Застосування 4,4′-біс[2-(діетиламіно)етокси]дифенілу та 4,4′-біс[2-(діетиламіно)етокси]дифеніл-2-карбонової кислоти метилового естеру як інтерфероніндукуючих противірусних агентів

Застосування 4,4'-біс-[2(діетиламіно)етокси]дифенілу та 4,4'-біс-[2(діетиламіно)етокси]дифеніл-2-карбонової кислоти метилового естеру загальної формули: Винахід відноситься до медичної хімії й може бути використаним для створення нових противірусних засобів. Підсилення імунного статусу та пошук нових противірусних препаратів все ще становить актуальну проблему із зв'язку з поширенням імунодефіцитів різної етіології, появою штамів вірусів, стійких до відомих препаратів та виникненню нових видів вірусів. Найбільш ефективним шляхом є стимулювання синтезу ендогенного інтерферону. Пошук ефективних індукторів інтерферону та противірусних агентів інтенсивно проводиться вже багато років, але дотепер неподоланими залишаються такі недоліки цих препаратів як гіпореактивність [Stringfellow D.A. Production of the interferon protein: hyporesponsiveness // Tex. Rep. Biol. Med. 1977. - Vol. 35. - P. 126-131], недостатня ефективність [Шмельков Ю.Б., Григорян С.С, Чижов Н.П., Оспельникова Т.П., Змызгова А.В., Антонова Л.В., Головкин В.И. Результаты клинического изучения амиксина // II Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» (Москва, 10-15 апр. 1995 г.). Москва - 1995. - С. 193-194.], наявність противірусної дії у вузькому діапазоні концентрацій та/або при великих концентраціях та токсичність [Weiss J.N., Ochs A.L., Abedi S., Selhorst J.B. Retinopathy after tilorone hydrochloride // Am J Ophthalmol. - 1980. - Vol. 90, №6. - 846-853]. Найближчим аналогом винаходу, що заявляється, виходячи з біологічної активності та структури, є аміксин - противірусний препарат та індуктор інтерферону, здебільшого a- та b-типу [Андронати С.А., Литвинова Л.А., Головенко Н.Я. Пероральный индуктор интерферона "Амиксин" и его аналоги // Журн. АМН Украины. - 1999. - Т. 5, №1. - С. 53-66.]. Перелічені вище недоліки індукторів інтерферону повною мірою притаманні й аміксину, біологічна активність якого приписується наявності в його структурі планарної структури та двох основних бокових ланцюгів [Burke H.M., Joullie M.M. New synthetic routes to tilorone dihydrochloride and some of its analogues. // J. Med. Chem. 1978. - Vol. 21, №10. - P. 1084-1086]. Аміксин одержують аміноетилюванням 2,7діоксифлуоренону дією діетиламіноетилхлориду при температурі 85-100°С у суміші толуолу з концентрованим розчином гідроксиду калію у присутності каталізатору міжфазного переносу. Цей метод, який добре себе зарекомендував для синтезу похідних 2,7-діоксифлуоренону [Литвинова Л.А., R N O O N CH3 H3C H3C CH3 (19) UA (11) 87254 (13) C2 , де R=Н, СООСН3, як інтерфероніндукуючих противірусних агентів. 3 87254 4 Андронати С.А., Лемпарт Г.В., Димитрищук Г.В., пературі інтенсивно перемішують суміш 1.86г (0. Денисенко Р.В., Беленькая И.А., Ясинская О.Г., 01моль) 4,4'-дигідроксидифенілу, 10.3г (0.06моль) Иванова В.В. 3,6-Дизамещенные флуореноны-9 и гідрохлорид діетиламіноетилхлориду, 15см3 насиих противовирусная активность // Хим.-фарм. ченого розчину карбонату калію та 15см3 хлорожурн. - 1983. - Т. 17, №10. - С.1177-1180, Редер форму протягом 8 годин. Органічний шар відокреА.С., Яндронаті С.А., Варава Т.А., Єрко O.K., Литмлюють, промивають 1%-им розчином карбонату винова Л.О., Лук'яненко М.Г., Мальцев Г.В. Спосіб калію (3 ´ 5см3), водою (3 ´ 5см3) та випарюють у одержання 2,7-біс-[2вакуумі. Залишок кип'ятять 10хв у воді, охолоджу(діетиламіно)етокси]флуоренона-9 дігідрохлориду ють, воду декантують з олієподібного залишку, // Патент України на винахід №41432 МПК7 який розчиняють у 15см3 бензолу. Розчин висушуС07С225/18, С07С221/00,17.09.2001]. ють сульфатом, магнію, упарюють досуха, залиНедоліками цього методу є: шок перекристалізовують з гексану. Вихід 3.2г - застосування легкозаймистих органічних (70%). C24H36N2O2; М. W. 384. 57. Тпл. 48-49°С. розчинників; Мас-спектр - m/z (I, %): 384 (7) - М+; 298 (5); 212 - використання основ чутливих до вологи й ву(27); 184 (90); 86 (100). глекислого газу, що міститься у повітрі; Приклад 2 - застосування каталізаторів, відділення яких Синтез 4,4'-Біс-[2від продуктів реакції вимагає, найчастіше, додат(діетиламіно)етокси]дифеніл-2-карбонової кислоти кові витрати праці. метилового естеру. Синтез. проводили як описано Задачею винаходу є пошук нових інтерфероу прикладі 1, виходячи із 1.8г (0.00737моль) 4,4'ніндукуючих противірусних препаратів. дигідроксидифеніл-2-карбонової кислоти. Вихід Поставлена задача вирішена застосуванням 1.94г (60%). C26H38N2O4; М. W. 442. 60. Тпл. 2484,4'-Біс-[2-(діетиламіно)етокси]дифеніл та 4,4'-біс249°С (гидрохлорид). Мас-спектр - m/z (I, %): 442 [2-(діетиламіно)етокси] дифеніл-2-карбонової кис(3) - М+; 411 (3); 384 (3); 356 (11); 298 (2); 270 (22); лоти метилового естеру загальної формули: 242 (95); 182 (85); 86 (100). Приклад 3 Визначення цитотоксичності препаратів в умовах in vitro клітин за дією на моношар клітин та пригніченням їх життєздатності. Перещеплювану культуру клітин фібробластів свиней - перевивних тестикул поросяти (ПТП) вирощували у 96-лункових мікроплатах (в атмосде R=Н, СООСН3 фері, що містить 5% СО2). Через 24 год. з лунок, як інтерфероніндукуючих противірусних агенде сформувався суцільний моношар клітин видатів. ляли середовище росту і вносили підтримуюче Сполуки, що заявляються, проявляють вирасередовище та розчинені препарати в діапазоні жену здатність інгібувати вірусну репродукцію при концентрацій від 5 до 500мкг/см3 (на одне розвенизькій токсичності та індукувати інтерферон. дення не менше 4 лунок). Контроль - лунки, в які Причинно-наслідковий зв'язок між структурою було внесене тільки середовище для підтримання об'єктів, що заявляються, і їхньою біологічною діросту. Плати поміщали в термостат. Через 24 та єю полягає, очевидно, у здатності сполук 1, 2 до 48 год після інкубації плат при 36°С в умовах 5% взаємодії з нуклеїновими кислотами, що призвоСО2 клітини проглядали за допомогою інверсійнодить до інгібування вірус-специфічних нуклеаз, го мікроскопу при малому збільшенні з метою видля сполуки 1 додатковим механізмом може бути явлення цитопатичної дії (ЦПД) препаратів, яку дерепресія генів інтерферону та їх транскрипції з оцінювали за порушенням цілісності моношару, наступним синтезом інтерферону, здатним надапоявою осередків дегенерованих клітин та визнавати клітинам противірусний стан. чали за чотирьохплюсовою системою. Визначали: Первинне дослідження сполук 1 та 2 проводиТЦД100 - тканинну цитотоксичну дозу (мкг/см3), що ли за схемою та при умовах, що враховували адевикликає повну деструкцію клітин, ТЦД50 - тканинкватність тест-моделі можливому механізму інну цитотоксичну дозу (мкг/см3), що викликає зміну терфероногенної активності, що передбачався на 50% моношару клітин; МВК - максимально витрипідставі аналізу структури хімічної сполуки, яка мувану концентрацію - максимальну із досліджевивчалась [Вильнер Л.М. Актуальные вопросы них доз речовини (мкг/см3), що не викликає незвоскрининга и последующего изучения противовиротніх змін у морфології та життєздатності клітин у русных препаратов типа интерфероногенов/ В сб.: порівнянні з контролем (фактично вона відповідає Методические вопросы научной разработки проТЦД0). тивовирусных средств. - Минск, 1977. - С. 134Розрахунок ТЦД50 проводили за методом Ріда 136]. Цитотоксичність та інтерфероніндукуючу акі Менча за формулами: тивність синтезованих сполук вивчали як описано log2 ТЦЦ50 = Iog2 A - (50 - b) log2d / (а - b) чи [Доклінічні дослідження лікарських засобів. Метоlog2 ТЦД50 = log2 В + (a - 50) log2d / (a - b), дичні рекомендації / За ред. чл.-кор. АМН України де log2 А і Iog2 В - логарифми концентрацій за О.В. Стефанова. - К: МОЗ, України. ДФЦ, 2001. основою 2, що викликали ефекти відповідно біль392 с.]. ше чи менше 50%, але найближчі до 50%: а і b Приклад 1 ефект, викликаний концентраціями А і В, %: log2d Синтез 4,4'-Біс[2логарифм за основою 2 співвідношення між дослі(діетиламіно)етокси]дифеніла. При кімнатній темджуваними концентраціями. 5 87254 6 Другим параметром, за яким оцінювали токсиметоду скринінгу антивірусних сполук [Первичное чність доз препаратів було пригнічення їх життєизучение антивирусных свойств синтетических и здатності [Методы испытания и оценки противовиприродных соединений: Метод, рекомендации / русной активности химических соединений в Вотяков В.И., Бореко Е.И., Владыко Г.В. и др. отношении вируса гриппа. Методические указаМинск. - 1986.]. ния. Сост. проф. В.И. Ильенко. - Л. - 1977. - 35 с]. В 96-лункові пластикові панелі вносили суПідрахунок клітин та визначення їх життєздатності спензію клітин в концентрації, необхідній для фочерез 24 та 48 годин інкубації проводили після рмування суцільного шару клітин. На 2-3-й день (в фарбування клітин водним розчином вітального залежності від активності росту культури) середофарбника трипанового синього. При відсутності вище зливали, моношар промивали середовищем токсичного ефекту клітини засвоювали вітальний для культур клітин без сироватки і вносили дослібарвник. Забарвлення контрольних культур приджувані препарати в серійних розведеннях в верймали за 100%. Розведення препарату, що виклитикальних рядах. На кожне розведення відводили кало засвоєння фарбника на 50% вважали токсич3 лунки для визначення антивірусної активності, ним. одну - для контролю токсичності. Враховували Приклад 4 також контроль клітин та вірусу. Клітини інкубуваВивчення інтерфероніндукуючих властивосли з препаратами 24 год при 37°С, після чого сетей. редовище вилучали з лунок. В лунки для визнаІнтерфероніндукуючу активність синтезованих чення контролю клітин та токсичності вносили сполук вивчали як описано [Доклінічні дослідження середовище для підтримання росту клітин, у всі лікарських засобів. Методичні рекомендації. За решта - вірусну суспензію ВВС. Для визначення редакцією член-кореспондента АМН України О.В. ефективності захисту клітин проводили досліди із Стефанова. / Міністерство охорони здоров'я Укразастосуванням ВВС в різних дозах: 10,100, 1000 їни. Державний фармакологічний центр, Київ, ЦТД50. 2001, С. 392]. Мікропанелі інкубували в термостаті з постійІнтерфероніндукуючу активність препаратів в ним рівнем СО2 при 37°С та вологості 98% до наумовах in vitro вивчали в культурі клітин ПТП. Престання 100% цитопатичного ефекту (ЦПЕ) в лунпарати в різних дозах (30-250мкг/см3) додавали до ках контролю вірусу. Потім визначали ступінь сформованого моношару клітин і культивували інгібування вірусоспецифічного ЦПЕ. Аналіз припри 37°С на протязі 24 та 48 год, після чого надогнічення вірусної реплікації проводили через 24 садову рідину збирали і в ній визначали активність год. Антивірусну активність препаратів оцінювали інтерферону за раніше опублікованою методикою за цитопатичним ефектом в формі некрозу (визна[Доклінічні дослідження лікарських засобів. Меточення проценту клітин, що загинули за допомогою дичні рекомендації. За редакцією членпрямого підрахунку під мікроскопом). кореспондента АМН України О.В. Стефанова / Визначали: ІД100 - дозу препарату (мкг/мл), що Міністерство охорони здоров'я України. Державний повністю інгібує розвиток вірусспецифічного ЦПЕ; фармакологічний центр. Київ, 2001. С. 392] (приІД50 - дозу (мкг/мл), що затримує ЦПЕ вірусу на гнічення цитопатогенної дії вірусу везикулярного 50%. стоматиту). Основна характеристика речовини з противіВизначення активності інтерферону здійснюрусною дією як можливого лікувального чи діагновали через 24-48 год., коли доза внесеного вірусу стичного засобу - ширина інтервалу між пороговивезикулярного стоматиту (ВВС) 100 ТЦД50 виклими токсичною та специфічно активними дозами. кає повну дегенерацію клітин у контролі вірусу Вона являє собою відношення ТЦД50 до ІД50 чи ХТІ (KB) за відсутністю дегенерації у неінфікованій - хіміотерапевтичний індекс - відношення між МВК культурі. (величину МВК визначали, досліджуючи токсичЗа титр інтерферону в одиницях дії (ОД) приність препаратів-інтерфероногенів) і МАК (мінімаймали величину, зворотну розведенню препарату, льною активною концентрацією), за яку приймали при якому культура клітин в 50% лунок була повнівеличину ІД50 (визначається найбільш точно). стю захищена від цитопатогенної дії індикаторного Хіміотерапевтичний індекс визначали за форвірусу. мулою: ХТІ = МВК / ІД50. Титр індукованого інтерферону (максимальне ХТІ, що складав 8 і більше, свідчив про ефекрозведення супернатанту, при якому в 50% лунок тивність препарату щодо досліджуваних вірусів цілком запобігалася дегенерація клітинного моно[Кремерман Н.Б., Приймяги Л.С, Ершов Ф.И. Эксшару) визначали в трьох паралельних експеримепериментальное изучение интерфероногенной и нтах. противовирусной активности некоторых биологиВиявлено, що в умовах in vitro досліджені речески активных веществ // Вопр. вирусол. - 1984. човини спричиняють утворення інтерферону. Т. 29, №5. - С. 549-552]. Приклад 5 Дані про цитотоксичність (МВК, мкг/мл), протиВивчення противірусної активності сполук, що вірусну (ІД50) та інтерфероніндукуючу (ТІФН) актизаявляються. вність сполук 1 та 2 у порівнянні з аміксином навеВплив сполук на противірусну резистентність дені в таблиці. культур клітин ПТП вивчали за допомогою мікро 7 87254 8 Таблиця Сполука МВК, мкг/мл ІД50 ХТІ Аміксин 1 2 50 500 1500 6-0.7 3-0.7 100-1.5 71 333 100 ІФН-індукуюча активність ТІФН С, мкг/см3 32 25 20 50 2-6 12.5 Підписне Тираж 28 прим. Комп’ютерна верстка А. Крулевський Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601