Спосіб визначення вмісту сечовини в молоці

Реферат: Винахід належить до галузі сільського господарства. Винахід стосується способу визначення вмісту сечовини в молоці, що базується на кольоровій реакції молока з 1 %-ним спиртовим розчином діметилгліоксиму і 0,025 %-ним розчином тіосемикарбазиду в 5 %-ній за об'ємом сірчаній кислоті, і подальшому кількісному визначенні вмісту сечовини в молоці за калібрувальним графіком. UA 109813 C2 (12) UA 109813 C2 UA 109813 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід належить до сільського господарства, зокрема, біохімії тварин і клінічної медицини, стосується шляхів забезпечення корів білкововмісними кормами без негативного впливу на здоров'я тварин. На сьогодні аналіз сечовини в молоці в ряді країн широко використовується як показник засвоєння протеїну кормів у лактуючих корів, а також для оцінки ефективності рубцевого травлення. Визначення сечовини в молоці доцільно використовувати також для контролю передозування у випадках збагачення кормів сечовиною (карбамідом). У ветеринарній практиці визначення сечовини в молоці використовується як діагностичний тест ниркової недостатності лактуючих тварин. У процесі молочнокислого бродіння рівень сечовини поступово знижується до нульових значень, таким чином визначення сечовини в кисломолочних продуктах використовується як показник технологічної ефективності процесу бродіння. Відомі різні способи визначення вмісту сечовини в коров'ячому і жіночому молоці, зокрема: фотометричне визначення сечовини та її похідних [5], визначення сечовини і креатиніну в біологічних рідинах [4], визначення сечовини в біологічних рідинах і набір реактивів для його здійснення [3], кількісне визначення сечовини в лікарських формах із ліпофільною основою [1], кількісне визначення сечовини в молоці та молочних продуктах [2]. Американські дослідники використовують уреазний метод визначення сечовини в молоці, який базується на ферментативному гідролізі сечовини під дією комерційного препарату уреази та визначенні утвореного в результаті цієї реакції аміаку. Проте цей метод вимагає чіткої стандартизації активності ферменту уреази [2]. За прототип нами взятий відомий спосіб кількісного визначення сечовини в молоці та молочних продуктах з утворенням кольорової сполуки, який включає взаємодію продукту з аналітичним реагентом (1 %-ний спиртовий розчин диметилгліоксиму і 0,025 %-ний розчин тіосемикарбазиду в 25 %-ній сірчаній кислоті), який добавляють в пробу, кип'ятять протягом 15 хвилин, охолоджують, фільтрують, отриманий кольоровий фільтрат колориметрують при 530 нм, а концентрацію сечовини визначають за калібрувальним графіком [2]. Проте існуючий спосіб визначення сечовини в молоці не дозволяє отримати стійкий яскравий червоно-пурпуровий колір реакції з молоком, а лише пурпурово-жовтий, який з часом у пробірках із чистою сечовиною змінюється з підвищенням в рази показників екстензії. В основу винаходу поставлена задача вдосконалення способу визначення сечовини в молоці, який за рахунок використання як складової аналітичного реагенту розчину тіосемикарбазиду в 5 %-ній сірчаній кислоті, забезпечив би стійкий в часі яскравий червонопурпуровий колір реакції, а це, своєю чергою, дасть можливість більш точно визначити концентрацію сечовини, а також більш повне уявлення про якісний склад молока та змогу краще забезпечити корів білкововмісними кормами без негативного впливу на здоров'я тварин при об'єктивній оцінці забезпеченості раціону протеїном корів різного рівня продуктивності. Поставлена задача вирішується тим, що у способі визначення кількісного вмісту сечовини в молоці, що включає взаємодію молока з аналітичними реагентами при кип'ятінні, згідно з винаходом, до 0,3 мл молока додають 3 мл дистильованої води і послідовно 0,3 мл 1 %-ого спиртового розчину диметилгліоксиму та 3 мл 0,025 %-ого розчину тіосемикарбазиду в 5 %-ній за об’ємом сірчаній кислоті, суміш кип’ятять на водяній бані протягом 15 хвилин, охолоджують, фільтрують і колориметрують отриманий фільтрат яскравого червоно-пурпурового кольору при 530 нм та визначають концентрацію сечовини за калібрувальним графіком, побудованим з -3 розведеннями 10 моль або 60 мг/мл розчину сечовини. Інша відзнака способу, що пропонується, в тому, що молоко консервують етиловим спиртом у співвідношенні 1:2. Це дає можливість запобігати прокисанню молока. Суть винаходу пояснюється такими прикладами: Реактиви: 1 %-ний спиртовий розчин диметилгліоксиму; 0,025 %-ний розчин тіосемикарбазиду в 5 %-ній (за об'ємом) сірчаній кислоті; 1 ммолярний розчин сечовини (60 мг/л) для побудови калібрувального графіку. Обладнання: водяна баня (близько 100 °С); фотоелектроколориметр КФК-3 або UNICO. Для аналізу вмісту сечовини в цільному молоці береться 0,3 мл проби молока (у 3-х паралелях) та додається 3,0 мл дистильованої води і послідовно по 0,3 мл спиртового розчину диметилгліоксиму та 3 мл розчину тіосемикарбазиду в 5 %-ній за об'ємом сірчаній кислоті. Проби інкубують у кип'ячій водяній бані протягом 15 хвилин. По закінченні кип'ятіння проби охолоджують і фільтрують крізь паперовий фільтр. Прозорий фільтрат яскравого червонопурпурового кольору колориметрується при 530 нм у 10-мм кюветі. Для перерахунку оптичної щільності в ммоль/л або мг% сечовини будується калібрувальна крива з розведенням 1ммолярного розчину сечовини. 1 UA 109813 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Оскільки для визначення вмісту сечовини відібране від корів молоко в умовах молочних ферм і молочних комплексів необхідно доставляти в лабораторію непрокислим, його можна консервувати етиловим спиртом. До 5 мл молока додається 10 мл спирту, перемішується, а потім фільтрується крізь паперовий фільтр для відділення жиру і денатурованих білків молока. Фільтрат може зберігатися тривалий час до проведення аналізу. Для визначення вмісту сечовини в фільтраті береться проба об'ємом 0,9 мл і 2,4 мл дистильованої води та проводиться аналіз, як описано вище. Верхньою межею концентрації сечовини в молоці є 30 мг%. Менш, ніж 15 мг% вмісту сечовини свідчить про недостатнє забезпечення протеїном корів в складі раціону. Оптимальний вміст сечовини 20-30 мг %, менше 15 - низький, максимальна межа норми - 60 мг %. Винахід може бути рекомендовано для використання у сільському господарстві, зокрема біохімії тварин і клінічній медицині. Запропонований нами спосіб визначення вмісту сечовини в молоці є достатньо простим, реактиви - доступними, тому може бути використаним у будь-якій лабораторії, оснащеній сучасним фотоелектроколориметром. Джерела інформації, взяті до уваги при описі винаходу 1. Спосіб кількісного визначення сечовини в лікарських формах з ліпофільною основою. Патент Український № 30617, A61N33/00/ Федущак Н.К., Ващенко К.Ф., Чолій Л.Ф., Зайченко О.І.; «Львівський державний медичний університет» - № 98031509. Заявка 25.03.1998; Опублік. 15.12.2000. 2. Способ количественного определения мочевины в молоке и молочных продуктах. Патент Российской Федерации № 2293984, G01N33/04/ Храмов В.А., Горлов И.Ф., Лютикова М.В.; «Государственное учреждение Волгоградский научно-исследовательский технологический институт мясо-молочного скотоводства и переработки продукции животноводства Россельхозакадемии (ГУ ВНИТИ ММС и ППЖ Россельхозакадемии)» - № 2005122344/13. Заявка: 14.07.2005; Опублик. 20.02.2007. 3. Способ определения мочевины в биологических жидкостях и набор реактивов для его осуществления. Патент Российской федерации № 2122740, G01N33/84/ Радионов Ю.В., Язвовская С.С; «Общество с ограниченной ответственностью «Импакт»» - № 95121678/14. Заявка 21.12.1995; Опубл. 27.11.1998. 4. Способ определения мочевины и креатинина в биологических жидкостях. Патент Российской Федерации № 2101706, G01 N33/50/ Моренкова С.А., Лопухин Ю.М.; «Научноисследовательский институт физико-химической медицины Минздрава РФ» - № 95107349/14. Заявка 05.05.1995; Опублик. 0.01.1998. 5. Способ фотометрического определения мочевины и ее производных. Патент Российской Федерации № 2093817, G01 N21/78/ Бедняк А.Е., Павлова В.М., Гриднев Ю.С., Яцевич О.В.; «Хабаровский государственный медицинский институт» - № 93015129/25. Заявка: 23.03.1993; Опублик. 20.10.1997. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 1. Спосіб визначення вмісту сечовини в молоці, що включає взаємодію молока з аналітичними реагентами при кип'ятінні, який відрізняється тим, що до 0,3 мл молока додають 3 мл дистильованої води і послідовно 0,3 мл 1 %-ого спиртового розчину диметилгліоксиму та 3 мл 0,025 %-ого розчину тіосемикарбазиду в 5 %-ній за об′ємом сірчаній кислоті, суміш кип′ятять на водяній бані протягом 15 хвилин, охолоджують, фільтрують і колориметрують отриманий фільтрат яскравого червоно-пурпурового кольору при 530 нм та визначають концентрацію -3 сечовини за калібрувальним графіком, побудованим з розведеннями 10 моль або 60 мг/мл розчину сечовини. 2. Спосіб визначення вмісту сечовини в молоці за п. 1, який відрізняється тим, що молоко попередньо консервують етиловим спиртом у співвідношенні 1:2. Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2