Спосіб визначення активності еластази в аорті за умови експериментального артеріосклерозу

Спосіб визначення активності еластази в аорті за умови експериментального артеріосклерозу, 29234 ферментів (натрієва сіль етілендіамінтетраацетату). Ар тфіопатія моделювалася за умови експериментальної трансплантації серця у гвінейських свинок. Після видалення судин їх занурювали в 0,05 М Трис-HCL буфер (рН 7,4) при температурі 4°С. Смужки судин гомогенізували у такому ж буфері, що містив 0,25% розчин Тритон Х-100. Гомогенати центрифугували при 3500 g протягом 10 хв і супернатант використовували для біохімічного аналізу. Еластазну активність визначали радіометрично за інтенсивністю гідролізу нерозчинного еластину, який мітили тритієм (3[Н]-еластин). За допомогою цього методу було встановлено, що еластазна активність в тканинах артерій після експериментальної трансплантації серця підвищується за рахунок серинового ферменту, а не металоеластази. Такий підхід, на нашу думку, є вельми перспективним, але автори, по-перше, нехтують активністю тіолового ферменту ендотеліального походження, а роль ендотелію у розвитку артеріосклерозу є надзвичайно важливою. По-друге, використовують як субстрат мічений еластин, а останній, як відомо, розщеплюється важче, ніж хромогенні субстрати, що не дає можливості кількісної оцінки активності різних форм еластази. І нарешті, не визначають співвідношення різних форм еластази при експериментальній судинній патології порівняно з нормою. Винахід вирішує задачу вибіркового пригнічення певних форм еластази за допомогою специфічних інгібіторів. Досягнутий те хнічний результат полягає в забезпеченні диференціації різних форм еластази в аорті. Поставлена задача вирішується тим, що у відомому способі визначення активності еластази в аорті за умови експериментального артеріосклерозу, який включає видалення судин, гомогенізацію з додавання детергенту, центрифугування, біохімічне дослідження еластолітичних властивостей супернатанта за допомогою субстрату для еластази при дії специфічних інгібіторів серинових та металоферментів, згідно винаходу, додатково супернатант піддають дії інгібітора тіолових протеаз (монойодацетата), в якості субстрату для еластази використовують хромогенний субстрат (Suc-(АІа)3-р-N А) та спектрофотометрично за відсотком пригнічення певних форм еластази дають кількісну оцінку їх активності. Відмінними ознаками способу визначення активності еластази в аорті за умови експериментального артеріосклерозу є те, що вперше забезпечується визначення всіх форм еластази в аорті, причому надається не тільки якісна, але і кількісна їх оцінка, що, в свою чергу, дає можливість встановлювати співвідношення певних форм ферменту. Завдяки цьому отримується реальна інформація про клітинні механізми еластолізу. Переважне збільшення того чи іншого ферменту дає можливість з'ясувати, за рахунок яких саме клітин (ГМК, макрофагів або ендотеліоцитів) в більшій мірі відбувається зростання еластазної активності, і навпаки, внесок яких клітин у загальну еластазну активність при патології зменшується. Провідна роль зазначених клітинних елементів в патогенезі артеріосклерозу підкреслювалася в багатьох дослідженнях, а визначення їх еластолітичної активнос ті свідчить про визначну роль еластолітичної системи в патогенезі артеріосклерозу. Підвищення експресії еластази певними клітинами може ініціювати ланцюгові реакції пошкодження судинної стінки, шляхом порушення кальцієвого гомеостазу, модифікації ліпопротеїдів, активації міграції клітин в осередок розвитку патологічного процесу, а головне, спричинювати деструкцію еластинового каркасу судин компенсаційного типу із втратою їх фізіологічної еластичності. Отже, можливість диференціювання різних форм еластази в аорті наближає нас до розуміння патогенезу артеріосклерозу. Спосіб здійснюють таким чином. Після видалення аорти через торакоабдомінальний розтин її негайно занурюють в 0,05 М Трис-НCL буфер (рН 7,4) при температурі 4°С. Смужки судин гомогенізують у 0,05 М Трис-HCL буфері (рН 7,4) з 0,25% розчином неіонного детергенту Тритон Х100 при температурі 4°С, використовуючи гомогенізатор скло-скло. Використання детергенту Тритон X-100 необхідне внаслідок того, що переважна кількість еластази в тканинах аорти знаходиться у мембран-асоційованій формі. Вибір буфер у, температури та гомогенізатора роблять з урахуванням збереження максимальної кількості ферменту в гомогенаті та для запобігання штучної активації того чи іншого ферменту. Гомогенати центрифугують при 6000 об/хв (3500 g) 10 хв і супернатант використовували для біохімічного аналізу. Еластазну активність визначають спектрофотометрично на довжині хвилі 410 нм за гідролізом специфічного хромогенного субстрату Suc-(АІа)3-р-NА за методикою Веремєєнка K.M. із співавторами [3] та виражають у mМ р-NА/(год на г білка). Кількість білка в гомогенатах тканин визначають за методом Lowry [4]. Для розмежування різних форм еластази використовують такі інгібітори: фенілметілсульфонілфторид (ФМСФ) - інгібітор серинових протеаз, монойодацетат (МЙА) - інгібітор тіолових (цистеїнових) ферментів, натрієву сіль етілендіамінтетраацетату (ЕДТА) - інгібітор металопротеаз. Готують вихідні 0,04 М розчини цих речовин - ФМСФ (7 мг/мл ізопропілового спірту), МЙ А (6,8 мг/мл фізіологічного розчину), ЕДТА (14,9 мг/мл фізіологічного розчину), які безпосередню перед дослідом розводять 0,05 М Трис-HCI буфером рН 8,1 таким чином, щоб концентрація речовин в реакційній суміші складала 0,0016 Моль. В процесі визначення до 0,3-0,4 мл супернатанту аорти додають 2,5 мл 0,05 М Трис-НСІ буфер у рН 8,1 з відповідним ферментним інгібітором та проводять визначення за методикою [3]. Порівнюючи активність еластази в пробах, які містили інгібітори з пробою без інгібіторів, вираховують різницю між ними. Отримані дані виражають в процентах від еластолітичної активності проби гомогенату аорти без інгібіторів, що приймають за 100%. Приклад конкретного виконання Після одноразового введення ергокальциферолу щура забивають шляхом декапітації, вилучають аорту та занурюють її в 0,05 М Трис-HCL буфер (рН 7,4) при температурі 4°С. Смужки судини гомогенізують у 0,05 М Трис-НCL буфері (рН 7,4) з 0,25% Тритон Х-100 при температурі 4°С, використовуючи гомогенізатор скло-скло. Гомогенат центрифугують при 6000 об/хв (3500 g) протягом 10 хв 2 29234 і супернатант використовують для біохімічного аналізу. В процесі визначення до 0,3 мл супернатанту аорти додають 2,5 мл 0,05 М Трис-HCl буферу рН 8,1 з відповідним ферментним інгібітором та без інгібіторів. Еластазну активність визначають за гідролізом специфічного хромогенного субстрату Suc-(Ala)3-p-NA за методикою Веремєєнка K.M. із співавторами [3]. В результаті досліду встановлено, що загальна еластазна активність в пробі без інгібіторів дорівнювала 6,9 mМоль пара-нітроаніліну за год на г білка (mM р-NA/год на г білка); в пробі з ФМСФ еластазна активність становила 2,80, в пробі з ЕДТА – 1,00, в пробі з МЙА – 3,08. Тобто в найбільшій мірі еластазна активність пригнічувалася інгібітором маталопротеаз (ЕДТА) і приблизно в однаковій мірі інгібіторами серинових та тіолових ферментів, що у процентному відношенні до загальної активності еластази становить 21% серинової, 59% метало- та 19% тіолової еластази. Використання даного методу завдяки кількісній оцінці різних форм еластази дійсно дає можливість встановлювати співвідношення різних форм еластази в аорті у експериментальних тварин. Нижче наведено результати дослідів по вивченню активності еластази та її різних форм в гомогенатах аорти кролів та щурів при моделюванні артеріосклерозу менкебергівського типу (адреналінова та ергокальциферолова модель). Як видно з табл. 1 за умов норми в аорті кролів визначаються приблизно рівні активності серинової метало- та тіолової еластази. При моделюванні адреналінового артеріосклерозу активність еластази (ЕА) в гомогенатах аорти вірогідно зростає у 1,9 рази порівняно з контролем (4,56±0,39; 2,38±0,14 відповідно, р