Спосіб одержання очищених, безпечних з вірусологічної точки зору препаратів антитіл

1. Спосіб одержання очищених, вірусологічно безпечних та інактивованих з вірусологічної точки зору препаратів антитіл з вихідного розчину, що містить антитіла і домішки, включаючий в себе наступні стадії: (a) доведення рН вихідного розчину приблизно до 4,6-4,95, зокрема, приблизно до 4,8-4,95, для одержання проміжного розчину; (b) додавання каприлат- і/або гептаноат-іонів до проміжного розчину при підтриманні рН на рівні приблизно 4,8-4,95, що приводить до утворення преципітату, при цьому антитіла головним чином присутні в супернатанті; (c) інкубування розчину супернатанта в умовах, що включають в себе певні концентрації каприлат- і/або гептаноат-іонів, час, рН і температуру; 2 (19) 1 3 87836 4 10. Спосіб за п.9, в якому детергент інкубаційної суміші видаляють екстракцією твердої та рідкої фаз. 11. Спосіб за одним з пп.1-10, в якому щонайменше один із способів, вибраних з групи, що складається з обробки УФ-С, теплової обробки, фільтрації вірусів і видалення або інактивації пріонів, комбінують з обробкою каприлатом згідно з п.1. 12. Спосіб за п.10, в якому у ході екстракції твердої фази значення рН доводять до 6,7-6,9. 13. Спосіб за п.12, в якому розчин піддають другій аніонообмінній хроматографії. 14. Спосіб за п.13, в якому значення рН розчину, що зійшов з колонки з аніонообмінником, доводять до 3,5-4,5, переважно до рН 4,0±0,1. 15. Спосіб за п.14, в якому розчин IgG приводять в контакт з фільтром для видалення вірусів. 16. Спосіб за п.14, в якому розчин IgG приводять в контакт з нанофільтром. 17. Спосіб за п.14, в якому розчин IgG інкубують щонайменше 24 години, переважно при 37°С±1. 18. Спосіб за п.14, в якому розчин IgG концентрують до 5 або 10%. 19. Спосіб за п.18, в якому осмолярність концентрату доводять до 200-400 мОсмоль/кг підхожою добавкою. 20. Спосіб за п.19, в якому рН розчину IgG доводять до 3,5-6,0, переважно до значення рН від 4,0 до 5,5. 21. Спосіб за п.20, в якому розчин IgG стерильно фільтрують і розливають у скляні бутлі або пластикові контейнери. 22. Фракція, що містить IgG, яка може бути одержана відповідно до будь-якого з пп.1-21. Даний винахід стосується способу одержання очищених, безпечних з вірусологічної точки зору препаратів антитіл з вихідного розчину, що містить антитіла та забруднюючі домішки. Описується процес очищення гамма-глобулінів з плазми крові людини та інших первинних джерел. Стадії інактивації та видалення вірусів включені в описаний тут виробничий процес. Преципітація і видалення/інактивація вірусів, що відбувається в результаті неї. У 40-х роках минулого століття Cohn з співавторами ввели в практику фракціонування людської плазми холодним етанолом. Декілька варіантів даної методики були пізніше розроблені для підвищення чистоти і/або виходу різних інтермедіатів. Було показано, що деякі стадії у процесі фракціонування за Cohn є ефективними в інактивації та видаленні вірусів. Особливо у процесі очищення IgG відокремлення фракції І+IIІ, за Cohn, є надзвичайно ефективним з даною метою. Певні чутливі віруси (головним чином оболонкові віруси) руйнуються під впливом низьких рН і ЕtOН, і значна частина як оболонкових, так і безоболонкових вірусів може бути видалена шляхом розподілу у преципітаті І+IIІ, який звичайно відкидається. У 60-х роках того ж століття було показано, що низькомолекулярні жирні кислоти (С6-С12) утворюють нерозчинні комплекси з α- та βглобулінами, тоді як g-глобуліни звичайно тлстільки ж легко не преципітуються (Chanutin et al., 1960). Steinbruch з співавторами (1996) описали процес очищення з каприлатом (тобто октаноатом, сіллю С8-насиченої жирної кислоти) як преципітувальним агентом. Неімуноглобулінові компоненти преципітували з людської плазми після розбавлення ацетатним буфером до кінцевого значення рН4,8. Після додавання каприлату при інтенсивному перемішуванні одержували розчин, збагачений IgG. Чистота і вихід залежали від кількості каприлової кислоти, рН, молярності буфера та фактора розведення. Steinbruch з спів авторами стверджували також, що переважним є додавання ефективної кількості каприлату у дві стадії з видаленням проміжного преципітату. Віруси, які мають і не мають зовнішню оболонку, видаляють шляхом розподілу у преципітаті HeIgG-білків, як у випадку відокремлення фракції І+IIІ. Хроматографія У декількох патентах описано очищення розчинів IgG у так званому негативному режимі; IgG проходить без зв'язування (тільки у слідових кількостях), тоді як більша частина нe-IgG-білків зв'язується з аніонними лігандами (Bertolini et al., 1998, WO-A-98/05686; Lebing 1999, US-A5886154; Friesen et al., 1986, CA 1201063). Комбінація преципітації каприлатом з подальшою іонообмінною хроматографією для очищення IgG була описана у багатьох публікаціях. Однією з перших була робота Steinbruch з співавторами (1969). Він описав подальше очищення IgG на DEAE-целюлозі після преципітації каприлатом. У недавній роботі Lebing з співавторами (2003) описано послідовне використання двох аніонообмінних колонок для видалення IgM, IgA, альбуміну та інших забруднюючих домішок. Lebing з співавторами скомбінували обидва ефекти, опосередкованих дією каприлату, а саме необхідне зниження вмісту нe-IgG-білків за рахунок преципітації, що забезпечує відокремлення вірусів, і здатність жирних кислот інактивувати оболонкові віруси, реалізовану на додатковій стадії інкубації. Так званий «pH-» Lebing з співавторами (2003), що полягає у послідовних стадіях розведення пасти/преципітату, що містить IgG, при рН4,2 та додавання каприлату одночасно з доведенням значення рН до 5,2, підкреслюється як необхідний для процедури збагачення IgG, таким чином потребуючи ефективного зниження вмісту нe-IgGбілків. Як деякі інші забруднюючі домішки, такі як IgM та IgA, так і каприлат потім видаляють за рахунок виконання вищезазначених подальших стадій іонообмінної хроматографії. 5 Несподівано авторами було виявлено, що подібний обговорюваний вище рН- описаний Lebing з співавторами, не є необхідним для досягнення значного ефекту очищення в результаті додавання каприлату та видалення одержаного преципітату. Замість того ефективне збагачення IgG досягається при підтриманні постійного рН на рівні 4,6-4,95 протягом всього процесу розведення пасти, інкубації з каприлатом і видалення преципітату. Також вміст забруднюючих домішок, особливо альбуміну, знижується більш ефективно при підтриманні постійного рН на рівні 4,84,95. Водночас видаляються і віруси. На останній стадії залишкові забруднюючі домішки та каприлат видаляють шляхом іонообмінної хроматографії. Класична інактивація вірусів Використання розчинника/детергента (S/D) і дія рН4 є добре відомими способами і широко використовуються для очищення імуноглобулінів. Звичайно у подібних процесах використовується обробка SD через перевагу цього методу в інактивації оболонкових вірусів (Biesert L. Clinical and Experimental Rheumatology 1996; 14: 47). Як оболонкові, так й безоболонкові віруси чутливі до дії низьких значень рН, хоча оболонкові віруси більш чутливі, ніж безоболонкові (Biesert. Clinical and Experimental Rheumatology 1996; 14: 47, Bos et al. Biologicals 1998; 26: 267, In Seop et al. J. Microbiol Biotechnol 2001; 11: 619). У документі ЕР-А-0 525 502 описано комбіновану дію розчинника/детергента (S/D) і рН4 як стадію інактивації вірусів. Фільтрація вірусів Для підвищення вірусологічної безпеки розчини IgG фільтрують через мембрани з надзвичайно малим розміром пор (звичайно від 15 до 50нм) в умовах, що утримують віруси по механізму, в основному заснованому на гель-фільтрації (Burnouf and Radosevich. Haemophilia 2003; 9: 24). Також для фільтрації імуноглобулінів використовуються глибинні фільтри, утримуючі віруси за рахунок іонообмінної адсорбції. Даний винахід стосується процесу очищення IgG з високим виходом та меншою тривалістю процесу у порівнянні з класичним процесом фракціонування за Коном-Онклі. IgG розводять у буфері в умовах кислого рН в діапазоні від 4,6 до 4,95, переважно 4,9. Не-IgG-білки відокремлюють шляхом двостадійної інкубації з каприлатом в діапазоні концентрацій від 10 до 30мМ, переважно 20мМ. Для ефективної інактивації оболонкових вірусів та підвищення інактивуючої активності всього процесу в цілому може бути додана стадія інкубації, відома як обробка розчинником/детергентом, тобто одночасна обробка розчинником (таким як ТnВР) і детергентом, таким як Triton X-100, Tween 80 і т.д. До процедур видалення вірусів також може бути додане видалення вірусів, наприклад, шляхом так званої нанофільтрації, або використання заряджених глибинних фільтрів. Далі у комбінації з вищезазначеними способами може бути використана обробка УФ-С. 87836 6 Подібні способи описані, наприклад, в документах ЕР-А-0 840 624 і ЕР-А-0 422 007. Далі каприлат/каприлова кислота можуть бути замінені або скомбіновані з гептаноатом/гептановою кислотою для виконання вищезазначених стадій преципітації та інкубації. У продукті, одержуваному описаним в заявці способом, віруси інактивовані (або видалені). Пріони також інактивують/видаляють у процесі обробки каприлатом. Фіг.1 і 2 являють собою блок-схему, що ілюструє специфічні втілення процесу згідно з даним винаходом. Даний винахід стосується способу одержання очищених, вірусологічно безпечних та інактивованих з вірусологічної точки зору препаратів антитіл з вихідного розчину, що містить антитіла та забруднюючі домішки. Спосіб включає в себе наступні стадії: (a) доведення рН вихідного розчину приблизно до 4,6-4,95, зокрема, приблизно до 4,8-4,95, для одержання проміжного розчину; (b) додавання каприлат- і/або гептаноат-іонів у проміжний розчин при підтриманні рН на рівні приблизно 4,6-4,95, зокрема, на рівні приблизно 4,8-4,95, що приводить до утворення преципітату, при цьому антитіла присутні в основному у супернатанті; (c) інкубування розчину супернатанта в умовах, що включають в себе певні концентрації каприлат- і/або гептаноат-іонів, час, рН і температуру; необов'язково концентрування та діафільтрацію розчину до доведення рН; (d) нанесення фільтрованого розчину щонайменше на одну аніонообмінну смолу, і необов'язково - на дві різні аніонообмінні смоли в умовах, що забезпечують зв'язування забруднюючих домішок з смолою за відсутності значного зв'язування антитіл із смолою, з одержанням очищених, вірусологічно безпечних та інактивованих з вірусологічної точки зору препаратів антитіл. В одному з втілень даного винаходу інактивований з вірусологічної точки зору розчин на стадії (d) приводять в контакт щонайменше з однією аніонообмінною смолою в діапазоні рН приблизно 5,0-5,2. У випадку застосування двох хроматографічних стадій з двома аніонообмінниками друга стадія повинна виконуватися в діапазоні рН від 6,7 до 6,9. Стадії (b) і (с) можуть (але необов'язково) бути повторені щонайменше один раз. Обробка каприлатом при рН4,9 приводить до значного видалення небажаних білків. У типовому випадку вихідний розчин містить антитіла, одержані з плазми. На стадії (d) може бути корисним привести інактивований розчин в контакт з двома різними аніонообмінними смолами в умовах, що забезпечують зв'язування забруднюючих домішок з смолою за відсутності значного зв'язування антитіл з смолою. Переважно, антитіла являють собою імуноглобуліни G-типу. Між двома стадіями аніонообмінної хроматографії (АЕХ) рН може бути змінений, зокрема, до 6,8±0,1. Розчин, що зійшов з хроматографічної 7 колонки, може бути сконцентрований до 6090мг/мл і підданий діафільтрації проти, наприклад, фосфатного буфера. В іншому втіленні даного винаходу розчин, що зійшов після першої АЕХ з хроматографічної колонки, одночасно обробляють розчинником та детергентом, переважно ТnВР і Triton X-100, відповідно, в переважних концентраціях 1% Triton X-100 і 0,3% ТnВР, на протязі від 4,5 до 8 годин, для інактивації вірусів з ліпідною оболонкою. Даний спосіб відомий як обробка розчинником і розкритий у документі ЕРА-0 131 740 (включений шляхом посилання). Згідно з винаходом, детергенти інкубованої суміші, зокрема, видаляють шляхом екстракції з твердої та рідкої фаз. Після екстракції твердої фази рН розчину доводять до 6,7-6,9. Комбінація S/Dобробки та інактивації вірусів каприлатом приводить до одержання більш (вірусологічно) безпечного продукту. Розчин далі може бути підданий АЕХ на другій колонці, і рН розчину, що зійшов з колонки в результаті АЕХ, може бути доведений, наприклад, до 3,5-4,5, зокрема, до 4,0±0,1. Згідно з винаходом, розчин IgG з доведеним рН далі приводять в контакт з фільтром, що утримує віруси. Ця необов'язкова стадія у комбінації з обробкою каприлатом приводить до одержання більш вірусологічно безпечного продукту. Розчин IgG також може бути проінкубований при 37°С±1 на протязі щонайменше 24 годин. Для підвищення рівня вірусологічної безпеки препарату антитіл обробка УФ-Свипромінюванням може бути використана у комбінації з обробкою фракції, що містить антитіла, каприлатом. Інактиваційні методи окремо або у комбінації з такими методами, як обробка ТnВР, УФ-С, фільтрація вірусів або нагрівання, можуть бути скомбіновані з процесом згідно з даним винаходом. Спосіб, згідно з даним винаходом, може бути скомбінований з методами видалення або інактивації пріонів, наприклад, з фільтраційними, адсорбційними або хроматографічними методами згідно з раніше розкритим у даній галузі техніки, наприклад, у документі ЕР-А-0 954 528, Trejo, S.R. et аІ., Vox Sanguinis, (2003) 84,176-187. Розчин IgG, одержуваний згідно з даним винаходом, концентрують для подальшого терапевтичного використання, звичайно до концентрацій 5 або 10%, і осмолярність концентрату доводять до 200-400мОсмоль/кг підхожою добавкою. Проте припустимі й будь-які інші значення у випадку збереження фармакологічної прийнятності. Подібні добавки добре відомі експертам і включають в себе (без обмеження спільності) цукри, цукрові спирти і амінокислоти. рН розчину IgG може бути доведений до 3,5-6,0, зокрема до 4,0-5,5. Далі розчин IgG стерильно фільтрують і розливають у скляні бутлі або пластикові контейнери. Альтернативно розчин, що зійшов з колонки після першого або другого етапу АЕХ, піддають фільтруванню на нанофільтрах для досягнення ще більшої безпеки продукту. 87836 8 Процес згідно з даним винаходом більш детально описаний і переважно виконаний відповідно до нижченаведеної схеми. Як вихідний матеріал використовували фракції плазми І+ІІ+III або ІІ+III. Дані фракції були одержані згідно з описаним Cohn з співавторами (1946). Доведення рН у процесі проводили за допомогою 1М оцтової кислоти, 0,1Μ NaOH або 0,3M HCl. Каприлат додавали у вигляді 1М стікрозчину каприлату натрію. Даний розчин приготовляли шляхом розчинення 166г каприлату натрію в 1л води для ін'єкцій (WFI) та перемішування до повного розчинення каприлату натрію. Як контроль для SD-обробки використовували Triton Х-100 і ТnВР. Для видалення S/Dреагентів використовували рослинну олію, таку як олія бобів сої або рицинова олія. Всі реагенти, що використовувалися, мали ступінь чистоти «USP» і вище. Кількісну хроматографію з виключенням за розміром та ELIS А використовували для визначення концентрації IgG. Аналітичну ВЕРХ проводили за допомогою Agilent HPLC System на колонках TosoHaas G3000SW. Схематична ілюстрація процесу наведена на Фіг.1. Процес починається з розчинення преципітату IgG, що називається пастою, в очищеній воді. Звичайно чим більший обсяг води використовується для розведення пасти, тим вище вихід IgG. рН розчину доводять до 4,60-4,95, переважно до 4,90 1М оцтовою кислотою. Розчин перемішують декілька годин для розчинення максимально можливої кількості IgG. Далі додають каприлат у вигляді стік-розчину до концентрації від 10 до 30мМ, переважно до 20мМ каприлату. рН у процесі додавання каприлату підтримують постійним на рівні 4,80-4,95, переважно на рівні 4,90. У процесі інкубації розчину IgG з каприлатом не-IgG-білки та ліпіди преципітують. Одержаний преципітат видаляють з розчину IgG фільтруванням. Після першої стадії преципітації деякі забруднюючі домішки можуть залишитися у розчині IgG. Подібно першій стадії, далі додають каприлат приблизно до 20мМ при постійному рН на рівні 4,80-4,95, переважно на рівні 4,9. Після інкубації преципітат видаляють шляхом фільтрування або центрифугування. Для більш ефективного фільтрування використовують сорбент для нанесення на фільтр. рН фільтрованого розчину доводять до 5,0-5,2, переважно до 5,1, і поміщають на аніонообмінну колонку. Як аніонообмінні колонки були обрані такі сильні аніонообмінники, як Q-Sepharose-FF, Q-Sepharose HP, QSepharose-XL, Source Q 15 або ЗО (Amersham Biosience), Q-Thruput, Q-Thruput plus (Sterogene), Macro Prep Q і Macro Prep High Q (BioRad), Q Hyper D (BioSepra) і Poros HQ (PerSeptive Biosystem). В обраних умовах IgG проходить через колонку, тоді як певні добавки/забруднюючі домішки, такі як каприлат і IgA, зв'язуються з смолою. Білковий розчин поміщають на колонку з розрахунку від 40 до 120г, зокрема, від 40 до 90мг на мл смоли. Розчин, який пройшов через колонку, концентрують до вмісту білка від 60 до 90мг/мл, пе 9 реважно до 70мг/мл, і піддають діафільтрації проти 5 обсягів фосфатного буфера з концентрацією від 5 до 20мМ, переважно 10мМ фосфату натрію. Як необов'язкова додаткова стадія інактивації вірусів після діафільтрації може бути виконана S/D-обробка. Підданий діафільтрації розчин піддають інактивації вірусів шляхом S/Dобробки згідно з описаним Horowitz, наприклад, у документі ЕР-А-0 131 740. Як S/D-реагенти використовували ТnВР і Triton X-100. Після перемішування розчин інкубували включно до 8 годин при температурі від 4 до 10°С. Далі додавали рослинну олію, таку як олія бобів сої або рицинова олія, переважно рицинову олію додавали у розчин до концентрації від 3 до 5% (мас/мас). Після поділу водної і масляної фаз водну фазу фільтрують. Для цього використовують підхожий глибинний фільтр. Прикладами подібних фільтрів можуть служити Polysep II (Мillіроrе), Sartofine PP і Sartobran P (Sartorius). Подальшу екстракцію водної фази виконують переважно з використанням гідрофобного «support»-буфера, використовуваного також у хроматографії з оберненою фазою з гелевою матрицею, виготовленою з діоксиду кремнію, співполімерів стиролу та дивінілбензолу (SDVB), глуцидилметакрилату і етилендиметакрилату, або поліароматики. Прикладами подібних буферів можуть служити μΒοndapak (Waters), Amberchrom CG-161 M і S, Amberchrom CG-070 (Tosoh Biosep), PLRP-S (Polymer Laboratories), RPC-1 і Toyopearl Hexyl 650C (Tosoh Biosep), Source 15 RPC (Amersham Biosiences), LiChroprep Si60 (Merck), Chromabond Sorbent HR-P і EASY (Machery-Nagel), ProntoSORB SPE (Bischoff Chrom.). Розчин білка наносять на колонку з розрахунку від 0,5 до 1,5мг/мл сухої смоли. Розчин, що пройшов, одержаний в результаті екстракції твердої фази (або стадії хроматографії, відповідно), піддають обробці УФ-С, після чого його рН доводять до 6,7-6,9, переважно до 6,8, шляхом додавання 0,1M NaOH при температурі від 4 до 10°С. Далі розчин IgG поміщають на другу аніонообмінну колонку. IgG проходить через колонку, де зв'язуючись, тоді як забруднюючі домішки та полімери зв'язуються з колонкою. Як аніонообмінні колонки були обрані такі сильні аніонообмінники, як Q-Sepharose-FF, Q-Sepharose HP, Q-Sepharose-XL, Source Q 15 або 30 (Amersham Biosience), Q-Thruput, QThruput plus (Sterogene), Macro Prep Q і Macro Prep High Q (Bio-Rad), Q Hyper D (BioSepra) і Poros HQ (PerSeptive Biosystem). Колонку зрівноважують 10мМ буфера фосфату натрію. Після нанесення розчину IgG колонку промивають зрівноважувальним буфером для того, щоб увесь IgG, який не зв'язався, зійшов з колонки. Розчин білка поміщають на колонку з розрахунку від 120 до 300мг білка/мл смоли. рН зібраного розчину IgG доводять до значень 3,9-4,1, переважно до 4,0, 0,3M HCl при температурі від 4 до 10°С. Далі розчин стерильно фільтрують та інкубують при 37°С щонайменше 24 години. Після обробки низькими рН розчину доводять до 4,7 0,1Μ NaOH при температурі від 4 до 10°С. Як додатковий етап зниження кількості вірусів може бути вико 87836 10 ристаний підхожий фільтр для очищення від вірусів. Для фільтрування від вірусів розчин IgG фільтрували через 0,1мкм фільтр з подальшою фільтрацією через фільтри для очищення від вірусів з розміром пор від 200 до 15нм. Прикладами подібних фільтрів можуть служити DVD, DV 50, DV 20 (Pall), Viresolve NFP, Viresolve NFR (Millipore), Planova 75, 35,20,15N (Asahi Kasei Pharma). Також може бути використаний заряджений глибинний фільтр, такий як Zeta Plus VR (Cuno). Стадія фільтрації також може бути проведена після інкубації при рН 4. Переважно ця стадія буде включена у процес до обробки низькими рН. Високоочищений розчин IgG піддають діафільтрації і концентрують до вмісту IgG, потрібного у даному препараті. Як кінцеві концентрації білка у рідкому препараті були обрані концентрації 5 або 10% (мас/об.). Після доведення концентрації осмолярність розчину також доводять до значень, сумісних із застосуванням препарату шляхом внутрішньовенних ін'єкцій, за рахунок підхожої добавки. Можуть бути використані цукри, цукрові спирти і амінокислоти. рН знову перевіряють і доводять до значень 4,5-5,0, переважно 4,7. Далі виконується стерильне фільтрування, і розчин розливають в інфузійні бутлі. Нижченаведені приклади більш детально пояснюють процес згідно з даним винаходом. Приклад 1: Фракцію І+ІІ+IIІ або ІІ+IIІ, за Cohn, розчиняли у 12 обсягах води, рH доводили до 4,9 1М оцтовою кислотою і розчин перемішували включно до 5 годин, поки велика частина IgG не перейшла у розчин при температурі від 2 до 8°С. Далі у розчин IgG додавали каприлат у вигляді 1М стікрозчину каприлату натрію до концентрації 20мМ каприлату при підтриманні постійного рН на рівні 4,9 шляхом додавання 1М оцтової кислоти. Розчин перемішували протягом однієї години. Ліпіди та забруднюючі домішки в цих умовах преципітували, їх видаляли фільтруванням. Далі у розчин знову додавали каприлат до концентрації 20мМ каприлату при підтриманні постійного рН на рівні 4,9. Преципітат, що утворився, знову відокремлювали фільтруванням. Після цього був одержаний прозорий розчин. рН розчину доводили до 5,1 0,1М NaOH при температурі 7±3°С, і розчин поміщали на колонку Source Q 30 column. Розчин IgG проходив через колонку, тоді як забруднюючі домішки та каприлат зв'язувалися з колонкою. Зібраний розчин IgG концентрували до вмісту 70мг/мл і піддавали діафільтрації проти 5 обсягів фосфатного буфера, рН5,1. Далі у розчин додавали 0,3% (мас/мас.) ТnВР і 1% (мас/мас.) Triton X-100, після чого інтенсивно перемішували. Після щонайменше 4,5 годин перемішування при температурі 7±3°С у розчин додавали 5% (мас/мас.) рицинової олії. Масляну екстракцію проводили при кімнатній температурі. Масляну і водну фази поділяли, і водну фазу фільтрували через фільтр Millipore Opticap Polysep. Фільтрований розчин поміщали на колонку з матрицею оберненої фази μВоndapak (Waters). pH розчину доводили до 6,8 0,1Μ NaOH при температурі 7±3°С і поміщали на колонку з сильним аніонообмінником, а саме на 11 Q-Sepharose-XL. IgG проходив через колонку, тоді як забруднюючі домішки зв'язувалися з колонкою. рН зібраного розчину доводили до 4,7 0,1Μ NaOH при температурі 7±3°С. Після цього знов проводили ультрафільтрацію для досягнення кінцевої концентрації білка 50 або 100мг/мл, після чого додавали мальтозу до концентрації від 2 до 10% за масою, переважно 8%, або гліцин до концентрації 0,1-0,5М, переважно 0,3М, особливо 0,2. Після стерильної фільтрації розчин розливали в стерилізовані та силіконізовані інфузійні бутлі різних об'ємів (50,100,200мл). Бутлі закупорювали пробками. Приклад 2: Даний приклад відрізняється від прикладу 1, зокрема, використанням стадії інкубації при рН4. Фракцію І+ІІ+ІII або ІІ+IIІ, за Conn, розчиняли у 12 обсягах води, рН доводили до 4,9 1М оцтовою кислотою і розчин перемішували включно до 5 годин, поки велика частина IgG не перейшла у розчин при температурі від 2 до 8°С. Далі у розчин IgG додавали каприлат у вигляді 1М стікрозчину каприлату натрію до концентрації 20мМ каприлату при підтриманні постійного рН на рівні 4,9 шляхом додавання 1М оцтової кислоти. Розчин перемішували протягом однієї години. Ліпіди та забруднюючі домішки в цих умовах преципітували, їх видаляли фільтруванням. Далі у розчин знову додавали каприлат до концентрації 20мМ каприлату при підтриманні постійного рН на рівні 4,9. Преципітат, що утворився, знову відокремлювали фільтруванням. Після цього був одержаний прозорий розчин. Зібраний розчин IgG концентрували до 70мг/мл і піддавали діафільтрації проти 5 обсягів фосфатного буфера рН5,1. рН розчину доводили до 5,1 0,1М NaOH при температурі 7±3°С, і розчин поміщали на колонку з сильним аніонообмінником Q-Sepharose-XL. Розчин IgG проходив через колонку, тоді як забруднюючі домішки та каприлат зв'язувалися з колонкою. Далі у розчин додавали 0,3% (мас/мас.) ТnВР і 1% (мас/мас.) Triton X-100, після чого інтенсивно перемішували. Після щонайменше 4,5 годин перемішування при температурі від 4 до 10°С у розчин додавали 5% (мас/мас.) рицинової олії. Масляну екстракцію проводили при кімнатній температурі. Масляну і водну фази поділяли, і водну фазу фільтрували через фільтр Millipore Opticap Polysep. Фільтрований розчин поміщали на колонку, наповнену Amberchrom CG-161M. рН розчину доводили до 6,8 0,1Μ NaOH при температурі 7±3°С і поміщали на колонку з сильним аніонообмінником Q-Hyper D. IgG проходив через колонку, тоді як забруднюючі домішки зв'язувалися з колонкою. рН зібраного розчину доводили до 4,0 0,3M HCl при температурі 7±3°С. Розчин стерильно фільтрували і зберігали при температурі 37±3°С щонайменше 24 години. Далі рН розчину доводили до 4,7 0,1Μ NaOH при температурі 7±3°С. Після цього знову проводили ультрафільтрацію для досягнення концентрації білка 50 або 100мг/мл після змішування з розчином мальтози або гліцину. Після стерильної фільтрації розчин розливали у стерилізовані та силіконізовані інфу 87836 12 зійні бутлі різних об'ємів (50,100,200мл). Бутлі закупорювали пробками. Приклад 3: Даний приклад відрізняється від попередніх концентрацією розчину IgG до 70мг/мл білка перед першою АЕХ, а також використанням стадії нанофільтрації. Фракцію І+ІІ+ІII або ІІ+ІII, за Cohn, розчиняли у 12 обсягах води, рН доводили до 4,9 1М оцтовою кислотою і розчин перемішували включно до 5 годин, поки велика частина IgG не перейшла у розчин при температурі від 2 до 8°С. Далі у розчин IgG додавали каприлат у вигляді 1М стікрозчину каприлату натрію до концентрації 20мМ каприлату при підтриманні постійного рН на рівні 4,9 шляхом додавання 1М оцтової кислоти. Розчин перемішували протягом однієї години. Ліпіди та забруднюючі домішки в цих умовах преципітували, і їх видаляли фільтруванням. Далі у розчин знову додавали каприлат до концентрації 20мМ каприлату при підтриманні постійного рН на рівні 4,9. Преципітат, що утворився, знову відокремлювали фільтруванням. Після цього був одержаний прозорий розчин. Зібраний розчин IgG концентрували до 70мг/мл і піддавали діафільтрації проти 5 обсягів фосфатного буфера рН 5,1. рН розчину доводили до 5,1 0,1М NaOH при температурі 7±3°С і розчин поміщали на колонку з сильним аніонообмінником. Розчин IgG проходив через колонку, тоді як забруднюючі домішки та каприлат зв'язувалися з колонкою. Далі рН розчину доводили до 6,8 0,1Μ NaOH при температурі 7±3°С, і розчин поміщали на колонку з другим сильним аніонообмінником. Розчин IgG проходив через колонку, тоді як забруднюючі домішки зв'язувалися з колонкою. рН зібраного розчину доводили до 4,0 0,3M HCl при температурі 7±3°С. Розчин фільтрували через 0,1мкм фільтр, після чого для нанофільтрації застосовували каскад фільтрів PALL, а саме - PALL DVD, DV 50 і DV 20 з розміром пор, що послідовно зменшується до 20нм. Нанофільтрований розчин інкубували при температурі 37±3°С щонайменше 24 години. Далі рН розчину доводили до 4,7 0,1 Μ NaOH при температурі 7±3°С. Після цього знову проводили ультрафільтрацію для досягнення концентрації білка 50 або 100мг/мл після змішування з розчином мальтози або гліцину. Після стерильного фільтрування розчин розливали у стерилізовані та силіконізовані інфузійні бутлі різних об'ємів (50, 100, 200мл). Бутлі закупорювали пробками. Порівняльні приклади Спосіб згідно з винаходом Близько 310г фракції І+ІІ+ІII (включаючи пресорбент для фільтрування) розводять у 12 обсягах WFI, розрахованих на основі теоретичної маси фракції І+ІІ+III (без пре-сорбенту для фільтрування). Розчин перемішують 1 годину при 5°С. Далі рН доводять до 4,9±0,1 (приблизно 950г). Розведення продовжують протягом2 годин при 5°С. Вміст альбуміну і IgA у пробі «Розведена фракція І+ІІ+III» наведено у таблицях наприкінці порівняльних прикладів. Далі у розчин додають одномольний розчин каприлату до досягнення концентрації у розчині 20мМ. рН підтримують 13 87836 постійним на рівні 4,9. Розчин інкубують 1 годину при 5°С. Розчин фільтрують через глибинний фільтр і листок паперу при 5°С (приблизно 1050г). Фільтр промивають 10мМ розчином хлориду натрію. Фільтрат доводять до температури 25°С і додають одномольний розчин каприлату для досягнення додаткової 10мМ концентрації. Розчин інкубують 1 годину при 25°С. Далі розчин центрифугують, і супернатант фільтрують через фільтр (1110г) з розміром пор 1 мкм і 0,5мкм. Вміст альбуміну та IgA у пробі «Після каприлату» наведено у таблицях наприкінці порівняльних прикладів. Згідно з ЕРО 893 450 Близько 310г фракції І+ІІ+III (включаючи пресорбент для фільтрування) розводять у 7 обсягах WFI, розрахованих на основі .теоретичної маси фракції І+ІІ+III (без пре-сорбенту для фільтрування). Розчин перемішують 1 годину при 5°С. Далі рН доводять до 4,1±0,1. Розведення продо Експеримент 1 2 3 4 Експеримент 1 2 3 4 14 вжують протягом 2 годин при 5°С. Вміст альбуміну і IgA у пробі «Розведена фракція І+ІІ+III» наведено у таблицях наприкінці порівняльних прикладів. Далі у розчин додають одномольний розчин каприлату до досягнення концентрації у розчині 20мМ. рН змінюється до 4,9 у ході додавання каприлату, і його доводять до 5,1. Розчин інкубують 1 годину при 5°С. Розчин фільтрують через глибинний фільтр і листок паперу при 5°С. Фільтр промивають 10мМ розчином хлориду натрію (приблизно 1050г). Фільтрат доводять до температури 25°С і додають одномольний розчин каприлату для досягнення додаткової 10мМ концентрації. Розчин інкубують 1 годину при 25°С. Далі розчин центрифугують і супернатант фільтрують через фільтр (приблизно 1110г) з розміром пор 0,45мкм. Вміст альбуміну і IgA у пробі «Після каприлату» наведено у таблицях наприкінці порівняльних прикладів. Видалення альбуміну та IgA Проби Розведена фракція І+ІІ+ІII Після каприлату Розведена фракція І+ІІ+ІII Після каприлату Розведена фракція І+ІІ+ІII Після каприлату Розведена фракція І+ІІ+IIІ Після каприлату Середнє по розведеній фракції І+ІІ+ІII Стандартне відхилення по розведеній фракції І+ІІ+ІII Середнє по «Після каприлату» Стандартне відхилення по «Після каприлату» Проби Розведена фракція І+ІІ+ІII Після каприлату Розведена фракція І+ІІ+ІII Після каприлату Розведейа фракція І+ІІ+ІII Після каприлату Розведена фракція І+ІІ+ІII Після каприлату Середнє по розведеній фракції І+ІІ+ІII Стандартне відхилення по розведеній фракції І+ІІ+ІII Середнє по пробі «Після каприлату» Стандартне відхилення по пробі «Після каприлату» рН4,9 Винахід Альбумін мкг/мг IgG 27,1 0,2 44,2 0,2 30,2 0,8 22,7 0,9 31,1 9,3 0,5 0,4 5,1 ЕР 0 893 450 Альбумін мкг/мг IgG 32,9 10,2 32,6 2,2 31,2 9,9 33,1 10,7 32,5 0,9 8,3 4,0 рН4,9 Винахід IgA мкг/мг IgG 86 40,9 74,3 23,7 88,5 30,8 115,5 34,4 91,1 17,4 32,5 7,2 5,1 ЕР 0 893 450 IgA мкг/мг IgG 106 49,3 120,7 60,5 114 56,9 113,6 51,3 113,6 6,0 54,5 5,1 15 Комп’ютерна верстка Т. Чепелева 87836 Підписне 16 Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601