N-бензил-спіро[індолін-3,4-(2-аміно-3-карбетокси-5-метил-4н-пірано[2,3-с]піразол)]-2-он, який проявляє антиоксидантну та гепатопротекторну активність

N-Бензил-спіро[індолін-3,4-(2-аміно-3карбетокси-5-метил-4H-пірано[2,3-с]піразол)]-2-он, загальної формули 2 3 Гепатопротекторна активність мексідолу проявляється лише при довготривалому введенні [9]. Найближчим за хімічною структурою до заявленої сполуки є 1-(3-амінофеніл)-3метіл[1]бензопірано[2,3-с]піразол-4-он [10], який проявляє здатність селективно інгібувати А2рецептори аденозіну. Сполука за прототипом не проявляє антиоксидантної та гепатопротекторної активності. В основу корисної моделі поставлене завдання створення нової хімічної сполуки, що проявляє високу антиоксидантну та гепатопротекторну активність при низькій токсичності і може бути використана як діюча речовина у складі фармацевтичних препаратів різних лікарських форм: таблеток, капсул, суспензій для перорального застосування тощо. Поставлене завдання вирішується шляхом синтезу індивідуальної хімічної сполуки N-бензілспіро[індолін-3,4-(2-аміно-3-карбетоксі-5-метил-4Hпірано[2,3-с]піразол)]-2-ону загальної формули Нова сполука є похідним 2-оксіндолу як структурного аналогу мелатоніну, що містить спіроз'єднані 4H-пірано[2,3-с]піразольну конденсовану систему та 2-оксіндольне ядро, а також аміноетильний фармакофор, присутній в молекулі мелатоніну, структурно закріплений у пірановому циклі заявленої сполуки. Сполука проявляє антиоксидантну та гепатопротекторну активність. Сполука, яка заявляється, синтезована однореакторним методом, заснованим на трикомпонентній конденсації N-бензілізатину з етилціаноацетатом та 5-метил-2,4-дігідро-піразол3-оном в умовах основного каталізу. N-Бензіл-спіро[індолін-3,4-(2-аміно-3карбетокcі-5-метил-4H-пірано[2,3-с]піразол)]-2-он це біла дрібнокристалічна речовина, добре розчинна у диметилформаміді (ДМФА), диметилсульфоксиді (ДМСО), розчинна в етанолі, практично не розчинна у воді та гексані. Будова сполуки підтверджена за допомогою елементного аналізу, ЯМР1Н-, масс- та ІЧ- та УФ-спектроскопії. Корисна модель ілюструється наступними прикладами: Приклад 1 До 2,37г (0,01моль) N-бензілізатину заздалегідь розчиненого в 10мл абсолютного етанолу додавали 1,1мл (0,01моль) етилціаноцтового ефіру та 1,3мл (0,01моль) триетаноламіну, а потім нагрівали розчин до початку кипіння та кип'ятили ще 15 хвилин після 28811 4 чого додавали 0,98г (0,01моль) 5-метил-2,4дігідро-піразол-3-ону розчиненого в 5мл абсолютного етанолу. Реакційну суміш кип'ятили ще 20 хвилин, залишали до повного охолодження, розбавляли 30мл води, та залишали на 12 годин. Осад, що випав, фільтрували, промивали киплячим н-гексаном та сушили. Вихід 3,74г (87%). Т.пл. 125-128°С. Спектр ЯМР1Н (DМSO-d6), δ, м.д.: 0.55 (т, J=6,7Hz, 3H), 1,00 (с, 3Н), 3,28 (к, J=7,1Hz, 2Н), 4,50 (с, 2Н), 6,9-7,2 (м, 3Н), 7,22-7,48 (м, 6Н), 7,85 (с, 2Н, D2Oмінливий, NH2), 11,85 (с, 1Н, D2Омінливий, NH). Масс-спектр, m/z (Івідносн., %): 430 (Μ+). C24H22N4O4 M.M=430,46 Знайдено, %: С, 66,70; Η, 5,26; Ν, 13,09. Вирахувано, %: С, 66,97; Η, 5,15; Ν, 13,02. ІЧ-спектр у КВr, см-1: n 3276 ( nNH2 ), 2978 ( nNH ), 1676( nCO ), 1466( n CH2 ), 1397. 1612, 1546(δΝΗ), 1485, УФ-спектр (EtOH) l max : 423нм (ε 256,000), 518 (10,400). Приклад 2 Вивчення антиоксидантної та гепатопротекторної активності заявленої сполуки N-бензіл-спіро[індолін-3,4-(2-аміно-3-карбетоксі-5метил-4Н-пірано[2,3-с]піразол)]-2-ону (І) проводили на білих статевозрілих мишах обох статей масою 22-25г на моделі гострого гепатиту, викликаного тетрахлорметаном, який в експериментальній фармакології використовується як класичний мембранотропний токсин, що посилює перекисне окиснення ліпідів (ПОЛ) і впливає на ліпідні мембрани як розчинник [11]. В якості препарату порівняння було обрано мексідол у дозі 100мг/кг (ДЕ50). Критеріями оцінки антиоксидантної та гепатопротекторної активності слугували індекси виживаності (IB, %) на протязі всього терміну спостереження, ДЛ50, МКП (масовий коефіцієнт печінки - показник гемодинаміки органу), кількісний вміст у гомогенаті органу кінцевого продукту ПОЛ ТБК-активні продукти. Ступінь антиоксидантного захисту функціонально важливих біомолекул клітин визначали за вмістом відновленого глутатіону (GSH). Результати вивчення антиоксидантної, гепатопротекторної активності та гострої токсичності заявленої сполуки (І) та препарату порівняння мексідол наведені у таблиці 1. Показники антиоксидантної, гепатопротекторн гострої токсичності заявленої сполуки (І) у порівнянні з мексідол о Піддослідні групи тварин Інтактний контроль Контрольна патологія Сполука (І) ДЕ50, ДЛ50, ТІ= IB МКП, мг/кг мг/кг ДЛ50/ % % per os per os ДЕ50 100 4,93±0,6 85,71 6,81±0,2 100 2300 23 100 6,48±0,3 5 Мексідол 28811 100 2010 20,1 100 6 6,69±0,21* 74,70±15,26 104,21±15,65* Показники антиоксидантної та гепатопротекторної сполуки (І) у порівнянні з мексідолом та мелатоніном на 2 Примітки: * - відхилення показника достовірне щодо групи інтактного контролю, р≤0,05; ** - відхилення показника достовірне щодо групи контрольної патології,ДЕ , р≤0,05; 50 МКП, GSH, ум.од. у *** - відхилення показника достовірне щодо препаратуУмови досліду мг/кг IB мексідол, р≤0,05; ΔΜ % % гомогенаті печінки per os В умовах гострого тетрахлорметанового Інтактний гепатиту у мишей в дозі 100мг/кг заявлена сполука 100 2,00±4,644,08±0,19 112,24±4,13 контроль (І) проявляє виражену антиоксидантну та Контрольна гепатопротекторну активність, що -25,83± 85,71 4,51±0,30 60,61±4,80 * патологія характеризується позитивним впливом на 4,17* загальний стан тварин (виживаність), стан -11,43± Сполука (І) 30 100 4,42±0,21 71,27±5,37 антиоксидантних систем та процес ПОЛ. 4,27** На тлі гепатотоксину досліджувана сполука (І) -23,75± Мексідол 100 57,14 4,57±0,21 47,04±6,93* достовірно зменшувала вміст ТБК-активних 3,75* продуктів в гомогенаті печінки. За показником -10,83± Мелатонін 30 85,71 4,15±0,25 74,76±7,96 зміни вмісту ТБК-активних продуктів заявлена 6,25 сполука (І) перевищує препарат порівняння мексідол більш ніж у 2 рази, за вмістом Примітки: відновленого глутатіону (GSH) сполука (І) * - відхилення показника достовірне щодо групи інтактного контро наближається до показника інтактного контролю, ** - відхилення показника достовірне щодо групи контрольної пат що свідчить про позитивний вплив на *** - відхилення показника достовірне щодо препарату мексідол, дезінтоксикаційні функції печінки. За показником *** - відхилення показника достовірне щодо препарату мелатонін МКП та IB заявлена сполука (І), не поступається мексідолу, при практично однакових величинах ТІ. Як видно з даних, представлених у таблиці 2, Зазначені зміни вмісту ТБК-активних продуктів тварини групи контрольної патології внаслідок вказують на здатність заявленої сполуки (І) тяжкої інтоксикації значно втрачали вагу та інгібувати процеси ПОЛ значно ефективніше ніж частина тварин гинула (16%) протягом препарат порівняння, що свідчить про її виражену експерименту. Про розвиток тетрахлорметанового антиоксидантну та гепатопротекторну активність. гепатиту також свідчила інтенсифікація процесів Приклад 3 ПОЛ, що характеризувалася збільшенням рівня Вивчення антиоксидантної та ТБК-активних продуктів у сироватці крові (р=0,07) і гепатопротекторної активності заявленої сполуки в гомогенаті печінки (р≤0,05) та зменшенням рівня N-бензіл-спіро[індолін-3,4-(2-аміно-3-карбетоксі-5GSH у гомогенаті печінки (р≤0,05) порівняно з метил-4Н-пірано[2,3-с]піразол)]-2-ону (І) інтактним контролем. проводили на білих статевозрілих щурах-самцях На тлі лікування гострого масою 180-250г на моделі гострого тетрахлорметанового гепатиту мексідолом IB тетрахлорметанового гепатиту. Гепатит викликали тварин був значно нижчим ніж у групах тварин, що пероральним введенням тетрахлоретану в дозі одержували мелатонін, заявлену сполуку (І) та у 0,4мл/100г маси тіла тварини у вигляді 50% групі контрольної патології. Лише під впливом розчину на рослинній олії двічі на добу. В якості заявленої сполуки (І) щури менше ніж в групі препаратів порівняння було обрано мексідол та контрольної патології втрачали вагу, а випадків мелатонін. загибелі дослідних тварин взагалі не Критеріями оцінки антиоксидантної та відзначалося. гепатопротекторної активності слугували Заявлена сполука (І) в умовах гострого показники індексу виживаності тварин (IB, %) на тетрахлорметанового гепатиту позитивно протязі всього терміну спостереження, МКП впливала на стан антиоксидантних систем та (масовий коефіцієнт печінки показник процес ПОЛ, як у тканині печінки, так і у сироватці гемодинаміки органу), кількісний вміст ТБКкрові. Рівень ТБК-активних продуктів у гомогенаті активних продуктів у гомогенаті печінки, кількісний печінки та в сироватці крові значно знижувався вміст ТБК-активних продуктів у сироватці крові. порівняно з групою контрольної патології, та Ступінь антиоксидантного захисту функціонально практично не поступався препаратам порівняння. важливих біомолекул клітин визначали за вмістом Значення GSH під впливом заявленої сполуки (І) відновленого глутатіону (GSH), ΔΜ - величиною підвищувалося відносно контрольної патології, зміни маси тіла тварин. було значно вищим, ніж у препарату порівняння Дослідних тварин було поділено на 5 груп: мексідолу та не поступалося мелатоніну, що інтактний контроль; контрольна патологія свідчить про позитивний вплив на захисні (неліковані тварини); група, що одержувала антиоксидантні механізми. заявлений засіб (сполуку (І)); групи тварин, Отже, порівняльний аналіз гепатопротекторної лікованих відповідно мексідолом та мелатоніном. та антиоксидантної активності заявленої сполуки Результати досліджень на 2-й день (І) та препаратів порівняння показав, що експерименту наведені у таблиці 2. досліджувана речовина у разовій дозі 30мг/кг перевершує лікувальні властивості препарату Таблиця 2 мексідол в дозі 100мг/кг, не поступається дії 7 мелатоніну у дозі 30мг/кг та перевищує його за показником IB. Таким чином, заявлено сполуку з високою антиоксидантною та гепатопротекторною активністю, при низькій токсичності. Заявлена сполука може знайти застосування у медичній практиці для лікування ряду патологічних станів, що супроводжуються інтоксикацією та оксидативним стресом внаслідок підвищення процесів ПОЛ, наприклад, при ураженнях печінки токсинами хімічної, бактеріальної або вірусної етіології в гепатології, гастроентерології та токсикології, гострих гнійно-запальних процесах черевної порожнини (гострий деструктивний панкреатит, перитоніт), отруєннях радіонуклідами, токсичних енцефалопатіях на тлі порушення функції печінки та інших внутрішніх органів, в онкології як ад'ювантний засіб у терапії злоякісних пухлин, в анестезіології та реанімації, у комплексній терапії поліорганної недостатності різного генезу тощо. Для синтезу заявленої сполуки використовуються однореакторний метод та доступні реактиви, дозволені у фармацевтичній практиці, нешкідливі для довкілля. Речовина проста у технологічних дослідженнях, відтворенні у промислових умовах, стійка, що збільшує термін її зберігання, а також має широку фармакологічну активність. Перелічені фактори дозволяють рекомендувати заявлену речовину як лікарську субстанцію для розробки високоефективних засобів у різних лікарських формах. Джерела інформації: 1. Reiter, R.J. The Indole amine Melatonin as a Free Radical Scavenger, Electron Donor, and Antioxidant: in vitro and in vivo Studies. Adv. Exp. Med. Biol.1996, 398, 307-313. 2. Меншикова Е.Б. и др. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданти / Ε.Б. Меньшикова, В.З. Ланкин, Н.К. Зенков, И.А. Бондарь, Н.Ф. Круговых, В.А. Труфакин. - М.: Фирма "Слово", 2006. - 556с. 3. Garfinkel, D.; Laudon, M.; Zisapel, N. Improvement of Sleep Quality by Controlled-Release Melatonin in Benzodiazepine-Treated Elderly Insomniacs. Arch. Gerontol Geriatr. 1997, 24, 223231. 4. Анисимов В.Н., Кветной И.М., Комаров Ф.И., Малиновская Н.К., Рапопорт С.И. Мелатонин в физиологии и патологии желудочно-кишечного тракта. - М.: Советский спорт, 2000. 5. Зорькина А.В., Костин Я.В., Инчина В.И. и соавт. Антиокислительные и гиполипидемические свойства мексидола и эмоксипина при длительном иммобилизационном стрессе // Хим.-фарм. журн., - 1998. - №5. - с.3-5. 6. Катикова О.Ю., Смирнов Л.Д. Коррекция мексидолом гепатотоксичности, индуцируемой туберкулостатиками у крыс. // Труды нац. научнопракт. конф. с междун. участием "Свободные радикалы, антиоксиданты и болезни человека". Смоленск, 2001. - с.148-150. 7. Олійник Е.В., Мещешин І.Ф., Плачінта О.В. Показники про- та антиоксидантного стану шлунка 28811 8 щурів за умов дії радіації та мелатоніну // Медична хімія. - Т.6, №1. - 2004. - С.73-76. 8. Зайцев В.Г., Островский О.В., Закревский В.И. Связь между химическим строением и мишенью действия как основа классификации антиоксидантов прямого действия // Эксперим. и клин, фармакология. - 2003. - №4. - с.66-70. 9. Цыганкова Г.М. Влияние мекисидола на развитие токсического гепатита // Автореф. дисс... канд. мед. наук. - Смоленск, 2003. - 21с. 10. CoІotta,V.; Cecchi, L.; Catarzi, D.; Melani, F.; Filacchioni, G.; Martini, C; Tacchi, P.; Lucacchini, A. 1-(3-Aminophenyl)-3-methyl[1]benzopyrano[2,3c]pyrazol-4-one: a new selective A2 adenosine receptor antagonist. Pharmacol. Lett. 1992, 2, 74-76; [Chem . Abstr.1993, 118, 32807]. 11. Вивчення гепатопротекторної та антиоксидантної активності халконів на моделі токсичного ураження печінки / С.В. Місюрьова, І.А. Зупанець, В.М. Ковальов, І.А. Журавель, В.П. Хіля // Вісник фармації. - 1999. - №2. - С.147-150.