Екстракт п’явки медичної сухий

Екстракт п'явки медичної сухий, що одержаний заморожуванням, гомогенізацією сировини, заморожуванням та ліофільним сушінням гомогенату, екстрагуванням гомогенату та очищенням екстракту, який відрізняється тим, що сировину заморожують та розморожують (фростаціядефростація) тричі, а очистку екстракту проводять фреоном -113 Винахід, що передбачається, відноситься до біотехнологм, а саме до одержання біологічно активних препаратів з екстракту п'явки Hirudo medicinal is Ще в 1884 році був одержан екстракт з тіла п'явки Одержаний екстракт послужив вихідним матеріалом для виділення чистого та антикоагулюючого препарату, що був названий гірудином від латинського Hirudo - п'явка Існує міжнародна заявка "Белок обладающий способностью ингибировать стимулированную коллагеном агрегацию тромбоцитов" W095/01375 від 12 01 1995 р , заявник Мерк Патент ГМБХ (DE), кл С07К14/436, цей винахід відноситься до біотехнологм для одержання білка, який придатний для профілактики та лікування тромболітичних хвороб Білок одержують шляхом очистки слюни п'явки медичної препаративним електрофорезом у поліакриламідному гелі Цей спосіб дорого коштує, та ще має місце втрата сировинної маси Існує патент US №6025330 від 15 02 2000, кл А61К38/00 "Inhibitors of fibrin cross-linking and/or transglutammases" Цей винахід використовують при одержані інгібіторів з ткані чи секрецій п'явок, які використовують для відновлювання стабільності тромбів таким чином, щоб вони були сприйнятливі до розпаду тромболітичними засобами Це рішення можливо використовувати тільки для одержання інгібіторів Загальним недоліком аналогів є обмежений спектр їх використання Є патент України №14625 кл А61К35/62, від 05 09 94 р "Спосіб отримання препарату з медич них п'явок, володіючого тромболітичною, антитромболітичною, ппотезивною та анальпзуючою дією" Це рішення може бути прототипом Недоліком його є не повний вихід біологічно активних речовин, інкубування гомогенату йде довгий час, та ще потрібне додаткове відтаювання перед центрифугуванням, а препарат, який отримується за цим рішенням, потребує додаткової очистки В основу винаходу, що передбачається, поставлено задачу розробити екстракт п'явки медичної сухий заморожуванням, гомогенізацією сировини, заморожуванням та ліофільним сушінням гомогенату, екстрагуванням гомогенату та очищенням екстракту, шляхом заморожування та разморожування сировини (фростація-дефростація) тричі та очистки екстракту фреоном-113, щоб забезпечити одержання високоефективного чистого екстракту п'явки медичної сухого з широким спектром використання Екстракт п'явки медичної сухий одержують таким чином Біомасу п'явки медичної промивають водою, після чого промивають водою з додаванням 30% спирту етилового Для іммобілізації біомаси виконують заморожування від мінус 5 до мінус 10°С Після чого проводять тричі фростацію-дефростацію Потім одержують гомогенат, який використовують для люфілізіцм Люфілізацію завершують при досягненні у продукті температури +28-30°С Сухий гомогенат екстрагують розчином Твин80, після чого освітлюють Після заморожування та ліофільного сушіння, екстракт очищають фрео СО ^ о (О 60434 ном-113 Аналіз відомих технічних рішень в галузі бютехнологм дозволяє зробити висновок про відсутність ознак, що схожі з суттєвими ВІДМІННИМИ ознаками екстракту п'явки медичної сухої, що заявляється, та признати це рішення, ВІДПОВІДНИМ критерію "суттєві ознаки" Екстракт п'явки медичної сухий, що одержують по технічному рішенню, має стабільні корисні властивості, які не втрачаються при тривалому зберіганні продукту Екстракт має високий рівень продуктивності Визначення специфічної активності та ДІЙСНОСТІ екстракту п'явки медичної сухого Специфічну активність та ДІЙСНІСТЬ визначали по антизагортуючій активності, антипрокоагулянтноі, антитриптичної активності, а також по швидкості тромбоцитів і по хроматографії Дослід 1 Антизагортуюча активність Антизагортуючу активність визначали за методом Лі-Уайта В пробірку з 1см3 венозної крові, що встановили на водяну баню (при 37°С), додавали 0,25см фізіологічного розчину натрію хлористого (контроль), а в іншу пробірку - 0,25см3 розчину екстракту п'явки медичної сухого 1%-ноі концентрації Фіксували час утворення згустку Затримки згортання крові на 1500 секунд відповідає 2890 одиницям активності За остаточний приймали середньоарифметичний результат трьох досліджень Одержані результати перераховували в одиниці активності, величина показника антизагортуючої активності не повинна бути менше 300 одиниць на 1мг (од/мг) сухого екстракту Дослід 2 Антипрокоагулянтна активність Антипрокоагулянтну активність визначали за часом рекальціфікацм цитратної плазми крові Час рекальціфікацм безтромбоцитарної плазми крові визначали в системі, яка містить 0,1см3 1%-ного розчину аналізуємого зразку Реакцію запускали додаванням 0,1см3 0.025М розчину кальцію хлориду Визначали час утворення згустку За остаточний приймали середньоарифметичний результат трьох досліджень Величину показника антипрокоагулянтної активності визначали по подовженню часу рекальціфікацм плазми та перераховують в умовні антипрокоагулянтні одиниці активності на 1мг (од/мг), вона не повинна бути менше 300од/мг Дослід 3 Антитриптична активність Антитриптичну активність препарату визначали по інпбіцм протеолітичної активності трипсину в присутності досліджуваних зразків Антитриптичну активність препарату визначали по ЗМІНІ оптичної ЩІЛЬНОСТІ 1%-ного розчину білку (казеїну) на 60 хвилин інкубації при 37°С в присутності 1%-ного розчину трипсину та 1%-ного розчину досліджуваного екстракту п'явки медичної сухого (співвідношення компонентів дорівнює 221) Концентрацію білка визначали за методом Бредфорда з барвником Кумассі синім G-250 За остаточний приймали середньоарифметичний результат трьох досліджень Величину показника антитриптичної активності перераховували в умовні одиниці активності на 1мг (од/мг), вони не по винні бути менше 400од/мг Дослід 4 Визначення швидкості інпбіцм агрегації тромбоцитів Визначення швидкості інпбіцм агрегації тромбоцитів проводили на агррегометрі "Shapemetr-SH-01" Плазму, збагачену тромбоцитами, одержували шляхом центрифугування цитратної крові (190д, 3 15 хвилин) До 0,9см фізіологічного розчину на3 трію хлориду додавали 0,1см плазми (контроль) 3 В ДОСЛІДІ до 0,9см натрію хлориду додавали 3 0,1см 1%-ного розчину досліджуємого екстракту п'явки медичної сухого, агрегацію тромбоцитів індукували додаванням розчину аденозш-5дифосфорної кислоти дінатрієвої солі в остаточній концентрації 20мкМ Визначали зміну оптичної ЩІЛЬНОСТІ, час і швидкість агрегації тромбоцитів За остаточний приймали середньоарифметичний результат трьох досліджень Швидкість агрегації тромбоцитів виражали в Доп/с Про інпбіцію агрегації тромбоцитів свідчило зменшення швидкості агрегації тромбоцитів в порівнянні з контролем Кратність швидкості агрегації тромбоцитів в присутності зразку, що контролюється, відносно контролю, не повинна бути вище за 4,5 Дослід 5 Визначення вмісту білкових речовин Концентрація білків заміряли за методом Бредфорда з барвником Кумассі синім G-250 За остаточний приймали середньоарифметичний результат трьох досліджень Вміст білка виражали в мг/г сухого екстракту, цей показник не повинен бути менше 90мг/г Дослід 6 Радіаційний контроль Радіаційний контроль екстракту п'явки медичної сухого проводили за допомогою радіометра бета-гамма випромінювання "Припять РКС20ю03" Екстракт п'явки медичної сухий не повинен мати радіоактивність, що перевищує природні фонові значення (від 0,012 до 0,019цР/год) Дослід 7 Визначення токсичності Токсикологічний контроль сухого екстракту здійснювали шляхом штраперитонеальної ін'єкції білим мишам Зразок сухого екстракту п'явки медичної, який контролюється, розчиняли в фізіологічному розчині натрію хлориду до вмісту 5мг/см3 с р і вводили штраперитонеально в дозі по 0,2см3 п'яти білим мишам Одночасно по 0,2см3 фізіологічного розчину штраперитонеально вводили п'яти білим мишам (контрольна група) За тваринами спостерігали на протязі 48 годин При відсутності відхилень КЛІНІЧНИХ показників в ПІДДОСЛІДНІЙ і контрольній групах серію екстракту п'явки медичної сухого вважали нетоксичною Дослід 8 Визначення вмісту важких металів Вміст важких металів визначали за методом Державної фармакопеї України (Випробування на граничний вміст домішок, Важкі метали) 2001, 78 Сумарна КІЛЬКІСТЬ важких металів не повинна бути вище 0,001 мг/г Екстракт п'явки медичної сухий є високоефективною чистою сировиною з широким спектром використання 60434 Комп'ютерна верстка А Крулевський Підписне Тираж 39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119