 % більш високий вихід глюкози і на 109,4 % більш високий вихід ксилози з трансгенного випадку XynB.2063.17, ніж з контрольної рослини AxB. Збільшений гідроліз ксилану у випадку XynB.2063.17 також був очевидний з невеликої відмінності у величинах виходу ксилози між обробками FCt і Ct-Xyn (критерій 2). Ці результати показують несподівано високу ефективність ксиланази B, експресованої у рослинах, відносно гідролізу соломи в порівнянні з ферментом, наданим у повному коктейлі. Рослини, експресуючі целюлозу 26 UA 112643 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Відомо, що лігноцелюлозна біомаса складається з матриксу з множиною біополімерів, що переплітаються (целюлоза, геміцелюлози, лігнін і екстрактивні речовини), які вимагають декілька різних класів ферментів у великих кількостях, щоб ефективно вивільняти ферментовані цукри. Серед них ключовим ферментом є целюлаза. Три типи целюлаз: ендоглюканаза, екзоглюканаза і β-глюкозидаза, діють разом, здійснюючи гідроліз целюлози в глюкозу. У процесі гідролізу ендоглюканаза руйнує зшивки між ланцюгами целюлози, у той час як екзоглюканаза гідролізує окремі ланцюги глюкану і β-глюкозидаза руйнує продукти екзоглюканази до мономерів глюкози (Sticklen M.B. 2008, Nature Reviews Genetics, 9:433). На ФІГ. 4A, 4B показані результати гідролізу для трансгенних рослин, експресуючих ендоглюканази. На цих фігурах проілюстрований вихід глюкози з трансгенних випадків EGA.2049.02 і EGA.2049.10, що експресують ендоглюканазу A (EGA), і трансгенної контрольної рослини TGC.4000.12, яка позбавлена цього ферменту (ФІГ. 4A). На цих фігурах також проілюстрований вихід глюкози з трансгенного випадку EGB.2042.03, що експресує ендоглюканазу B (EGB), і трансгенної контрольної рослини TGC.2004.8.02 (ФІГ. 4B). Гідролітичні обробки проводили з повним коктейлем ферментів #1 (FCt), коктейлем ферментів, позбавленим ендоглюканази (Ct-EG), і без ферментів (NCt). Для експресуючих EGA випадків кукурудзи, як EGA.2049.02, так і EGA.2049.10, досягали на 48,9-126,9 % більш високої конверсії глюкану в порівнянні з трансгенною контрольною рослиною (TGC.4000.12) (ФІГ. 4A). Відмінність у виходах глюкози між гідролізом Ct-EG і FCt є незначною для EGA.2049.10 і приблизно на 29,1 % нижче для TGC.4000.12. Подібні спостереження, виходячи з критерію 2, були зроблені для трансгенного випадку EGA.2049.02. Посилаючись на ФІГ. 4B, експресуюча EGB трансгенна рослина EGB.2042.0 демонструє на 63,6 % більш високу конверсію глюкану після гідролізу CtEG, ніж трансгенний контроль TGC.2004.8.02. Несподівано, вихід глюкози після гідролізу EGB.2042.03 був тільки на 12,2 % нижче, ніж після гідролізу FCt, у порівнянні з на 23,0 % більш низькою величиною після відповідної обробки TGC.2004.8.02. Ці дані показують приблизно на 50,0 % кращий гідроліз для експресуючої EGB рослини, ніж для контрольної рослини. Рослини, експресуючі множину ферментів Для розробки ефективної і недорогої системи продукування ферментів для швидкої і менш дорогої деполімеризації біомаси, декілька ферментів, використовуваних у коктейлі гідролітичних ферментів, експресували в кукурудзі. На ФІГ. 5A-5D і ФІГ. 6A, 6B показані результати гідролізу трансгенних рослин XynA/AccA/B.2096.05, XynA/AccA/B.2096.01, EGA/XynA.2242.09, XynB/EGA/CBHB.2349.56, XynB/EGA/CBHB.2349.55 і XynB/EGA/CBHA.2345.116, що експресують множину ферментів. На ФІГ. 5A, 5B проілюстровані дані ферментативного гідролізу попередньо оброблених трансгенних рослин кукурудзи XynA/AccA/B.2096.01, XynA/AccA/B.2096.05, експресуючих ксиланазу A (XynA) і допоміжні ферменти (Acc), і трансгенної контрольної рослини TGC.2004.8.02 після обробки повним коктейлем #1 (FCt), коктейлем #1 без ксиланази (Ct-Xyn) і без коктейлю (NCt). Вихід глюкози (ФІГ. 5A) після гідролізу Ct-Xyn трансгенних випадків XynA/AccA/B.2096.01, XynA/AccA/B.2096.05, відповідно, на 80,4 % і 93,5 % перевищує вихід глюкози з контрольної рослини TGC.2004.8.02. Посилаючись на ФІГ. 5C, несподівано більш високий вихід глюкози після гідролізу EGA/XynA.2242.09 за допомогою Ct-Xyn-EG може бути пояснений синергічним гідролітичним ефектом. Аналогічно, ефективність конверсії ксилану, виходячи з виходу ксилози (ФІГ. 5B), після гідролізу CT-Xyn трансгенних тканин з XynA/AccA/B.2096.01, XynA/AccA/B.2096.05, відповідно, на 143,4 % і 172,1 % перевищує ефективність конверсії ксилану в контрольній рослині TGC.2004.8.02. Виявлена висока ефективність конверсії ксилану для цих трансгенних випадків також може бути приписана синергічному ефекту декількох ферментів. На ФІГ. 5 проілюстрований вихід глюкози (ФІГ. 5C) і ксилози (ФІГ. 5D) для випадку трансгенної кукурудзи EGA/XynA.2242.09, одночасно експресуючої ендоглюканазу A (EGA) і ксиланазу A (XynA), після ферментативних обробок повним коктейлем #1 (FCt), коктейлем #1, позбавленим ксиланази (Ct-Xyn), коктейлем #1, позбавленим ендоглюканази (Ct-EG), і коктейлем #1, позбавленим ксиланази і ендоглюканази (Ct-Xyn-EG). Експресія XynA у рослині приводить до збільшених виходів глюкози і ксилози для EGA/XynA.2242.09 після гідролізу. Наприклад, при обробці Ct-Xyn трансгенні випадки продемонстрували на 50,1 % більш високу ефективність конверсії глюкану (ФІГ. 5C) і на 29,8 % більш високу ефективність конверсії ксилану (ФІГ. 5D) відносно контрольної рослини. Експресія EGA у рослинах приводить до збільшеної ефективності гідролізу глюкану, про яку свідчить відмінність у виходах глюкози між обробками FCt, Ct-EG і Ct-Xyn-EG. На ФІГ.6A, 6B проілюстрований вихід глюкози (ФІГ. 6A) і ксилози (ФІГ. 6B) з 1) трансгенних випадків, одночасно експресуючих три ферменти CWD (XynB/EGA/CBHB.2349.56 і 27 UA 112643 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 XynB/EGA/CBHB.2349.55, які одночасно експресують ксиланазу B, ендоглюканазу A (EGA), целобіогідролазу B, і XynB/EGA/CBHA.2345.116, що одночасно експресує ксиланазу B, ендоглюканазу A (EGA) і целобіогідролазу A), і 2) контрольної рослини дикого типу AxB. Показані результати обробки повним коктейлем (FCt) і без ферментів (NCt). Попередня обробка включала 0,17M бісульфіт амонію і карбонат амонію (BSC), співвідношення рідини і твердої речовини, що дорівнює 10, при 55 °C протягом 17 годин. Ферментативний гідроліз соломи проводили при 50 °C, pН 5,0, протягом трьох діб з використанням 0,2/0,1 мл Accellerase® 1500/XY на грам соломи. Посилаючись на ФІГ. 6, результати показують, що виходи глюкози і ксилози з трансгенних рослин, експресуючих три ферменти CWD, були значно більш високими, ніж з контрольної рослини дикого типу. Несподівано, випадок з найбільшою ефективністю XynB/EGA/CBHB.2345.56 показав на 43,6 % більш високий вихід глюкози і на 117,6 % більш високий вихід ксилози, ніж негативний контроль (AxB), після дуже помірної попередньої хімічної обробки. Рослини другого покоління, експресуючі ферменти CWD Рослина першого покоління (T0) XynA.2015.05 була ідентифікована як хороший кандидат для гідролізу. Для подальшої оцінки цього випадку і відповідної конструкції ферменту (XynA), насіння цього випадку висівали з одержанням потомства другого покоління T1. Оцінка результатів гідролізу для рослин XynA.2015.05 T0 і T1 представлена на ФІГ. 7B. Два критерії, використані для оцінки рослин T0, також використовували для оцінки ефективності гідролізу для рослин, одержаних у T1, і для демонстрації того, що ферменти можуть бути ефективними в цьому виді. На ФІГ. 7B показані виходи глюкози (ФІГ. 7A) з рослин проса, одержаних з використанням pAG2015, і виходи ксилози (ФІГ. 7B) із трансгенного випадку T0 XynA.2015.05T0, експресуючого ксиланазу A, трансгенного випадку T1 XynA.2015.05T1, експресуючого ксиланазу A, і трансгенної контрольної рослини, позбавленої ферменту TGC.4000.11. Гідроліз проводили повним коктейлем (FCt), коктейлем, позбавленим ксиланази (Ct-Xyn), і без обробки коктейлем ферментів (NCt). Для обробки Ct-Xyn трансгенний випадок першого покоління XynA.2015.05T1 продемонстрував на 55,3 % більш високий гідроліз глюкану і на 101,6 % більш високий гідроліз ксилану, виходячи з виходів глюкози і ксилози, аналогічно тому, як і випадок першого покоління XynA.2015.05T0, і більш високий вихід цукрів для контрольної рослини TGC.4000.12. Ці дані показують, що ферменти, експресовані в рослинах, є успадковуваними і зберігають активність у наступних поколіннях трансгенних рослин. Різні види рослин На доповнення до трансгенних випадків кукурудзи, одержували рослини проса, експресуючі ксиланазу A, шляхом трансформації вектором pAG2015. Коли ксиланазу A з XynA.2015.05, що добре здійснює гідроліз, експресували в просі шляхом трансформації тією же конструкцією (pAG2015), одержане трансгенне просо XynA.pv2015.3c також продемонструвало кращу конверсію глюкану і ксилану відносно контрольного проса Alamo. На ФІГ. 8 проілюстровані виходи глюкози (ФІГ. 8A) і ксилози (ФІГ. 8B) після гідролізу попередньо оброблених випадків трансгенного проса XynA.pv2015.3c, XynA.pv2015.4c і контрольної рослини проса дикого типу (Alamo) при обробці повним коктейлем (FCt), коктейлем ферментів, позбавленим ксиланази (CtXyn), і без ферментів (NCT). Обидва трансгенних випадки XynA.pv2015.3c і XynA.pv2015.4c показали кращий гідроліз, ніж контрольне просо (Alamo). Випадок з найбільшою ефективністю XynA.pv2015.3c продемонстрував приблизно на 30,0 % більш високу ефективність конверсії глюкану і на 50,0 % більш високу ефективність конверсії ксилану в порівнянні з контрольною рослиною. Ці дані показують, що одна і таж ознака гідролізу може бути збережена серед видів, експресуючих ферменти в рослинах. Рослини, експресуючі модифіковані інтеїном ферменти Щоб уникнути шкідливих ефектів накопичення в рослинах ферментів CWD на ріст рослин, були розроблені і експресовані в рослинах модифіковані інтеїном ферменти для досягнення бажаної ефективності гідролізу без виникнення фенотипічних аномалій у рослинах. На ФІГ. 9 проілюстрований вихід глюкози (ФІГ. 9A) і ксилози (ФІГ. 9B) після гідролізу попередньо обробленої рослини iXynA.2229.110, експресуючої модифіковану інтеїном XynA, і контрольної рослини дикого типу AxB при обробці FCt, Ct-Xyn і NCt. Температура попередньої обробки вище 50 °C індукувала сплайсинг інтеїну в iXynA.2229.110. Гідроліз за допомогою Ct-Xyn демонструє на 66,0 % більш високу ефективність конверсії глюкану і на 57,3 % більш високу ефективність конверсії ксилану для iXynA.2229.110, ніж для контрольної рослини AxB. Усі трансгенні рослини iXynA.2229.110 були нормальними. Дані аналізу складу вуглеводів показали відсутність значимих відмінностей у кількостях глюкану і ксилану між трансгенними рослинами, експресуючими гідролітичний фермент або 28
ДивитисяДодаткова інформація
Автори англійськоюRaab, R. Michael, Zhang, Dongcheng, Bougri, Oleg
Автори російськоюРааб Р. Майкл, Чжан Дунчэн, Бугри Олег
МПК / Мітки
МПК: C10L 5/44, C12N 9/42, C12N 9/24, C12P 19/14, C12N 15/82
Мітки: розчинних, рослин, одержання, спосіб, генетично, стінку, клітинну, ферменти, експресують, деградуючі, модифікованих, цукрів
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/316-112643-sposib-oderzhannya-rozchinnikh-cukriv-z-genetichno-modifikovanikh-roslin-shho-ekspresuyut-fermenti-degraduyuchi-klitinnu-stinku.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб одержання розчинних цукрів з генетично модифікованих рослин, що експресують ферменти, деградуючі клітинну стінку</a>
Застосування генетично сконструйованих клітин, які експресують на поверхні білок гена активації лімфоцитів (lag-3), для захисту трансплантата від відторгнення та спосіб індукції специфічного захисту від відторг
Номер патенту: 73270
Опубліковано: 15.07.2005
Автори: Біффоні Мауро, Папоян Рубен
МПК: A01K 67/027, A61K 35/12, C07K 14/705, A61P 37/02, A61K 48/00, C12N 5/10, A61K 38/17, C12N 15/19, C12N 15/09
Мітки: клітин, lag-3, застосування, поверхні, індукції, захисту, експресують, спосіб, активації, сконструйованих, відторгнення, білок, трансплантата, лімфоцитів, гена, генетично, відторг, специфічного
Формула / Реферат:
1. Застосування генетично сконструйованих клітин, що містять ДНК, яка кодує трансмембранний білок гена активації лімфоцитів (LAG-3), що експресується на поверхні згаданих клітин, для виробництва лікарського засобу для індукції захисту трансплантата від відторгнення імунною системою.2. Застосування за п. 1, де вказана ДНК, яка кодує білок LAG-3, є екзогенною.3. Застосування за п. 1, де вказана ДНК, яка кодує білок LAG-3, є...
Спосіб одержання генетично трансформованих рослин з підвищеним вмістом крохмалю, рекомбінантна дволанцюгова днк-молекула
Номер патенту: 43827
Опубліковано: 15.01.2002
Автор: Ганеш Мерфі Кішор
МПК: C12N 15/54, C12N 15/82, C12N 15/31, A01H 5/00, C12N 5/10, C12N 9/12, C12P 19/04, C12N 15/09
Мітки: підвищеним, дволанцюгова, одержання, рослин, крохмалю, вмістом, генетично, спосіб, рекомбінантна, днк-молекула, трансформованих
Формула / Реферат:
1. Способ получения генетически трансформированных растений с повышенным содержанием крахмала, отличающийся тем, что осуществляют следующие стадии:(a) введение в геном клетки растения рекомбинантной двухцепочечной ДНК-молекулы, состоящей из;(і) промотора, действие которого в растениях вызывает продуцирование РНК-последовательности в целевых тканях растения;(ii) структурной ДНК-последовательности, вызывающей продуцирование...
Спосіб дослідження продуктів цукрового виробництва на вміст генетично модифікованих організмів
Номер патенту: 66390
Опубліковано: 26.12.2011
Автори: Міронова Галина Серафимівна, Ігнатов Ігор Валентинович
МПК: A01H 1/00, C13B 99/00
Мітки: модифікованих, цукрового, спосіб, вміст, виробництва, дослідження, продуктів, організмів, генетично
Формула / Реферат:
Спосіб дослідження продуктів цукрового виробництва на вміст генетично модифікованих організмів, що включає відбір проб для виявлення генетично модифікованих організмів, екстрагування, виявлення генетично модифікованих організмів, ідентифікація, якісне визначення, засноване на полімеразній ланцюговій реакції, який відрізняється тим, що на першому етапі проводять аналіз бурякового насіння, згідно з яким здійснюють відбір проб бурякового насіння...
Тест-система для визначення якісного та кількісного вмісту генетично модифікованих організмів (гмо) в харчових продуктах методом полімерної ланцюгової реакції в реальному часі (плр-рч)
Номер патенту: 72083
Опубліковано: 10.08.2012
Автори: Северинов Дмитро Олександрович, Ример Віктор Давидович, Голубець Руслан Анатолійович, Новак Ніна Богданівна, Малієнко Вадим Анатолійович, Облап Руслан Васильович, Семенович Володимир Костянтинович
МПК: C12N 15/00
Мітки: якісного, часі, полімерної, кількісного, вмісту, реальному, тест-система, реакції, харчових, продуктах, модифікованих, генетично, гмо, ланцюгової, методом, плр-рч, визначення, організмів
Формула / Реферат:
Тест-система для визначення якісного та кількісного вмісту генетично модифікованих організмів (ГМО) в харчових продуктах методом полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі (ПЛР-РЧ), яка містить набір реагентів для екстрагування ДНК, суміш для проведення полімеразної ланцюгової реакції, Taq-полімеразу, сертифіковані стандартні зразки ДНК трансгенних культур, яка відрізняється тим, що містить оригінальну панель олігонуклеотидних...
Процес ферментації за участю генетично модифікованих дріжджів та спосіб здійснення ферментації
Номер патенту: 88437
Опубліковано: 26.10.2009
Автори: Ращ Бріан, ван Хоек Пім, Арістідоу Арістос
МПК: C12N 1/19, C12N 1/16, C12N 15/81, C12P 17/02, C12P 7/40
Мітки: генетично, модифікованих, участю, здійснення, спосіб, процес, дріжджів, ферментації
Формула / Реферат:
1. Процес ферментації, який відрізняється тим, що мікроорганізм, яким є генетично модифіковані дріжджі, що мають розрив нативного шляху метаболізму PDC, перетворює шляхом ферментації ферментаційний субстрат, а питому швидкість поглинання кисню контролюють протягом виробничої фази цього процесу ферментації і принаймні один робочий параметр регулюють у відповідності з виміряною швидкістю поглинання кисню, причому концентрацію розчиненого кисню...
Попередній патент: Спосіб нагрівання повітронагрівника доменної печі
Наступний патент: Пристрій та спосіб зварювання тертям пристрою для зберігання електричної енергії
Випадковий патент: Спосіб обмеження розвитку планктонних ціанобактерій у декоративних і рибоводних водоймах