Спосіб одержання креатинамідиногідролази

Способ получения креатинамидиногидролазы, предусматривающий конструирова ние рекомбинантной плазмидной ДНК. кодирующей креатинамидиногидролазы. трансформацию полученной ДНК штамма бактерий Escherichia coll, культивирование трансформированного штамма, выделение и очистку целевого продукта, о т л и ч а ю щийся тем, что конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК рВТ 109 или рВТ 119, трансформации подвергают штамм Е, coll DSM 4105, или DSM 4106, при этом плазмидой трансформируют штамм В coll DSM 4105, а плазмидой рВТ 119 - штамм E.coll 4106. С> Изобретение относится к генетической инженерии и касается получения креатинамидиногидролазы, которая стабильнее, чем нативный фермент, и поэтому более пригодна для определения содержания креатинина в сыворотке, плазме или моче. Фермент креатинамидиногидролаза ЕС 3.5.3.3 находит промышленное применение для определения креатинина. Его используют для диагноза заболеваний почек, при которых в сыворотке или моче содержание креатинина отклоняется от таковых здорового организма. Известны микроорганизмы, которые при индукции за счет креатина в состоянии вырабатывать креатинамидиногидролазу в достаточном для переработки количестве Однако достигаемый выход и стоимость фермента представляют собой лимитирующий фактор для промышленного применения фермента. Известен также способ получения данного фермента, при котором удалось выделить ген, кодирующий креатинамидиногидролазу из Pseudomonas putida, клонировать его рВР 322. После трансформации микроорганизмов вида E.coll или полученной рекомбинантной ДНК удалось получить конститутивно креатинамидиноогидролазу. Этот способ с помощью генной инженерии креатинамидиногидролазы эффективнее и легче в осуществлении, чем выделение из индуцированного, не содержащего никакого плазмида микроорганизма. Однако получаемый с помощью данного способа фермент естественного типа облад?ет только ограниченной детергентной и термической стабильностью и, таким образом, оптимально непрлгоден для использования в клиническом тест-і_пособе. Цель изобретения - nOk-мшение стабильности фермента. ю о со о 12993 Получены креатинамидиногидролазы, которые катализируют реакцию: Креатин + НгО -»саркозин + мочевина. В отличие от нативного фермента в полученном белке происходит замена амино- 5 кислоты в положении 109. Аминокислота аланин заменяется валином. Полученный фермент обладает намного лучшей стабильностью, чем нативный фермент. Сконструированы плазмиды рВТ 109 и 10 рВТ 119, содержащие ген креатинамидино гидролазы, в котором произошла аминокис лотная замена в положении 109, а в случае рВТ 119 такде в положении 355 заменена Val и Met. Благодаря секвенсированию рВТ 119 15 установлено, что в положении 1063 последо вательности в кодирующей нити G заменен из A(G -* А), так что триплет GTG превращен в ATG. В результате трансформации штам мов рецинентом полученными плазмидами 20 созданы штаммы E.coll, DSM 4105, содержа щие плазмиду рВТ 109, и штамм E.coll, DSM 4106, содержащий плазмиду рВТ 119, кон ститутивно экспрессирующие креатинамидиногидролазу. 25 Пример. Клетки E.coll DSM 4105, E.coll DSM 4106 и для срапнения E.coll DSM 3143 выращивают в течение ночи в ферменторах на 1 л. Среда - полная (дрожжи, пентоновый 30 экстракт); 0,4% глюкозы; 100 ммоль/л фосфатного буфера. После 15-минутного центрифугирования при 8000 об/мин клетки переводят в удобную для переработки форму в French- 35 прессе и креатикамидиногидролазу очищаю т п у те м ф ра к ци н и ро в ан ия ч е ре з молекулярное сито (Софакрил S 200). Пол ученные ферменты инкубируют при указанных в табл. 3 условиях и затем осуществляют определение фермента при применении тест-комбинации "Мочевина" (ВМ определение № 124770, табл. 4). Тобл. 4 воспроизводит характер стобипьности предлагаемых в изобретении мутанто в кр еат инам ид ин огид р ол азы по сравнению с ферментом полученным способом-прототипом при 37°С, причем тест-смесь 1 из тест-комбинации "креатинин-РАР" (ВМ определение № 839 434); исходная активность: 12У(мл)=100% Р е з у л ь та т ы с р а в н ен и я к о нс т а н т Michaells (Км) при 37°С, 0,1 моль/л Трио-НСІ, рН 8,0 (оптимальные тест-условия) приведены в табл. 2. Тест-условия: фосфатный буфер 20 ммоль/л; рН 8,0; Нативная креатинамидиногидролиза 1,05 мг белка/мл (8,0 V/мг). Полученная креатинамидиногидролаза 1,10 мг белка/мл (8,7 V/мг), (аминокислота 109=Val). Фермент инкубируют при указанных тест-условиях и затем осуществляют определение фермента при тест-комбинациях "Мочевина" (ВМ определение № 124770). Полученный фермент обладает большей стабильностью и с помощью данной креатинамидиногидролазы можно избежать потерь активности фермента при определении креатинина и осуществлять надежно такие определения также через более длительные промежутки времени, на основании улучшенных свойств также возможно уменьшение количества фермента в креатинин-тесте. Таблица 1 Стабильность полученной креатинамидиногидролазы по сравнению с известным ферментом Остаточная активность, %, спустя, мин Креатинамидиногидролаза из E.coll (кодирующий плазмид) 15 30 45 60 DSM3143(pBT2a-1 DSM 3148 Р) DSM 4105 (рВТ 109 DSM 4108 Р) DSM 4106 (рВТ 119 DSM 4107 Р) 69 96 102 51 90 102 39 84 102 27 84 102 12993 Таблица 2 Константа Михаэлиса ферментов Креатинамидиногидролаза из E.coll (кодирующий плазмид) Km, ммоль/л DSM3143(pBT2a-1 DSM3148P) DSM 4105(pBT2109 DSM 4108 Р) DSM4106(pBT119DSM4107P) 25 20 16 Таблица 3 Определение остаточной активности фермента при оптимальных условиях при различных температурах Остаточная активность, %, креатиназы и инкубация, мин Температура, °С (DSM3143) (DSM4105) 30 37 42 47 52 60 120 30 60 100 87 1 0 86 36 0.4 80 13 0 100 '84 42 3 Креатинамидиногидролаза Креатинамидиногидролаза мин а- типа (патент ФРГ № 3500184 А1) (DSM3143) Сравнение 90 63 0 96 73 2 о О Таблица 4 Определение фермента при 37°С Время 120 Тест-условия мутанта (аминокислота 109 = v a I) (DSM 4105) Согласно изобретению 0 3,3 V/мл (активность = 100%) 3,0 V/мл (активность - 100 %) 15 1,9 V/мл (остаточная активность 59%) 0,6 V/мл (остаточная активность = 18%) 0,2 V/мл (остаточная активность 6%) 3,3 V/мл (активность - 100%) 3,0 V/мл (остаточная активность •* Креатин-РАР 100%) 2,7 V/мл (остаточная активность - (ВМ Ьк 839434) 91%) 2,5 V/мл (остаточная активность) 0,7 V/мл (остаточная активность 21%) 0.0 V/мл (остаточная активность « 0%) 0,0 V/мл (остаточная активность 0%) 2,7 V/мл (остаточная активность 91%) 2,7 V/мл (остаточная активность « 91%) ш 2.-1 V/мл (остаточная активность 71%) 30 60 0 15 30 60 3.0 V/мл (активность - 100%) Тест-смесь 1 на тест-комбинации • В 125 ммоль/л фосфатного буфера 1 детергент П р и м е ч а н и е : ферменты инкубируют при указанных условиях и затем осуществляют определение фермента при применении тест-комбинаций "Мочевина" (ВМ определение Nk 124770) 12993 Упорядник Замовлення 4093 Техред М.Моргентал Коректор М. Керецман Тираж Підписне Державне патентне відомство України, 254655, ГСП Ки!а»53, Львівська ля., 8 Відкрите акціонерне товариство "Патент", м. Ужгород, вул.ГагарІна. 101