Спосіб одержання суттєво очищених капсульних полісахаридів з лізату клітин streptococcus pneumoniae

Реферат: Спосіб одержання суттєво очищених капсульних полісахаридів з лізату клітин Streptococcus pneumoniae, який включає етапи ультрафільтрації та діафільтрації освітленого лізату клітин, одержаного шляхом лізису бактеріальних клітин з вибраного серотипу 1, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F та 23F Streptococcus pneumoniae літичним агентом та освітлення лізату клітин за допомогою центрифугування або фільтрації з утворенням ретентату. Після цього знижують показник рН ретентату до рівня, нижчого за 4,5, а утворений таким чином підкислений розчин ретентату витримують протягом часу, достатнього для відстоювання осаду, з наступною фільтрацією або центрифугуванням. Після цього фільтрують утворений освітлений розчин капсульного полісахариду крізь фільтр з активованого вугілля. Наступним етапом способу є ультрафільтрація та діафільтрація відфільтрованого розчину, з утворенням концентрованого розчину очищеного капсульного полісахариду. На останньому етапі фільтрують концентрований розчин очищеного капсульного полісахариду з застосуванням стерильного фільтра; в результаті чого одержують суттєво очищені капсульні полісахариди у формі розчину. За рахунок ультрафільтрації та діафільтрації освітленого лізату Streptococcus pneumoniae з наступним доведенням рН до рівня, нижчого за 4,5, в оптимальному варіанті - приблизно 3,5, осаджували принаймні 98 % білка у розчині без серйозного впливу на вихід полісахариду. UA 99278 C2 (12) UA 99278 C2 UA 99278 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Цей винахід стосується способів видалення надлишку розчинного білка та інших забруднювачів з клітинних лізатів серотипів Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae), які застосовують у виробництві очищених пневмококових полісахаридів. Streptococcus pneumoniae є грампозитивними ланцетоподібними коками, які зазвичай спостерігаються парами (диплококи), але також у коротких ланцюгах або як окремі клітини. Вони швидко ростуть на планшетах з кров’яним агаром блискучими колоніями і демонструють альфагемоліз, якщо не вирощуються в анаеробних умовах, за яких вони демонструють бета-гемоліз. Вони є чутливими до солей жовчних кислот, які можуть руйнувати стінки клітин у присутності власного ферменту клітин, аутолізину. Організм є аеротолерантним анаеробом і є вимогливим у тому сенсі, що має складні харчові потреби. Клітини більшості пневмококових серотипів мають капсулу, яка є полісахаридним покриттям, що оточує кожну клітину. Ця капсула є визначальною для вірулентності у людському організмі, оскільки впливає на фагоцитоз через запобігання приєднанню антитіл до бактеріальних клітин. На даний час розпізнано 90 капсульних серотипів, серед яких 23 серотипи зумовлюють приблизно 90% інфекційних хвороб. Як вакцина полісахарид може забезпечувати належний ступінь імунності до S. pneumoniae у суб’єктів з розвинутою або непорушеною імунною системою. Однак якщо полісахарид є кон’югованим з високомолекулярним білком, таким, як CRM197 і рецептованим у вакцину, яка містить кон’югати багатьох серотипів, такі кон’юговані вакцини забезпечують імунну реакцію у дітей та літніх людей, які також є найбільш підданими ризикові пневмококових інфекцій. Капсульний полісахарид для кожного серотипу S. pneumoniae, який застосовують для вакцин, продукують шляхом вирощування організму у рідкому середовищі. Масштаб висіяної популяції організму часто збільшують від флакона до пляшок і пропускають через один або кілька біореакторів збільшуваного об’єму до досягнення промислових масштабів об’єму культивування. Кінець циклу росту визначають одним з кількох способів, і в цей момент клітини піддають лізисові через додавання детергента або іншого реагента, який сприяє руйнуванню стінок клітин та вивільненню аутолізину, який викликає клітинний лізис, коли клітини досягають стаціонарної фази. Після цього бульйон збирають для наступної обробки (очищення). Головними забруднювачами є клітинні білки, нуклеїнові кислоти, C-полісахарид та компоненти середовища. Для більшості серотипів існуючої нині на ринку 7-валентної пневмококової кон’югованої (7vPnC) вакцини (Prevnar®), а також нещодавно розробленого 13-валентної пневмококової кон’югованої (13vPnC) вакцини нині існуючий спосіб очищення вимагає шістнадцяти етапів, включаючи багато дорогих, трудомістких і активно вимогливих операцій, таких, як хроматографія та багато мембранних відокремлень. Здійснювані раніше спроби вдосконалення способів очищення для полісахаридів S. Pneumoniae включали, наприклад, регулювання рівня pH під час ферментації та видобування (див. публікацію патентної заявки США № 2006/0228381) і осадження розчинником та детергентом. Однак видалення забруднювачів у цих процесах все одно відбувається з застосуванням багатьох трудомістких і дорогих етапів. Рівень білка є найбільш проблематичною для дотримання вимогою через фізичні та хімічні властивості розчинних білків. Таким чином, існує потреба у спрощеному способі очищення для зниження рівня розчинного білка у лізатах S. pneumoniae та усуненні неефективності існуючого способу очищення для утворення суттєво очищених капсульних полісахаридів, придатних для включення до пневмококових кон’югованих вакцин. Даний винахід стосується способу одержання суттєво очищених капсульних полісахаридів з лізатів клітин Streptococcus pneumoniae. Цей спосіб включає етапи: (a) забезпечення ферментаційного бульйону, який включає бактеріальні клітини, які продукують вибраний серотип Streptococcus pneumoniae; (b) піддавання бактеріальних клітин лізисові на етапі (a) літичним агентом з утворенням, таким чином, лізату клітин, який включає клітинний дебрис, розчинні білки, нуклеїнові кислоти та полісахариди; (c) освітлення лізату клітин з етапу (b) за допомогою центрифугування або фільтрації для видалення клітинного дебрису, з утворенням, таким чином, освітленого лізату клітин; (d) ультрафільтрації та діафільтрації освітленого лізату клітин з етапу (c) для видалення низькомолекулярних забруднювачів та підвищення концентрації полісахариду з утворенням, таким чином, ретентату; (e) зниження показника pH ретентату з етапу (d) до рівня, нижчого за 4,5, для осадження білка та нуклеїнових кислот з утворенням, таким чином, підкисленого розчину ретентату; 1 UA 99278 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (f) утримання підкисленого розчину ретентату, утвореного на етапі (e), протягом часу, достатнього для відстоювання осаду, з наступною фільтрацією або центрифугуванням підкисленого розчину ретентату з утворенням, таким чином, освітленого розчину полісахариду; (g) фільтрування освітленого розчину полісахариду з етапу (f) крізь фільтр з активованого вугілля; (h) ультрафільтрації та діафільтрації фільтрованого розчину, утвореного на етапі (g), з утворенням, таким чином, концентрованого розчину очищеного полісахариду; та (i) фільтрування концентрованого розчину очищеного полісахариду, одержаного на етапі (h), з застосуванням стерильного фільтра; з застосуванням яких одержують суттєво очищені капсульні полісахариди у формі розчину. Необмежувальними прикладами серотипів S. pneumoniae, вибраних для цього варіанта втілення винаходу, є 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F та 23F. У конкретному варіанті втілення pH на етапі (e) знижують до приблизно 3,5. В іншому варіанті втілення діафільтрація на етапі (h) включає регулювання pH до рівня від приблизно 5,5 до приблизно 7,5. В іншому варіанті втілення діафільтрація на етапі (h) включає регулювання pH до рівня від приблизно 7,0 до приблизно 7,5. В іншому варіанті втілення діафільтрація на етапі (h) включає регулювання рівня pH до приблизно 7,4. У ще одному варіанті втілення на етапі (e) видаляють принаймні 98% білка з ретентату з етапу (d). В іншому варіанті втілення на етапі (g) видаляють принаймні 90% білка з освітленого розчину полісахариду з етапу (f). В іншому варіанті втілення фільтр з активованого вугілля з етапу (g) включає активоване фосфорною кислотою деревне вугілля. В іншому варіанті втілення етап (f) включає утримання підкисленого розчину ретентату, утвореного на етапі (e), протягом принаймні 2 годин. У ще одному варіанті втілення літичним агентом з етапу (b) є дезоксихолатом натрію (DOC). В іншому варіанті втілення літичним агентом з етапу (b) є літичний агент нетваринного походження. У ще одному варіанті втілення літичним агентом з етапу (b) є літичний агент нетваринного походження N-лаурилсаркозин натрію (NLS). Суттєво очищений капсульний полісахарид, одержаний способом згідно з винаходом з лізату клітин Streptococcus pneumoniae, може застосовуватись у виробництві пневмококової вакцини, в оптимальному варіанті – пневмококової вакцини, яка містить полісахарид, кон’югований з білковим носієм. Даний винахід також стосується способу одержання суттєво очищених капсульних полісахаридів з лізату клітин Streptococcus pneumoniae, які включають серотип 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F або 23F. Спосіб включає етапи: (a) забезпечення ферментаційного бульйону, який включає бактеріальні клітини, які продукують Streptococcus pneumoniae, серотипу 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F або 23F; (b) піддавання бактеріальних клітин лізисові на етапі (a) літичним агентом з утворенням, таким чином, лізату клітин, який включає клітинний дебрис, розчинні білки, нуклеїнові кислоти та полісахариди; (c) освітлення лізату клітин з етапу (b) за допомогою центрифугування або фільтрації для видалення клітинного дебрису, з утворенням, таким чином, освітленого лізату клітин; (d) ультрафільтрації та діафільтрації освітленого лізату клітин з етапу (c) при кімнатній температурі при нейтральному рівні pH у безсольовому середовищі для видалення низькомолекулярних забруднювачів та підвищення концентрації полісахариду, з утворенням, таким чином, безсольового ретентату; (e) зниження рівня pH безсольового ретентату з етапу (d) до рівня, нижчого за 4,5, для осадження білка та нуклеїнових кислот з утворенням, таким чином, підкисленого розчину ретентату; (f) утримання підкисленого розчину ретентату, утвореного на етапі (e), протягом принаймні 2 годин при кімнатній температурі для забезпечення відстоювання осаду, з наступною фільтрацією або центрифугуванням підкисленого розчину ретентату з утворенням, таким чином, освітленого розчину полісахариду; (g) фільтрування освітленого розчину полісахариду з етапу (f) крізь фільтр з активованого вугілля; (h) ультрафільтрації та діафільтрації фільтрованого розчину, утвореного на етапі (g), з утворенням, таким чином, концентрованого розчину очищеного полісахариду; та (i) фільтрування концентрованого розчину очищеного полісахариду, одержаного на етапі (h), з застосуванням стерильного фільтра; з застосуванням яких одержують суттєво очищені капсульні полісахариди, які включають серотип 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F або 23F, у формі розчину. У конкретному варіанті втілення pH на етапі (e) знижують до приблизно 3,5. В іншому варіанті втілення діафільтрація на 2 UA 99278 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 етапі (h) включає регулювання pH до рівня від приблизно 5,5 до приблизно 7,5. В іншому варіанті втілення діафільтрація на етапі (h) включає регулювання pH до рівня від приблизно 7,0 до приблизно 7,5. В іншому варіанті втілення діафільтрація на етапі (h) включає регулювання рівня pH до приблизно 7,4. У ще одному варіанті втілення на етапі (e) видаляють принаймні 98% білка з безсольового ретентату з етапу (d). В іншому варіанті втілення на етапі (g) видаляють принаймні 90% білка з освітленого розчину полісахариду з етапу (f). В іншому варіанті втілення фільтр з активованого вугілля з етапу (g) включає активоване фосфорною кислотою деревне вугілля. У ще одному варіанті втілення літичним агентом з етапу (b) є дезоксихолатом натрію (DOC). В іншому варіанті втілення літичним агентом з етапу (b) є літичний агент нетваринного походження. У ще одному варіанті втілення літичним агентом з етапу (b) є літичний агент нетваринного походження N-лаурилсаркозин натрію (NLS). Даний винахід також стосується способу одержання суттєво очищених капсульних полісахаридів з лізату клітин Streptococcus pneumoniae, які включають серотип 19A. Спосіб включає етапи: (a) забезпечення ферментаційного бульйону, який включає бактеріальні клітини, які продукують Streptococcus pneumoniae, серотип 19A; (b) піддавання бактеріальних клітин лізисові на етапі (a) літичним агентом з утворенням, таким чином, лізату клітин, який включає клітинний дебрис, розчинні білки, нуклеїнові кислоти та полісахариди; (c) освітлення лізату клітин з етапу (b) за допомогою центрифугування або фільтрації для видалення клітинного дебрису, з утворенням, таким чином, освітленого лізату клітин; (d) ультрафільтрації та діафільтрації освітленого лізату клітин з етапу (c) при температурі приблизно 4 °C і pH приблизно 6 у натрієвофосфатному буфері для видалення низькомолекулярних забруднювачів та підвищення концентрації полісахариду з утворенням, таким чином, ретентату; (e) зниження показника pH ретентату з етапу (d) до рівня, нижчого за 4,5, для осадження білка та нуклеїнових кислот з утворенням, таким чином, підкисленого розчину ретентату; (f) утримання підкисленого розчину ретентату, утвореного на етапі (e), протягом принаймні 2 годин при температурі приблизно 4 C для забезпечення відстоювання осаду, з наступною фільтрацією або центрифугуванням підкисленого розчину ретентату з утворенням, таким чином, освітленого розчину полісахариду; (g) доведення рівня pH освітленого розчину полісахариду з етапу (f) до приблизно 6, з утворенням, таким чином освітленого розчину полісахариду з відрегульованим рівнем pH; (h) фільтрування освітленого розчину полісахариду з відрегульованим рівнем pH з етапу (g) крізь фільтр з активованого вугілля; (i) ультрафільтрації та діафільтрації фільтрованого розчину, утвореного на етапі (h), з утворенням, таким чином, концентрованого розчину очищеного полісахариду; та (j) фільтрування концентрованого розчину очищеного полісахариду, одержаного на етапі (i) з застосуванням стерильного фільтра; з застосуванням яких одержують суттєво очищені капсульні полісахариди, які включають серотип 19A, у формі розчину. У конкретному варіанті втілення pH на етапі (e) знижують до приблизно 3,5. В іншому варіанті втілення діафільтрація з етапу (i) включає регулювання pH до рівня від приблизно 5,5 до приблизно 7,5. В іншому варіанті втілення діафільтрація з етапу (i) включає регулювання pH до рівня від приблизно 7,0 до приблизно 7,5. В іншому варіанті втілення діафільтрація з етапу (i) включає регулювання рівня pH до приблизно 7,4. У ще одному варіанті втілення на етапі (e) видаляють принаймні 98% білка з ретентату з етапу (d). В іншому варіанті втілення на етапі (h) видаляють принаймні 90% білка з освітленого розчину полісахариду з відрегульованим рівнем pH з етапу (g). В іншому варіанті втілення фільтр з активованого вугілля з етапу (h) включає активоване фосфорною кислотою деревне вугілля. В іншому варіанті втілення натрієвофосфатний буфер з етапу (d) являє собою 25 мM фосфату натрію. У ще одному варіанті втілення літичним агентом з етапу (b) є дезоксихолат натрію (DOC). В іншому варіанті втілення літичним агентом з етапу (b) є літичний агент нетваринного походження. У ще одному варіанті втілення літичним агентом з етапу (b) є літичний агент нетваринного походження N-лаурилсаркозин натрію (NLS). КОРОТКИЙ ОПИС ФІГУР Фігура 1 показує середній активний вихід полісахариду (PS), співвідношення білка/PS та співвідношення нуклеїнової кислоти (NA)/PS для серотипу 5 при застосуванні скороченого способу очищення згідно з винаходом. Результати показано для кожного етапу очищення. Фігура 2 показує ЯМР-спектри для серотипу 4 PS згідно з існуючим способом очищення (A) порівняно з серотипом 4 PS згідно зі скороченим способом очищення (B). Значних розбіжностей 3 UA 99278 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 між двома спектрами не спостерігалося. Другий пік справа в обох спектрах означав піруват, і висота піка піруватної групи в обох спектрах була порівнянною. Фігура 3 показує середній активний вихід PS, співвідношення білка/PS та співвідношення NA/PS для серотипу 4 при застосуванні скороченого способу очищення згідно з винаходом. Результати показано для кожного етапу очищення. Фігура 4 показує середній активний вихід PS, співвідношення білка/PS та співвідношення NA/PS для серотипу 19A при застосуванні скороченого способу очищення згідно з винаходом. Результати показано для кожного етапу очищення. Фігура 5 показує середній активний вихід PS, співвідношення білка/PS та співвідношення NA/PS для серотипу 7F при застосуванні скороченого способу очищення згідно з винаходом. Результати показано для кожного етапу очищення. Фігура 6 показує середній активний вихід PS, співвідношення білка/PS та співвідношення NA/PS для серотипу 6B при застосуванні скороченого способу очищення згідно з винаходом. Результати показано для кожного етапу очищення. Фігура 7 показує середній активний вихід PS, співвідношення білка/PS та співвідношення NA/PS для серотипу 6A при застосуванні скороченого способу очищення згідно з винаходом. Результати показано для кожного етапу очищення. Фігура 8 показує середній активний вихід PS, співвідношення білка/PS та співвідношення NA/PS для серотипу 1 при застосуванні скороченого способу очищення згідно з винаходом. Результати показано для кожного етапу очищення. Фігура 9 показує середній активний вихід PS, співвідношення білка/PS та співвідношення NA/PS для серотипу 14 при застосуванні скороченого способу очищення згідно з винаходом. Результати показано для кожного етапу очищення. Фігура 10 показує порівняння показників активного виходу PS для серотипів 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A та 19F, очищених при застосуванні скороченого способу очищення згідно з винаходом. Фігура 11 показує порівняння співвідношень білка/PS для серотипів 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A та 19F, очищених при застосуванні скороченого способу очищення згідно з винаходом. Результати порівнюються для кожного етапу очищення. Фігура 12 показує порівняння співвідношень NA/PS для серотипів 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A та 19F, очищених при застосуванні скороченого способу очищення згідно з винаходом. Результати порівнюються для кожного етапу очищення. Фігура 13 показує ефективність видалення білка, яка зумовлюється етапом підкислення скороченого способу очищення згідно з винаходом. Представлено графік залежності різниці у концентрації білка (SDS-PAGE) до та після підкислення від первісної концентрації білка до підкислення для порцій серотипів 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A та 19F. Різниця у концентрації білка, ділена на первісну концентрацію білка, відображає швидкість видалення білка за допомогою етапу підкислення. Фігура 14 показує ефективність видалення білка, яка зумовлюється етапом адсорбції активованим вугіллям скороченого способу очищення згідно з винаходом. Представлено графік залежності кількості видаленого білка (адсорбованого на вугілля) від кількості первісного білкового навантаження для порцій серотипів 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A та 19F. Кількість видаленого білка, ділена на кількість первісного білкового навантаження відображає швидкість видалення білка за допомогою етапу адсорбції активованим вугіллям. детальний ОПИС ВИНАХоДу Даний винахід стосується скороченого способу очищення для зниження рівня розчинного білка у клітинних лізатах Streptococcus pneumoniae для одержання суттєво очищених капсульних полісахаридів, придатних для включення у пневмококові кон’юговані вакцини. Для більшості серотипів для реалізованого у даний час на ринку 7-валентної пневмококової кон’югованої (7vPnC) вакцини (Prevnar®), а також нещодавно розробленої 13-валентної пневмококової кон’югованої (13vPnC) вакцини існуючий нині спосіб очищення полісахариду вимагає до шістнадцяти етапів. Ці етапи включають багато дорогих, трудомістких і активно вимогливих операцій, таких, як хроматографія та багато мембранних відокремлень. Спосіб згідно з даним винаходом дозволяє уникнути до восьми цих етапів при здійсненні такого самого очищення і усуває необхідність хроматографії. Таким чином, даний винахід стосується більш ефективного способу очищення, який є дешевшим, потребує менше часу і включає меншу кількість етапів. Скорочений спосіб очищення згідно з даним винаходом стосується виявлення того факту, що ультрафільтрація та діафільтрація освітленого бульйону лізату клітин S. pneumoniae з наступним підкисленням концентрованого бульйону лізату до рівня pH, нижчого за 4,5, в 4 UA 99278 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 оптимальному варіанті – приблизно 3,5, осаджує принаймні 98% білка у розчині без серйозного впливу на вихід полісахариду. При ультрафільтрації та діафільтрації підданого лізисові і освітленого ферментаційного бульйону перед підкисленням до рівня pH, нижчого за 4,5, в оптимальному варіанті – близько 3,5, ефект “всолювання” білків усувається, і частка білка, яка є “висоленою”, збільшується. “Всолювання” є пов’язаним зі збільшеною розчинністю білків, тоді, як “висолювання” є пов’язаним з осадженням білків у розчині, коли вони досягають їхніх ізоелектричних точок. Етап ультрафільтрації та діафільтрації також запобігає спінюванню, яка спостерігається тоді, коли оброблений карбонатом натрію бульйон піддається підкисленню навіть до pH 5,0 (див. публікацію патентної заявки США № 2006/0228381). Таким чином, ультрафільтрація та діафільтрація освітленого бульйону лізату дозволяє застосовувати будьякий низькомолекулярний pH титрант, такий, як карбонат натрію, під час ферментації серотипу S. pneumoniae і запобігати спінюванню освітленого бульйону лізату у разі підкислення до рівня pH, нижчого за 4,5. “Освітлений бульйон лізату” означає бульйон лізату, який було піддано центрифугуванню або фільтрації для видалення клітинного дебрису. “Діафільтрування”, “діафільтрація”, “DF” та інші подібні терміни означають, наприклад, застосування напівпроникних мембран з прийнятними фізичними та хімічними властивостями для видалення малих молекул з розчину. “Ультрафільтрування”, “ультрафільтрація”, “UF” та інші подібні терміни означають, наприклад, застосування напівпроникних мембран з прийнятними фізичними та хімічними властивостями для розрізнення між молекулами у розчині та концентрування подібних молекул у менший об’єм розчину. У контексті способів даного винаходу ультрафільтрація та діафільтрація зазвичай включають фільтрацію у “поперечному потоці” або “подовжньому потоці” з метою уникнення забивання фільтрувальних мембран. При фільтрації у “поперечному потоці” розчин, який підлягає фільтруванню, пропускають через поверхню мембрани. Матеріали, які проходять крізь мембрану, називають пермеатом. Матеріали, які не проходять крізь мембрану, називають ретентатом. Ретентат повертають у завантажувальний резервуар для повторного фільтрування. У контексті даного опису може бути застосована будь-яка кислота для зниження рівня pH ультрафільтрованого і діафільтрованого бульйону лізату, якщо досягається рівень pH, нижчий за 4,5, зокрема, приблизно 3,5. Відповідно, способи згідно з винаходом передбачають можливість застосування як органічних, так і мінеральних кислот. У контексті даного опису термін “мінеральна кислота” означає кислоту, одержану з неорганічного мінералу шляхом хімічної реакції, на відміну від органічних кислот. Типовими необмежувальними прикладами мінеральних кислот, які можуть застосовуватися згідно зі способами даного винаходу, є хлористоводнева кислота, азотна кислота, фосфорна кислота та сірчана кислота. У конкретних варіантах втілення показник pH концентрованого бульйону лізату знижують до рівня, нижчого за 4,4, 4,3, 4,2, 4,1, 4,0, 3,9, 3,8, 3,7, 3,6, 3,5, 3,4, 3,3, 3,2, 3,1 або 3,0. В інших варіантах втілення рівень pH концентрованого бульйону лізату знижують до приблизно 4,4, приблизно 4,3, приблизно 4,2, приблизно 4,1, приблизно 4,0, приблизно 3,9, приблизно 3,8, приблизно 3,7, приблизно 3,6, приблизно 3,5, приблизно 3,4, приблизно 3,3, приблизно 3,2, приблизно 3,1, приблизно 3,0, приблизно 2,9, приблизно 2,8, приблизно 2,7, приблизно 2,6, приблизно 2,5, приблизно 2,4, приблизно 2,3, приблизно 2,2, приблизно 2,1 або приблизно 2,0. Скорочений спосіб очищення згідно з даним винаходом також стосується виявлення того, що у комбінації з описаними вище етапами концентрування та зниження рівня pH фільтрація з застосуванням активованого вугілля осаджує принаймні 90% білка, що залишився, без серйозного впливу на вихід полісахариду. У конкретних варіантах втілення було виявлено, що вугільна фільтрація з застосуванням вугілля, одержаного з тирси або інших деревних продуктів і активованого фосфорною кислотою є більш ефективною для зменшення або видалення білкових забруднювачів, ніж при використанні різновидів вугілля, які застосовують у нині існуючих способах вугільної фільтрації. Відповідно, даний винахід стосується способу одержання суттєво очищених капсульних полісахаридів з лізату клітин Streptococcus pneumoniae, який включає етапи: (a) забезпечення ферментаційного бульйону, який включає бактеріальні клітини, які продукують вибраний серотип Streptococcus pneumoniae; (b) піддавання бактеріальних клітин лізисові на етапі (a) літичним агентом з утворенням, таким чином, лізату клітин, який включає клітинний дебрис, розчинні білки, нуклеїнові кислоти та полісахариди; 5 UA 99278 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (c) освітлення лізату клітин з етапу (b) за допомогою центрифугування або фільтрації для видалення клітинного дебрису, з утворенням, таким чином, освітленого лізату клітин; (d) ультрафільтрації та діафільтрації освітленого лізату клітин з етапу (c) для видалення низькомолекулярних забруднювачів та підвищення концентрації полісахариду з утворенням, таким чином, ретентату; (e) зниження показника pH ретентату з етапу (d) до рівня, нижчого за 4,5, зокрема, приблизно 3,5, для осадження білка та нуклеїнових кислот з утворенням, таким чином, підкисленого розчину ретентату; (f) утримання підкисленого розчину ретентату, утвореного на етапі (e), протягом часу, достатнього для відстоювання осаду, зокрема, протягом принаймні 2 годин, зі збовтуванням або без нього, з наступною фільтрацією або центрифугуванням підкисленого розчину ретентату з утворенням, таким чином, освітленого розчину полісахариду; (g) фільтрування освітленого розчину полісахариду з етапу (f) крізь фільтр з активованого вугілля, зокрема, фільтр з активованого вугілля, який включає активоване фосфорною кислотою деревне вугілля; (h) ультрафільтрації та діафільтрації фільтрованого розчину, утвореного на етапі (g), з утворенням, таким чином, концентрованого розчину очищеного полісахариду; та (i) фільтрування концентрованого розчину очищеного полісахариду, одержаного на етапі (h), з застосуванням стерильного фільтра; з застосуванням яких одержують суттєво очищені капсульні полісахариди у формі розчину. Стерильну фільтрацію з етапу (i) застосовують для видалення бактерій та частинок з концентрованого розчину очищеного полісахариду. Необмежувальними прикладами серотипів S. pneumoniae, вибраних для цього варіанта втілення винаходу, є 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F та 23F. У конкретному варіанті втілення на етапі (e) видаляють принаймні 98% білка з ретентату з етапу (d). В іншому варіанті втілення на етапі (g) видаляють принаймні 90% білка з освітленого розчину полісахариду з етапу (f). В іншому варіанті втілення діафільтрація на етапі (h) включає регулювання pH до рівня від приблизно 5,5 до приблизно 7,5. Однак для поліпшення стійкості суттєво очищеного капсульного полісахариду під час довготривалого зберігання діафільтрація на етапі (h) включає регулювання pH до рівня від приблизно 7,0 до приблизно 7,5, зокрема, до приблизно 7,4. У контексті даного опису термін “лізат, який містить суттєво очищений капсульний полісахарид” або “розчин, який містить суттєво очищені капсульні полісахариди” стосується клітинного лізату або розчин Streptococcus pneumoniae, з якого було видалено білок, таким чином, що відсоткове співвідношення білка з полісахаридом (білок/PS) є меншим за 10%, меншим за 9%, меншим за 8%, меншим за 7%, меншим за 6%, меншим за 5%, меншим за 4%, меншим за 3%, меншим за 2% або меншим за 1%, і відсоткове співвідношення нуклеїнової кислоти з полісахаридом (NA/PS) є меншим за 5%, меншим за 4%, меншим за 3%, меншим за 2% або меншим за 1%. У конкретних варіантах втілення відсоткові співвідношення білка/PS та NA/PS для лізатів або розчинів, які містять суттєво очищений капсульний полісахарид і включають специфічні серотипи, є такими: для серотипу 1 співвідношення білка/PS є меншим за 2%, і співвідношення NA/PS є меншим за 2%, для серотипу 4 співвідношення білка/PS є меншим за 3%, і співвідношення NA/PS є меншим за 2%, для серотипу 5 співвідношення білка/PS є меншим або дорівнює 7.5%, і співвідношення NA/PS є меншим або дорівнює 2%, для серотипу 6A співвідношення білка/PS є меншим за 2%, і співвідношення NA/PS є меншим за 2%, для серотипу 6B співвідношення білка/PS є меншим за 4%, і співвідношення NA/PS є меншим за 1%, для серотипу 7F співвідношення білка/PS є меншим за 5%, і співвідношення NA/PS є меншим за 2%, для серотипу 9V співвідношення білка/PS є меншим за 2%, і співвідношення NA/PS є меншим за 1%, для серотипу 14 співвідношення білка/PS є меншим за 3%, і співвідношення NA/PS є меншим за 2%, для серотипу 18C співвідношення білка/PS є меншим за 2%, і співвідношення NA/PS є меншим за 2%, для серотипу 19A співвідношення білка/PS є меншим за 2%, і співвідношення NA/PS є меншим за 2%, для серотипу 19F співвідношення білка/PS є меншим за 3%, і співвідношення NA/PS є меншим за 2%, і для серотипу 23F співвідношення білка/PS є меншим за 2%, і співвідношення NA/PS є меншим за 2%. Способи кількісного визначення концентрації білка, полісахариду та нуклеїнової кислоти у клітинному лізаті або розчині є загальновідомими серед спеціалістів у даній галузі і включають, наприклад, аналіз за допомогою SDS-PAGE (електрофорезу у поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфату натрію), HPLC (високоефективної рідинної хроматографії) та SEC (ексклюзійної хроматографії), модифікованого метода Лоурі, спектрофотометрії, SEC-MALLS (ексклюзійної хроматографії/розсіювання лазерного випромінення з кратними кутами), та ЯМР (ядерного магнітного резонансу). 6 UA 99278 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Згідно зі способами даного винаходу, бактеріальні клітини можуть піддаватися лізисові з застосуванням будь-якого літичного агента. “Літичним агентом” є будь-який агент, який сприяє руйнуванню стінок клітин та вивільненню аутолізину, що викликає клітинний лізис, включаючи, наприклад, детергенти. У контексті даного опису термін “детергент” стосується будь-якого аніонного або катіонного детергента, який може викликати лізис бактеріальних клітин. Типовими прикладами таких детергентів для застосування згідно зі способами даного винаходу, є дезоксихолат натрію (DOC), N-лаурилсаркозин (NLS), сіль натрію з хенодезоксихолевою кислотою та сапоніни. В одному варіанті втілення даного винаходу літичним агентом, який застосовують для лізису бактеріальних клітин, є DOC. DOC є сіллю натрію з жовчною кислотою – дезоксихолевою кислотою, яку зазвичай одержують з біологічних джерел, таких, як корови або воли. DOC активує білок LytA, який є аутолізином, що бере участь у рості стінок клітин та поділі у Streptococcus pneumoniae. Білок LytA має домени зв’язування з холіном у C-кінцевій частині, і відомо, що мутації гена lytA створюють мутанти LytA, які є резистентними до лізису за допомогою DOC. Хоча немає свідчень того, що застосування DOC під час очищення полісахариду Streptococcus pneumoniae є ризикованим для здоров’я, застосування таких реагентів біологічного походження може викликати проблеми з регуляцією. Відповідно, в одному варіанті втілення даного винаходу літичним агентом, який застосовують для лізису бактеріальних клітин, є літичний агент нетваринного походження. До літичних агентів нетваринного походження для застосування згідно зі способами даного винаходу належать агенти з нетваринних джерел з механізмами дії, подібними до механізму дії DOC (тобто, ті, що впливають на функцію LytA і в результаті ведуть до лізису клітин Streptococcus pneumoniae). До таких літичних агентів нетваринного походження, крім інших, належать аналоги DOC, поверхнево-активні речовини, детергенти та структурні аналоги холіну, і вони можуть бути визначені з застосуванням процедур, описаних нижче у розділі “Експерименти”. В одному варіанті втілення літичний агент нетваринного походження є вибраним з групи, до якої належать декансульфонова кислота, трет-октилфенокси полі(оксіетилен)етаноли (наприклад, Igepal® CA-630, CAS #: 9002-93-1, які виробляються компанією Sigma Aldrich, St. Louis, MO), конденсати октилфенол етиленоксиду (наприклад, Triton® X-100, які виробляються компанією Sigma Aldrich, St. Louis, MO), Nлаурилсаркозин натрію (NLS), лаурилімінодипропіонат, додецилсульфат натрію, хенодезоксихолат, гіодезоксихолат, глікодезоксихолат, тауродезоксихолат, таурохенодезоксихолат та холат. В іншому варіанті втілення літичним агентом нетваринного походження є NLS. Даний винахід також стосується серотип-специфічних модифікацій описаного вище способу. Наприклад, оскільки полісахарид серотипу 19A є нестійким, і його молекулярна маса змінюється під час очищення, було виявлено, що модифікації описаного способу є корисними для стабілізації полісахариду 19A. Ці модифікації включали здійснення етапу ультрафільтрації та діафільтрації перед підкисленням при температурі приблизно 4 C і при pH приблизно 6 у натрієвофосфатному буфері, утримування підкисленого розчину ретентату протягом принаймні 2 годин при температурі приблизно 4 C для забезпечення відстоювання осаду та доведення рівня pH освітленого розчину полісахариду до 6 перед етапом фільтрації на активованому вугіллі. Натомість для серотипів 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F та 23F було виявлено, що менша втрата полісахариду і більше видалення білка досягалися тоді, коли етап ультрафільтрації та діафільтрації перед підкисленням здійснювали у безсольовому середовищі, такому, як вода, і цей етап може здійснюватися при кімнатній температурі та нейтральному рівні pH. Відповідно, даний винахід також стосується способу одержання суттєво очищених капсульних полісахаридів з лізату клітин Streptococcus pneumoniae, які включають серотип 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F або 23F, включаючи етапи: (a) забезпечення ферментаційного бульйону, який включає бактеріальні клітини, які продукують Streptococcus pneumoniae, серотипу 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F або 23F; (b) піддавання бактеріальних клітин лізисові на етапі (a) з застосуванням детергента, з утворенням, таким чином, лізату клітин, який включає клітинний дебрис, розчинні білки, нуклеїнові кислоти та полісахариди; (c) освітлення лізату клітин з етапу (b) за допомогою центрифугування або фільтрації для видалення клітинного дебрису, з утворенням, таким чином, освітленого лізату клітин; (d) ультрафільтрації та діафільтрації освітленого лізату клітин з етапу (c) при кімнатній температурі при нейтральному рівні pH у безсольовому середовищі для видалення 7 UA 99278 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 низькомолекулярних забруднювачів та підвищення концентрації полісахариду, з утворенням, таким чином, безсольового ретентату; (e) зниження рівня pH безсольового ретентату з етапу (d) до рівня, нижчого за 4,5, зокрема, приблизно 3,5, для осадження білка та нуклеїнових кислот з утворенням, таким чином, підкисленого розчину ретентату; (f) утримання підкисленого розчину ретентату, утвореного на етапі (e), протягом принаймні 2 годин при кімнатній температурі зі збовтуванням або без нього для забезпечення відстоювання осаду, з наступною фільтрацією або центрифугуванням підкисленого розчину ретентату з утворенням, таким чином, освітленого розчину полісахариду; (g) фільтрування освітленого розчину полісахариду з етапу (f) крізь фільтр з активованого вугілля, зокрема, фільтр з активованого вугілля, який включає активоване фосфорною кислотою деревне вугілля; (h) ультрафільтрації та діафільтрації фільтрованого розчину, утвореного на етапі (g), з утворенням, таким чином, концентрованого розчину очищеного полісахариду; та (i) фільтрування концентрованого розчину очищеного полісахариду, одержаного на етапі (h), з застосуванням стерильного фільтра; з застосуванням яких одержують суттєво очищені капсульні полісахариди, які включають серотип 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F або 23F у формі розчину. У конкретному варіанті втілення на етапі (e) видаляють принаймні 98% білка з безсольового ретентату з етапу (d). В іншому варіанті втілення на етапі (g) видаляють принаймні 90% білка з освітленого розчину полісахариду з етапу (f). В іншому варіанті втілення діафільтрація на етапі (h) включає регулювання pH до рівня від приблизно 5,5 до приблизно 7,5. Однак для поліпшення стійкості суттєво очищеного капсульного полісахариду під час довготривалого зберігання діафільтрація на етапі (h) включає регулювання pH до рівня від приблизно 7,0 до приблизно 7,5, зокрема, до приблизно 7,4. Даний винахід також стосується способу одержання суттєво очищених капсульних полісахаридів з лізату клітин Streptococcus pneumoniae, які включають серотип 19A, включаючи етапи: (a) забезпечення ферментаційного бульйону, який включає бактеріальні клітини, які продукують Streptococcus pneumoniae, серотип 19A; (b) піддавання бактеріальних клітин лізисові на етапі (a) з застосуванням детергента, з утворенням, таким чином, лізату клітин, який включає клітинний дебрис, розчинні білки, нуклеїнові кислоти та полісахариди; (c) освітлення лізату клітин з етапу (b) за допомогою центрифугування або фільтрації для видалення клітинного дебрису, з утворенням, таким чином, освітленого лізату клітин; (d) ультрафільтрації та діафільтрації освітленого лізату клітин з етапу (c) при температурі приблизно 4 C і при pH приблизно 6 у натрієвофосфатному буфері, 25 мМ фосфат натрію, для видалення низькомолекулярних забруднювачів та підвищення концентрації полісахариду з утворенням, таким чином, ретентату; (e) зниження показника pH ретентату з етапу (d) до рівня, нижчого за 4,5, зокрема, приблизно 3,5, для осадження білка та нуклеїнових кислот з утворенням, таким чином, підкисленого розчину ретентату; (f) утримання підкисленого розчину ретентату, утвореного на етапі (e), протягом принаймні 2 годин при температурі приблизно 4 C зі збовтуванням або без нього для забезпечення відстоювання осаду, з наступною фільтрацією або центрифугуванням підкисленого розчину ретентату з утворенням, таким чином, освітленого розчину полісахариду; (g) доведення рівня pH освітленого розчину полісахариду з етапу (f) до приблизно 6, з утворенням, таким чином освітленого розчину полісахариду з відрегульованим рівнем pH; (h) фільтрування освітленого розчину полісахариду з відрегульованим рівнем pH з етапу (g) крізь фільтр з активованого вугілля, зокрема, фільтр з активованого вугілля, який включає активоване фосфорною кислотою деревне вугілля; (i) ультрафільтрації та діафільтрації фільтрованого розчину, утвореного на етапі (h), з утворенням, таким чином, концентрованого розчину очищеного полісахариду; та (j) фільтрування концентрованого розчину очищеного полісахариду, одержаного на етапі (i) з застосуванням стерильного фільтра; з застосуванням яких одержують суттєво очищені капсульні полісахариди, які включають серотип 19A у формі розчину. У конкретному варіанті втілення на етапі (e) видаляють принаймні 98% білка з ретентату з етапу (d). В іншому варіанті втілення на етапі (h) видаляють принаймні 90% білка з освітленого розчину полісахариду з відрегульованим рівнем pH з етапу (g). В іншому варіанті втілення діафільтрація з етапу (i) включає регулювання pH до рівня від 8 UA 99278 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 приблизно 5,5 до приблизно 7,5. Однак для поліпшення стійкості суттєво очищеного полісахариду 19A під час довготривалого зберігання діафільтрація з етапу (i) включає регулювання pH до рівня від приблизно 7,0 до приблизно 7,5, зокрема, до приблизно 7,4. Представлені нижче приклади пропонуються для пояснення винаходу і не обмежують його обсягу. експерименти Далі у Прикладах представлено результати для полісахариду S. pneumoniae серотипів 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A та 19F, очищених у масштабі 10 л з застосуванням удосконаленого способу згідно з даним винаходом, і результати порівнюються з результатами існуючого способу очищення. Приклад 1. Скорочений спосіб очищення для полісахариду S. pneumoniae серотипів 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 14 та 19A. Ферментаційні бульйони S. pneumoniae, піддані лізисові з застосуванням дезоксихолату натрію (DOC), одержували або протягом двох днів після їх збирання, або зберігали при 4°C і обробляли протягом наступного тижня. Як описується нижче, даний спосіб очищення включає такі зміни порівняно з існуючим способом очищення: 1) етап підкислення було переміщено, і його здійснювали не на початку, а після першого етапу ультрафільтрації / діафільтрації (UF/DF), і рівень pH доводили до 3,5 замість 5; 2) діафільтраційний буфер міняли з 0,025 M фосфату на деіонізовану (DI) воду; 3) адсорбцію активованим вугіллям змінювали на 2 вугільні диски CUNO R32SP (CUNO Inc., Wayne, NJ) з застосуванням активованого фосфорною кислотою деревного вугілля, і час адсорбції подовжували з 4 до 12 циклів (кожен цикл складав 22 хвилини); і 4) pH доводили до 7,4 під час останнього етапу діафільтрації (30K), коли діафільтрацію здійснювали приблизно 5 разів. Таку саму процедуру очищення застосовували до серотипів 1, 4, 5, 6A, 6B або 7F. Для серотипу 19A етапи піддавали подальшим модифікаціям, і очищення здійснювали у прохолодному приміщенні, як описується нижче. Етапи очищення Усі етапи здійснювали при кімнатній температурі за винятком типу 19A, коли процес здійснювали при 4°C у прохолодному приміщенні. Освітлення лізату: Метою цього етапу було видалення клітинного дебрису та освітлення бульйону. Це здійснювали шляхом центрифугування або фільтрації. Бульйон центрифугували при 10 000 g протягом 30 хв або доти, доки бульйон не ставав прозорим при 20°C (4°C для типу 19A), або фільтрували за допомогою попереднього фільтра Millipore Prefilter (Millipore Corp., ® Billerica, MA) з додавання допоміжних фільтрувальних речовин Celpure (Advanced Minerals, Santa Barbara, CA). Освітлений лізат збирали для подальшої обробки і осад на фільтрі видаляли. Перша UF/DF (ультрафільтрація / діафільтрація): Цей етап забезпечував зменшення об’єму та буферний обмін, а також видаляв низькомолекулярні забруднювачі. Освітлений лізат концентрували до приблизно 1/8-ї первісного об’єму. Діафільтрацію здійснювали з застосуванням приблизно 10 об’ємів DI-води (pH 6, 25 мM фосфату для 19A). Підкислення: На цьому етапі видаляли понад 98% білків. При перемішуванні до ретентату обережно додавали концентровану фосфорну кислоту. Рівень pH ретентату доводили до заданого значення pH 3,5. Підкислений ретентат перемішували протягом півгодини і витримували при кімнатній температурі до наступного дня (2 години при 4°C для 19A), в результаті чого забезпечувалося осадження білка та нуклеїнових кислот. Освітлення підкисленого ретентату: Воно являло собою етап освітлення для видалення осадів після підкислення. Гідросуміш підкисленого розчину центрифугували за допомогою ротора при 10 000 об/хв (відносна сила центрифугування або RCF 17 000) протягом однієї години при 20°C (за винятком 6B, для якого центрифугування тривало 6 годин при 37°C). Супернатант збирали і твердий залишок видаляли. На цьому етапі також може застосовуватися глибока фільтрація з застосуванням попереднього фільтра Millipore Prefilter (Millipore Corp., ® Billerica, MA) з додаванням допоміжних фільтрувальних речовин Celpure (Advanced Minerals, Santa Barbara, CA). Адсорбція активованим вугіллям: У більшості випадків спостерігався жовтуватий колір після центрифугування підкисленого ретентату 100K. Знебарвлення досягали шляхом адсорбції активованим вугіллям з застосуванням активованого фосфорною кислотою деревного вугілля. На цьому етапі також видаляли залишковий білок, який залишався після підкислення. Освітлений розчин полісахариду піддавали рециркуляції через вугільний фільтр протягом 5-6 годин або до наступного дня (для 19A рівень pH доводили до 6 перед адсорбцією активованим вугіллям). 9 UA 99278 C2 5 10 15 20 25 Кінцева UF/DF (30K): Вона являла собою ще один етап концентрування та буферного обміну для концентрування розчину до кінцевої концентрації полісахариду (PS) >2 г/л, який діафільтрували у деіонізовану (DI) воду. Фільтрований вугіллям розчин PS концентрували. Потім концентрат діафільтрували 10X DI-водою. Рівень pH під час діафільтрації доводили до 7,4. Кінцева стерильна фільтрація 0,2 мкм: Кінцевий розчин PS піддавали стерильній фільтрації з застосуванням 0,22 мкм фільтра або стерильного одноразового фільтрувального елемента і зберігали у холодильнику при 4°C. Аналітичні методи Кількісне визначення концентрації білка, PS та нуклеїнової кислоти здійснювали, застосовуючи способи які є загальновідомими серед спеціалістів у даній галузі, включаючи аналіз шляхом SDS-PAGE (електрофорезу у поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфату натрію), HPLC (високоефективну рідинну хроматографію) та SEC (ексклюзійну хроматографію), модифікований метод Лоурі, спектрофотометрію, SEC-MALLS (ексклюзійну хроматографію / розсіювання лазерного випромінення з кратними кутами) та ЯМР (ядерний магнітний резонанс). Результати та обговорення Партії скороченого очищення Типу 5: Порівняння кінцевого виходу PS, молекулярної маси PS та рівень основних забруднювачів у трьох партіях, які піддавали очищенню з застосуванням скороченого способу, та партіях, які очищали з застосуванням існуючого способу, для Типу 5 показано у Таблиці 1. Усі вихідні бульйони являли собою ферментовані партії, піддані лізисові з застосуванням DOC при високій густині клітин, які мали концентрацію полісахариду (~0,5 г/л), вищу, ніж у стандартному ферментаційному бульйоні SOP (~0,3 г/л). Для першого етапу UF/DF застосовували мембрану 30K або 50K. Рівень забруднення розраховували за співвідношенням забруднювача/PS. Такий самий підхід застосовували до всіх інших описаних серотипів. Таблиця 1. ПАРТІЯ # L29276-27 (30K UF/DF) L29276-32 (30K UF/DF) L29276-52 (50K UF/DF) Існуючий спосіб Технічні вимоги або очікуваний показник 30 35 40 45 Дані випробування для партій скороченого очищення Типу 5 МОЛЕКУЛЯРНА ВИХІД СПІВВІДН. СПІВВІДН. МАСА PS PS (%) БІЛКА (%) NA (%) (КГ/МОЛЬ) СПІВВІДН. C-PS (%) 56,7 1,2 0,12 299 20,7 54,6 1,8 0,12 282 24,7 60,2 1,40,03 275 22,8 57 3,6 0,18 320 15,9 50-60 ≤7,5 ≤2,0 NA ≤35 Як свідчать дані у Таблиці 1, співвідношення білків в усіх трьох партіях з застосуванням скороченого способу очищення відповідали технічним вимогам ≤7,5%, а також були порівнянними з показниками існуючого способу. Співвідношення нуклеїнової кислоти (NA), а також C-полісахариду (C-PS) також були значно нижчі за максимально допустимі згідно з технічними вимогами ≤2,0% та ≤35%, відповідно, і були порівнянними з показниками існуючого способу. Результати кінцевого виходу PS та рівня забруднення для трьох партій, показані у Таблиці 1, демонструють повторюваність і стійкість скороченого способу. Існували певні питання щодо того, чи можуть полісахариди гідролізуватися при нижчому рівні pH 3,5. Таким чином, також спостерігали за зміною часу утримання PS під час здійснення способу очищення і вимірювали молекулярну масу кінцевого очищеного PS. Значних змін у часі утримання серотипу 5 PS у HPLC-хроматограмі не спостерігалося. Також не було значних розбіжностей у молекулярній масі для очищеного PS при здійсненні скороченого способу та існуючого способу (284 кг/моль), згідно з вимірюваннями шляхом MALLS. Таким чином, було зроблено висновок, що молекулярна маса очищеного PS не зазнавала негативного впливу скороченого способу очищення. Показники активного виходу полісахариду, співвідношення білка / полісахариду та співвідношення нуклеїнової кислоти / полісахариду на кожному з етапів обробки для трьох партій скороченого процесу зведено у Таблиці 2. 10 UA 99278 C2 Таблиця 2. Активний вихід PS типу 5, співвідношення білка (SDS-PAGE) та нуклеїнових кислот. ЕТАП Бульйон Центрифугування 30/50K UF/DF Підкислення Вугілля 30K UF/DF ВИХІД PS (%) L29276-27 L29276-32 100,0 100,0 99,9 95,6 71,1 82,8 56,1 65,9 57,7 55,7 54,5 54,6 L29276-52 100,0 94,6 93,9 58,6 58,7 60,3 БІЛОК/PS (%) L29276-27 L29276-32 384,40 1026,60 274,60 642,00 152,10 561,00 9,00 7,50 0,20 1,90 0,10 1,00 L29276-52 193,26 209,78 204,76 0,20 0,50 0,09 Таблиця 2 продовження ЕТАП Бульйон Центрифугування 30/50K UF/DF Підкислення Вугілля 30K UF/DF 5 10 15 20 25 30 НУКЛЕЇНОВА КИСЛОТА / PS (%) L29276-27 L29276-32 825,80 579,83 505,10 484,30 107,30 139,90 9,44 16,40 0,22 0,30 0,11 0,12 L29276-52 344,70 311,90 137,60 7,38 0,74 0,19 Під час кожного етапу будь-якого способу очищення завжди існує втрата продукту. У цих трьох партіях, до яких було застосовано скорочений спосіб, втрата PS відбувалася здебільшого на першому етапі UF/DF та етапі підкислення. Втрата PS на першому етапі UF/DF відбувалася через адсорбцію PS або комплексу PS-білка на поверхні мембрани. Цю втрату зводили до мінімуму шляхом промивання сторони мембрани, на якій знаходився ретентат, DI-водою після діафільтрації та комбінування промивання з первісним ретентатом. Втрата PS на етапі підкислення може відбуватися з двох причин: фізична адсорбція PS в осаджені тверді речовини та зв’язування полісахариду з білком зі спільним осадженням під час підкислення. Цю другу причину піддавали подальшому дослідженню, в результати свідчили про зв’язування PS/білка. Фігура 1 показує зниження співвідношення білка/PS на кожному етапі очищення. Хоча на етапі центрифугування видалявся невеликий відсоток білків, більшість білка видалялася на етапі підкислення. Лише незначна кількість білка виявлялася після обробки при pH 3,5, навіть у партії з найвищою концентрацією білка. Так само, як і співвідношення білка/PS, співвідношення нуклеїнової кислоти/PS демонструвало мінливість рівня забруднення між партіями. На етапі 30/50K UF/DF видалялася значна кількість нуклеїнової кислоти порівняно з видаленням білка на тому ж самому етапі обробки. Без прив’язування до теорії, це могло бути зумовлено молекулярним розміром нуклеїнових кислот, який є меншим за розмір білків, що полегшує їх видалення на етапі 30/50K UF/DF. На першому етапі центрифугування та підкислення також видалялася значна кількість нуклеїнової кислоти. У Таблиці 2 показано, що на етапі адсорбції активованим вугіллям також знижується рівень білка/PS та NA/PS. Відсоток зниження не був таким значним, як на перших двох етапах, але цей етап був важливим для усунення кольору розчину і забезпечував відповідність рівня забруднення технічним вимогам. Партії скороченого очищення Типу 4: Зведені дані для трьох партій скороченого очищення для Типу 4 показано у Таблиці 3. Вихідні бульйони для всіх трьох партій піддавали DOCлізисові. 11 UA 99278 C2 Таблиця 3. ПАРТІЯ L29276-47 L29276-55 L29276148 Існуючий спосіб Технічні вимоги 5 10 15 20 Зведені дані для партій скороченого очищення Типу 4. ВИХІД БІЛОК/PS НУКЛЕЇНОВА МОЛЕКУЛЯРНА PS (%) (%) КИСЛОТА /PS (%) МАСА PS (КГ/МОЛЬ) 56,3 0,7 0,04 289 53,0 1,3 0,03 354 57,3 1,16 0,02 293 71,1 0,05 0,02 285 NA