Спосіб стимуляції синтезу біологічно активних речовин симбіотичною мікробною асоціацією в торфі

Винахід належить до біотехнології, зокрема до біотехнологічних способів збільшення кількості мікробних клітин і утворення ними мікробних метаболітів: вітамінів, амінокислот, вищих жирних кислот (ВЖК) у торфосировині шляхом стимулювання життєдіяльності симбіотичної мікробної асоціації. Спосіб може бути застосований для виготовлення з торфосировини, збагаченої біологічно активними речовинами (БАР), кормових добавок та препаратів, які корегують обмін речовин у сільськогосподарських тварин і птиці з метою підвищення продуктивності і якості продукції, а також стійкості тварин і птиці до негативного впливу факторів різної етіології. На даному етапі розвитку біотехнології відомі різні способи використання природної здатності мікроорганізмів продукувати важливі в біологічному відношенні сполуки з наступним їх використанням у медицині, ветеринарії, харчовій промисловості, годівлі сільськогосподарських тварин і птиці для корекції обміну речовин підвищення імунітету, продуктивності і покращення якості продукції (Безбородов А.М. Биосинтез биологически активных веществ микроорганизмами. - Л.: Медицина. 1969. - 128с.; Воларович М.П., Тереньтьев А.А. Новые формы микроорганизмов и их распространение в естественных торфах. // Микробиология. - 1970. - Т.39. - Вып.3. - С.488494; Герш Н.Б., Рыбакова З.Г., Розанова Л.И. и др. Влияние микроорганизмов на биологическую активность торфяных грун тов // Тор фяная промышленность. - М.: Недра, 1987. - №11. - С.28-29; Блинов Н.П. Химическая микробиология. - М.: Высшая школа, 1989. - 348с; Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды. - М.: Изд. «Мир», 1987. - С.196-242). Ці способи передбачають: - стимулювання діяльності відповідних штамів мікроорганізмів-продуцентів вітамінів, амінокислот, речовин естрогенного характеру, антибіотиків та інших мікробних метаболітів з метою синтезу цих сполук на спеціальних середовищах (Безбородов А.М. Биохимические основы микробиологического синтеза. - М.: Легкая и пищевая промышлен., 1984. - 112с.; Быховский В.Я., Зайцев Н.И., Хучуа Г.Н. Влияние S-метилметионина /витамина U/ на биосинтез витамина В12 Propionobacterium shermanii. // Приклади, биохим. и микробиол. - М.: Наука, 1970. - Т.3. Вып.1. - С.75-79; Микробный синтез биологически активных соединений // Сб. науч. труд Инст. микробиол. АН БССР. - Минск, 1976. - 136с.); - використання природних субстратів як середовища, на якому можуть розвиватись відповідні види мікроорганізмів з метою одержання бажаних продуктів мікробного синтезу з наступним їх використанням як джерела таких сполук (Евдокимова Г.А., Раковский В.Е., Шиманский В.М., Костюкевич Л.И. // Биологически активные вещества тор фа и их использование для интенсификации роста дрожжей и растений. // Торф и его использование. Труды АН БССР. - Минск: Наука и техника, 1974. - С.59-60; Конова И.В., Лысенкова Л.А., Калмыкова Г.Я., Улезло И.В. Получение витамина В12 с помощью Actynomices olivaceus на некоторых производственных отходах. // Микробиология. - 1964. - 333, №3. - С.528-532); - використання субстратів із симбіотичною мікробною асоціацією для підвищення вмісту різних БАР, які є мікробними метаболітами, шляхом стимулювання мікробіологічних процесів за допомогою відповідних факторів (Палфій Ф.Ю. Симбіотична мікрофлора - основа біохімічної еволюції. // Матер. наук. конфер. до 95-річчя від дня народж. С.З. Гжицького. - Львів, 1995, - С.9-13). Недоліком зазначених способів є недостатня їх ефективність. Одні з них є те хнологічно енергомісткі і дорогі, що понижує можливість забезпечення біологічно активними речовинами фізіологічні потреби тварин і птиці. Не задовольняється повністю потреба мікроорганізмів у сполуках, які забезпечують підвищений синтез окремих бажаних мікробних метаболітів, зокрема вітамінів групи В, дефіцитних амінокислот, ненасичених вищих жирних кислот тощо. Відомі способи використання торфу-сирцю, висушеного торфу і продуктів його кислотного гідролізу, а також мулу, сапропелю як джерела амінокислот, вуглеводів, органічних кислот, мікро- та макроелементів у годівлі тварин і птиці, а також як субстратів для одержання цих сполук. (Андросов Н.Е., Яковлева Е.П., Субботин В.И. Питательная ценность сапропелей озер Якутии // Сбор. науч. труд. Якутск. филиала СО АН СССР. - 1983. - С.7275; Евдокимова Г.А., Яночкина Л.П., Букач О.М. и др. Биологическая активность продуктов химической модификации сапропелей // Торфяная промышленность. - М.: Недра, 1987. - №3. - С.34-36; Елисеев А.А., Бинеев Р.Г., Григорян Б.Р. Сапропель - комплексное биологически активное вещество. // Сбор. Науч. тр уд. Беларус. с.-х. академии. - 1982. - С.18-20; Шаблий В.Я., Дергилева А.Н., Колос Ю.А., Цыганков С.П. Переработка активного ила в белковые кормовые добавки // Нетрадиц. корма в питании с.-х. животн. - Ужгород, 1984. - С.110-111). Найбільш близьким по суті до способу, що заявляється, є спосіб оптимізації життєдіяльності мікроорганізмів торфу з метою підвищення вмісту біологічно активних речовин (БАР), викладений у матеріалах дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук (Гвоздь О.О. Автореферат дисертації "Изменение содержания витаминов В1 и В12 и аминокислот в процессе биотехнологической обработки торфа с применением сульфата натрия и их влияние на некоторые биохимические показатели и продуктивность цыплят-бройлеров". Львов, 1992). Відомий спосіб полягає у використанні торфосировин, а саме торфу-сирцю з місцевих торфородовищ низинного типу з високим ступенем розкладання органічної речовини, високим вмістом різних гр уп мікроорганізмів та продуктів їх життєдіяльності. Відомий спосіб включає інкубацію торфової маси протягом трьох діб при температурі 25°С в присутності сульфату натрію (Nа2SО4 х10Н2О), внесеного у дозі 0,3% від маси торфу у формі водного розчину і доведення вологості торфу до 60%. Спосіб забезпечує активацію мікробіологічних процесів, збільшення вмісту ві тамінів В1, В 2, В 6 та В12, вищи х жирних кислот та амінокислот у торфосировині. Недоліком відомого способу є недостатня ефективність створення оптимальних умов для симбіотичних мікроорганізмів, які є продуцентами вітамінів групи В, амінокислот, вищих жирних кислот та інших біологічно активних сполук у масі торфу в процесі інкубації, що понижує якість одержаного таким способом біосубстрату. Запропонований нами спосіб усуває недоліки прототипу, краще стимулює мікробіологічні процеси в торфі і активніше забезпечує збільшення кількості мікробних клітин та підвищення вмісту ві тамінів групи В (В1, В2, В6, В12), амінокислот, вищих жирних кислот, сульфгідрильних груп у масі торфу, у зв'язку з чим біологічна цінність торфосировини значно зростає. В основу винаходу покладено завдання створити ефективний технологічно простий і дешевий спосіб активування синтезу вітамінів групи В (В 1, В 2, В 6, В12), амінокислот та органічних кислот (ВЖК), SH-вмісних сполук, а також мікробної біомаси в торфі. Технічний результат досягають активуванням мікробіологічних процесів шляхом додавання до маси торфу з високим ступенем розкладання органічної речовини водного розчину сульфату натрію в кількості 0,3% одночасно з мелясою в кількості 0,5-1,5% від маси торфу, ретельним перемішуванням компонентів зволоженої торфової маси та інкубуванням при температурі 27°С протягом трьох діб. Заявлений спосіб забезпечує активування мікробіологічних процесів, внаслідок чого у масі торфу загальне число мікроорганізмів, вирощених на м'ясо-пептонному агарі (МЛА), зростає до 884,2х103 клітин/г, кількість SH груп - до 0,57мкмоль/г, вміст вітамінів В1 - до 3,14мкг/г, В2, - до 0,624мкг/г, В6 - до 23,64мкг/г, В12 - до 5,98мкг/г, амінокислот - до 35,56г/кг, ВЖК - до 27,73мг % на сиру речовину. Інкубування торфу при температурі 27°С та зволоження торфової маси розчином сульфату натрію в поєднанні з мелясою створює у масі торфу оптимальні умови для розвитку і функціонування симбіотичних мікроорганізмів, які продукують вітаміни групи В, амінокислоти, вищі жирні кислоти. Внесення у торфову суміш меляси на фоні сульфату натрію сприяє кращій активації мікробіологічних процесів, оскільки меляса є додатковим джерелом вуглеводів, які стимулюють життєдіяльність симбіотичної мікробної асоціації, сприяють активному розмноженню мікроорганізмів і синтезу мікробних метаболітів та їх накопиченню в торфі в процесі інкубації. При проведенні патентно-інформаційного пошуку авторами і заявником знайдено технічне рішення (Гвоздь О.О. Автореферат дисертації "Изменение содержания витаминов В1 и В12 и аминокислот в процессе биотехнологической обработки торфа с применением сульфата натрия и их влияние на некоторые биохимические показатели и продуктивность цыплят-бройлеров". - Львов, 1992), яке містить найбільшу кількість ознак, спільних із заявленим рішенням: стимулювання діяльності симбіотичної мікробної асоціації і збільшення вмісту біологічно активних сполук в субстраті зволоженням торф'яної маси водним розчином сульфату натрію, перемішуванням зволоженої маси, інкубуванням протягом трьох діб. Але наявність зазначених ознак, спільних з прототипом, не забезпечує технічний результат, який досягається заявленим способом. Технічних рішень, які б повністю співпадали із заявленим - не виявлено. Це дозволяє зробити висновок про відповідність заявленого технічного рішення критерію винаходу «новизна». У джерелах патентної і науково-технічної інформації не знайдено технічних рішень, в яких були б описані відомості про ознаки, які відрізняють заявлений спосіб від прототипу і забезпечують досягнення технічного результату (у торф'яну масу одночасно з розчином сульфату натрію вносять мелясу в кількості 0,5-1,5% від маси торфу, зволожену торфосировину інкубують при температурі 27°С). Отже, заявлене технічне рішення не випливає явним чином з рівня техніки, що дозволяє зробити висновок про відповідність заявленого способу критерію «винахідницький рівень». Заявлений спосіб належить до галузі біотехнології, зокрема до способів збільшення кількості мікробних клітин і утворення ними мікробних метаболітів: вітамінів, амінокислот, вищи х жирних кислот у торфосировині шляхом стимулювання життєдіяльності симбіотичної мікробної асоціації. Спосіб може бути застосований на підприємствах з різними формами власності, в першу чергу таких, що розташовані поблизу торфородовищ і використовують тор фосировину, збагачену біологічно активними речовинами для виготовлення кормових добавок та препаратів для корекції обміну речовин сільськогосподарських тварин і птиці, збільшення ефективності відгодівлі, підвищення продуктивності і якості продукції, і тому відповідає критерію винаходу "промислова придатність". Таким чином, заявлене технічне рішення є новим, промислове придатним і має винахідницький рівень, тобто відповідає всім умовам патентоспроможності винаходу відповідно до ст.7 розділу II закону України «Про охорону прав на винаходи і корисні моделі» №1771 - III - 2000p. Заявлений спосіб збагачення торф'яної маси біологічно активними сполуками мікробного походження та мікробною масою здійснюють наступним чином: 1. Торфосировину - низинний торф природної вологості (40-45%) з високим ступенем розкладу органічної речовини (40-50%) готують у кількості, необхідній для одержання запланованої ваги біосубстрату, очищують від сторонніх предметів і нерозкладених рослинних решток, розкладають рівномірним шаром на підготовленому заздалегідь майданчику і залишають на добу, після чого поміщають у відповідні резервуари, наприклад, дерев'яні ящики, в яких буде проводитись перемішування внесених компонентів. 2. Торфосировину зволожують водним розчином сульфату натрію (Na2SО4 х10 H2O) в кількості 0,3% діючої речовини з додаванням 0,9-1,1% меляси від ваги торфосировини, доводячи вологість висхідної маси до 60%, і ретельно перемішують. 3. Підготовану до інкубування торфосировину переносять у відповідні резервуари, в яких проводять інкубування, закривають їх поліетиленовою плівкою, щоб уникнути випаровування і не допускати до різкого зменшення вологості у торф'яній масі, поміщають у термостат (нами було використано термостат "Флора"), виставляють температурний режим на рівні 27°С. 4. Інкубування при температурі 27°С здійснюють протягом трьох діб, при цьому компоненти періодично ретельно перемішують. 5. Готовий біосубстрат перевіряють на наявність біологічно активних речовин: вітамінів групи В (В1, B2, В6 , В12), амінокислот, ВЖК визначають кількість мікроорганізмів (число мікробних клітин), вміст SH-груп за загально прийнятими методиками, фасують і зберігають до реалізації. Ефективність заявленого способу і його переваги перед прототипом і розрахунок граничних норм додатково внесеного компоненту - меляси, підтверджені прикладами конкретного виконання способу. Приклад 1. В умовах лабораторії Науково-дослідного інституту фізіологічних основ підвищення продуктивності сільськогосподарських тварин Львівської державної академії ветеринарної медицини ім. С.З. Гжицького було виготовлено три партії субстрату на основі торфу за схемою, наведеною у таблиці 1. І партія - контроль - перед інкубуванням була зволожена лише водою, II партія - прототип - перед інкубуванням була зволожена розчином сульфату натрію у кількості 0,3% від загальної маси торфосировини в партії, III, IV, V партії - дослідні - після зволоження розчином сульфату натрію в кількості 0,3% від загальної маси сировини в усіх дослідних партіях в кожну з них додавалася меляса в різних кількостях: в ІІІ-ю (мінімальна) - 0,5%, в IV-y (середня) - 1,0%, в V-y (максимальна) - 1,5% від кількості торфосировини в партії. Вологість торфосировини в усі х партіях торфосировини доводили до 60%. Усі партії торфосировини, які виготовляли, переносили у відповідні резервуари, поміщали у термостат і утримували: контрольні партії і прототип - при температурі 25°С, дослідні партії - при температурі 27°С протягом трьох діб, періодично ретельно перемішуючи. Вологість торфосировини в усі х партіях тор фосировини доводили до 60%. Таблиця 1 Схема виготовлення біологічно активного середовища № Елементи виготовлення п/п 1. Торфо-сировина - при вологості, % 2. Зволоження перед інкубуванням до вологості, % - водою в- розчином Na2S04 в %ід маси торфу - з додаванням меляси в % від маси торфу 3. Інкубування при Т°С Тривалість, діб І партія контроль 40-50 60 X 25 3 II партія прототип 40-50 60 0,3 25 3 Дослідні партії III IV V 40-50 40-50 40-50 60 60 60 0,3 0,3 0,3 0,5 1,0 1,5 27 27 27 3 3 3 У взірцях з усіх виготовлених партій торфсубстрату визначали вміст окремих мікро- та макроелементів, вітамінів В1, В2 , В6 і В 12, амінокислот та органічних кислот (ВЖК), SH-груп, а також кількість мікроорганізмів за загально прийнятими методиками. Результати проведених досліджень наведені в таблицях 2 і 3. Заявлений спосіб забезпечує синтез і нагромадження у складі біосубстрату таких сполук: амінокислот 35,56г/кг, ВЖК-27,73мг%, вітамінів В1-3,14мкг/г, В2-0,624мкг/г, В6-23,64мкг/г, В12-5,98мкг/г, а також SH-груп 0,57мкмоль/г та мікробних клітин - 884,2x103клітин/г натуральної речовини торфу. Таблиця 2 Вміст деяких мікро- та макроелементів та сирого протеїну у торфі, М±m Показники, одиниці виміру Na, г/кг К, г/кг Са, г/кг Fe, мг/кг Сu, мг/кг Zn, мг/кг Мn, мг/кг Co, мг/кг Сирий протеїн, % Вміст елементів, М±m 2,30±0,170 18,00±0,88 10,00±1,026 380,00±2,060 1,20±0,126 18,00±0,406 140,00±3,604 1,90±0,120 8,28±0,238 Як видно з даних, одержаних при визначенні вмісту деяких мікро- та макроелементів у торфі і представлених у таблиці 2, за вмістом цих елементів торф наближується до деяких кормових засобів. Відомо, що значна частина мінеральних компонентів знаходиться у недоступній для мікроорганізмів формі. Проте, в результаті активування мікробних процесів ці елементи переходять у рухому форму і можуть використовуватись мікроорганізмами для синтезу різних сполук. Так, присутність кобальту в торфі дає можливість мікроорганізмам використовувати його у синтезі вітаміну В12. З даних таблиці 3 видно, що найбільше вітамінів групи В (В1, В2, В6, В12), амінокислот, ВЖК, мікробних клітин, SH-груп міститься у торфі, який інкубували з суль фатом натрію та мелясою при температурі 27°С. При цьому відмічено збільшення як етерифікованих, так і неетерифікованих ВЖК, а також насичених і ненасичених, причому вміст ненасичених ВЖК зростає у більшій мірі, ніж насичених. Таблиця 3 Якість біосубстрату на основі торфу, М±m, n=3 Показники, одиниці виміру Кількість мікробних клітин в торфі, бак/г Вміст SH-груп, мкмоль/г Вміст вітаміну В1, мкг/г Вміст вітаміну В12, мкг/г Вміст вітаміну В2, мгк/г Виготовлені партії І контроль II прототип 3 3 125,3х10 678,5х10 Дослідні IV III 810,2x10 3 884,2x10 3 V 780,3 х 103 0,30±1,085 0,43±0,189 0,52±0,256 0,57±0,235* 0,56±0,221 1,30±0,22 1,98±0,16 2,44±3,27 3,14±3,16 2,54±2,06 2,56±0,60 4,59±0,39 5,50±0,42 5,98±3,31* 5,60 ±2,17 0,503±0,223 0,563±0,159 0,587±0,017 0,624±0,034 0,608±0,024 Вміст вітаміну В6, мкг/г Вміст амінокислот, мг/г Вміст ВЖК, мг%, в т.ч. Етерифіковані - насичені - ненасичені Неетерифіковані - насичені - ненасичені 20,410±0,430 21,65±0,350 22,01±0,480 23,64±0,410* 22,9±4,16* 22,69±0,22 25,17±0,44 32,01±1,56 35,56±3,57 34,62±3,35 19,19±0,54 23,08±0,48 25,86±2,87 27,73±2,97 26,56±2,17 10,47±0,18 5,06±0,22 5,41±0,43 8,72±0,48 4,56±0,12 4,16±0,80 11,32±0,67 5,50±0,44 5,82±0,66 12,76±0,84 5,90±0,93 6,86±0,68 12,81±0,75 6,70±0,15 6,11±0,58 13,05±0,44 6,10±0,46 6,95±0,33 13,90±0,75 6,78±0,15 7,12±0,58 13,83±0,44 6,15±0,46 7,68±0,33 13,62±0,75 6,98±0,15 6,64±0,58 12,94±0,44 6,24±0,46 6,70±0,33 *Р>0,05 Отже, заявлений спосіб одержання біологічно активних речовин методом стимулювання мікробіологічних процесів у торфі забезпечує збільшення вмісту вітамінів В1, В2 , В 6 і В12, амінокислот, вищи х жирних кислот (насичених і ненасичених), вмісту SH-груп, а також мікробної біомаси шляхом активування торфу за допомогою зволоження та інкубування зі сульфатом натрію та мелясою протягом трьох діб при температурі 27°С.