Застосування сполук, які беруть участь в біосинтезі нуклеїнових кислот як кріопротективні агенти

1. Заморожена або ліофільно-висушена культура прямого внесення, яка включає заквасочну культуру для приготування ферментованих харчових продуктів та один або декілька кріопротективних агентів, вибраних з групи, яка складається з інозин-5'-монофосфату (ІМФ), уранозин-5'монофосфату (УМФ) та цитидин-5'-монофосфату (ЦМФ) та інозиту. 2. Культура за п. 1, яка відрізняється тим, що один або декілька кріопротективних агентів являють собою агент або суміш агентів, яка, на додаток до її кріопротективності, виявляє бустерний ефект. 3. Культура за п. 1, яка відрізняється тим, що кріопротективний агент являє собою інозин-5'монофосфат (ІМФ). UA (21) a200600911 (22) 02.07.2004 (24) 27.07.2009 (86) PCT/DK2004/000477, 02.07.2004 (31) 03077079.6 (32) 02.07.2003 (33) EP (46) 27.07.2009, Бюл.№ 14, 2009 р. (72) КРІНГЕЛУМ БЕРГЕ ВІНДЕЛЬ, DK, СОРЕНСЕН НІЛЬС МАРТІН, DK, СОРЕНСЕН ПЕТЕР, DK (73) КР. ХАНСЕН А/С, DK (56) CARCOBA R ET AL: "Influence of cryoprotectants on the viability and acidifying activity of frozen and freeze-dried cells of the novel starter strain Lactococcus lactis ssp. lactis CECT 5180" EUROPEAN FOOD RESEARCH AND TECHNOLOGY, SPRINGER VERLAG, HEIDELBERG, DE, vol. 211, no. 6, 2000, pages 433437. FONT DE VALDEZ G ET AL: "COMPARATIVE STUDY OF THE EFFICIENCY OF SOME ADDITIVES IN PROTECTING LACTIC-ACID BACTERIA AGAINST FREEZE DRYING" CRYOBIOLOGY, vol. 20, no. 5, 1983, pages 560566. FONSECA ET AL: "Operating conditions that affect the resistance of lactic acidic bacteria to freezing and frozen storage" CRYOBIOLOGY, ACADEMIC PRESS INC, US, vol. 43, November 2001 (2001-11), pages 189-198. DATABASE BIOSIS [Online] BIOSCIENCES INFORMATION SERVICE, PHILADELPHIA, PA, US; 1991, SCHMIDT J L ET AL: "CRYOPRESERVATION OF YEASTS AND MOLDS CULTURES FROM CHEESE FACTORIES" XP002295730 Database accession no. PREV199293004147 & SCIENCES DES ALIMENTS, vol. 11, no. 4, 1991, pages 653-672. DATABASE BIOSIS [Online] BIOSCIENCES INFORMATION SERVICE, PHILADELPHIA, PA, US; March 2001 (2001-03), PETER G ET AL: "The effect of growth phase, cryoprotectants and freezing rates on the survival of selected micro-organisms during freezing and thawing" XP002295731 Database 2 (19) 1 3 87462 4 4. Культура за п. 1, яка відрізняється тим, що (ІМФ), уранозин-5'-монофосфату (УМФ) і цитидинвона включає від приблизно 0,1 % до приблизно 5'-монофосфату (ЦМФ) та інозиту, до концентро20 % кріопротективного агента або суміші агентів. ваної заквасочної культури життєздатних мікроор5. Культура за п. 4, яка відрізняється тим, що ганізмів, заморожування та пакування заморожевона включає від приблизно 2 % до приблизно 5 % ного матеріалу придатним чином. 17. Спосіб за п. 16, який відрізняється тим, що кріопротективного агента або суміші агентів. 6. Культура за будь-яким з пп. 1-5, яка відрізнямікроорганізм заквасочної культури являє собою ється тим, що вона є ліофільно-висушеною. Lactoccocus spp., який включає один або декілька 7. Культура за будь-яким з пп. 1-5, яка відрізняз Lactococcus lactis підвид lactis і Lactococcus lactis ється тим, що вона є заквасочною культурою. підвид cremoris. 8. Культура за будь-яким з пп. 1-5, яка відрізня18. Спосіб за п. 16, який відрізняється тим, що ється тим, що вона включає один або декілька мікроорганізм заквасочної культури являє собою організмів, вибраних з групи, що включає Lactobacillus spp., який включає Lactobacillus Bifidobacterium spp., Brevibacterium spp., acidophilus. 19. Спосіб за п. 16, який відрізняється тим, що Propionibacterium spp., Lactococcus spp., Lactobacillus spp., Streptococcus spp., Enterococcus мікроорганізм заквасочної культури являє собою spp., Pediococcus spp., Leuconostoc spp., гриб, який включає один або декілька з Penicillium Oenococcus spp. або гриби. spp., Cryptococcus spp., Debraryomyces spp., 9. Культура за п. 6, яка відрізняється тим, що Klyveromyces spp. і Saccharomyces spp. вона включає один або декілька мезофільних мік20. Спосіб отримання ліофільно-висушеної кульроорганізмів, що мають оптимальну температуру тури прямого внесення, що включає додавання росту близько 30 °C. одного або декількох кріопротективних агентів, 10. Культура за п. 9, яка відрізняється тим, що вибраних з групи, яка складається з інозин-5'вона включає один або декілька мезофільних мікмонофосфату (ІМФ), уранозин-5'-монофосфату роорганізмів, вибраних з групи, яка включає (УМФ) і цитидин-5'-монофосфату (ЦМФ) та інозиту, Lactococcus lactis, Lactococcus lactis підвид до концентрованої біомаси життєздатних мікроорcremoris, Leuconostoc mesenteroides підвид ганізмів заквасочної культури, заморожування і cremoris, Pediococcus pentosaceus, Lactococcus сублімацію води з замороженого матеріалу, та lactis підвид lactis біовар diacetylactis, Lactobacillus пакування ліофільно-висушеного матеріалу приcasei підвид casei і Lactobacillus paracasei підвид датним чином. 21. Спосіб за п. 20, який відрізняється тим, що paracasei. 11. Культура за п. 6, яка відрізняється тим, що мікроорганізм заквасочної культури являє собою вона включає один або декілька термофільних Lactoccocus spp., який включає один або декілька мікроорганізмів, що мають оптимальні температуз Lactococcus lactis підвиду lactis і Lactococcus ри росту від приблизно 35 °C до приблизно 45 °C. lactis підвиду cremoris. 12. Культура за п. 11, яка відрізняється тим, що 22. Спосіб за п. 20, який відрізняється тим, що вона включає один або декілька термофільних мікроорганізм заквасочної культури являє собою мікроорганізмів, вибраних з групи, яка включає Lactobacillus spp., який включає Lactobacillus Streptococcus thermophilus, Enterococcus faecium, acidophilus. 23. Спосіб за п. 19, який відрізняється тим, що Lactobacillus delbrueckii підвид lactis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii підвид мікроорганізм заквасочної культури являє собою bulgaricus і Lactobacillus acidophilus. гриб, який включає один або декілька з Penicillium 13. Культура за п. 8, яка відрізняється тим, що з spp., Cryptococcus spp., Debraryomyces spp., Lactococcus spp. вона включає один або декілька з Klyveromyces spp. і Saccharomyces spp. Lactococcus lactis підвид lactis і Lactococcus lactis 24. Спосіб отримання ферментованого харчового підвид cremoris. продукту, що включає культивування вихідного 14. Культура за п. 13, яка відрізняється тим, що з молочного матеріалу з культурою за будь-яким з Lactobacillus spp. вона включає Lactobacillus попередніх пунктів і отримання ферментованого acidophilus. харчового продукту. 15. Культура за п. 8, яка відрізняється тим, що 25. Спосіб за п. 24, який відрізняється тим, що гриби включають один або декілька з Penicillium ферментований харчовий продукт являє собою spp., Cryptococcus spp., Debraryomyces spp., сколотини. 26. Спосіб за п. 24, який відрізняється тим, що Klyveromyces spp. і Saccharomyces spp. 16. Спосіб отримання замороженої культури пряферментований харчовий продукт являє собою мого внесення, що включає додавання одного або сир, вибраний з Чеддера, Гауди, Коттеджа, Еммедекількох кріопротективних агентів, вибраних з нталю, Грана, Моцарелли/Піци, Маасдамера і стагрупи, яка складається з інозин-5'-монофосфату білізованого Брі або Камамбера. Ця заявка претендує на пріоритет по даті попередньої заявки США №60/484,126, яка подана 2 липня 2003 року, і європейської патентної заявки № ЕР 03077079.6, яка подана 2 липня 2003 року, розкриття кожної з яких приведене тут як посилання в повному об'ємі. Винахід стосується галузі заморожених і ліофільно-висушених мікробних культур і сполук, що беруть участь в біосинтезі нуклеїнових кислот як кріопротективні агенти. Більш детально винахід стосується культур, отриманих при застосуванні таких агентів, які, в доповнення до кріопротектив 5 87462 6 заквашувальні культури звичайно мають оптиманої активності, додають збільшену метаболічну льну температуру приблизно 30°С, тоді як терактивність культурі при інокуляції в поживне семофільні культури мають оптимальну температуредовище для його ферментації або перетворенру приблизно 35-45°С [Nielsen і Ullum, 1999]. ня. Такі заморожені або ліофільно-висушені кульПриклади комерційних мезофільних змішаних тури корисні у виробництві численних харчових і культур включають: кормових продуктів. "О-культура", що включає Lactococcus lactis Мікроорганізми беруть участь у виробництві підвид lactis і Lactococcus lactis підвид cremoris. харчових і кормових продуктів, включаючи біль"D-культура", що включає Lactococcus lactis шість молочних продуктів. Культури бактерій, підвид lactis, Lactococcus lactis підвид cremoris і зокрема, культури бактерій які звичайно класифіLactococcus lactis підвид lactis біовар diacetylactis. куються як молочнокислі бактерії, є необхідними "L-культура", що включає Lactococcus lactis у виготовленні всіх ферментованих молочних підвид lactis, Lactococcus lactis підвид cremoris і продуктів, сиру і масла. Однак, культури деяких вид Leuconostoc. небактерійних мікроорганізмів, наприклад, деяких "LD-культура", що включає Lactococcus lactis дріжджів і грибів, застосовуються для обробки підвид lactis, Lactococcus lactis підвид cremoris, харчових і кормових продуктів. Культури цих мікLactococcus lactis підвид lactis біовар diacetylactis роорганізмів часто називаються заквашувальниі вид Leuconostoc. ми культурами і додають специфічні особливості О-культура застосовується для виготовлення різним молочним продуктам, виконуючи численну сиру без дірок (Чеддер, Чешир, Фета). D-культура кількість функцій. Заквашувальні культури широзастосовується для виготовлення масла. Lко застосовуються в різних галузях промисловоскультура застосовується для виготовлення сиру з ті, таких як молочна промисловість, також як у маленькими дірками (наприклад, сиру котедж) і виноробстві, і в сокопереробній промисловості, в звурджених молочних продуктів з низькою продумясообробній промисловості. кцією СО2. LD-культура застосовується для вигоКультури мікроорганізмів також знаходять товлення сиру з нормальними розмірами дірок, важливі застосування в біоконсервуванні харчозвурджених молочних продуктів і кислових продуктів [Andersen et al., 1997]. вершкового масла. У промисловому масштабі, Комерційні молочні заквашувальні культури LD-культури в цей час є одними із змішаних кульзвичайно складаються з бактерій, які ферментутур, що найбільш застосовуються. ють лактозу і лимонну кислоту. Молочнокислі Приклади комерційних термофільних змішабактерії означають групу Грам-позитивних, неруних культур включають: хомих, мікроаерофільних або анаеробних бакте"Йогуртову культуру", яка включає рій, які ферментують цукор з продукцією кислот, включаючи молочну кислоту. У промисловому Streptococcus thermophilus і Lactobacillus відношенні деякі з найбільш корисних молочноdelbrueckii підвид bulgaricus, і ''Термофільну сирну культуру", яка включає кислих бактерій включають рід Lactococcus, рід Streptococcus thermophilus і Lactobacillus Streptococcus, рід Enterococcus, рід Lactobacillus, helveticus. рід Leuconostoc і рід Pediococcus. Йогуртова культура застосовується для вигоПоширені штами молочних заквашувальних товлення йогурту і особливих італійських сирів, культур молочнокислих бактерій звичайно роздіТермофільна сирна культура застосовується для ляються на мезофільні організми, які мають опвиготовлення сиру Емменталер і деяких італійсьтимальні температури зростання близько 30°С і ких сирів. термофільні організми, які мають оптимальні теКрім того, як молочні заквашувальних кульмператури зростання в діапазоні від приблизно тури, особливо у виробництві сиру, часто засто35°С до приблизно 45°С. Приклади організмів, які совуються різновиди Propionibacterium. Як харчоналежать мезофільній групі включають ві заквашувальних культури звичайно також Lactococcus lactis підвид lactis, Lactococcus lactis застосовуються організми, які належать роду підвид cremoris, Leuconostoc mesenteroides підBrevibacterium і роду Bifidobacterium. вид cremoris, Pediococcus pentosaceus, Іншою групою мікробних заквашувальних Lactococcus lactis підвид lactis біовар diacetylactis культур є грибкові культури, включаючи культури і Lactobacillus paracasei підвид paracasei. Термодріжджів і культури філаментних грибів, які є кофільні штами молочнокислих бактерій включарисними у виробництві певних сортів сиру і напоють, наприклад, Streptococcus thermophilus, їв. Приклади включають Penicillium roqueforti, Enterococcus faecium, Lactobacillus delbrueckii Penicillium candidum, Geotrichum candidum, Torula підвид lactis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus kefir, Saccharomyces kefir і Saccharomyces delbrueckii підвид bulgaricus і Lactobacillus acidophilus. cerevisiae. Молочні заквашувальні культури також клаЗаквашувальні культури також широко застосифіковані по їх специфічному штамовому складу совуються в мясопереробній промисловості, наприклад для виробництва різних ковбас і салямі. і переважному виробничому застосуванню. Чиста Комерційні заквашувальні культури звичайно заквашувальна культура включає тільки єдиний розповсюджуються у вигляді заморожених кульвид, тоді як змішана культура включає два або тур. При низькій температурі заморожених кульдекілька різних видів. Заквашувальні культури тур, більшість метаболічних процесів в клітині часто класифікуються по температурі, при якій припиняється, і клітини можуть підтримуватися у вони показують оптимальне зростання або максимальну ферментативну активність. Мезофільні 7 87462 8 протективним агентом, може бути шкідливим. завислому, але життєздатному стані протягом Автори не знають ні про які комерційні доступні тривалих періодів. концентровані заморожені культури, які містять Комерційно дуже цікаві концентровані замозначні кількості кріопротективних агентів. рожені культури, оскільки культури можуть бути інокульовані безпосередньо в продукційний конАгенти крім вуглеводів, протеїнів і поверхнетейнер. При застосуванні концентрованих замово-активних агентів застосовувалися для поліпшення стійкості культур до низької температури. рожених культур, кінцевий споживач уникає інакше обов'язкового, який віднімає багато часу WO 00/39281 описує застосування ІМФ і сполук, що беруть участь в біосинтезі ДНК, для стапроміжного кроку ферментації, протягом якого білізації метаболічної активності рідких заквашузаквашувальна культура збільшується, і кінцевий вальних культур, але не стійкості заморожених споживач значно зменшує ризик контамінації. або ліофільно-висушених культур. Концентровані культури можуть називатися готоWO 00/19817 описує кріопротективну комповими до застосування у виробництві DVS™ кульзицію, в якій для кріопротекції застосовується не турами. будь-який окремий компонент, а комбінація споЯк альтернатива концентрованим заморожелук. Комбінація включає блокатор кальцієвого ним культурам, можуть бути приготовані конценканалу, матрицю поживної речовини клітини, вотровані ліофільно-висушені DVS™ культури. Ці ду і аденозин. Однак, застосування фармацевтикультури мають додаткову перевагу в тому, що чно активних сполук, таких як блокатори кальцієвони можуть перевозитися без охолоджування. вого каналу, не прийнятне для галузей харчової У основному, можливі ушкоджуючі впливи промисловості. заморожування і розморожування на життєздатJP 05308956 описує культуральне поживне ність живих клітин приписувалися дегідратації середовище для культури нітрифікуючих бактеклітини і формуванню кристалів льоду в цитозолі рій, яка включає високомолекулярний полісахав процесі заморожування. рид, в якому ланка, яка складається з 1 молекули Безліч кріопротективних агентів вважаються альфа-L-рамнози, 1 молекули D-глюкуронової такими, що впливають на концентрацію цитозолю кислоти і 2 молекул D-глюкози, полімеризована контрольованим і мінімально шкідливим чином лінійно, і, наприклад, АТФ. Нітрифікуючі бактерії, так, що в процесі заморожування кристалізація які культивуються в цьому поживному середовильоду в цитозолі запобігається або мінімізується. щі можуть бути заморожені і збережені. Немає Стаття F.J. Chavarri і інш. [Biotechnology ніякої вказівки, що компоненти поживного сереletters, vol 10, 1, 11-16 (1988),"Cryoprotective довища можуть функціонувати як кріопротективні agents for frozen concentrated starters from nonагенти при доданні до концентрованих культур до bitter Streptococcus Lactis strains"] описує, що заморожування. життєздатність замороженої чистої культури Залишається потреба в ефективних кріопроStreptococcus lactis при зберіганні може бути потективних агентах, які можуть бути додані до конліпшена доданням 5% лактози або 5% сахарози. центрованих культур, які застосовуються в харЛактоза або сахароза діяли як кріопротективні човій промисловості. агенти. Streptococcus lactis є колишньою назвою Вважалося, що не було ніяких значних проLactococcus lactis підвиду lactis. блем стійкості при зберіганні для комерційно реТочно так само стаття R. Carcoba et al [Eur левантних концентрованих заморожених культур Food Res Technol (2000) 211, 433-437, "Influence молочнокислих бактерій. Хоча загальновідомо, of cryoprotectants on the viability and acidifying що більшість живих клітин страждає від замороactivity of frozen and freeze-dried cells of the novel жування і подальшого розморожування, проблеstarter strain Lactococcus lactis subsp. lactis CECT ма життєздатності взагалі не розглядалася як 5180"] описує, що життєздатність зберігання зазначна для комерційно релевантних концентромороженої чистої культури Lactococcus lactis підваних заморожених культур молочнокислих баквиду lactis, могла бути поліпшена доданням різтерій. Тому комерційно доступні концентровані них кріопротективних агентів, таких як цукор заморожені культури не містять значних кількос(лактоза, сахароза і трегалоза), глутамінова кистей кріопротективних агентів. Це може бути вналота і желатин. слідок того, що деякі комерційні заквашувальні Життєздатність ліофільно-висушених культур культури, очевидно, дуже стійкі до ушкоджуючих може також бути поліпшена за допомогою кріоефектів заморожування і розморожування. протективних агентів. Наприклад ЕР259739 опиНаприклад, численна кількість досліджень сує численну кількість різних кріопротективних стійкості була виконана з комерційними концентагентів для ліофільно-висушених культур. рованими культурами молочнокислих бактерій, Існували різні підходи по забезпеченню кріоякі були заморожені протягом 2-3 місяців. 2-3протекції, такі як вуглеводи, протеши і певні поМісячні заморожені культури не показали ніякого верхнево-активні агенти. значного погіршення культуральної активності Загалом, для отримання кріопротективного протягом одного року при температурі нижче за ефекту потрібні відносно великі кількості кріопро45°С. Отже, вважалося, що комерційно релевантективних агентів. Незважаючи на те, що це тні культури не мали значних проблем стійкості представляє незначну проблему по деяких парапри зберіганні. метрах, це представляє значну проблему для Автори спостерігали наприклад, що заморообластей харчової промисловості, де навіть мале жені LD-культури мають значну втрату активності небажане відхилення у смаку ферментованого в межах перших 1-3 тижнів зберігання в замороабо обробленого продукту, яке викликане кріо 9 87462 10 ферментує цукор з продукцією кислот, включаюженому стані (як проілюстровано в прикладі 1). чи молочну кислоту (як переважно продуковану Далі, після перших декількох тижнів втрата актикислоту), оцтову кислоту і пропіонову кислоту. У вності була відносно незначною і відповідала промисловому відношенні найкорисніші молочнопопереднім відомим результатам, описаним викислі бактерії знайдені серед видів Lactococcus, ще. видів Streptococcus, видів Lactobacillus, видів Автори виявили невизнані проблеми стійкосLeuconostoc, видів Pediococcus, видів ті, що стосуються заморожування і початкової Brevibacterium, Enterococcus і видів фази зберігання для деяких типів комерційно Propionibacterium. Додатково, в групу молочнокирелевантних концентрованих заморожених кульслих бактерій звичайно включають бактерії, що тур молочнокислих бактерій, наприклад комерналежать групі облігатних анаеробних бактерій, ційно доступних заморожених LD-культур. Особбіфідобактерії, тобто види Bifidobacterium, які ливо, коли культури зберігаються при часто застосовуються як харчові заквашувальні температурі, яка підтримується сучасними прокультури самостійно або в комбінації з молочномисловими морозильними апаратами, звичайно кислими бактеріями. близько -50°С. Термін "концентрована" культура стосується Автори виявили новий клас кріопротективних композиції, яка має кількість життєздатних клітин агентів, які призначені для розв'язання як про(колонієутворювальних одиниць, КУО), яка склаблеми стійкості, так і додають збільшену метабо8 дає, принаймні, 10 КУО в мл, більш переважно, лічну активність культурі. принаймні, 109 КУО в мл, більш переважно, приОдин варіант здійснення винаходу стосується 10 наймні, 10 КУО в мл, більш переважно, принайконцентрованої замороженої або ліофільновисушеної культури, де культура включає один мні, 1011 КУО в мл, або більш переважно, при12 або декілька кріопротективних агентів, вибраних з наймні, 10 КУО в мл. Як може бути видно з групи, яка складається з однієї або декількох прикладів, концентрована культура може, наприсполук, що беруть участь в біосинтезі нуклеїноклад, бути отримана центрифугуванням. Термін "упаковка" повинен розумітися ширових кислот, або одного або декількох похідних ко. Він означає, що заморожена або ліофільнобудь-яких таких сполук. висушена культура упакована таким чином, що Кріопротективний агент переважно додається може бути надана користувачеві. Вона може бути до життєздатних бактерій до того як вони заморожуються або ліофілізуються. упакована в бутель, тетра-пак®, пакет, і т. д. Даний винахід також надає спосіб виготовТермін "кріопротективний агент" означає сублення замороженої культури або ліофільностанцію, яка здатна поліпшити стійкість до ушковисушеної культури, який включає наступні стадії: джуючих ефектів, викликаних заморожуванням і додання одного або декількох кріопротективних початковою фазою зберігання замороженої або агентів, вибраних з групи, яка складається з одніліофільно-висушеної культури. У даному контексєї або декількох сполук, що беруть участь в біоті це можуть бути окремі особливі кріопротективні синтезі нуклеїнових кислот, або одного або декіагенти, або це можуть бути два або декілька різлькох похідних будь-яких таких сполук до них агентів. Відповідно, ваговий процентний вміст життєздатних організмів; заморожування матерікріопротективного агента(ів) всередині культураалу для отримання замороженого матеріалу, і льного матеріалу повинен розумітися як сума упаковування замороженого (або ліофільнокількості кріопротективного агента(ів). Переважвисушеного) матеріалу відповідним чином. У разі ний спосіб визначення, чи є субстанція кріопротестворення ліофільно-висушеної культури спосіб ктивним агентом, який здатний поліпшити стійвключає стадію, де сублімація води від заморокість замороженої культури до ушкоджуючих женого матеріалу відбувається до стадії упаковефектів, викликаних заморожуванням і початкоки. вою фазою зберігання, полягає в розділенні Згідно з даним винаходом, також наданий культури, як описано тут, на два зразки, додаючи спосіб приготування харчових і кормових продукпевну кількість кріопротективного агента до однотів, який включає застосування культури згідно з го з них, заморожуючи їх обох і вимірювання підвинаходом. Переважно харчовий продукт вибракислювальної активності в релевантному культуний з продукту на основі молока, м'ясного продуральноиу середовищі (наприклад, молоці) в день кту, овочевого продукту і напою. заморожування і періодично (наприклад, до одноДодаткова перевага описаного тут нового го року) при зберіганні в замороженому стані. класу кріопротективних агентів полягає в тому, Якщо культура з кріопротективним агентом пощо вони зберігають не тільки життєздатність, але ліпшила активність, що вивчається за період збеі метаболічну активність відновлених клітин і не рігання (таку як поліпшену активність підкислення впливають на смак ферментованого або обробмолока), субстанція є кріопротективним агентом. леного продукту будь-яким несприятливим чиПрийнятний аналіз визначення активності підкисном. лення молока дається тут в демонстраційних До обговорення деталізованих варіантів здійприкладах. снення винаходу надане визначення специфічних Варіанти здійснення даного винаходу описані термінів різних аспектів, які стосуються і варіантів нижче, тільки як приклади. здійснення винаходу. Як обговорювалося раніше, вважається, що Використовуваний тут термін "молочнокисла концентровані заморожені або ліофільнобактерія" (LAB) визначає грам-позитивну, мікровисушені культури є стійкими. Однак, всупереч аероаерофільну або анаеробну бактерію, яка загальному переконанню в цій галузі, автори, на 11 87462 12 Тому було абсолютно дивним, коли експериподив, спостерігали невиявлені до цього часу менти показали, що ІМФ і деяка сполука(и), які проблеми стійкості, пов'язані із заморожуванням і беруть участь в біосинтезі нуклеїнових кислот, початковою фазою зберігання для деяких типів поліпшували стійкість і заморожених, і ліофільнокомерційно релевантних концентрованих замовисушених концентрованих культур. рожених культур молочнокислих бактерій, таких Як показано нижче в Прикладі 2, додання одяк комерційно доступні заморожені LD-культури, нієї такої сполуки, інозин-5'-монофосфату (ІМФ), див. Приклад 1 нижче. Передбачається, що подізначно поліпшує стійкість до ушкоджуючих ефекбні проблеми стійкості будуть широко розкриті, тів, індукованих заморожуванням і початковою коли комерційні заморожені або ліофільнофазою зберігання. Доповнення ІМФ також значно висушені культури будуть адекватно тестуватися. Для подолання цієї проблеми, була протесполіпшує стійкість ліофільно-висушеної культури тована численна кількість можливих агентів, щоб як проілюстровано нижче в прикладі 9. Нижче, з з'ясувати, чи здатні вони подолати проблему. прикладу 10 ясно, що як кріопротективні агенти є Серед протестованих агентів був агент (а), вибефективними не тільки ІМФ, але і більш широкий діапазон агентів, вибраних з групи, яка складараний з групи, яка складається з однієї або декіється із сполуки(ук), що бере участь в біосинтезі лькох сполук, що беруть участь в біосинтезі нукзаздалегідь були нуклеїнових кислот. леїнових кислот, які продемонстровані авторами по поліпшенню стійЯк проілюстровано в прикладі 10, і нуклеотикості незаморожених, рідких заквашувальних ди і нуклеозиди можуть бути застосовані як кріокультур. протективні агенти. WO 00/39281 описує застосування ІМФ і споТаким чином, в переважних варіантах здійслук, які беруть участь в біосинтезі ДНК для стабінення, кріопротективна сполука, корисна по полізації метаболічної активності рідких заквашуваліпшенню стійкості до ушкоджуючих ефектів, викликаних заморожуванням і початкової фазою льних культур, але на відміну від культур, які зберігання заквашувальної культури, є сполукою, залишаються рідкими під час охолоджування, культури, які заморожуються, зазнають безлічі вибраною з групи, яка включає сполуку, що бере потенційних ушкоджуючих проблем, які безпосеучасть в біосинтезі нуклеїнових кислот, включаюредньо стосуються процесу заморожування. чи групу пуринових основ, піримідинових основ, нуклеозидів і нуклеотидів. Прикладами подібних При температурі замерзання, коли культура сполук є інозин-5'-монофосфат (ІМФ), аденозинпочинає заморожуватися, і поза- і внутрішньоклі5'-монофосфат (АМФ), гуанозин-5'-монофосфат тинно формується лід, мікроорганізми зазнають (ГМФ), уранозин-5'-монофосфат (УМФ), цитидинзагибелі і пошкодження. Формування льоду нано5'-монофосфат (ЦМФ), аденін, гуанін, урацил, сить клітинам механічного пошкодження і, крім цитозин, гуанозин, уридин, цитидин, гіпоксантин, того, генерує високий позаклітинний осмотичний ксантин, гіпоксантин, оротидин, тимідин, інозин і тиск, який приводить до дегідратації клітини. Зміпохідне будь-яких таких сполук або їх суміші. ни в іонній силі і рН води внаслідок заморожування також приводять до порушення структури і Описаний раніше WO 00/19817 надає як кріофункції численних клітинних компонентів і макпротективну композицію композицію блокатора ромолекул, стабільність яких залежить від цих кальцієвого каналу, матриці поживної речовини чинників (Adams, 2000). клітини, води і аденозину, однак, можлива кріоВідмінність між проблемами стійкості рідких в протективна активність окремих компонентів, порівнянні із замороженими культурами може таких як, наприклад, аденозин не була обговоребути далі проілюстрована експериментом, про на. Однак, аденозин, можливо, неефективний як який повідомляє Mazur (1961). У цьому експерикріопротективний агент, як проілюстровано в применті клітини дріжджів були занурені у ванну при кладі 12 і 15, де аденозин справляє враження -15°С. Результат був такий, що 97% клітин вижизниження стійкості культур бактерій. Надалі, ли, коли система залишалася рідкою, але тільки Demetriou (WO 00/19817), застосовував аденозин 27% клітин вижило, коли, це зовнішнє поживне в кількостях від 2,7 до 3,6мМ. Додатково, експесередовище заморожувалася до -15°С (Mazur рименти авторів показують, що інозин досить 1961). ефективний як кріопротективний агент, і аденоТому критерії, які необхідно надати за допозин і інозин є пуриновими нуклеотидами. Це спомогою ефективного кріопротективного агента, стереження може бути поширене на монофосфазначно розрізнюються, в залежності від того, чи ти. Наші експерименти показують, що як розроблений кріопротективний агент для захисту кріопротективний агент є ефективним ІМФ, але рідких або заморожених культур, а отже, добавне АТФ. Це ще більш дивно, оскільки в організмі ки, які є ефективними кріопротективними агентаінозинова кислота (ІМФ) синтезується з аденіломи для рідких культур, можуть бути неефективні вої кислоти (АМФ) гідролітичним дезамінуванням (White, 1973). Таким чином, в переважному варідля заморожених культур. Один приклад такої анті здійснення винаходу один або декілька кріодобавки - це Na-форміат. Як описано в WO протективних агентів вибрані з групи піримідино00/39281 3% Na-форміат ефективний в збільвих нуклеотидів і інозину. шенні стійкості при зберіганні концентратів рідких У подальшому переважному варіанті здійсзаквашувальних культур молочнокислих бактерій. нення винаходу один або декілька кріопротективОднак, як проілюстровано нижче в Прикладі 15, них агентів вибрані з групи нуклеозидмонофос3% Na-форміат зменшує стійкість при зберіганні фатів. У переважному варіанті здійснення, замороженої заквашувальної культури молочнокислих бактерій. 13 87462 14 пазоні від 0,2% до 15%, більш переважно в мепринаймні, один або єдиний кріопротективний жах діапазону від 0,2% до 10%, більш переважно агент є ІМФ. в межах діапазону від 0,5% до 7%, і більш переВуглеводний або протеїновий типи кріопроважно в межах діапазону від 1% до 6% по вазі, тективних агентів взагалі не описані з приводу включаючи в межах діапазону від 2% до 5% кріозбільшення метаболічної активності розморожупротективного агента або суміші агентів, виміряваних або відновлених культур. Кріопротективні них у ваговому процентному вмісті в заморожеагенти винаходу в доповнення до їх кріопротекному матеріалі по вазі. У переважному варіанті тивної активності також можуть додавати збільздійснення культура включає приблизно 3% кріошену метаболічну активність (бустерний ефект) протективного агента або суміші агентів, вимірякультурі, коли вона інокулюється в поживне сених у ваговому процентному вмісті в заморожередовище для ферментації, обробки або переному матеріалі по вазі. Переважна кількість творення. приблизно 3% кріопротективного агента відповіТаким чином, один варіант здійснення винадає концентраціям в діапазоні 100мМ. Повинно ходу - це заморожена або ліофільно-висушена культура, в якій кріопротективний агент є агентом бути визнаним, що для кожного аспекту варіанту або сумішшю агентів, який, в доповнення до його здійснення винаходу діапазони можуть бути із кріопротективного, має бустерний ефект. збільшенням описаних діапазонів. Термін "матеріал" культури означає релеванВираз "бустерний ефект" застосовується для тні субстанції культури, що включають і життєопису ситуації, при якій кріопротективний агент додає збільшену метаболічну активність (бустерздатні бактерії і кріопротективний агент. Можлива ний ефект) розморожуваній або відновленій кульупаковка не включена. Отже, вага матеріалу турі, коли вона інокулюється в поживне середокультури не включає вагу можливої упаковки. вище для ферментації або перетворення. У випадку, коли культура є ліофільноЖиттєздатність і метаболічна активність - не сивисушеною культурою, переважне додання кріононімічні поняття. Комерційні заморожені або протективного агента або суміші агентів в кількості, яка знаходиться в діапазоні від 0,8% до 60% ліофільно-висушені культури можуть зберігати по вазі, або в межах діапазону від 0,8% до 55% свою життєздатність, незважаючи на те, що вони по вазі, або в межах діапазону від 1,3% до 40% можуть втрачати значну частку своєї метаболічної активності, наприклад, культури можуть втрапо вазі, або в межах діапазону від 3% до 30% по тити свою кислотопродукуючу (ацидифікуючу) вазі, або в межах діапазону від 6% до 25% по активність при зберіганні навіть протягом укоровазі, включаючи діапазон від 10% до 24% по вазі. чених проміжків часу. Таким чином, життєздатУ переважному варіанті здійснення ліофільноність і бустерний ефект повинні бути оцінені різвисушена культура включає приблизно 16% кріоними аналізами. Оскільки життєздатність оцінена протективного агенти або суміші агентів, виміряаналізами життєздатності, такими як детермінаних у ваговому процентному вмісті в ліофільноція колонієутворювальних одиниць, бустерний висушеному матеріалі по вазі. ефект оцінений кількісним визначенням релеванДодатково, заморожена або ліофільновисушена культура може містити додаткові тратної метаболічної активності розморожуваної або диційні добавки, включаючи поживні речовини, відновленої культури відносно життєздатності культури. такі як екстракт дріжджів, цукор, антиоксиданти, інертні гази і вітаміни і т. д. Як додаткова добавка Аналіз підкислювальної активності, описаний до культури згідно з винаходом також можуть нижче, є одним прикладом аналізу, що кількісно застосовуватися сурфактанти, включаючи сполувизначає релевантну метаболічну активність розморожуваної або відновленої культури. Буски Tween®. терний ефект далі проілюстрований в Прикладі 3. Додаткові приклади таких традиційних добавок, які, крім того, можуть бути додані до культуНезважаючи на те, що тут ілюструється кисри згідно з винаходом, можуть бути вибрані з лотопродукуюча активність, цей винахід признапротеїнів, гідролізатів протеїнів і амінокислот. чений, щоб охопити стабілізацію будь-яких типів Переважні прийнятні приклади їх включають вибметаболічної активності культури. Таким чином, рані з групи, яка складається з глутамінової кистермін "метаболічна активність" стосується актилоти, лізину, Na-глутамату, Na-казеїнату, екстравності культури по видаленню кисню, її кислотокту солоду, знежиреного сухого молока, сухої продукуючої активності, тобто продукції, наприсироватки, екстракту дріжджів, глютену, колагену, клад, молочної кислоти, оцтової кислоти, желатину, еластину, кератину і альбумінів або їх мурашиної кислоти і/або пропіонової кислоти, або сумішей. її активності по продукції метаболітів, такій як Більш переважні традиційні добавки - це вугпродукція ароматичних сполук, таких як ацетальлеводи. Прийнятні їх приклади включають вибрані з групи, яка складається з пентоз (наприклад дегід, (α-ацетолактат, ацетоїн, діацетил і 2,3рибоза, ксилоза), гексоз (наприклад фруктоза, бутиленгліколь (бутандіол)). маноза, сорбоза), дисахаридів (наприклад сахаУ варіанті здійснення винаходу заморожена роза, трегалоза, мелібіоза, лактулоза), олігосакультура містить або включає від приблизно 0,2% харидів (наприклад рафіноза), олігофрутози (надо приблизно 20% кріопротективного агента або приклад актилайт, фрібролози), полісахаридів суміші агентів, виміряних у ваговому процентно(наприклад мальтодекстрини, ксантанова смола, му вмісті в замороженому матеріалі. Однак, пепектин, альгінат, мікрокристалічна целюлоза, реважно додавати кріопротективний агент або суміш агентів в кількості, яка знаходиться в діа 15 87462 16 можливо надати генетично модифіковану бактедекстран, ПЕГ), і цукрові спирти (сорбітол, манірію за допомогою неспецифічного мутагенезу з тол і інозитол). Незважаючи на те, що існуючий винахід стоподальшою селекцією спонтанно виникаючих сується будь-яких концентрованих заморожених мутантів, тобто без використання ДНКабо ліофільно-висушених культур, він особливо рекомбінантної технології. Далі передбачено, що направлений на культури мікроорганізмів, які бемутанти молочнокислих бактерій і інших потенруть участь у виробництві харчових і кормових ційних корисних організмів заквашувальних кульпродуктів, включаючи більшість молочних продутур можуть бути надані такою технологією, вклюктів. Переважні варіанти здійснення винаходу чаючи сайт-направлений мутагенез і методики включають культури бактерій, зокрема культури ПЛР і інші in vitro або in vivo модифікації специфібактерій, які загалом класифікуються як молочночних послідовностей ДНК, як тільки такі послідовкислі бактерії і які є необхідними у виготовленні ності будуть ідентифіковані і ізольовані. Таким всіх кисломолочних продуктів, сиру і масла. Кульчином, далі розглянуто, що корисні організми тури таких бактерій часто називаються заквашузаквашувальних культур можуть бути отримані за вальними культурами, і вони додають специфічні допомогою ДНК-рекомбінантної технології. Зокособливості різним молочним продуктам, викорема, привабливою з точки зору харчових станнуючи численну кількість функцій. Однак культудартів є можливість отримувати корисні організри, які включають культури грибків, включаючи ми заквашувальних культур рекомбінацією культури дріжджів і культури філаментних грибпослідовностей ДНК, які були властиві особливому організму, тобто самоклонуванням. ків, які зокрема застосовуються у виробництві Як прийнято в молочній промисловості, запевних типів сиру і напою, також називаються квашувальна культура може включати суміш штазаквашувальними культурами. Також культури, мів, включаючи суміш штамів різних видів молочякі застосовуються для обробки інших типів харнокислих бактерій, таку як наприклад суміш чових або кормових продуктів, називаються заStreptococcus thermophilus і Lactobacillus квашувальними культурами. Культури, що застоdelbrueckii підвиду bulgaricus. совуються у виробництві силосу, також часто називаються заквашувальними культурами. Звичайно застосовувані штами молочної заЗгідно з винаходом, може бути застосована квашувальної культури в цілому розділяються на заквашувальна культура будь-якого організму, "мезофільні організми", які в даному контексті є який корисний в харчовій або кормовій промисорганізмами, що мають оптимальні температури ловості, включаючи молочну промисловість. Тазростання приблизно 30°С і "термофільні органіким чином, заквашувальна культура може вклюзми", які в даному контексті є організмами, що чати один або декілька організмів, вибраних з мають оптимальні температури зростання в діагрупи, яка включає підвид молочнокислої бактерії пазоні від приблизно 40° до приблизно 45°С. (LAB), підвид Bifidobacterium, підвид Вибір штамів для заквашувальної культури Brevibacterium, підвид Propionibacterium або підвинаходу буде залежати від конкретного типу вид грибків, такий як підвид Torula, підвид ферментованого харчового або кормового продуPenicillium, підвид Cryptococcus, підвид кту, який необхідно зробити. Наприклад, для виробництва сиру і масла широко застосовуються Debraryomyces, підвид Klyveromyces і підвид Saccharomyces. Прийнятні культури з групи момезофільні культури виду Lactococcus, виду лочнокислих бактерій (LAB) включають звичайно Leuconostoc і виду Lactobacillus. Таким чином, в одному варіанті здійснення культура винаходу застосовувані штами підвиду Lactococcus, підвивключає один або декілька мезофільних організду Streptococcus, підвиду Lactobacillus, включаюмів, що мають оптимальні температури зростанчи Lactobacillus acidophilus, підвиду Enterococcus, ня близько 30°С. Типові організми, які стосуються підвиду Pediococcus, підвиду Leuconostoc, підвиподібних мезофільних організмів включають ду Oenococcus, підвиду Lactococcus і включають Lactococcus lactis, Lactococcus lactis підвид широко Lactococcus lactis, що застосовується, cremoris, Leuconostoc mesenteroides підвид включаючи Lactococcus lactis підвид lactis і cremoris, Pediococcus pentosaceus, Lactococcus Lactococcus lactis підвид cremoris, які звичайно lactis підвид lactis біовар diacetylactis, застосовуються у виробництві сирів із закритою Lactobacillus casei i, Lactobacillus paracasei підвид текстурою, наприклад чеддер, фета і сир котедж. Потрібно розуміти, що організм заквашуваparacasei. льної культури може бути вибраний з генетично У ще одному варіанті здійснення винаходу модифікованого штаму одного або декількох викультура винаходу включає один або декілька щезазначених штамів молочнокислих бактерій термофільних організмів, які мають оптимальні або будь-яких інших штамів заквашувальних температури зростання від приблизно 40°С до культур. Використовуваний тут вираз "генетично приблизно 45°С. Термофільні організми часто модифікована бактерія" використовується в тразастосовуються для виробництва йогурту і інших диційному значенні цього терміну, тобто він стокисломолочних продуктів, але також певні сири сується штамів, отриманих, піддаючи бактерійний виробляють за допомогою термофільних культур, штам будь-якій мутагенній обробці, що традиційнаприклад сир емменталер і деякі італійські сири. но застосовується, включаючи обробку хімічним Типові організми, які стосуються подібних термутагеном таким як етанметан сульфонат (EMS) мофільних організмів, включають організми, вибабо N-метил-N'-нітро-N-нітрогуанідин (NTG), УФ рані з групи, яка включає Streptococcus опроміненню або спонтанно виникаючим мутаціthermophilus, Enterococcus faecium, Lactobacillus ям, включаючи класичний мутагенез. Крім того, delbrueckii підвид lactis, Lactobacillus helveticus, 17 87462 18 30% Lactococcus lactis підвиду lactis біовару Lactobacillus delbrueckii підвид bulgaricus і diaceylactis. Lactobacillus acidophilus. Звичайно повна сума процентів 4 різних LAB Зокрема, культури молочнокислих бактерій визначень не може перевищити 100%. Однак, (LAB-культури) знайшли широке комерційне завона може бути меншою ніж 100%, якщо в LDстосування. Таким чином, переважним варіантом культурі присутні інші бактерії, крім 4 згаданих. здійснення винаходу є LAB-культура, яка включає Приклад 2 тут надає приклад стабілізованої LDодин або декілька організмів, вибраних з групи, культури. яка включає Lactococcus spp., Streptococcus spp., Культури грибків - інша група мікробних заEnterococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc квашувальних культур, які можуть застосовуваspp., Pediococcus spp. і Bifidobacterium spp. тися згідно з винаходом. Культури грибків, такі як Комерційні заквашувальні культури часто какультури дріжджів і культури філаментних грибтегоризуються згідно з їх застосуваннями. Окультура застосовується для виготовлення сиру ків, звичайно застосовуються у виробництві певбез дірок (Чеддер, Чешир, Фета) і звичайно вклюних типів сиру і напою. Приклади культур грибків, чає один або декілька організмів, вибраних з грущо застосовуються в наш час, включають пи, яка включає Lactococcus lactis підвид lactis і Penicillium roqueforti, Penicillium candidum, Lactococcus lactis підвид cremoris. D-культура Geotrichum candidum, Torula kefir, Saccharomyces застосовується для виготовлення масла і звиkefir і Saccharomyces cerevisiae. чайно включає один або декілька видів Особливо переважний варіант здійснення Lactococcus, тобто Lactococcus lactis підвид lactis, даного винаходу - це культура, що включає Lactobacillus acidophilus. Lactococcus lactis підвид cremoris і Lactococcus У подальшому аспекті винахід надає спосіб lactis підвид lactis біовар diacetylactis. L-культура може зручно застосовуватися для виробництва виготовлення замороженої культури, який вклюсиру тільки з маленькими дірками (наприклад, чає наступні стадії: 1) додання кріопротективного домашнього сиру) і звурджених молочних продуагента, вибраного з групи, яка складається з одктів з низькою продукцією СО2. Звичайно організнієї або декількох сполук, що беруть участь в мами в L-культурі є Lactococcus lactis підвид біосинтезі нуклеїнових кислот, або одного або lactis, Lactococcus lactis підвид cremoris і декількох похідних будь-яких таких сполук, до Leuconostoc spp. І, нарешті, LD-культура застосоконцентрованої культури життєздатних організвується для виготовлення сиру з нормальними мів, 2) заморожування матеріалу для отримання розмірами дірок, звурджених молочних продуктів замороженого матеріалу, і 3) упаковування замо(солодкий сирок з вершками) і кисло-вершкового роженого матеріалу відповідним чином. Розуміється, що стадії заморожування і упамасла. У промисловому масштабі, LD-культури в ковування можуть бути здійснені численною кільнаш час є одними із змішаних культур, що найкістю способів. більш застосовуються. LD-культура звичайно Стадія заморожування повинна бути оптимівключає один або декілька організмів, вибраних з зована для гарантії виживання клітин. Деякі клігрупи, яка включає Lactococcus lactis підвид lactis, тини (наприклад, більшість LAB), можуть бути Lactococcus lactis підвид cremoris, Lactococcus заморожені безпосередньо, тобто, піддані безпоlactis підвид lactis біовар diacetylactis і середньому контакту з агентом вже при темпераLeuconostoc spp. турі кріоконсервації. Прямі способи включають Як і в інших типах змішаних заквашувальних зрошування, розпилення, інжекцію або вливання культур, певна кількість індивідуальних бактерійклітин безпосередньо в рідину з "кріогенною темних видів в LD-культурі може варіювати відповідпературою", такою як рідкий азот, рідкий СО2 або но до певного необхідного застосування. Фахірідкий гелій. У даному контексті кріогенні темпевець знає про це і здатний визначити переважну ратури стосуються температур нижче за -50°С, композицію змішаної культури по необхідних попереважно до температур нижче за -150°С требах. (123°К). Клітини також можуть безпосередньо Наприклад, якщо потрібний аромат, повинна контактувати з охолодженою твердою речовибути переважна оптимальна композиція ароманою, такою як рідкий азот, заморожений стальний тоутворювальних бактерій Lactococcus lactis підблок. Кріогенна рідина може також бути налита вид lactis біовар diacetylactis і Leuconostoc spp. безпосередньо на контейнер з клітинами. Прямий Переважна LD-культура включає: спосіб також охоплює контактування клітин з газами, включаючи повітря, при кріогенній темпеТаблиця 1 ратурі. Кріогенний газовий потік азоту або гелію Композиція LD-культури може безпосередньо продуватися або барботуватися в суспензію клітин. Посередній спосіб включає вміщення клітин в контейнер і контактуLactococcus lactis підвид 60-95%, переважвання контейнера з твердою речовиною, рідиною lactis, Lactococcus lactis підно 70-90% або газом при кріогенній температурі. Контейнер вид cremoris для непрямого способу заморожування не повиLactococcus lactis підвид lactis 5-40%, переважно нен бути непроникним для повітря або рідини. біовар diacetylactis, від 0,1 до 30% Наприклад, придатний пластиковий пакет або Leuconostoc spp. тетра-пак®. У межах вищезгаданих діапазонів, переважно мати від 0,25 до 6% Leuconostoc spp. і від 7 до 19 87462 20 У ще подальшому аспекті винахід надає спосиру Чеддер, включаючи, але не обмежуючись сіб виготовлення ліофілізованої культури, який ними, Чеддер, Терріторіал, американським Чедвключає наступні стадії: дер, Монтерей Джек і Колбі; і сорти зернистого 1) додання до життєздатних організмів кріосиру, включаючи, але не обмежуючись ними, Грана, Пармезан і Сбрінз. протективного агента, вибраного з групи, яка Крім того, харчовий продукт може бути вибвключає або складається з однієї або декількох раний з м'ясного продукту, овочевого продукту і сполук, що беруть участь в біосинтезі нуклеїнонапою, такого як вино і пиво. вих кислот, або одного або декількох похідних Інше істотне застосування способу даного будь-яких таких сполук, 2) заморожування матеріалу для отримання винаходу - це застосування рідких заквашувальзамороженого матеріалу, них культур як так званих пробіотиків. Під термі3) сублімацію води із замороженого матеріаном "пробіотик" в даному контексті розуміється мікробна культура, яка, при застосуванні всерелу, і дину в формі життєздатних клітин людьми або 4) упаковування ліофілізованого матеріалу тваринами, поліпшує стани здоров'я, наприклад, прийнятним чином. придушуючи шкідливі мікроорганізми в шлунковоДодання кріопротективного агента(ів), додаткишковому тракті, посилюючи імунну систему або кова стадія концентрації, стадія заморожування сприяючи засвоєнню поживних речовин. Типовим (або ліофілізації) і упаковування можуть бути прикладом такого пробіотично активного продукздійснені як описано. Тоді як заморожені культури повинні трансту є "солодке ацидофільне молоко". У наступних варіантах здійснення спосіб випортуватися і зберігатися при низьких температунаходу застосовується у виробництві корму для рах, ліофільно-висушені або ліофілізовані культури можуть транспортуватися і зберігатися без тварин, такого як силос, наприклад трава, зерновий матеріал, горох, люцерна або лист цукрового охолоджування протягом тривалих проміжків чабуряка, де культури бактерій інокульовані в корсу, при умові, що вони зберігаються в сухих умомову культуру для силосування з метою досягвах. Однак навіть у разі ліофільно-висушених нення її консервування, або в багаті протеїном культур, рекомендується зберігання нижче 0°С. відходи тварин, такі як відходи первинної переЗвичайно і заморожені і ліофільно-висушені робки худоби і відходи від оброблення риби, такультури винаходу надаються як комерційні кож в цілях збереження цих відходів з метою гоDVS®-заквашувальні або Redi-Set® культури. дування тварин. Однією перевагою DVS®-заквашувальних кульВинахід далі проілюстрований в наступних тур є те, що вони можуть бути додані безпосеренеобмежувальних прикладах і на фігурах. дньо в продукційний ферментер, який містить Фіг.1. Показує стійкість комерційної заморопоживне середовище або контейнер в формі заженої концентрованої культури (F-DVS™ Fl-Da N, морожених або ліофільно-висушених клітин. Це Chr. Hansen A/S Item. No. 501691) протягом почаприводить до майже миттєвої регенерації життєткової фази зберігання при -50°С. Активність здатних клітин. Багатьма з комерційно поширекультури визначена аналізом підкислювальної них заквашувальних культур є культури молочноактивності, використовуючи кількість інокульовакислих бактерій, таким чином, переважним ного матеріалу, що становить 0,01% у відношенні варіантом здійснення даного винаходу є замороваги до об'єму. Рівень рН був виміряний після 6 жена або ліофільно-висушена культура молочногодин інкубації в молоці при 30°С. Примітка: кислих бактерій (LAB), отримана як описано. більш високий рН свідчить про меншу підкислюУ подальшому аспекті, винахід стосується вальну активність (тобто меншу метаболічну акспособу приготування харчового або кормового тивність) культури. продукту, вказаний спосіб включає застосування Фіг.2. Показує стійкість при зберіганні, виразамороженої або ліофільно-висушеної культури жену в підкислювальній активності замороженої винаходу. концентрованої культури F-DVS™ CH-N 14 (Chr. У особливому варіанті здійснення харчовим Hansen A/S Item. No. 200118) з доданням і без 3% продуктом є продукт на основі молока, такий як у ваговому відношенні ІМФ. Примітка: ордината сир, йогурт, масло або рідкий кисломолочний показує рН, виміряний після 6 годин інкубації при продукт, такий як, наприклад сколотини, імер, 30°С, кількість інокульованого матеріалу: 0,01% у вершковий або питний йогурт. У іншому варіанті відношенні ваги до об'єму. Більш високий рН свіздійснення винаходу, харчовим продуктом є сир, дчить про меншу підкислювальну активність (тобвключаючи: сорти м'якого сиру, включаючи, але то меншу метаболічну активність) культури. Світне обмежуючись ними, камамбер, брі, Аргентинлі квадрати означають культури з доданням ІМФ, ським Порт Салют, крезенза і горгонзола; сорти сиру емменталер, включаючи, але не обмежуютоді як ромби означають культури без ІМФ. Фіг.3. Показує підкислювальну активність чись ними, емменталер і грюйер; сорти сиру Котедж, включаючи, але не обмежуючись ним, сир культур F-DVS™ CH-N 14 (Chr. Hansen A/S Item. Котедж; сорти сиру Фета, включаючи, але не обNo.200118) з і без додання ІМФ. Ферментація межуючись ними, Фета і білий сир; сорти сиру була здійснена з культурами після 2 місяців збеКонтінентал, включаючи, але не обмежуючись рігання при -50°С. Ферментація була протестованими, Гауда, Едам, Маасдам, Самсу, Сент-полін, на в низькопастеризованому незбираному молоці Раклетт, Манчего і Прато; сорти сиру Паста Філапо температурному профілю Danbo Таблиці 2. та, включаючи, але не обмежуючись ними, МоцаКількості доданої культури даються у процентнорела, сир Піца, Проволоне, і Каськавал; сорти му відношенні ваги до об'єму. Примітка: ордината 21 87462 22 ві, від Chr. Hansen A/S, Данія як: F-DVSTM FI-Da показує рН, виміряний після 6 годин інкубації при 30°С. Більш високий рН свідчить про меншу підN (Chr. Hansen A/S Item. No. 501691). F-DVS™ кислювальну активність (тобто меншу метаболічCH-N 14 (Chr. Hansen A/S Item. No. 200118), Fну активність) культури. DVS™ CH-N 19 (Chr. Hansen A/S Item. No. Фіг.4. Ілюструє втрату активності культур F501593). DVS™ CH-N 19 протягом заморожування (Chr. Способи ферментації і умови ферментації: Hansen A/S Item. No. 501593). Культура тестуваСклад середовища для культури LD-культур: лася на активність відповідно до продукції кульLD-культури культивувалися в поживному сетури (в день 0). Смуги помилки показують станредовищі, що має наступний склад: гідролізат дартне відхилення. Примітка: ордината показує казеїну (Oxoid, Basingstoke, UK, Product Code рН виміряний після 6 годин інкубації при 30°С, L41), 30г/л; Primatone RL (Quest, Naarden, The кількість інокульованого матеріалу: 0,01% у відNetherlands, Product Code 5X59051), 30г/л; соєвий ношенні ваги до об'єму. Більш високий рН свідпептон (Oxoid, Basingstoke, UK, Product Code чить про меншу підкислювальну активність (тобто L44), 30г/л; екстракт з дріжджів (Oxoid, меншу метаболічну активність) культури. Basingstoke, UK, Product Code L21), 15г/л; MgSO4, Фіг.5. Ілюструє втрату підкислювальної акти1,5г/л; Na-аскорбат, 3г/л; і лактоза 50г/л. вності культури F-DVS™ Fl-Da N (Chr. Hansen A/S Поживне середовище стерилізувалася ультItem. No. 501691), відповідно до функції доданої рависокотемпературною, (UHT) обробкою (143°С кількості ІМФ. Перед заморожуванням концентпротягом 8 секунд). Готове поживне середовище мало рН 6,5. рати зберігалися в рідкому вигляді при 8°С протяУмова ферментації для LD-культур: гом 5 годин. Смуги помилки показують стандартФерментація була здійснена в 100 літровому не відхилення. Примітка: ордината показує рівень ферментаційному чані при 30°С, застосовуючи рН виміряний після 6 годин інкубації при 30°С, 1% (у ваговому відношенні) культуру, згадану кількість інокульованого матеріалу: 0,01% у відвище як заквашувальну. Анаеробне бродіння ношенні ваги до об'єму. Більш високий рН свідпроводилося з азотом у вільному просторі над чить про меншу підкислювальну активність (тобто продуктом і тиску вільного простору над продукменшу метаболічну активність) культури. Фіг.6. Показує стійкість при зберіганні, виратом приблизно 0,2 бар. Культурам дозволяли жену в підкислювальній активності ліофільнопідкисляти до рН 6,0. Надалі підтримувався рН 6,0 за допомогою контрольованого додання 13,4 висушеної концентрованої культури DVS™ Fl-Da Ν ΝΗ4ΟΗ. N культури з доданням ІМФ 3% у ваговому відКоли не було виявлено ніякої подальшої виношенні і без. Культура була протестована на трати основи, відповідна культура була охолоактивність після 7 днів зберігання при -50°С. Смуджена до приблизно 10°С. ги помилки показують стандартне відхилення. Постферментативна обробка LD-культур: Примітка: ордината показує рН виміряний після 6 Після охолоджування бактерії в ферментагодин інкубації при 30°С, кількість інокульованого ційних бульйонах були концентровані 10-20 разів матеріалу: 0,01% у відношенні ваги до об'єму. за допомогою центрифугування з доданням доБільш високий рН свідчить про меншу підкислюбавок і надалі заморожені у вигляді гранул в рідвальну активність (тобто меншу метаболічну аккому азоті при тиску однієї атмосфери, якщо не тивність) культури. визначено інакше. Підкислювальна активність Фіг.7. Показує стійкість при зберіганні, вирагранул була виміряна в різний час після заморожену в підкислювальній активності замороженої жування, гранули, що покояться, зберігалися при концентрованої культури (F-DVS™ Fl-Da N, Chr. -50°С до подальшого аналізу, якщо не указано Hansen A/S Item. No. 501691) протягом початкоінакше. вої фази зберігання з або без 3% ІМФ, ГМФ, іноДобавки: зину у ваговому відношенні або без додатків. Добавки були отримані як указано: інозин-5'Примітка: ордината показує рН виміряний після 6 монофосфат (ІМФ) (Alsiano A/S, Birkeroed, DK), годин інкубації при 30°С, кількість інокульованого аденозин-5'-монофосфат (АМФ) (Sigma A2252), матеріалу: 0,01% у відношенні ваги до об'єму. уранозин-5'-монофосфат (УМФ) (Sigma U6375), Більш високий рН свідчить про меншу підкислюцитидин-5'-монофосфат (ЦМФ) (Sigma C1006), вальну активність (тобто меншу метаболічну акNa-форміат (Kirsch Pharma, Salzgitter, DE), адетивність) культури. Зафарбований ромб означає нозин (Alsiano A/S, Birkeroed, DK), гуанозин додання 3% ІМФ у ваговому відношенні, сірий (Alsiano A/S, Birkeroed, DK) і інозин (Alsiano A/S, квадрат означає додання 3% ГМФ у ваговому Birkeroed, DK). відношенні, зафарбований ромб означає додання Аналіз підкислювальної активності і аналіз 3% інозину у ваговому відношенні, і коло означає КУО: відсутність додання якої-небудь кріопротективнои Заморожена культура була інокульована до добавки. рівня 0,01% (у ваговому відношенні) в 200мл Приклади: UHT-стерилізованого відновленого знежиреного Матеріали і методи молока (RSM), що містить 9,5% (у ваговому відКультури: ношенні) твердої речовини і нагрітого до 99°С Застосовувалися наступні комерційно доступротягом 30 хвилин (LAB-молоко). RSM інкубувапні культури: FI DaN, СН N 14 і СН N19. Всі три лось при 30°С протягом 6 годин до дозволу підкультури є комерційно доступними замороженикислення матеріалу субстрату. Активність підкисми LD-культурами в формі заморожених культур лення була виміряна як описано в Прикладі 6: (F-DVS™), готових до застосування у виробницт 23 87462 24 концентрованих заморожених культур молочноАналітична Процедура QAm-052, "підкислювалькислих бактерій, таких як наприклад комерційно на активність-UHT", Chr. Hansen A/S (Данія). Імітована продукція сиру згідно з температудоступних заморожених LD-культур. Приклад 2: дослідження стійкості заморожерним профілем DANBO: ної LD-культури СН N14 із застосуванням ІМФ як Підкислення виконане згідно з температуркріопротективного агента ним профілем, що відображає температурну динаміку з якою культура звичайно стикається при Цей приклад описує дослідження стійкості застосуванні в молочному господарстві для прозаморожених культур (F-DVS™) СН N14, готових дукції даного молочного продукту, в цьому випаддо застосування у виробництві, сформованих з ку сиру DANBO. ІМФ як кріопротективний агент. У експериментах рН вимірювався в фіксовані проміжки часу як концентрація ІМФ підтримувалася на рівні 3% у визначено в таблиці 2. ваговому відношенні на грам концентрованої біомаси. ІМФ був доданий до концентрату у виТаблиця 2 гляді 30% у ваговому відношенні, стерильного розчину. Профіль Danbo Після ферментації, біомаса була зібрана і концентрована від ферментаційного бульйону FЧас, хвилини Температура, °С Варіація DVS™ СН N14 за допомогою центрифугування. 2:40 31,0°С +0,2°С Концентрат клітин був розділений на дві частини по 300 грамів кожний і ІМФ був доданий до однієї 00:15 Зміна від 31,0°С до 38,0°С ±0,5°С частини. Добавки і концентрати були змішані про00:35 38,0°С ±0,2°С тягом 30 хвилин, заморожені в рідкому азоті і 04:24 Зміна від 38,0°С до 16,0°С ±0,5°С надалі зберігалися при -50°С. Заморожена кульДо 16:00 16,0°С ±0,2°С тура мала вміст життєздатних бактерій не менше за 1010 колонієутворювальних одиниць (КУО) на Активність підкислення була виміряна як опиграм замороженого матеріалу. Активність культусано в прикладі 7: Аналітична Процедура QAmри в молоці (LAB-молоко) була виміряна після 3 043, підкислювальна активність "Запрограмоваднів зберігання при -50°С, і активність відстежуний температурний профіль" Chr. Hansen A/S валася періодично до 65 днів. (Данія). Профілі стійкості для F-DVS™ СН N14, дані у Аналіз КУО був виміряний і розрахований як вигляді підкислювальної активності, узагальнені описано в прикладі 8: Аналітична Процедура Qна Фігурі 2. AM-071, "Рахунок мікроорганізмів" Chr-Hansen Очевидно, що F-DVS™ СН N14, яка не місA/S (Данія). тить добавок, втрачає активність. Зниження стійПриклад 1: дослідження стійкості заморожекості дорівнює 0,25 одиниці рН для СН N 14 після ної LD-культури Fl-Da N зберігання протягом 65 днів при -50°С. 0,25 одиУ цьому прикладі стійкість, що вимірюється ниці рН майже дорівнює 50% втраті підкислювавиробпідкислювальною активністю комерційно льної активності (тобто стійка культура приблизленої LD-культури: F-DVS™ Fl-Da N (Chr. Hansen но в 2 рази більш активна, ніж нестійка культура). A/S Item. No. 501691), відстежувалася протягом б Приклад 3: дослідження стійкості заморожемісяців. Культура була вироблена і зберігалася ної LD-культури F-DVS™ СН N14 із застосуванпри -50°С як описано в підрозділі "Методи і матеням ІМФ як кріопротективних агентів проведене ріали". після температурного профілю На відміну від звичайних, перше вимірювання У цьому експерименті зразки культури, опиактивності в цьому прикладі було виконане безсаної в Прикладі 2, були протестовані після зберіпосередньо після того, як культура була заморогання протягом приблизно двох місяців при -50°С. жена у вигляді гранул в рідкому азоті з подальПідкислювальна активність була виміряна в різні шими вимірюваннями через 1, 2, 12, 20 і 188 днів моменти часу протягом інкубації згідно з імітовазберігання при -50°С. ним температурним профілем "Danbo", див. табРезультати цього експерименту показані на лицю 2. Середовищем ферментації було низькоФігурі 1. пастеризоване незбиране молоко, подібне до Підкислювальна активність була істотно знимолока, яке звичайно застосовується для промижена протягом перших декількох днів зберігання. слового виробництва сиру Danbo. Тільки після одного тижня зберігання підкислюПорівнювалася підкислювальна активність вальна активність була знижена на 0,26 одиниць культур з доданням інозин-5'-монофосфату (ІМФ) рН. Це зниження еквівалентне 50% скороченню і без, до заморожування. підкислювальної активності тільки після одного Один набір бутлів з низькопастеризованим тижня зберігання. Після двох тижнів зберігання незбираним молоком був інокульований замороподальша втрата підкислювальної активності женою культурою СН N14 без доданого ІМФ. У культур стала менш вираженою і підкислювальна цьому випадку кількість доданої культури станоактивність культури, тільки трохи поменшала вила 0,01%, 0,02% і 0,03%, відповідно (% у вагопротягом іншої частини періоду. вому відношенні). Несподіваний результат цього експерименту Інший набір бутлів з низькопастеризованим примусив авторів зрозуміти, що існували значні і незбираним молоком був інокульований замородо цього часу невизнані проблеми стійкості, поженою культурою СН N14 з 3% ІМФ (у ваговому в'язані із заморожуванням і початковою фазою відношенні) доданим до заморожування. У цьому зберігання деяких типів комерційних релевантних 25 87462 26 ниці рН, при заморожуванні культури без додання випадку кількість доданої культури становила ІМФ. Втрата 0,06 одиниці рН еквівалентна втраті 0,01% (у ваговому відношенні). 5-10% підкислювальної активності. Однак, при Як видно в прикладі 2, культура без ІМФ доданні ІМФ до цієї культури, ніякої значної втравтратила приблизно 50% підкислювальної активти активності не спостерігалося. Відмінність на ності, що еквівалентне тому, що культура з до0,01 одиниці рН має таку ж величину як і стандаданням ІМФ, має активність, яка є майже подвійртна помилка, позначена смугами помилки на ною активністю в порівнянні з подібною кількістю такої культури без додання ІМФ. фігурі. Робиться висновок, що ІМФ також здатний Для ілюстрації бустерного ефекту ІМФ, зразок без додання ІМФ був інокульований, викорисдіяти як кріопротективний агент і протидіяти товуючи три різних кількості культури СН N14. впливу, що створюється заморожуванням цього Виходячи з результатів, отриманих в прикладі 1 типу культури. (тобто те, що трохи менше ніж 50% активності Приклад 5: Дозозалежний ефект ІМФ при завтрачено протягом зберігання культури без достосуванні з культурами F-DVS™ Fl-Da N дання ІМФ) можна було б очікувати, що підкисЦей приклад описує дослідження дозозалежлювальна активність 0,01% інокуляту культури з ного ефекту із замороженими культурами (Fдоданням ІМФ буде де-небудь між підкислювальDVS™) Fl-Da-N сформованими з ІМФ як кріопроною активністю 0,01%, і 0,02% інокуляту культури тективного агента. У експериментах концентрація без додання ІМФ. ІМФ становила 0%, 0,1%, 0,5%, 1%, 3% і 6% у Однак, як проілюстровано на Фігурі 3, це не ваговому відношенні на грам концентрованої так. Виявилося, що підкислювальна активність біомаси. Добавка була додана до концентрату у 0,01% інокуляту культури з доданням ІМФ, була вигляді 30% стерильного розчину. десь між підкислювальною активністю 0,02%, і Після ферментації біомаса була зібрана і кон0,03% інокуляту культури без додання ІМФ. Цю центрована від ферментаційного бульйону Fl-Da додаткову активність автори приписують бустерN за допомогою центрифугування. Концентрат ному ефекту доданого ІМФ. клітин був розділений на 6 частин по 300 грамів, і Цей експеримент показує, що додання ІМФ ІМФ був доданий до кожної частини. Для імітації до культури приводить до 2-2,5 кратної більш ситуації, подібної до промислової, в процесі зависокої активності в порівнянні з доданням подібморожування добавки і концентрати були змішані ної кількості такої культури без додання ІМФ. і зберігалися протягом 5 годин при 8°С і надалі Бустерний ефект не був очевидний в приклабули заморожені в рідкому азоті і далі зберігалиді 2, тому що в прикладі 2 молоко було піддане ся при -50°С. Таким чином, цей приклад не може досить грубій процедурі теплової стерилізації, бути порівняний з попередніми прикладами. Затобто LAB-молоко. У нашому випадку, бустерний морожена культура мала вміст життєздатних бак10 ефект є найбільш вираженим в молоці, що застотерій не менше за 10 колонієутворювальних совується для виробництва сиру, оскільки таке одиниць (КУО) на грам замороженого матеріалу. молоко звичайно є низько-пастеризованим молоКультуральна активність в молоці (LAB-молоці) ком. була виміряна в той же день, коли були сформоПриклад 4: Втрата активності під час замовані заморожені закваски. рожування CH-N 19 Результати показані на Фігурі 5. Цей приклад описує втрату активності під час З цих результатів ясно, що концентровані заморожування культури СН N19, з включенням культури, які були заморожені без додання ІМФ, ІМФ як кріопротективного агента. У експерименпоказали найбільшу втрату підкислювальної актах концентрація ІМФ зберігалася на рівні 3% у тивності. Оптимальний результат (тобто найваговому відношенні на грам концентрованої менше зменшення підкислювальної активності) біомаси (доданої у вигляді стерильного 30% відбув отриманий при доданні 3% (% у ваговому носно вагового розчину). відношенні) ІМФ. Після ферментації біомаса була зібрана і конПриклад 6: Аналітична Процедура QAm-052, центрована від ферментаційного бульйону куль"підкислювальна активність-UHT", Chr. Hansen тури CH-N 19 за допомогою центрифугування. A/S (Данія) Концентрат клітин був розділений на дві частини Застосування по 300 грамів, і ІМФ був доданий до однієї з часЦей метод застосовується для визначення тин. Добавки і концентрати були змішані протяпідкислювальної активності. гом 30 хвилин, і в подальшому 150г цих двох часПринцип тин були заморожені в рідкому азоті. Заморожена Для продуктів F-DVS™ і FD-DVS: культура мала вміст життєздатних бактерій не Культура розбавлена і інокульована в моло10 менше за 10 колонієутворювальних одиниць ко. Інкубація протягом даного часу при даній тем(КУО) на грам замороженого матеріалу. Заморопературі. Після інкубації був виміряний рН. жені і незаморожені культури з доданням ІМФ і Для замороженого Redi-Set® (F-RS) і ліофібез були протестовані відносно їх підкислювальльно-висушеного Redi-Set® FD-RS продуктів: ної активності безпосередньо після того, як вони Для цих продуктів аналіз активності складабули зроблені. Була виміряна культуральна актиється з 2 стадій росту. Виробнича закваска виговність в молоці (LAB-молоці з тепловою стерилітовлена вирощуванням культури в молоці при зацією). даних часу і температурі. Після цього виробнича Результати, показані на Фігурі 4, показують закваска інокульована в молоко, і після нової інвтрату підкислювальної активності на 0,06 одикубації виміряний рН. 27 87462 28 Аналіз параметрів Заморожені і розморожувані продукти ретеВказівка параметрів продуктів, що аналізульно струшуються доти, поки продукт буде розються, може бути прочитана в лабораторній інподілений або максимально 10 разів, після яких формаційно-керуючій системі (LIMS). Приклади: бутель стоїть протягом приблизно 50 секунд. тип молока, температура молока при 1 і 2 дощиДля ліофільно-висушених продуктів ротаційруванні, час інкубації, температура інкубації, проний апарат (швидкість 2) застосовується протягом 5 хвилин або доти, поки продукти будуть розцент інокуляції для зразків і контрольних стандаподілені. ртів. Примітка: Для ліофільно-висушених продукПрилади і реагенти тів L. acidophilus, Bifidobacterium або L. casei, всі рН-метр; рН електрод; калібрувальні буфери, інокуляції проводяться на чистому лабораторнорН 7,00±0,01 і 4,01±0,01; водяна баня з термостатом, точність ±0,2°С; температурний датчик; му столі. вага, точність 0,01г з мінімум двома десятерич2 дозування ними знаками; ротаційний апарат; термометр; Бутель для 2 дозування вміщений на ваги, які годинник; магнітна мішалка; магніти; мензурки, встановлені на нуль. 50мл. Для заморожених і розморожуваних продукПроцедура тів бутель розведення ретельно струшується Підготовка аналізу: перед проведенням 2 дозування. 2 дозування Примітка: Всі колби повинні бути з однакової виконане згідно із звичайними процедурами конпартії, тобто з однаковою датою. тролю якості (Qc) протягом 1 хвилини. Принаймні за 16 годин до початку аналізу Для ліофільно-висушених продуктів 2 дозукришки на всіх бутлях послаблені. Водяна баня(і) вання виконане згідно зі звичайним Qc. Час для 2 дозування наступає, коли інокуляти доведена(і) до температури інкубації. Бутлі для 1 дозування доведені до температури інокуляції нагріті/охолоджені. (може бути або холодне або гаряче молоко). БуФактична кількість інокуляту (2 дозування) фери з рН 4,01 і рН 7,00 вміщені у водяну баню з реєструється принаймні з двома десятеричними температурою інкубації, принаймні, за 30 хвилин знаками. Бутель з активністю обертається, і процедура до калібрування рН метра. Примітка: Для зразків, які вміщені в крижану інокуляції повторюється для наступних зразбаню при 4°С до інкубації, нагрівання водяної ків/контролю. бані почате по таймеру. Бутлі з активністю, які інокульовані від того ж Підготовка зразків перед аналізом 1 дозування, інокульовані послідовно. Заморожені культури: Заморожені зразПримітка: Дозування змішаних продуктів: Спочатку 1 дозування здійснене від кожного ки/контрольні стандартні перед 1 дозуванням контрольного стандартного/окремого штаму. Від вміщені в коробку піни з сухим льодом і зберігакожного з них 2 дозування виконані до того ж булися тут, поки не були виконані всі дозування. тля з активністю, таким чином, що вона буде місЗаморожені культури, які розморожуються тити всі контрольні стандартні/окремі штами. перед застосуванням: Для заморожених продуктів час від першого Для заморожених продуктів, де застосований дозування до останнього 2 дозування повинен цільний картон, продукт розморожується відповібути максимум 5 хвилин. Для ліофільнодно, згідно з окремою інструкцією. Після розмовисушених продуктів час від першого 1 дозування рожування зразок може зберігатися при 4°С продо останнього 2 дозування повинен бути макситягом максимально 30 хвилин перед мально 10 хвилин. застосуванням. Для заморожених культур в банНа останньому місці неінокульований бутель ках, банка вміщена у водяну баню при 22°С на 20 молока на водяній бані. хвилин, для розморожування вмісту. Після розДля продуктів, де 1 дозування виготовлялося морожування культура може зберігатися при 4°С в холодному молоці: протягом максимально 30 хвилин перед застосуЧас (вимірювання)=Час 2 дозування+Час інванням. Ліофільно-висушені культури: кубації або продуктів, де 1 дозування виготовлялося Ліофільно-висушені зразки/контрольні станв гарячому молоці: дартні акліматизовані при кімнатній температурі Час (вимірювання)=Час 1 дозування+Час інпротягом, принаймні, 15 хвилин до початку аналікубації. зу. Примітка: Для продуктів, які крім того проПроцедура інокуляції аналізовані на тривале підкислення, інокуляція 1 дозування/розбавлення: Бутель для 1 дозування вміщений на ваги, які для них може бути виконана в той же час, що і інокуляція для підкислювальної активності. встановлені на нуль. Від 1 дозування, що застосовується для підДозування продукту/контрольних стандартів кислювальної активності, 2 дозування може бути виконане безпосередньо в молоці. здійснене в молоці холодної активності, яке вміЧас для 1 дозування завжди реєструється, щене до інкубації у водяну баню при 4°С, яка коли інокуляція в теплому молоці виконана. нагріта до температури інкубації. У цьому випадФактична кількість інокуляту (1 дозування) ку бутлі інкубувались на 1/2 години більше, ніж реєструється принаймні з двома десятеричними знаками. даний час інкубації. 29 87462 30 Параметри, що аналізуються Примітка: Для продуктів, у яких і інокуляція, і Параметри, що аналізуються, які є специфічвимірювання рН зразків/контрольних стандартів, ними для продуктів, подані в LIMS. через довгий час підкислення, є неможливим в Визначення температурного профілю (для межах нормальних робочих годин, 1 і 2 дозуванпродуктів, де профіль Pearce не застосовується). ня можуть бути виконані в холодному молоці. Контрольний стандарт, що застосовується. Після інокуляції молока активності бутлі вміТип вимірювання рН. щені на водяну баню з охолоджуванням. ТемпеПроценти інокуляції для зразка і контрольних ратурний датчик від контактних годин вміщений в стандартів. бутель з неінокульованим молоком, який вміщеМолоко розчинення: 206,9г холодного (4°С) ний на водяну баню. Контактні години синхроніLAB-молока (тобто UHT-стерилізованого відновзовані з початком нагрівання води у встановлеленого знежиреного молока (RSM), що містить ний час, і від моменту коли температура продукту 9,5% (у ваговому відношенні) твердої речовини і представляє інтерес, починається відлік часу нагрітого до 99°С протягом 30 хвилин). інкубації. Молоко активності: 200г холодного (4°С) ниПримітка: Якщо необхідно застосувати більзькопастеризованого незбираного молока 3,5% ше ніж одну водяну баню, контрольний стандарт жирності. повинен бути інкубований разом з його пов'язаними зразками в тій же водяній бані. Фермент: Natures® стандарт 190, розбавлеКонтроль рН електрода ний водою 1:40. Калібрування виконується згідно зі звичайниПрилади і реактиви ми інструкціями з урахуванням калібрування елерН-метр/рН-метр для напівбезперервного ктрода і технічного обслуговування. вимірювання рН модель Radiometer® PHM92. Контроль рН-метра рН електрод Radiometer® PFC2401. рН повинен бути виміряний в зразБуфери: рН 7,00±0,01 і рН 4,01±0,01. ках/контрольному стандартах по вимірюванню Водяна баня з термостатом, запрограмовачасу. Якщо час перевищує більше ніж одну хвиним для нагрівання згідно з запропонованим темлину, це записується. Якщо час перевищений пературним профілем ±0,2°С. більше ніж на дві хвилини, вимірювання пропусТемпературний датчик. кається. Безпосередньо перед часом вимірюванВаги, точність 0,01г з мінімум двома десятеня бутель повернений на 180°. ричними знаками Вимірювання виконане в бутлі або в зразку, Годинник. який налитий в мензурку об'ємом 50мл з переміМагнітна мішалка. шуванням магнітом. Магніти. рН реєструється принаймні з 2 десятеричниМензурки, 50мл. ми знаками. Малі пластмасові чашки. Можливі зауваження по вимірюванню реєстРотаційний апарат. руються. Процедура вимірювання продовжується Процедура доти, поки всі зразки/контрольні стандарти і неПідготовка аналізу інокульоване молоко будуть виміряні. ТемпераВсі колби повинні бути з однакової партії, тура водяної бані виміряна в інокульованому бутобто з однаковою датою. тлі молока і занесена в реєстраційний журнал. Водяна баня(і) доведена(і) до початкової теУ завершення вимірюється рН в калібрувамператури температурного профілю, що застосольних буферах. вується. Приклад 7: Аналітична Процедура QAm-043, Бутлі для розбавлення (1 дозування) і для підкислювальна активність - "Програмований теактивності (2 дозування) вміщені в 4°С безпосемпературний профіль" Chr. Hansen A/S (Данія) редньо перед застосуванням. Застосування Буфери 4,01 і 7,00 вміщені у водяну баню з Цей метод застосовується для визначення певною температурою вимірювання ±0,2°С припідкислювальної активності згідно з тестом наймні за 30 хвилин перед калібруванням рНPearce і в інших ситуаціях, коли підкислення виметра. конується згідно з температурним профілем, наПідготовка зразків перед аналізом. приклад Danbo-профілю. Тільки тест Pearce Заморожені культури: включений в IDF стандарт (міжнародний молочЗаморожені зразки/контрольні стандартні пений стандарт). ред 1 дозуванням вміщені в коробку з піною і суПринцип хим льодом і зберігалися тут, поки не були вироПідкислення виконане згідно з температурблені всі дозування. ним профілем, що відображає курс зміни темпеЗаморожені культури, які розморожуються ратури, з яким культура звичайно стикається при перед застосуванням: застосуванні в молочному господарстві для проДля заморожених продуктів, де застосовудукції даного молочного продукту. ється цільний картон, продукт розморожується Для тесту Pearce, це температура виготовзгідно зі звичайними інструкціями. лення сиру під час продукції чеддера. Після розморожування зразок може зберігарН вимірюється в фіксований час. тися при 4°С протягом максимально 30 хвилин Для культур, де під час аналізу фермент не перед застосуванням. доданий, може бути застосоване безперервне Ліофільно-висушені культури: вимірювання рН. 31 87462 32 Молоко. Ліофільно-висушені зразки і контрольні стандарти акліматизуються при кімнатній температурі Таблиця 3 протягом, принаймні, 15 хвилин перед початком аналізу. Температурна програма За умови, що зразок буде застосовуватися в профілі Pearce (слідуючи IDF) для повторного дослідження на наступний день, він може зберігатися при +8°С. Процедура інокуляції Час, хвилини Температура, °С Варіація Дозування продукту/контрольного стандарту 0 31,0 ±0,2°С здійснюється безпосередньо в молоко. 50 31,0 ±0,2°С Фактична кількість інокуляту (1 дозування) 54 31,7 ±0,5°С вноситься принаймні з двома десятеричними 58 32,2 ±0,5°С знаками. 62 32,8 ±0,5°С Заморожені і розморожені продукти ретельно 66 33,3 ±0,5°С обертаються приблизно 4 рази, після яких бутель 70 33,9 ±0,5°С стоїть протягом приблизно 50 секунд. 73 34,4 ±0,5°С Для ліофільно-висушених продуктів повинен 76 35,0 ±0,5°С застосовуватися ротаційний апарат. Він повинен 79 35,6 ±0,5°С обертатися з постійною швидкістю протягом 5 82 36,1 ±0,5°С хвилин або поки продукт не буде повністю розчи85 36,7 ±0,5°С нений. Це контролюється за допомогою зали81,5 37,2 ±0,5°С шення бутля на столі на мить, з подальшою перевіркою розчину, оглядом основи бутля. 90 37,8 ±0,2°С Примітка: 360 37,8 ±0,2°С Якщо для режиму роботи придатний холод, 1 дозування може проводитися при кімнатній темТаблиця 4 пературі протягом максимально 15 хвилин перед 2 дозуванням. Профіль Danbo 2 дозування: Бутель розбавлення обертається перед виЧас, хвилини Температура, °С Варіація конанням 2 дозування. 02:40 31,0°С ±0,2°С Фактична кількість інокуляту (2 дозування) 00:15 Зміна від 31,0°С до 38,0°С ±0,5°С вноситься принаймні з 2 десятеричними знаками. 00:35 38,0°С ±0,2°С Бутель з активністю обертається, і процедура 04:24 Зміна від 38,0°С до 16,0°С ±0,5°С інокуляції повторюється для зразків/контрольних До 16:00 16,0°С ±0,2°С стандартів. Бутлі з активністю, які інокулюються від того Примітка: У 3 години і 30 хвилин подається ж 1 дозування інокулюються послідовно. охолоджуюча вода У кожний бутель додається 2мл ферменту до *Ручне вимірювання рН після 06:00 годин +/-2 або після 2 зважування. Після цього бутлі оберхвилини відповідають температурі у водяній бані таються для розподілу ферменту. 25,5°С +/-0,5°С. Фермент не додається в Danbo-профіль. Калібрування електрода (Не IDF стандарт) Калібрування виконується при початковій теБутлі надалі інкубуються одночасно, як опимпературі по звичайних інструкціях, з урахувансано в 6. ням калібрування електрода і технічного обслуУ кінці 2 бутлі з неінокульованим молоком говування. вміщуються у водяну баню. Один для вимірюванВимірювання рН ня температури водяної бані і один для вимірюПісля інкубації бутлі ретельно струшуються і вання рН в топленому молоці. вимірюється рН. Інкубація Вимірювання рН виконується в бутлі або в Примітка: Коли потрібно більше водяних зразку, який налитий в мензурку 50мл з перемібань, контрольні стандарти з відповідними зразшуванням магнітом. ками повинні інкубуватися в одній і тій же водяній рН реєструється, принаймні, з 2 десятеричбані. ними знаками. Всі бутлі з активністю інкубуються в один і Можливі зауваження по вимірюванню реєсттой же час в підігрітій водяній бані з встановлеруються. ною стартовою температурою температурного Процедура вимірювання продовжується доти, профілю. поки всі зразки/контрольні стандарти і неінокуТемпературний профіль запущений одночасльоване молоко не будуть виміряні. но з вміщенням бутлів у водяну баню. У завершення вимірюється рН в калібруваПісля цього температура інкубації контролюльних буферах. ється термостатом, запрограмованим слідувати Безперервне вимірювання рН певному температурному профілю. Для тесту Значення рН відмічені з моменту початку теPearce дивіться таблицю 3 і таблицю Danbo 4. мпературного профілю. Після завершення інкуРівень води у водяній бані повинен бути мінімум на 2 см вищий, ніж рівень молока. 33 87462 34 бації реєструються змінені значення рН в обох Готовий розчинник (Таблиця 5) може зберігабуферах при початковій температурі. тися протягом 6 місяців при 5°С в темному місці. Приклад 8: Аналітична процедура Q-AM-071, Таблиця 6 "Рахунок мікроорганізмів" Chr-Hansen A/S (Данія) Сфера застосування Агар Leesment, Склад Цей спосіб застосовується для рахунку молочнокислих бактерій в різних заквашувальних культурах і для підрахунку крос-контамінантів. Триптон (Oxoid L42) 20,0г Метод застосовний тільки разом з програмою Екстракт дріжджів (Oxoid L21) 5,0г аналізу культур, що розглядається, згідно із звиЖелатин 2,5г чайними процедурами контролю якості (Qc), тому Лактоза 10,0г тут повинне бути дане посилання до аналітичних NaCl 4,0г параметрів. 2,0г Тринатрій цитрат, 2×Н2О (Merck 6432) Принцип 8,0г Кальцію лактат, 5×Н2О (Merck 2102) Спосіб є кількісним способом, де результат Агар (So-Bi-Gel) 12,0г приводиться як КУО/г. Відома кількість зразка гомогенізується з розПідготовка чинником, і виготовляється десятиразове розвеСуспендувати інгредієнти в 1000мл дистидення. Відповідне розведення змішується з агальованих води. Нагріти до точки кипіння з частим ром Leesment або розподіляється на поверхні. перемішуванням до отримання розчину. РозподіПісля інкубації всі колонії підраховуються. лити поживне середовище в бутлі і автоклавуваЗдійснення вибірки ти при 121°С протягом 15хв. рН після автоклавуВзяти зразки згідно з встановленими мікробівання: 6,8±0,2. ологічними принципами так, щоб зразок був наЯкщо поживне середовище повинне бути застільки представницьким наскільки можливо для стосоване негайно, його необхідно охолодити до продукту, який буде досліджуватися. приблизно 47°С у водяній бані. Перед застосуПрилади і скляний посуд ванням, до 200мл Агару Leesment повинно бути Бутлі 250мл додано 2мл 50% розчину глюкози (Таблиця 6) Пробірки 20мл з пробками для всіх CR-культур. Автоклав, з регулюванням ±1°С Якщо поживне середовище застосовується рН метр, з чутливістю ±0,2 для посіву, 12-15мл розплавленого поживного Ваги, які працюють з А ±0,01г середовища налити в чашки Петрі і дати поживЦентрифуга ному середовищу затвердіти і висохнути протяГомогенізатор Stomacher гом 30 хвилин на чистому лабораторному столі. мішки для гомогенізатора Стерильні Розчин глюкози Stomacher, 400мл 2,0г глюкози розчиняють в 100мл дистильоІнкубатор, з регулюванням ±1°С ваної води. Потім розчин стерильно фільтрують Водяна баня, з регулюванням ±1°С за допомогою 0,20нМ фільтрів. Стерильні піпетки Leesment-глюкозний агар Чашки Петрі, 9см Безпосередньо перед застосуванням, 2мл Стерильні шпателі Drigalski 50% розчину глюкози додають до 200мл поживСередовище ного агару (Таблиця 6). Зберігання Таблиця 5 Готовий агар Leesment (Таблиця 6) може зберігатися в темряві протягом 6 місяців при 5°С. Розчинник, Вміст Залиті чашки, упаковані в пластикові пакети, можуть зберігатися в темряві протягом 10 днів Казеїновий пептон 15,0г при 5°С. NaCl 9,0г Процедура Піногасник FG-10,2% 1,14мл NB - аналітичний період від розваження зразка до посіву наливом або посіву розподілом не Підготовка повинен перевищувати 30хв. Суспендувати інгредієнти в 1000мл дистиПеред початком мікробіологічної експертизи, льованих води. Нагріти до точки кипіння з частим розплавляють поживне середовище в киплячій перемішуванням. Розлити розчинник в бутлі або водяній бані або кип'ятінням в автоклаві, і потім пробірки і автоклавувати при 121°С протягом 15 охолоджують її до 47±1°С у водяній бані. хвилин. Примітка: якщо необхідно застосувати поперН після автоклавування: 7,0±0,2. редньо залиті чашки, поверхня поживного сереВміст в бутлях після автоклавування: довища повинна бути сухою перед засіванням. 99,0±1,0мл. У Аналітичній Програмі або Qc продукту, що Вміст в пробірках після автоклавування: розглядається, дається наступне: 9,00±0,05мл. a) кількість грамів (X), щоб використовуватиЯкщо розчинник (Таблиця 5) повинен бути ся для першого розведення (D1) застосований негайно, то його необхідно охолоb) хвилини в гомогенізаторі Stomacher (M) дити до 20°С або нижче. Зберігання c) відповідне розведення (D2) d) кількість, що засівається (мл) 35 87462 36 e) параметри інкубації Якщо χ2--тест пройдений, то середнє значенf) метод засівання. ня КУО/г (N) обчислюється згідно з нижчевказаПідготовка розведень ним: Зважити X грамів продукту в стерильний міN=(Σc)/((n1+0,1n2)d), шок гомогенізатора Stomacher і додати по вазі де: достатню кількість стерильного розчинника, для Σс - сума колоній, підрахованих у всіх чашках виготовлення першого розведення (D1). Вмістити Петрі; мішок в гомогенізатор Stomacher і обробити проn1 - кількість чашок Петрі в першому розветягом (М) хвилин. Якщо зручно, вилити вміст мішденні; ка в пустий стерильний бутель. За допомогою n2 - кількість чашок Петрі у другому розвестерильної піпетки перемістити 0,1 або 1,0мл від денні; найслабшого розведення в бутель або пробірку зі d - фактор розведення, відповідний першому стерильним розчинником для виготовлення нарозведенню. ступного розведення (яке тепер є найслабшим!). Представлення результатів Вміст в бутлі змішується за допомогою збовОбчислене значення може бути представлетування бутля протягом 7 секунд 20-25 разів з не як в прикладі вище або як округлене число з амплітудою кута 30°. Вміст пробірки змішується в двома значущими цифрами. центрифузі з максимальною швидкістю 3 обороти Результати, які публікуються, повинні завжди за секунду. округлятися. Дають піні осісти і повторюють пункти 4 і 5 Приклад доти, поки не буде досягнуте відповідне розве19184 округляється до 19000 і представля4 дення/я (D2). ється як 1,9×10 . 8 8 Залиття чашки 294×10 округляється до 290×10 і представ10 За допомогою стерильної піпетки перемістиляється як 2,9×10 . ти А мл відповідного розведення/нь (D2) в чашки Для тризначного числа, округлюється третя Петрі. Налити 10-12мл розплавленого поживного цифра до найближчого нуля: - якщо третя цифра середовища не більш ніж 41±1°С, в кожну чашку - 5, і попередня цифра - парне число, число окруПетрі і ретельно змішати із зразком. Налити 10глюється в менший бік. Якщо попередня цифра 12мл розплавленого поживного середовища в непарне число, число округлюється у більший бік. пусту чашку Петрі як контроль стерильності. ЗаПриклад 28500 округлюється до 28000 і лишити чашки на чистій горизонтальній поверхні, 11500 округлюється до 12000 поки поживне середовище не затвердіє. ПеревеПриклад 9: дослідження стійкості ліофільнорнути чашки і інкубувати згідно з продуктами Qc, висушеноїLD-культури Fl-Da N що розглядаються. У цьому прикладі, порівняння виконане між Розподіл на чашку ступенем зміни в процесі виробництва ліофільноЗа допомогою стерильної піпетки перемістивисушених культур (FD-DVS) Fl-Da-N, приготовати А мл відповідного розведення/нь (D2) на повених з ІМФ і без нього як кріопротективний агент. У рхню поживного середовища. Розподілити зразок експериментах концентрація ІМФ була 0% і 3% у на всю поверхню поживного середовища за доваговому відношенні на грам концентрованої помогою стерильного шпателя Drigalski. Як контбіомаси. Добавка була додана до концентрату у роль стерильності застосовують неінокульовану вигляді 30% стерильного розчину. чашку Петрі з поживним середовищем. Дати зраПісля ферментації, біомаса була зібрана і зку вбратися поживним середовищем раніше, ніж сконцентрована з ферментаційного бульйону Flчашки будуть перевернуті і інкубовані згідно з Da N за допомогою центрифугування. Концентпродуктами Qc, що розглядаються. рат клітин був розділений на 2 частині по 300 Підрахунок колоній грамів, і ІМФ був доданий до однієї з частин. Щоб Для підрахунку загальної кількості життєздатзмоделювати ситуацію, з якою стикаються у виних клітин вибираються чашки Петрі, що містять робництві в процесі заморожування, добавки і 30-300 колоній. Підраховуються всі колонії. концентрати були змішані і зберігалися протягом Для підрахунку крос-контамінантів вибира5 годин при 8°С і надалі заморожені в рідкому ються чашки Петрі, які містять не більше 300 коазоті і далі зберігалися при -50°С протягом однолоній. Підраховуються всі колонії. го дня перед ліофілізацією. Після завершення Примітка: при підрахунку крос-контамінантів, ліофілізації, культура зберігалася при -50°С до продукт, який аналізується, може утворювати аналізу. Заморожена культура мала вміст життє10 точкові колонії, які створять помутніння на задздатних бактерій не менше за 10 колонієутвоньому плані. Тому підраховуються тільки колонії рювальних одиниць (КУО) на грам замороженого більшого розміру, ніж точкові колонії в помутнінні. матеріалу. Активність культури в молоці (LABОбчислення молоко) була виміряна після 7 днів зберігання 2 Після підрахунку, повинен бути виконаний χ при -50°С. тест на чашках з підрахованими колоніями, згідно Результати показані на Фігурі 6. зі стандартними статистичними процедурами. Очевидно, що ліофільно-висушені DVS Fl-Dn 2 Примітка: χ -тест не виконується, коли спосіб N без доданого ІМФ втратили більше активності. застосовується для крос-контамінантів. Зниження стійкості дорівнює 0,25 одиниць рН Якщо χ2-тест не пройдений, то результати для Fl-Dn N після зберігання протягом 7 днів при повинні бути відхилені, і аналіз повторений. -50°С. 0,25 одиниць рН майже рівні втраті 50% підкислювальної активності. 37 87462 38 Приклад 10: Дослідження стійкості замороПрофілі стійкості для F-DVS™ FL-DA N подані женої LD-культури у вигляді підкислювальної активності, узагальнеF-DVS™ Fl-Da N, із застосуванням різних ної на Фігурі 8. Мабуть тенденція, про яку повідомлялося сполук, що беруть участь в біосинтезі нуклеїнопротягом початкової фази зберігання F-DVS Flвих кислот як кріопротективні агенти Da N, може бути продовжена до 21 або навіть 49 Цей приклад описує дослідження стійкості днів. Також протягом тривалого зберігання інозаморожених культур F-DVS Fl-Da N (Chr. Hansen A/S Item. No. 501691), готових до застосування у зин, мабуть, кращий кріопротектор для F-DVS Flвиробництві, приготованих або з нуклеотидами Da N, ніж ГМФ, який, в свою чергу, кращий за ІМФ або ГМФ (гуанозин-5'-монофосфат) або нукІМФ. Крім того, цей експеримент показує, що пелеозидом, інозином як кріопротективних агентів. ревага застосування інозину як кріопротективного У експериментах концентрація ІМФ, ГМФ або агента протягом початкової фази зберігання таінозину зберігалася на рівні 3% у ваговому відкож може бути розширена для ситуації тривалого ношенні на грам концентрованої біомаси. ІМФ і зберігання. Таким чином, застосування інозину як ГМФ були додані до концентрату у вигляді 25% кріопротективного агента, як очікується, приведе відносно ваговому стерильного водного розчину, до продукту з більш ніж двократним посиленням тоді як інозит був доданий у вигляді сухого поропідкислювальної активності навіть після тривалошку. У разі інозину, вода була додана до культуго зберігання. ри в кількості, яка дорівнює кількості, доданій у Це є важливим результатом, оскільки середразі додання ІМФ і ГМФ. ній термін придатності при зберіганні комерційних заморожених культур становить 1 рік. Після ферментації, біомаса була зібрана і сконцентрована з ферментаційного бульйону FlПриклад 12: Вплив різних добавок на стійDa N за допомогою центрифугування. Конценткість ліофільно-висушеної LD-культури Fl-Da N рат клітин був розділений на 4 частині по 300 Цей приклад описує стійкість ліофільнограмів кожна і до однієї з частин був доданий висушених LD-культур (FD-DVS) FI-Da-N, пригоІМФ, ГМФ, інозин або нічого. Добавки і конценттованих з і без безлічі різних добавок, які можуть рати змішувалися протягом 30 хвилин, замородіяти як кріопротективні агенти. У експериментах жені в рідкому азоті і надалі зберігалися при концентрація різних добавок становила 3% у ва50°С. Заморожена культура мала вміст життєздаговому відношенні на грам концентрованої біома10 тних бактерій не менше за 10 колонієутворюваси, якщо інакше не указано. льних одиниць (КУО) на грам замороженого маПісля ферментації біомаса була зібрана і скотеріалу. Активність культури в молоці (LABнцентрована з ферментаційного бульйону Fмолоко) була виміряна в день заморозки, і активDVS™ СН N 14 за допомогою центрифугування, ність відстежувалася періодично до 13 днів. як описано в розділі "Матеріали і Методи". КонПрофілі стійкості для F-DVS™ Fl-Da N подані центрат клітин був розділений на безліч частин і у вигляді підкислювальної активності, узагальнені був доданий до кожної з частин. Щоб змоделювана Фігурі 7. ти ситуацію, з якою стикаються у виробництві в процесі заморожування, добавки і концентрати Очевидно, що F-DVS™ Fl-Da N, що не містить були змішані і зберігалися протягом 5 годин при добавок, втрачає активність. Відносно культури, 8°С і надалі заморожені в рідкому азоті і далі стабілізованої інозином зниження стійкості кульзберігалися при -50°С протягом одного дня перед тури без доданого інозину дорівнює 0,41 одиниць ліофілізацією. Після завершення ліофілізації, рН для F-DVS™ Fl-Da N після зберігання протякультура зберігалася при -50°С до аналізу. Замогом 13 днів при -50°С. 0,41 одиниць рН відповірожена культура мала вміст життєздатних бактедають втраті 60% підкислювальної активності. 10 рій не менше за 10 колонієутворювальних одиАналогічно, відмінність в стійкості між культурами ниць (КУО) на грам замороженого матеріалу. F-DVS™ Fl-Da N з доданням ГМФ або без дорівАктивність культури в молоці (LAB-молоко) була нює 0,31 одиниць рН, які відповідають втраті 50% виміряна аналізом підкислювальної активності підкислювальної активності. через 1 день і через 2 місяці зберігання при Приклад 11: Тривале дослідження стійкості 50°С. замороженої LD-культури F-DVS™ Fl-Da N, із З цього експерименту ясно, що різні добавки застосуванням різних сполук, що беруть участь в впливають зовсім різний чином на стійкість ліобіосинтезі нуклеїнових кислот як кріопротективні фільно-висушеної культури DVS Fl-Dn N. Крім агенти того, цей експеримент показує, що добавки, які Цей приклад описує тривале дослідження представляються оптимальними для початкової стійкості заморожених культур F-DVS™ Fl-Da N фази зберігання, не обов'язково є оптимальними (Chr. Hansen A/S Item. No. 501691), готових до протягом тривалого зберігання. Це проілюстрозастосування у виробництві, приготованих або з ване впливом додання 3% у ваговому відношенні нуклеотидами ІМФ або ГМФ (гуанозин-5'інозину або аденозину до культур. Протестувавмонофосфат) або нуклеозидом, інозином як кріоши тільки після одного дня зберігання при -50°С, протективних агентів. з'ясовано, що і 3% у ваговому відношенні інозин і Деталі експерименту проводилися як описано 3% у ваговому відношенні аденозин високоефекв Прикладі 10, за винятком того, що активність тивні в гарантії стійкості культури, але після 2 контролювалася протягом продовженого періоду місяців зберігання при -50°С стало ясно, що печасу. реважний 3% у ваговому відношенні ЦМФ, УМФ або ІМФ. На подив, результат 2 місячного експе 39 87462 40 Культура Bifidobacterium infantis культивуварименту стійкості при -50°С (Фігура 10) вказує, що лася в MRS бульйоні (Difco). Культура була охоаденозин шкідливий для культури. MSG (мононалоджена до 12°С, і рН культури був доведений до трію глутамат), який є відомим кріопротективним 6,0. Після охолоджування бактерії в ферментаагентом (Font de Valdez, 1983), включений в ексційних бульйонах були концентровані в 10-20 перимент по причинах порівняння. Далі, повинно разів центрифугуванням, були додані добавки, і бути зазначено/що концентрація Na-форміат станадалі культури були заморожені або швидко, новить 1/2% у ваговому відношенні, оскільки 3% у краплинним зануренням концентрованої культури ваговому відношенні шкідливе для заморожених в рідкий азот (культура А) або повільно, охолокультур, див. приклад 15 нижче. джуванням культури в морозильнику з регульоПриклад 13: Вплив комбінації добавок на стабільність замороженої культури L. bulgaricus, ваним охолоджуванням, що забезпечує швидзамороженої з швидкістю заморожування 1°С за кість охолоджування приблизно 1°С за хвилину, хвилину поки не була досягнута -50°С (культура В і С). Культури зберігалися при -50°С до наступного Цей приклад описує вплив додання комбінадня (приблизно 18 годин) раніше, ніж був виконації двох потенційних кріопротективних агентів ний аналіз життєздатності (аналіз КУО) як описа(ІМФ і інозину) на активність передбачувану при но в "Матеріалах і Методах". виробництві заморожених культур L. bulgaris. Як Цей експеримент показав, що, в порівнянні з приклад, була порівняна активність культур з швидко замороженою культурою Bifidobacterium таким доданням і без нього. infantis (культура А), життєздатність повільно заКультура L. bulgaricus культивувалася в бумороженої культури (В) значно знижена. Важлильйоні MRS (Difco) протягом 12 годин при 40°С. во, що цей експеримент далі показує що, якщо Культура була охолоджена до 12°С, і був встанокомбінація двох добавок даного винаходу, в цьовлений рН культури 6,0. Після охолоджування му випадку 3% у ваговому відношенні ІМФ і 2% у бактерії в ферментаційних бульйонах були сконваговому відношенні інозину, була додана до центровані в 10-20 разів центрифугуванням, дозаморожування (культура С), то кількість КУО бавки були додані і надалі повільно заморожені в повільно замороженої культури була майже іденморозильнику з регульованим охолоджуванням, тична швидко замороженої культури. що забезпечує швидкість охолоджування приАвтори прийшли до висновку, що комбінація близно 1°С за хвилину, поки не була досягнута 3% у ваговому відношенні ІМФ і 2% у ваговому 50°С. Культури зберігалися при -50°С до наступвідношенні інозину ефективна як кріопротективна ного дня (приблизно 18 годин) раніше, ніж був добавка для В. infantis, які заморожуються повівиконаний аналіз підкислення. Аналіз підкисленльно. ня був виконаний, як описано в розділі "Матеріали і Методи" за винятком того, що аналіз був осПриклад 15: Вплив різних добавок на стабінований на 0,02% у ваговому відношенні льність замороженої культури F-DVS™ CH-N 19 інокуляті і виконаний при 40°С за період 5 годин. Цей приклад описує стабільність заморожеУ експерименті були додані 3% у ваговому них культур (F-DVS™), готових до застосування у відношенні ІМФ і 2% у ваговому відношенні іновиробництві, культури CH-N 19, сформованих з зин як кріопротектори, в об'ємному відношенні безліччю різних добавок, які можуть діяти як кріостосується ваги добавки на грам концентрованої протективні агенти, і без них. біомаси. ІМФ і інозин були додані до концентрату Після ферментації біомаса була зібрана і скоу вигляді водного розчину, приводячи до 13% нцентрована з ферментаційного бульйону Fзбільшення об'єму культури. Це збільшення не DVS™ CH-N 19 за допомогою центрифугування. було враховане в даних, представлених на Фігурі Концентрат клітин був розділений на безліч час11. Таким чином, кріопротективний ефект є ще тин, були додані різні добавки, як визначено на більшим, ніж позначений на Фігурі. фігурах. Концентрація різних добавок дається на Цей експеримент показує, що комбінація фігурах як % у ваговому відношенні на грам кондвох добавок даного винаходу, в цьому випадку центрованої біомаси. 3% у ваговому відношенні ІМФ і 2% у ваговому Добавки і концентрати були змішані протягом відношенні інозину, робить культуру значно більш 30 хвилин, заморожені по краплях в рідкому азоті стійкою. Відмінність в стійкості дорівнює 0,26 і надалі зберігалися при -50°С. одиниці рН для культури L. bulgaricus після зберіКультуральна активність в молоці (LABгання протягом 1 дні при -50°С. 0,26 одиниці рН молоко) була виміряна як підкислювальна активмайже рівні 50% відмінності в підкислювальній ність після 1 дня (Фігура 13) і 6 днів (Фігура 14) активності (тобто стабілізована культура приблизберігання при -50°С. Аналіз активності основазно в 2 рази більш активна, ніж нестабілізована). ний на 0,005% відносно ваги до об'єму інокуляту і Цей експеримент, крім того, показує, що кріоінкубації протягом 6 годин при 30°С. протективний ефект ІМФ і інозину може бути таЯк видно з прикладу 12, цей експеримент також поширений на культури, які повільно заморокож показав, що різні добавки мають досить різжені. ний вплив на стабільність замороженої культури. Приклад 14: Вплив комбінації добавок на Що цікаво, цей експеримент показав, що і аденожиттєздатність заморожених В. infantis зин, і аденозин-5'-монофосфат шкідливі для акЦей приклад досліджує вплив комбінації 3% у тивності культури. Експеримент також надав доваговому відношенні ІМФ і 2% у ваговому відноказ того, що 3% у ваговому відношенні Naшенні інозину на стійкість повільно заморожених форміат шкідливий для активності заморожених Bifidobacterium infantis. культур. 41 87462 42 різальна машина була спочатку запущена гориПриклад 16: Проба з доданням ІМФ і інозину зонтально з кінця в кінець, з подальшим запуском (з прикладу 15) з доданим CH-N19, для продукції вертикально з кінця в кінець в сирній ванні. Потім сира Gouda 45+ коагулят був розрізаний вертикально з сторони в Продукція Gouda 45+ в 150-кілограмових сирних ваннах сторону три рази вниз до стінок ванни, поки не 1. Молоко були отримані куби розміром 5мм. На даному етапі згусток оброблявся дуже ретельно, щоб Сире молоко було доставлене з молочного мінімізувати втрати в сироватці. Мішалка була заводу Borup, Данія, яке було пастеризоване при ~72°С протягом 15 секунд (органічне молоко, 76переміщена у ванну і згусток попередньо повіль78°С протягом 15 секунд) і потім охолоджене до но перемішувався (350об./хв.) протягом 15-20хв. 5°С. Вміст протеїну буде звичайно варіювати в Після 15-20 хвилин було злито 45кг сироватки, і межах 3,4-3,7% протеїну. Отримане молоко було потім мішалка була встановлена на більш швидпроаналізоване на Milkoscanner (Foss Electric кий рівень перемішування протягом 20 хвилин A/S, Hillerd, Данія) на % вмісту протеїну і жиру. (415об./хв.). Потім було почате варіння за допоБула прийнята температура молока, і був взятий могою підіймання температури до 38°С в першозразок для бактеріологічного аналізу. Молоко му наборі партій і 40°С для другого набору партій зберігалося в камері охолоджування до викориспротягом 20хв. Було потрібне повільне, рівноміртання. не і контрольоване збільшення температури. Піс2. Стандартизація ля досягнення 38°С або 40°С перемішування Молоко для продукції Gouda 45+ повинно мабуло продовжене до сумарного перемішування ти жирність 3,00% (із вмістом білка 3,4%), яка в 85 хвилин (що означає 35-45хв. при 38°С або готовому сирі буде дорівнювати -45% жиру в су40°С). 6. Пресування хій речовині. Відношення жир/білок було обчисПісля 95 хвилин перемішування мішалка булене із застосуванням стандартних способів рівла видалена, і згустку дали осісти у ванні. Потім ня техніки. Молоко для сироробства було згусток був вийнятий і попередньо спресований, стандартизоване доданням розрахункової кількозастосовуючи пластини попереднього пресувансті вершків або збираного молока. Після стандарня і гідравлічні циліндри, для прикладання тиску тизації молоко було підігріте в теплообміннику до до згустку в 2,5бар протягом 30хв. Після поперепереддозріваючої температури 32°С і накачане в днього пресування згусток був розрізаний на два сирні ванни. Повільне перемішування (235об./хв.) продовжувалося поки фермент не розчинився в блоки. Сирні блоки були вміщені в відповідні молоці. прес-форми (30×30см) тією ж стороною вниз, як 3. СаСl2 і Селітра під час попереднього пресування. Потім пресСелітра була додана в концентрації 0,020% в форми були вміщені в пресувальний пристрій і кількості 30г на 150кг молока. СаСl2 був доданий пресувалися 20 хвилин при тиску 2бар і надалі до молока в кількості 0-20г на 150кг молока з 34% протягом 1-2 годин при тиску 4-6бар. розчину якщо необхідно. Після завершення пресування була виміряна 4. Культура висота сирів, сири були зважені, марковані, і був У цьому експерименті були вироблені і порівпроаналізований рН. У кінці, сири зберігалися в няні 4 партії. У першому наборі партій, одна парпрес-формах, поки вони не досягли рН 5,7, і після тія була інокульована 0,005% F-DVS CH-N 19 з цього вони були направлені безпосередньо на ІМФ і інозином, доданими перед заморожуванням соління в розсолі. (партія 1В). Культура початкової партії була іно7. Соління кульована 0,01% F-DVS CH-N 19 без додання Соління було виконане протягом 20-24 годин ІМФ і інозину (партія 1А). Другий набір партій був в розсолі 20% NaCl+0,25% СаСl2 при температурі інокульований з 0,005% F-DVS CH-N 19 з ІМФ і 10-12°С, до досягнення концентрації солі в готоінозином, доданими перед заморожуванням (парвих сирах приблизно 1,7%. Було важливо, щоб тія 2В). Початкова партія була інокульована сири були належно розділені і занурені протягом 0,01% F-DVS CH-N 19 без додання ІМФ і інозину соління в розсолі для отримання бажаної концен(партія 2А). Перед доданням ферменту культурі трації солі. Після соління сири були висушені дозволяють рости протягом 35 хвилин при 32°С. протягом 1-2 годин перед упаковуванням. 5. Сичужний фермент 8. Упаковування Сичужний фермент CHY-MAX Plus (200 Перед упаковуванням сири були обприскані IMCU/мл) був доданий в кількості 0,022% у вагонатаміцином (300млн 1 у воді), потім герметично вому відношенні (30,0г на 150кг). Перед застосуупаковані в поліетиленові пакети Cryovac (BK1L) і ванням фермент був розчинений в 3 кратному вміщені в тверді пластикові коробки (30×30см). його об'ємі в чистій холодній водопровідній воді. Після упаковування коробки зберігалися при 14°С Перемішування (235об./хв.) продовжувалося пропротягом 4 тижнів, а після цього вони зберігалися тягом не більше 1 хвилини після додання фермепри 5-8°С. нту, і мішалка була видалена з ванни. Виходить, Умови культивування: що молоко згортається через 35хв. після додання Партія 1: ферменту. А.) Експериментальна Культура F-DVS CH-N Виробництво Gouda 45+ 19 з доданням ІМФ і інозину Коагуляція молока звичайно займає 30-45хв. Температура варіння 38°С. Інокуляція 0,005% Коагулят був розрізаний струнно-різальною машиною з відстанню 5мм між струнами. Струнно 43 Обробка Партія № Додання молока Додання культури Додання добавок Додання ферменту Розрізання Попереднє перемішування Зливання молочної сироватки Проміжне перемішування Варіння Початок/Перемішування Кінець варіння Останнє перемішування Попереднє пресування Кінець попереднього пресування Завантаження в пресформи Пресування 1 Пресування 2 Пресування 3 Кінець пресування рН після 6годин У воді Вміщення в розсіл Виймання з розсолу Передпресувальна підготовка рН після 30 годин 87462 44 СН-N19 з ІМФ і інозином 1В Швидкість перемішуЧас Температура вання рН титр встановленийфактичнийвстановленафактична встановлена фактична 09:30 32,0 235 6,64 09:45 10:15 10:20 6,55 10:55 11:00 350 11:20 32,0 11:25 6,53 0,14 390 11:35 6,52 0,14 11:50 12:30 12:35 38,0 390 13:05 6,51 0,15 6,48 0,16 6,34 0,17 13:10 13:15 13:45 15:15 15:15 15:45 16:00 17:15 5,75 15:45 Розсіл: 21% NaCl, рН 5,2, 22,5 годин температура: 11,5°C рН 5,48 2,5бар 30хв. В.) Контрольна культура F-DVS CH-N 19 без доданого ІМФ і інозину Температура варіння 38°С. Інокуляція 0,01% 5,21 45 Обробка Партія № Додання молока Додання селітри Додання культури Додання добавок Додання ферменту Розрізання Попереднє перемішування Зливання молочної сироватки Проміжне перемішування Варіння Початок/Перемішування Кінець варіння Останнє перемішування Попереднє пресування Кінець попереднього пресування Завантаження в пресформи Пресування 1 Пресування 2 Пресування 3 Кінець пресування рН після 6 годин У воді Вміщення в розсіл Виймання з розсолу Передпресувальна підготовка рН після 30 годин 87462 46 Контроль CH-N19 1А Швидкість перемішуЧас Температура вання рН титр встановлений фактичнийвстановленафактична встановлена фактична 09:00 32,0 235 6,63 09:05 09:15 09:45 09:50 6,57 10:25 10:30 350 10:50 32,0 10:55 6,53 0,15 390 11:05 6,52 0,15 11:20 12:00 12:05 38,0 390 12:35 6,52 0,15 6,51 0,16 6,41 0,17 12:40 12:45 13:15 14:45 14:45 15:15 15:30 16:45 5,92 15:15 Розсіл: 21% NaCl, рН 5,2, 22,5 годин температура: 11,5°С рН 5,70 2,5бар 30хв. 5,20 Партія 2: А.) Експериментальна Культура F-DVS CH-N 19 з доданням ІМФ і інозину Температура варіння 40°С. Інокуляція 0,005% 47 Обробка Партія № Додання молока Додання селітри Додання культури Додання добавок Додання ферменту Розрізання Попереднє перемішування Зливання молочної сироватки Проміжне перемішування Варіння Початок/Перемішування Кінець варіння Останнє перемішування Попереднє пресування Кінець попереднього пресування Завантаження в пресформи Пресування 1 Пресування 2 Пресування 3 Кінець пресування рН після 6 годин У воді Вміщення в розсіл Виймання з розсолу Передпресувальна підготовка рН після 30 годин 87462 48 СН-N19 з ІМФ і інозином 2В Швидкість перемішуЧас Температура вання рН титр встановлений фактичнийвстановленафактична встановлена фактична 08:30 32,0 235 6,63 08:35 08:45 09:15 09:20 6,54 09:55 10:00 350 10:20 32,0 10:25 6,52 0,14 390 10:35 6,52 0,15 10:50 11:30 11:35 40,0 12:05 390 6,50 0,15 6,47 0,16 6,36 0,16 12:10 12:15 12:45 14:15 14:15 14:15 16:00 19:00 6,02 рН 5,60 17:30 22,5 годин 2,5бар 30хв. В.) Контрольна культура F-DVS CH-N 19 без додання ІМФ і інозину Температура варіння 40°С. Інокуляція 0,01% 5,22 49 Обробка Партія № Додання молока Додання селітри Додання культури Додання добавок Додання ферменту Розрізання Попереднє перемішування Зливання молочної сироватки Проміжне перемішування Варіння Початок/Перемішування Кінець варіння Останнє перемішування Попереднє пресування Кінець попереднього пресування Завантаження в пресформи Пресування 1 Пресування 2 Пресування 3 Кінець пресування рН після 6 годин У воді Вміщення в розсіл Виймання з розсолу Передпресувальна підготовка рН після 30 годин 87462 50 Контроль CH-N19 2А Швидкість перемішуЧас Температура вання рН титр встановлений фактичнийвстановленафактична встановлена фактична 08:00 32,0 235 6,60 08:05 08:15 08:45 08:50 6,54 09:25 09:30 350 09:50 32,0 09:55 6,54 0,14 390 10:05 6,53 0,14 10:20 11:00 11:05 40,0 390 11:35 6,51 0,14 6,49 0,15 6,41 0,16 11:40 11:45 12:15 13:45 13:45 14:15 15:30 19:00 6,24 17:30 Розсіл: 21% NaCl, рН 5,2, 22,5 годин температура: 11,5°C рН 5,84 2,5бар 30хв. Результати: Сири були оцінені через 8 тижнів. Хімічний аналіз визначав гарантію того, що сир був в межах вимог до цього виду сиру (вологість, сіль, жир) 4 тижневої давності. Також проводилася сенсорна оцінка сирів, щоб гарантувати, що вони мали правильну форму дірок, текстуру і аромат. Сирні продукти були далі проаналізовані на наступні дефекти: 1.) Зовнішні дефекти (форма, кірка, колір, запах). 2.) Внутрішні дефекти (колір, структура, консистенція). 3.) Дефекти запаху і смаку. Потім були оцінені партії, використовуючи один з номерів: 0, 3, 6, 8, 9, 10, 11, 12 або 13. Партії з міткою 13 є кращими. Партії 1 1Α.) Початкові умови. Ванна 406 F-DVS CHN19 Температура варіння 38°С - Форма дірок була хороша, 11. - Запах був хороший, приємний і чистий, характеристика 11. 5,32 - Смак був як бажаний для Гауди, дуже хороший, 11 (маслянистий, трохи кисло-солоний і горіховий). 1В.) Ванна 407 F-DVSCHN-19 з доданням ІМФ і інозину. Температура варіння 38°С. - Форма дірок була хорошою, 11. - Запах був хороший, приємний і чистий, характеристика 11. - Смак був як бажаний для Гауди, дуже хороший, 11 (маслянистий, трохи кисло-солоний і горіховий). - Не було виявлено ніяких відмінностей в сирах від існуючої культури і тест культури. Партії 2 2А.) Початкові умови. Ванна 404 F-DVS CH-N 19. Температура варіння 40°С - Мав не цілком бажану форму дірок; дірки були дуже маленькими, характеристика 9. - Запах був хороший, приємний і чистий, характеристика 11. - Смак був як бажаний для Гауди, можливо трохи пересолений, але дуже хороший, 11. 51 87462 52 5. Чеддеризація 2В.) Ванна 405. F-DVS CH-N 19 з ІМФ і інозиЗгусток і сироватка розділяються, і згустку доном. Температура варіння 38°С. зволяють розплавитися. Потім розплавлений згус- Форма дірок трохи краща, ніж у іншого, але ток "чеддеризується". Розплавлений згусток розріпроте бажані великі розміри дірок, 10. зається на блоки, які повертаються кожні 10-15 - Запах був хороший, приємний і чистий, харахвилин. Коли кислотність сироватки від блоків доктеристика 11. сягає рН 5,5-5,6, згусток розмелюється. Розмелю- Смак був як бажаний для Гауди, можливо вання включає розрізання великих блоків згустку трохи пересолений, але дуже хороший, 11. до частин розміром з палець. - Не було виявлено ніяких відмінностей в сирах від існуючої культури і тест культури. 6. Соління Приклад 17: Проба з доданням ІМФ і інозину До згустку додається приблизно 2% сіль, даюдо F-DVS R-604 для продукції сиру Чеддер чи кінцеву концентрацію солі в сирі 1,6-1,8% (Сіль Стандартна інструкція для продукції сира Чедпри вологості 4,5-5%). дер в 150-кілограмових сирних ваннах 7. Упаковування Чеддер - один з сирів, що найбільш широко Відливання в форму і пресування проводяться виробляються. Спочатку він виготовлявся тільки в у башті під частковим вакуумом, з сильним мехаВеликобританії, але тепер виготовляється у всьонічним тиском. Сир формується в 20-кілограмові му світі, переважно в Австралії, Канаді, Ірландії, блоки і вакуумно запаковується в пластикові пакеНовій Зеландії і США. Основні принципи виготовти. лення сиру Чеддер залишаються однаковими у Сир витримується при 7-10°С протягом 3-12 всіх країнах тільки з незначними модифікаціями. місяців, в залежності від необхідної сили смаку Колір може коливатися від світло-кремового (тобто, м'якого або витриманого). Висновок до темно-жовтого кольору. У деяких випадках доСир Чеддер, зроблений від кожної з партій, дається аннатто, щоб додати оранжевий/червоний буде порівняний відносно смаку, текстури і інших колір. Текстура стійка і щільна, і сир не кришиться якостей, для визначення, чи впливає застосування при розрізанні. Більшість Чеддера продається пісінокуляту, кріоконсервованого з ІМФ і інозином на ля витримки протягом 3-5 місяців, і він дуже м'яготовий продукт сиру Чеддер. Інокулят, що містить кий. Хороший зрілий Чеддер має горіховий присуміш ІМФ і інозину, зробить сир практично такої ж смак з відмітною гостротою, і він кращий після 9-12 якості, що і інокулят, позбавлений ІМФ і інозину. місячної витримки. Подальша перевага винаходу полягає в тому, що Ця процедура описує традиційну процедуру може бути застосована менша кількість концентвиготовлення Чеддера, і служить для визначення рованого інокуляту, якщо інокулят містить суміш впливу кріоконсервації з ІМФ і інозином на інокулят культури. ІМФ і інозину. 1. Молоко Приклад 18: Проба з доданням ІМФ і інозину Молоко замовляється на молочному заводі до F-DVS ST-M3 для продукції сиру Котедж Стандартна інструкція для продукції сиру КоBorup (Данія) і доставляється як сире молоко, яке пастеризується при приблизно 72°С (162°F) протятедж в 150-кілограмових сирних ваннах гом 15 секунд, і потім охолоджується до приблизно Сир Котедж - дуже популярний м'який сир ни30-32°С. У випадку якщо бажаний забарвлений зької жирності у Великобританії і США, країнах, які Чеддер, додається 475-600мл аннатто Chr. піклуються про вагу. Простий сир Котедж позбавHansen A320WS на 5000л молока. Паралельні лений смаку, тому популярно додавати смак продукту додаючи зубчики часнику, цибулю і т. д. Запартії культури готуються для порівняння впливу стосовується два способи виробництва сиру кріоконсервації в присутності ІМФ і інозину на FКотедж: короткочасний спосіб і довготривалий DVS R-604. спосіб. Деталі обох надані. Короткочасний спосіб 2. Культура описаний нижче безпосередньо, потім довготриКонтрольна культура F-DVS R-604, кріоконсевалий спосіб, який описаний в п'ятому розділі. рвована без ІМФ і інозину (Партія 1), додається у 1. Молоко вигляді інокуляту в концентрації приблизно Молоко замовляється на молочному заводі 750г/5000 літрів культури. Тест культура F-DVS RBorup (Данія) і доставляється як сире молоко, яке 604 кріоконсервована з ІМФ і інозитом (Партія 2) пастеризується при приблизно 72°С (162°F) протядодається у вигляді інокуляту в концентрації пригом 15 секунд, і потім охолоджується до приблизно близно 500г/5000 літрів культури. 3. Сичужний фермент 34°С. Сичужний фермент CHY-MAX Powder Extra 2. Культура додається до кожної партії в кількості 2,5-3г на Для короткочасного способу, контрольна куль100л молока. Після додання ферменту, гель буде тура F-DVS ST-M3, кріоконсервована без ІМФ і формуватися протягом 30-45 хвилин. інозину (Партія 1) додається у вигляді інокуляту в 4. Виробництво сиру Чеддер концентрації приблизно 2500 г/5000 л культури. Наступна процедура проводиться для кожної з Тест культура F-DVS ST-M3, кріоконсервована з ІМФ і інозином (Партія 2), додається у вигляді іноперевірених партій настільки однаково наскільки куляту в концентрації приблизно 2000г/5000л кульможливо. Згусток розрізається на маленькі куби тури. 5×5мм. Потім температура підіймається приблизно 3. Сичужний фермент до 38-40°С за період 40-50 хвилин. Згусток і сироватка розмішуються протягом 30-50 хвилин в залежності від необхідного вмісту вологи. 53 87462 54 релла звичайно застосовується як сир піци. ЧастіСичужний фермент CHY-MAX Powder Extra ше за все згусток ферментується до рН 5,0-5,2 додається до кожної з партій в кількості 0,2-0,5г на перед тим як згусток змішується з гарячою водою і 5000л молока. розтягується. Вибір культури впливає головний 4. Виробництво сиру Котедж чином на характеристики сиру для піци (тобто, Наступна процедура проводиться для кожної з розтяжність, потемніння, розплавлення і знежиперевірених партій настільки однаково, наскільки можливо. Молоко культивується протягом 4,5-5 рення). 1. Молоко годин, поки не буде досягнутий рН 4,65-4,8. ЗгусМолоко замовляється на молочному заводі ток розрізається на рівні куби приблизно по 12мм. Borup (Данія) і доставляється як сире молоко, яке Згусток залишають в спокої протягом 10-15 хвипастеризується приблизно при 72°С (162°F) протялин. Згусток розмішується дуже обережно, і варінгом 15 секунд, і потім охолоджується до приблизно ня починається при температурі 55-58°С, яка досягається за 60-75 хвилин. Коли згусток стає досить 36-38°С. твердим, сироватка зливається. Потім згусток 2. Культура промивається і зливається три рази таким чином: Контрольна культура F-DVS ST-M3, кріоконсеПо-перше, проводиться промивання водою рвована без ІМФ і інозину (Партія 1), додається у вигляді інокуляту в концентрації приблизно (13-15°С), щоб знизити температуру згустку до 29750г/5000л культури. Тест культура F-DVS ST-M3, 32°С. По-друге, проводиться промивання водою (13-15°С), щоб знизити температуру згустку до кріоконсервована з ІМФ і інозином (Партія 2), до18°С. Нарешті, проводиться промивання водою (2дається у вигляді інокуляту в концентрації прибли5°С), щоб знизити температуру згустку до 2-5°С. зно 500г/5000л культури. Культура культивується Після заключного зливання згусток готовий до протягом 30-45 хвилин при 35-38°С. змішування з прісною або культивованою заправ3. Сичужний фермент Сичужний фермент CHY-MAX Powder Extra кою. Заправки можуть бути виготовлені з різних доданий до кожної з партій в кількості 1-3г на 100л комбінацій вершків, молока і сухого знежиреного молока. молока. 4. Виробництво сиру Моцарелла 5. Довготривалий спосіб Процес подібний до того, який може бути заНаступна процедура проводиться для кожної з стосований в короткочасному способі, за винятком перевірених партій настільки однаково наскільки концентрації інокульованої культури, температури можливо. Коагулят нарізується на куби величиною інкубації і часу інкубації. Для довготривалого спо5-8мм, і залишається для загусання протягом 5 собу, контрольна культура F-DVS ST-M3, кріоконхвилин. Потім температура збільшується до 40сервована без ІМФ і інозину (Batchl) додається у 43°С протягом 15-20 хвилин з перемішуванням. Потім сир обробляється, застосовуючи спосіб згувигляді інокуляту в концентрації приблизно стку Чеддера, де вся сироватка зливається, згус500г/5000л культури. ток нарізується на блоки, і блоки повертаються в Тест культура F-DVS ST-M3, кріоконсервована процесі ферментації. Розмелювання згустку відбуз ІМФ і інозином (Партія 2), додається у вигляді вається при рН 5-5,25. інокуляту в концентрації приблизно 300г/5000л Коли досягається бажаний рН, сир вміщується культури. Більш низька концентрація інокуляту і в розтяжну машину і змішується з гарячою водою, температура інкубації 20-22°С приведуть до більш 75-80°С. Процес займає приблизно 10-15 хвилин, і тривалого часу інкубації, необхідного для досягтемпература згустку досягає приблизно 58-65°С. нення бажаного кінцевого рН, який буде звичайно Розтягнутий сир формується і негайно охолоджузаймати 14-18 годин. ється в охолодженій воді до 5-10°С, що зупиняє Висновок подальше підкислення. Соління сиру виготовляСир Котедж, зроблений від кожної з партій, ється в насиченому сольовому розчині при темпебуде порівняний відносно смаку, текстури і інших якостей для визначення, чи впливає застосування ратурі 10°С або нижче. інокуляту, кріоконсервованого з ІМФ і інозином на Сир Моцарелла/Піца, вироблений від кожної з готовий продукт сиру Котедж. Інокулят, що містить партій, буде порівняний відносно смаку, текстури і інших якостей, для визначення, чи впливає застосуміш ІМФ і інозину, зробить сир практично такої ж сування інокуляту, кріоконсервованого з ІМФ і іноякості, що і інокулят, позбавлений ІМФ і інозину. зином на готовий продукт сиру Моцарелла/Піца. Подальша перевага винаходу полягає в тому, що Інокулят, що містить суміш ІМФ і інозину, зробить може бути застосована менша кількість концентсир практично такої ж якості, що і інокулят, позбарованого інокуляту, якщо інокулят містить суміш влений ІМФ і інозину. Подальша перевага винахоІМФ і інозину. ду полягає в тому, що може бути застосована меПриклад 19: Проба з доданням ІМФ і інозину нша кількість концентрованого інокуляту, якщо до F-DVS ST-M3 для продукції сиру Моцарелінокулят містить суміш ІМФ і інозину. ла/Піца Приклад 20: Проба з доданням ІМФ і інозину Стандартна інструкція для продукції сира Модо F-DVS CH-N 11 для продукції сиру Маасдам царелла/Піца в 150-кілограмових сирних ваннах Стандартна інструкція для продукції сира МаЦей тип Моцарелли головним чином застосоасдам в 150-кілограмових сирних ваннах вується як сир для піци. Оскільки він більш твердий, ніж м'який сир Моцарелла, він легше стираМаасдам - тип швейцарського сиру, названий ється на тертушці. Існують різні типи Моцарелли, на честь річки Маас в Нідерландах. які мають різний вміст води і жиру в сухій речовині. Частково знежирена, з низькою вологістю Моца 55 87462 56 вість, білу поверхню і його смак. Існує два основСир має відносно великі розміри дірок, а також них способи по стабілізації рН сиру: негострий і горіховий присмак через додані пропі1.) Стабілізоване промивання згустку, тобто, оновокислі бактерії. видалення лактози і таким чином зменшення кіль1. Молоко кості цукру, доступної для перетворення в молочну Молоко замовляється на молочному заводі кислоту. Це допомагає досягати бажаного високоBorup (Данія) і доставляється як сире молоко, яке го рН. Для стабілізації сиру Брі/Камамбер застосопастеризується при приблизно 72°С (162°F) протявуються і мезофільні і термофільні культури, звигом 15 секунд або термічно обробляється при 65чайно 30% мезофільних і 70% термофільних. 70°С протягом 20 секунд, і потім охолоджується 2.) Розчинне інгібування закваски, коли рН приблизно до 30-32°С. близький до бажаного рівня, наприклад солінням 2. Культура або охолоджуванням. Цей тип здійснюється тільки Контрольна культура F-DVS CH-N 11, кріоконз термофільними культурами, так як вони менш сервована без ІМФ і інозину (Партія 1), додається чутливі до низьких температур, ніж мезофільні у вигляді інокуляту в концентрації приблизно культури. 750г/5000л культури. Тест культура F-DVS CH-N 1. Молоко 11, кріоконсервована з ІМФ і інозином (Партія 2), Молоко замовляється на молочному заводі додається у вигляді інокуляту в концентрації приBorup (Данія) і доставляється як сире молоко, яке близно 500г/5000л культури. Культура культивупастеризується при приблизно 72°С (162°F) протяється протягом 10-40 хвилин при 32°С. гом 15 секунд і потім охолоджується приблизно до 3. Сичужний фермент 35-37°С. Сичужний фермент CHY-MAX Powder Extra 2. Культура додається до кожної з партій в кількості 1-3г на 100л молока. Контрольна культура F-DVS CHN-12, кріокон4. Виробництво сиру Маасдам сервована без ІМФ і інозину (Партія 1), додається Гель формується приблизно через 30-45 хвиу вигляді інокуляту в концентрації приблизно лин. Коагулят нарізується на куби розміром 5-7мм, 250г/5000л культури. Тест культура F-DVS CHN12, кріоконсервована з ІМФ і інозином (Партія 2), і згусток повільно розмішується протягом 15-25 додається у вигляді інокуляту в концентрації прихвилин. Приблизно 35-45% сироватки зливається, близно 200г/5000л культури. У прес-форму подаі згусток обережно розмішується протягом 15 хвиється 3-5Од рідкого РСа 1, РСа 3 або РСа FD на лин. Додається приблизно 15-20% (початкового 1000 літрів, а також 0,5-1Од GEO GDI. об'єму) гарячих води температурою приблизно 60°С. Температура згустку становить приблизно 3. Сичужний фермент 35-38°С, і згусток розмішується протягом приблизСичужний фермент CHY-MAX Powder Extra но 30-45 хвилин. Велика частина сироватки зливадодається до кожної з партій в кількості 2,5-3г на ється, і згусток злегка пресується при тиску 2100л молока. 2 4кг/см під сироваткою, що залишається протягом 4. Виробництво сиру Брі/Камамбер Гель формується приблизно через 30-45 хви15-30 хвилин. Згусток нарізується в блоки відповідного розміру, які вміщуються в прес-форми. лин. Коагулят нарізується на куби по 10мм, і злиПрес-форми злегка пресують протягом 20 хвилин, вається 40% сироватки. Той же об'єм води дода2 з подальшим тиском 4-6кг/см протягом 1-2 годин. ний в приблизно 40-45°С. Культурі дозволяють Блоки згустку розвантажуються безпосередньо в постояти 30-50 хвилин з випадковим, обережним холодний розсіл з рН 5,6-5,7, і цільова концентраперемішуванням. Згусток розливається з ванни в ція солі в сирі становить 1-1,5%. прес-форму, і прес-форма повертається перший Сир Маасдам, вироблений від кожної з партій, раз через одну годину, повертається другий раз через три години, і повертається третій раз через буде порівняний відносно смаку, текстури і інших якостей, для визначення, чи впливає застосування вісім годин. Згусток видаляється з прес-форми і інокуляту, кріоконсервованого з ІМФ і інозином на завантажується в 18% розсіл. Сир зрошується 1готовий продукт сиру Маасдам. Інокулят, що міс2Од РСа 1, РСа 3 або РСа FD на 100 кілограмів тить суміш ІМФ і інозину, зробить сир практично сира. Сир дозріває при 14-15°С і відносній вологотакої ж якості, що і інокулят, позбавлений ІМФ і сті 85% протягом одного дня, потім при 12°С і відінозину. Подальша перевага винаходу полягає в носній вологості 95% протягом 8-10 днів. Коли тому, що може бути застосована менша кількість утвориться достатньо плісняви, поверхня сиру концентрованого інокуляту, якщо інокулят містить висушується, упаковується і зберігається при 4°С. суміш ІМФ і інозину. Кожний сир упаковується в жиронепроникний папір Приклад 21: Проба з доданням ІМФ і інозину і вміщується в картонну коробку або ящик з тирдо F-DVS CHN-12 для виробництва сиру сою. Брі/Камамбер Сир Брі/Камамбер, вироблений від кожної з Стандартна інструкція для виробництва сира партій, буде порівняний відносно смаку, текстури і інших якостей, для визначення, чи впливає застоБрі/Камамбер в 150-кілограмових сирних ваннах сування інокуляту, кріоконсервованого з ІМФ і іноСтабілізований Брі/Камамбер відрізняється від зином, на готовий продукт сиру Брі/Камамбер. традиційного Брі/Камамбера тим, що пом'якшення Інокулят, що містить суміш ІМФ і інозину, зробить серцевини сиру не стільки залежить від часу, як сир практично такої ж якості, що і інокулят, позбавід мінімального значення рН, що складає в кінці влений ІМФ і інозину. Подальша перевага винаховиробництва згустку 4,9-5,4, в порівнянні з 4,6-4,8 ду полягає в тому, що може бути застосована медля традиційного Брі/Камамбера. Застосовуються білі прес-форми, щоб додати сиру його особли 57 87462 58 нша кількість концентрованого інокуляту, якщо Культури F-DVS™ FD-N були заморожені без інокулят містить суміш ІМФ і інозину. ІМФ і інозину для контролю. Всі культури F-DVS™ Приклад 22: Проба з доданням ІМФ і інозину до застосування зберігалися протягом двох місядо DVS FD-N для виробництва сквашених сколоців при -50°С. тин в 3-літровому об'ємі Концентровані культури (DVS FD-N), що місСквашені сколотини тять ІМФ і інозин, були застосовані для інокуляції Рецепт, що пропонується молока в концентрації 0,005%, і молоко культивуПопередня обробка валося при температурі 25°С до рН приблизно 4,5 Високоякісне, стандартизоване гомогенізоване в 3-літровому ферментатори. Контрольні культури молоко 0,5% жирності попередньо оброблене пасDVS™ FD-N, заморожені без ІМФ і інозину, застотеризацією при 90°С протягом 20 хвилин у ванні. совувалися для інокуляції молока в концентрації 3%-ий у ваговому відношенні ІМФ і 2% інозин 0,01%, і молоко культивувалося при температурі додані як стабілізатори до концентрованих культур 25°С до рН приблизно 4,5 в 3-літровому ферменDVS FD-N, суміш яких потім була заморожена. таторі. Назва замороженого продукту тепер F-DVS™ FDN. Тест № 1 2 Культура FD-N з ІМФ і інозином FD-N без ІМФ і інозину Кількість інокуляту 0,005% 0,01% Подальша обробка Коли рН досяг 4,51, продукт був розмішаний спочатку в подрібнювачі з ручною мішалкою, а потім протягом 1 хвилини мішалкою Ystral при напрузі 55В. Після перемішування, місткість була вміщена в охолоджуючу ванну і охолоджувалася до 18°С при періодичному перемішуванні ручною мішалкою. Потім продукт був налитий в бутлі і зберігався в 8°С. Результати: Сквашені сколотини були протестовані на відповідний аромат в дні 1 і 8: День 1: FD-N з ІМФ і Іонозином: Свіжий, з низьким СО2, хороший аромат FD-N без ІМФ і Іонозину: Свіжий, з низьким СО2, хороший аромат День 8: FD-N з ІМФ і Іонозином: Свіжий, з низьким СО2, хороший аромат FD-N без ІМФ і Іонозину: Сильне розжовування, свіжий, з низьким СО2, хороший аромат Ті ж час ферментації і рН застосовувалися для інокуляту 0,005% F-DVS FD-N з доданням ІМФ і інозину, в порівнянні з інокулятом 0,01% F-DVS без ІМФ і інозину. Доповнення ІМФ і інозину не приводило ні до якої зміни в'язкості або аромату/присмаку сквашених сколотин. Мабуть, кількість матеріалу інокуляції може бути зменшена на половину, якщо суміш ІМФ і інозину була додана до матеріалу інокуляції в порівнянні з матеріалом без ІМФ і інозину. Подібна якість сиру з точки зору смаку і текстури була отримана, застосовуючи як експериментальний інокулят, так і контрольний інокулят. Посилання Час ферментації 154 154 До рН 4,51 4,51 1. M.R. Adams and M.O. Moss (2000) Food Microbiology, second edition, The Royal Society of Chemistry, UK, pp. 480, ISBN: 0-85404-611-9. 2. J. K. Andersen, B. Fabech, B. L. Jacobsen, H. Mejborn and L. Rasmussen (1997) Biokontaminering, Veterinas- og fedevaredirektoratet, Kefoenhavn, Denmark. 3. P. Mazur. (1961) Physical and temporal factors involved in the death of yeast at subzero temperatures. Biophys J. (1): 247-64. 4. E. W. Nielsen and J. A. Ullum (1999). Mejerilaere 1, Erhvervsskolernes Forlag, Odense, Denmark. 5. G. Font de Valdez et al. (1983) Comparative study of the efficiency of some additives in protecting lactic acid bacteria against freeze-drying. Cryobiology; 20(5):560-6. 6. A. White, P. Handler and E. L. Smith (1973) Principles of Biochemistry, 5'th ed., McGraw-Hill Kogakusha, Tokyo. 7. R. Scott, (1986), Cheesemaking process, second ed., Elsevier Applied Science Publishers, London and New York. 8. G. Bylund, (1995), Dairy processing handbook, Tetra Рак Processing Systems, Lund, Sweden. 9. F. Kosikowski, (1982), Cheese and fermented milk foods, second ed., Kosikowski & Associates, New York. 10. R. Scott (1986), Cheesemaking Practice, Second edition, Elsevier Applied Science Publishers, London and New York. 11. Gösta Bylund, MSc (1995), Dairy Processing Handbook, Tetra Рак Processing Systems, S-221 86 Lund, Sweden. 12. Frank Kosikowski (1982), Cheese and Fermented nd Milk Foods (2 Ed), Published by Kosikowski & Associates, New York. 59 87462 60