Спосіб визначення коєвої кислоти

Реферат: UA 101125 U UA 101125 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі ветеринарії, зокрема - мікробіології, а саме до мікотоксикології, і може бути використана у лабораторіях ветеринарної медицини для діагностики та профілактики коєтоксикозу сільськогосподарських тварин та птиці. Аналогом корисної моделі є спосіб визначення коєвої кислоти в культурах грибів роду Aspergillus [1], який базується на культивуванні потенційних грибів продуцентів на поживних середовищах, подальшої екстракції гарячим ацетоном та розподілом методом тонкошарової хроматографії. Прототипом корисної моделі був вибраний спосіб визначення здатності грибів роду Aspergillus продукувати коєву кислоту [2]. Аспергили культивують на зернових субстратах протягом 7 діб при температурі 30-35 °C, а потім від 2 днів при температурі 0 °C [2]. Екстрагують токсин гарячим ацетоном, знежирюють екстракт гексаном та переекстраговують знову в ацетон і наявність токсину визначають методом тонкошарової хроматографії (ТШХ), За наявності значної кількості коекстрактивних речовин в екстракті проводять повторну очистку. Екстракт із токсином випаровують, залишок розчиняють в 100 мкл ацетону та наносять по 10 мкл на пластини для ТШХ "Sorbfill", як речовину свідка на пластини наносять стандартний розчин коєвої кислоти. Хроматографію проводять в системі розчинників тоуол-етилацетат (1:3). Після підйому фронту розчинників на висоту 10 см пластину виймають, висушують та обприскують 5 % розчином хлориду заліза (III). На хроматограмі коєва кислота проявляється у вигляді плям червоного або червоно-коричневого кольору. Хроматографічна рухливість (Rf) коєвої кислоти досліджуваних зразків та стандарту складає 0,7-0,8. Недоліком цього способу є значна тривалість рутинного дослідження (від 9 до 14 діб) та слабка чутливість. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб визначення коєвої кислоти шляхом культивування на агарозному середовищі з додаванням реагенту, що забезпечить виявлення слаботоксигенних штамів. Поставлена задача вирішується тим, що для прояву коєвої кислоти на поживних агаризованих середовищах використовують додавання до середовища на стадії його приготування хлориду заліза (III) (FeCl3) та цитринової кислоти відповідно 0,3 та 0,5 г/л. Цитринова кислота перешкоджає розвитку бактеріальної флори, що дозволяє не проводити додаткової стерилізації, а хлорид заліза є індикатором на коєву кислоту - змінює колір середовища на червоний. Вирішення поставленої задачі наведено у нижчезазначених прикладах. Приклад 1. Диференціація токсиноутворюючих штамів аспергил на поживному середовищі ґрунтується на якісній реакції коєвої кислоти з хлоридом заліза (III). Червоне забарвлення середовища навколо колоній грибів вказує на наявність в субстраті коєвої кислоти і дає можливість протягом 48-72 годин диференціювати серед аспергилів токсичні штами продуценти коєвої кислоти, яка в свою чергу є попередником в біосинтезі афлатоксинів. Приклад 2. Середовище не має складних компонентів, до агаризованого середовища Чапека, Сабуро чи сусло-агару додають хлорид заліза (FeCl3) та цитринову кислоту 0,3 та 0,5 г/л відповідно. Цитринова кислота перешкоджає розвитку бактеріальної флори, що дозволяє не проводити додаткової стерилізації, а хлорид заліза є індикатором на коєву кислоту - змінює колір середовища на червоний або червоно-коричневий. Отже, спосіб визначення коєвої кислоти на поживному середовищі дозволяє прискорити дослідження та виявляти токсинпродукуючі та слаботоксигенні штами вже на стадії культивування. Практичне застосування корисної моделі значно прискорює час дослідження (до 3-5 діб), а також дає можливість виявляти слаботоксигенні штами (чутливість методу 4,55,5 мкг/мл). Використання способу в насіннєвих інспекціях сприятиме зменшенню забруднення токсигенними мікроміцетами зерна, що знизить ймовірність захворювання тварин на коєтоксикоз. Крім цього, використання корисної моделі мікотоксикологами може застосовуватись при вивченні ареалу поширення продуцентів коєвої кислоти та афлатоксинів. Джерела інформації: 1. Bentley R. Preparation and analysis of kojic acid // Method Enzymol. - 1957. - № 3. - P. 238241. 2. Kwak M.Y., Rhee J.S. Cultivation characteristics of immobilized Aspergillus oryzae for Kojic acid production // Biotechnology and Bioengineering. - 1992. - V. 39. - № 9. - P. 903-906. 1 UA 101125 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 Спосіб визначення коєвої кислоти, що полягає в культивуванні мікроскопічних грибів, який відрізняється тим, що до агаризованого середовища додають речовину-проявник для виявлення слаботоксигенних штамів. Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2