Бензольні сполуки, що містять замісники

Реферат: Даний винахід стосується бензольних сполук, що містять замісники. Даний винахід також стосується фармацевтичних композицій, що містять дані сполуки, та способів лікування раку шляхом введення даних сполук та фармацевтичних композицій суб'єктам, які потребують цього. Даний винахід також стосується застосування таких сполук для досліджень або інших нетерапевтичних цілей. UA 115074 C2 (12) UA 115074 C2 UA 115074 C2 5 10 СПОРІДНЕНІ ЗАЯВКИ Ця заявка претендує на пріоритет та переваги на підставі попередньої заявки США №61/714140, поданої 15 жовтня 2012 року, №61/714145, поданої 15 жовтня 2012 року, №61/780703, поданої 13 березня 2013 року, та №61/786277, поданої 14 березня 2013 року. Повний зміст кожної з даних попередніх заявок включений в даний документ шляхом посилання. РІВЕНЬ ТЕХНІКИ Зараз існує необхідність в розробці нових агентів як інгібіторів активності EZH2, які можна застосовувати для лікування EZH2-опосередковуваного порушення (наприклад, раку). СТИСЛИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Один з аспектів даного винаходу стосується бензольної сполуки, що містить замісники, вибраної з , та їх фармацевтично прийнятних солей. 15 , Наприклад, вказана сполука є прийнятною сіллю. або його фармацевтично Наприклад, сполука є . 1 UA 115074 C2 Наприклад, сполука прийнятною сіллю. є або Наприклад, сполука є 5 10 його фармацевтично . Наприклад, сполука є сіллю. або його фармацевтично прийнятною Наприклад, сполука є . Згідно з даним винаходом також запропоновані фармацевтичні композиції, що містять один чи декілька фармацевтично прийнятних носіїв та одну чи декілька сполук, описаних в даному документі. Інший аспект даного винаходу є способом лікування або запобігання EZH2опосередковуваного порушення. Вказаний спосіб включає введення суб’єкту, що потребує цього, терапевтично ефективної кількості однієї чи декількох сполук, описаних в даному документі. EZH2-опосередковуване порушення є захворюванням, порушенням або станом, які 2 UA 115074 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 принаймні почасти опосередковуються активністю EZH2. В одному з вариантів реалізації EZH2опосередковуване порушення пов’язане з підвищеною активністю EZH2. В одному з варіантів реалізації EZH2-опосередковуване порушення є раком. EZH2-опосередковуваний рак може бути лімфомою, лейкозом або меланомою, наприклад, дифузною великоклітинною В-клітинною лімфомою (ДВВЛ), неходжкінською лімфомою (НХЛ), фолікулярною лімфомою, хронічним мієлогенним лейкозом (ХМЛ), гострим мієлоїдним лейкозом, гострим лімфоцитарним лейкозом, недиференційованим лейкозом або мієлодиспластичними синдромами (МДС). В одному з варіантів реалізації EZH2-опосередковуваний рак може бути злоякісною рабдоїдною пухлиною або пухлиною з дефіцитом INI1. Гістологічний діагноз злоякісної рабдоїдної пухлини залежить від ідентифікації характерних рабдоїдних клітин (великі клітини з ексцентрично розташованими ядрами та великою кількістю еозинофільної цитоплазми) та імуногістохімії з антитілами до віментину, кератину та епітеліального мембранного антигену. В більшості злоякісних рабдоїдних пухлин ген SMARCB1/INI1, розташований в сегменті хромосоми 22q11.2, інактивований внаслідок делецій та/або мутацій. В одному з варіантів реалізації злоякісні рабдоїдні пухлини можуть бути пухлиною з дефіцитом INI1. Якщо не вказане інше, будь-який опис способу лікування включає застосування сполук для забезпечення такого лікування або профілактики, как вказано в даному описі, а також застосування сполук для одержання лікарського засобу для лікування або запобігання такого стану. Вказане лікування включає лікування тварин, які є людиною або не є людиною, включаючи гризунів, та інших моделей захворювань. Більш того, сполуки або способи, описані в даному документі, можна застосовувати для досліджень (наприклад, досліджень епігенетичних ферментів) та для інших нетерапевтичних цілей. В деяких варіантах реалізації кращі сполуки, описані в даному документі, мають бажані фармакологічні та/або фармакокінетичні властивості, наприклад, мають низькі швидкості кліренсу та/або обмежений ризик небажаних взаємодій лікарських засобів в комбінованій терапії, оцінюваний, наприклад, за залежним від часу та оборотним інгібуванням ферментів системи цитохрому P-450. Якщо не визначено інше, усі технічні та наукові терміни, використовувані в даному описі, мають такі значення, які звичайно зрозумілі фахівцю в галузі техніки, до якої належить даний винахід. В даному описі форми однини також включають множину объектів, якщо в контексті явно не вказано інше. Назважаючи на те, щопри практичному застосуванні або тестуванні даного винаходу можна використовувати способи та речовини, аналогічні або еквівалентні описаним в даному документі, нижче описані придатні способи та речовини. Зміст усіх публікацій, заявок на патент, патентів та інших джерел, згаданих в даному документі, включений шляхом посилання. Джерела, вказані в даному описі, не вважаються рівнем техніки по відношенню до винаходу, що заявляється. У випадку протиріччя даний опис, включаючи визначення, буде мати переважну силу. Крім того, речовини, способи та приклади наведені лише як ілюстрації та не є обмежуючими. У випадку протиріч між хімічними структурами та назвами сполук, описаних в даному документі, хімічні структури будуть мати переважну силу. Інші ознаки та переваги даного винаходу будуть очевидні виходячи з наведеного далі детального опису та формули винаходу. КОРОТКИЙ ОПИС ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ Фіг.1 є графіком, що демонструє протипухлинну дію перорально введеної сполуки 1 або сполуки А по відношенню до ксенотрансплантата лімфоми KARPAS-422 у мишей. Дані представлені як середнє значення ± SD (n = 10). Фіг.2 є графіком, що демонструє вплив сполуки 1 або сполуки А на масу тіла миші. Дані представлені як середнє значення ± SD (n = 10). Фіг.3 є графіком, що демонструє концентрацію сполуки 1 в пухлині на 7 день або 28 день після лікування або концентрацію сполуки А в пухлині на 7 день після лікування. На даній фигурі «А» - «G» позначають 7 днів після введення сполуки 1 в дозах, що складають 62,5, 83,3, 125, 166,7, 250, 333,3 та 500 мг/кг, відповідно; «Н» та «I» позначають 7 днів після введення сполуки А в дозах, що складають 125 та 250 мг/кг, відповідно; і «J» - «L» позначають 28 днів після введення сполуки 1 в дозах, що складають 62,5, 125 та 250 мг/кг, відповідно. Фіг.4 є графіком, що демонструє концентрацію сполуки 1 або сполуки А в плазмі крові на 7 день або 28 день після лікування. Верхня пунктирна лінія показує найменшу цитотоксичну концентрацію (LCC) сполуки А з поправкою на зв’язування з білками плазми крові (PPB), а нижня пунктирна лінія показує LCC сполуки 1 з поправкою на PPB. Фіг.5 є графіком, що демонструє глобальне метилування H3K27me3 в пухлинах KARPAS422 у мишей, яких лікували сполукою 1 або сполукою А протягом 7 днів. На даній фигурі «А» 3 UA 115074 C2 5 10 15 20 позначає лікування носієм; «В» - «Н» позначають лікування сполукою 1 в дозах, що складають 62,5, 83,3, 125, 166,7, 250, 333,3 та 500 мг/кг, відповідно; і «I» та «J» позначають лікування сполукою А в дозах, що складають 125 та 250 мг/кг, відповідно. Фіг.6 є графіком, що демонструє глобальне метилування H3K27me3 в пухлинах KARPAS422 у мишей, яких лікували сполукою 1 протягом 28 днів. Фіг.7 є графіком, що демонструє глобальне метилування H3K27me3 в кістковому мозку мишей з ксенотрансплантатними пухлинами KARPAS-422, яких лікували сполукою 1 або сполукою А протягом 7 днів. На даній фигурі «А» позначає лікування носієм; «В» - «Н» позначають лікування сполукою 1 в дозах, що складають 62,5, 83,3, 125, 166,7, 250, 333,3 та 500 мг/кг, відповідно; і «I» та «J» позначають лікування сполукою А в дозах, що складають 125 та 250 мг/кг, відповідно. Фіг.8 є графіком, що демонструє глобальне метилування H3K27me3 в кістковому мозку мишей з ксенотрансплантатними пухлинами KARPAS-422, яких лікували сполукою 1 протягом 28 днів. На даній фигурі «А» позначає лікування носієм; «В» - «Е» позначають лікування сполукою 1 в дозах, що складають 62,5, 125, 250 та 500 мг/кг, відповідно; і «F» позначає лікування сполукою А в дозі, що складає 250 мг/кг. ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Згідно з даним винаходом запропоновані нові бензольні сполуки, що містять замісники, способи синтезу для одержання вказаних сполук, що містять їх фармацевтичні композиції та різні способи застосування вказаних сполук. Типові сполуки згідно з даним винаходом включають сполуки, перелічені в таблиці 1. Таблиця 1 № сполуки Структура 1 2 4 UA 115074 C2 Таблиця 1 № сполуки Структура 105 5 10 15 20 25 30 35 40 45 В даному описі структурна формула сполуки в деяких випадках для зручності зображує певний ізомер, але даний винахід може включати усі ізомери, такі як геометричні ізомери, оптичні ізомери на основі асиметричного атома вуглецю, стереоізомери, таутомери, енантіомери, ротамери, діастереомери, рацемати тощо, при цьому зрозуміло, що не усі ізомери можуть мати однаковий рівень активності. Крім того, для сполук, представлених формулою, може бути характерним кристалічний поліморфізм. Слід відзначити, що будь-яка кристалічна форма, суміш кристалічних форм або її ангідрид чи гідрат входять до обсягу даного винаходу. Термін «ізомерія» означає сполуки, які мають однакові молекулярні формули, але відрізняються послідовністю зв’язування атомів або розташуванням атомів у просторі. Ізомері, які відрізняються розташуванням атомів в просторі, називаються «стереоізомерами». Стереоізомері, які не є дзеркальними відображеннями одна одної, називаються «діастереоізомерами», і стереоізомері, які є ненакладними дзеркальними відображеннями одна одної, називаються «енантіомерами» або інколи оптичними ізомерами. Суміш, що містить рівні кількості окремих енантіомерних форм з протилежною хіральністю, називається «рацемічною сумішшю». Термін «геометричний ізомер» означає діастереомери, існування яких обумовлено ускладненим обертанням навколо подвійних зв’язків або циклоалкільного лінкера (наприклад, 1,3-циклобутил). Дані конфигурації відрізняються в назвах приставками «цис» та «транс», або Z та Е, які вказуть на те, що групи перебувають з одного боку або з різних боків від подвійного зв’язку в молекулі згідно з правилами Кана-Інгольда-Прелога (Cahn-Ingold-Prelog). Слід розуміти, що сполуки згідно з даним винаходом можуть бути зображені у вигляді стереоізомерів. Слід також розуміти, що, коли сполуки мають стереоізомерні форми, усі стереоізомерні форми входять до обсягу даного винаходу, при цьому зрозуміло, що не усі стереоізомері можуть мати однаковий рівень активності. Крім того, структури та інші сполуки, що розглядаються в даному винаході, включають усі їх атропоізомері, при цьому зрозуміло, що не усі атропоізомері можуть мати однаковий рівень активності. «Атропоізомері» є типом стереоізомера, в якому атоми двох ізомерів по-різному розташовані в просторі. Існування атропоізомерів обумовлено обмеженим обертанням, викликаним ускладненням обертання великих груп навколо центрального зв’язку. Такі атропоізомері, як правило, існують у вигляді суміші, однак завдяки останнім досягненням в галузі методів хроматографії в окремих випадках стало можливим розділення сумішей двох атропоізомерів. «Таутомер» є одним з двох чи декількох структурних ізомерів, які існують у рівновазі, та легко перетворюється з однієї ізомерної форми на іншу. Дане перетворення приводить до формального перенесення атома водню, яке супроводжується переходом сусідніх спряжених подвійних зв’язків. Таутомери існують у вигляді суміші набору таутомерів в розчині. В розчинах, де можлива таутомеризація, буде досягатися хімічна рівновага таутомерів. Точне співвідношення таутомерів залежить від декількох факторів, включаючи температуру, розчинник та рН. Поняття таутомерів, які є взаємоперетворюваними в результаті таутомеризації, називається таутомерією. З різних можливих типів таутомерії звичайно спостерігають два. У випадку кето-енольної таутомерії відбувається одночасний зсув електронів та атома водню. Кільчасто-ланцюгова таутомерія є результатом реакції альдегідної групи (-CHO) в ланцюговій молекулі цукру з однією з гідроксильних груп (-OH) в тій самій молекулі з утворенням циклічної (кільцевої) форми, 5 UA 115074 C2 демонстрованої глюкозою. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 В даному описі будь-який випадок слід розглядати як . Звичайними таутомерними парами є: кетон-енол, амід-нітрил, лактам-лактим, таутомерія амід-імідокислота в гетероциклічних кільцях (наприклад, в нуклеотидних основах, таких як гуанін, тимін та цитозин), імін-енамін та енамін-енамін. Прикладом кето-енольної рівноваги є рівновага між піридин-2(1Н)-онами та відповідними піридин-2-олами, як показано нижче. . Слід розуміти, що сполуки згідно з даним винаходом можуть бути зображені у вигляді різних таутомерів. Слід також розуміти, що, коли сполуки мають таутомерні форми, усі таутомерні форми входять до обсягу даного винаходу, та назва сполук не виключає будь-яку таутомерну форму. Очевидно, що деякі таутомери можуть мати більш високий рівень активності, ніж інші. Термін «кристалічні поліморфи», «поліморфи» або «кристалічні форми» означає кристалічні структури, в які сполука (или її сіль чи сольват) може кристалізуватися з різною кристалічною упаковкою при одному й тому самому елементному складі. Різні кристалічні форми звичайно мають різні рентгенівські дифрактограми, інфрачервоні спектри, температури плавлення, густину, твердість, форму кристалів, оптичні та електричні властивості, стабільність та розчинність. Розчинник для перекристалізації, швидкість кристалізації, температура зберігання та інші фактори можуть викликати переважання однієї кристалічної форми. Кристалічні поліморфи сполук можуть бути одержані шляхом кристалізації в різних умовах. Сполуки згідно з даним винаходом включають власне сполуки, такі як сполуки будь-якої з формул, описаних в даному документі. Сполуки згідно з даним винаходом можуть також включати їх солі та їх сольвати при необхідності. Сіль, наприклад, може бути утворена між аніоном та позитивно зарядженою групою (наприклад, аміно) в бензольній сполуці, що містить замісники. Придатні аніони включають хлорид, бромід, йодид, сульфат, бісульфат, сульфамат, нітрат, фосфат, цитрат, метансульфонат, трифторацетат, глутамат, глюкуронат, глутарат, малат, малеат, сукцинат, фумарат, тартрат, тозилат, саліцилат, лактат, нафталінсульфонат та ацетат (наприклад, трифторацетат). Термін «фармацевтично прийнятний аніон» стосується аніона, придатного для утворення фармацевтично прийнятної солі. Крім того, сіль також може бути утворена між катіоном та негативно зарядженою групою (наприклад, карбоксилатом) в бензольній сполуці, що містить замісники. Придатні катіони включають іон натрію, іон калію, іон магнію, іон кальцію та катіон амонію, такий як іон тетраметиламонію. Бензольні сполуки, що містять замісники, також включають солі, що містять четвертинні атоми азоту. Крім того, сполуки згідно з даним винаходом, наприклад, солі вказаних сполук, можуть існувати чи то в гідратованій, чи то в негідратованій (безводній) формі, чи то у вигляді сольватів з молекулами іншого розчинника. Необмежуючі приклади гідратів включають моногідрати, дигідрати і т.д. Необмежуючі приклади сольватів включають етанольні сольвати, ацетонові сольвати і т.д. Термін «сольват» означає форми приєднання розчинника, які містять чи то стехіометричні, чи то нестехіометричні кількості розчинника. Деякі сполуки схильні утримувати фіксоване молярне співвідношення молекул розчинника в твердому кристалічному стані, таким чином утворюючи сольват. Якщо розчинником є вода, то утворюваний сольват є гідратом; і якщо розчинником є спирт, то утворюваний сольват є алкоголятом. Гідрати утворюються шляхом комбінації однієї чи декількох молекул води з однією молекулою речовини, причому вода зберігає свій молекулярний стан у вигляді Н2О. В даному описі термін «аналог» стосується хімічної сполуки, яка є структурно схожою з іншою сполукою, але дещо відрізняється за складом (як у випадку заміни одного атома атомом іншого елемента або у випадку присутності конкретной функціональної групи, або заміни однієї функціональної групи іншою функціональною групою). Таким чином, аналог є сполукою, схожою або порівнянною за функцією та зовнішнім виглядом, але не по структурі або походженню, з вихідною сполукою. В даному описі термін «похідне» стосується сполук, які мають спільну базову структуру та містять як замісники різні групи, описані в даному документі. Наприклад, усі сполуки в таблиці 1 6 UA 115074 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 є бензольними сполуками, що містять замісники та мають спільну базову основу. Термін «біоізостер» стосується сполуки, яка утворюється в результаті заміни атома або групи атомів іншим схожим в широкому розумінні атомом або групою атомів. Задачею біоізостеричної заміни є одержання нової сполуки, що має біологічні властивості, схожі з вихідною сполукою. Біоізостерична заміна може бути на фізико-хімічній або топологічній основі. Приклади біоізостерів карбонових кислот включають, без обмеження ними, ацилсульфоніміди, тетразоли, сульфонати та фосфонати. Див., наприклад, Patani and LaVoie, Chem. Rev. 96, 31473176, 1996. Даний винахід включає усі ізотопи атомів, що зустрічаються в сполуках згідно з даним винаходом. Ізотопи включають такі атоми, які мають однаквий атомний номер, але різні масові числа. Як загальний приклад та без обмеження, ізотопи водню включають тритій та дейтерій, а ізотопи вуглецю включають С-13 та С-14. Згідно з даним винаходом запропоновані способи синтезу сполук, описаних в даному документі. Згідно з даним винаходом також запропоновані детально розглянуті способи синтезу різних описаних сполук згідно з даним винаходом відповідно до схем, представлених в розділі «Приклади». У всьому даному описі у випадку, коли композиції описані як такі, що мають, включають або містять конкретні компоненти, передбачається, що композиції також складаються або по суті складаються з перелічених компонентів. Так само, у випадку, коли методи або способи описані як такі, що мають, включають або містять конкретні етапи способу, вказані способи також складаються або по суті складаються з перелічених етапів способів. Крім того, слід розуміти, що порядок етапів або порядок виконання певних дій не має значення, якщо даний винахід залишається реалізовним. Більш того, два чи більше етапів або дій можна здійснювати одночасно. Способи синтезу згідно з даним винаходом можуть припускати широкий спектр функціональних груп, тому можна використовувати різні вихідні речовини, що містять замісники. Вказані способи, в цілому, дозволяють одержати бажану кінцеву сполуку в кінці або наприкінці загального способу, хоча в деяких випадках може бути бажаним подальше перетворення сполуки на її фармацевтично прийнятну сіль. Сполуки згідно з даним винаходом можуть бути одержані різними способами з використанням комерційно доступних вихідних речовин, сполук, відомих в літературі, або з легко одержуваних проміжних сполук шляхом використання стандартних способів та процедур синтезу, які чи то відомі фахівцю в даній галузі техніки, чи то будуть очевидні фахівцю в даній галузі техніки у світлі ідей, описаних в даному документі. Стандартні способи та процедури синтезу для одержання органичних молекул і трансформацій та маніпуляцій з функціональними групами можна знайти у відповіднуй науковуй літературі або в стандартних посібниках в даній галузі. Незважаючи на відсутність обмежень будь-яким одним чи декількома джерелами, класичні посібники, такі як Smith, M. B., March, J., March’s Advanced Organic Chemistry: Reactions, th Mechanisms, and Structure, 5 edition, John Wiley & Sons: New York, 2001; Greene, T.W., Wuts, rd P.G. M., Protective Groups in Organic Synthesis, 3 edition, John Wiley & Sons: New York, 1999; R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989); L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994); та L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995), зміст яких включений в даний опис шляхом посилання, є корисними та загальнопризнаними еталонними посібниками з органичного синтезу, відомими фахівцю в даній галузі техніки. Наведений далі опис способів синтезу призначений для ілюстрації, а не для обмеження, загальних процедур одержання сполук згідно з даним винаходом. Для фахівця в даній галузі техніки очевидно, що для деяких груп може бути необхідний захист від умов реакцій шляхом використання захисних груп. Захисні групи можна також використовувати для розрізнення схожих функціональних груп в молекулах. Перелік захисних груп та способи введення та видалення даних груп можна знайти в Greene, T.W., Wuts, P.G. M., rd Protective Groups in Organic Synthesis, 3 edition, John Wiley & Sons: New York, 1999. Кращі захисні групи включають, без обмеження ними: Для гідроксильної групи: TBS, бензил, ТНР, Ac Для карбонових кислот: складний бензиловий ефір, складний метиловий ефір, складний етиловий ефір, складний аліловий ефір Для амінів: Cbz, BOC, DMB Для діолів: Ac (×2) TBS (×2) або для узятих разом - ацетоніди Для тіолів: Ac Для бензимідазолів: SEM, бензил, PMB, DMB 7 UA 115074 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Для альдегідів: діалкілацеталі, такі як диметоксіацеталь або діетилацетил. В схемах реакцій, описаних в даному документі, може бути одержано декілька стереоізомерів. Коли не вказаний конкретній стереоізомер, слід розуміти усі можливі стереоізомері, які можуть бути одержані в результаті реакції. Для фахівця в даній галузі техніки очевидно, що реакції можуть бути оптимізовані для одержання одного кращого ізомеру, або можуть бути розроблені нові схеми для одержання одного ізомеру. Якщо одержують суміші, для розділення ізомерів можуть бути використані такі методи, як препаративна тонкошарова хроматографія, препаративна ВЕРХ, препаративна хіральна ВЕРХ або препаративна надкритична рідинна хроматографія (SFC). В усьому даному описі використовуються такі скорочення, які визначені нижче: Ac ацетил AcOH оцтова кислота водн. водний BID або b.i.d. bis in die (два рази на добу) BOC трет-бутоксикарбоніл Cbz бензилоксикарбоніл CDCl3 дейтерований хлороформ CH2Cl2 дихлорметан ДХМ дихлорметан DMB 2,4-диметоксибензил ДМФА N,N-диметилформамід ДМСО диметилсульфоксид EA або EtOAc етилацетат EDC або EDCI N-(3-диметиламінопропіл)-N'-етилкарбодіімід ESI-електророзпилення, режим визначення негативних іонів ESI+ електророзпилення, режим визначення позитивних іонів EtOH етанол год. години H2O вода HOBt 1-гідроксибензотриазол HCl хлористий водень або хлористоводнева кислота ВЕРХ високоефективна рідинна хроматографія K2CO3 карбонат калію ЖХ/МС або ЖХ-МС рідинна хроматографія-мас-спектрометрія M молярний MeCN ацетонітрил хв. хвилини Na2CO3 карбонат натрію Na2SO4 сульфат натрію NaHCO3 бікарбонат натрію NaHMDs гексаметилдисилазид натрію NaOH гідроксид натрію NaHCO3 бікарбонат натрію Na2SO4 сульфат натрію ЯМР ядерний магнітний резонанс Pd(OH)2 дигідроксид паладію PMB пара-метоксибензил p.o. per os (пероральне введення) ppm частин на мільйон преп. ВЕРХ препаративна високоефективна рідинна хроматографія PYBOP (бензотриазол-1-ілокси)трипіролідинфосфонію гексафторфосфат Кт або КТ кімнатна температура МТБЕ метил-трет-бутиловий ефір ТФОК трифтороцтова кислота ТГФ тетрагідрофуран THP тетрагідропіран Сполуки згідно з даним винаходом можна зручно одержувати різними способами, відомими фахівцю в даній галузі техніки. Сполуки згідно з даним винаходом з будь-якою формулою, описаною в даному документі, можуть бути одержані згідно з процедурами, проілюстрованими в 8 UA 115074 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 наведених нижче прикладах, з комерційно доступних вихідних речовин або вихідних речовин, які можуть бути одержані з використанням процедур, описаних в літературі. Фахівцю в даній галузі техніки слід відзначити, що у випадку послідовностей реакцій та схем синтезу, описаних в даному документі, порядок деяких етапів може бути змінений, наприклад, введення та видалення захисних груп. Сполуки згідно з даним винаходом інгібують гістонметилтрансферазну активність EZH2 або його мутанта і, відповідно, згідно з одним з аспектів даного винаходу, деякі сполуки, описані в даному документі, є кандидатами для лікування або запобігання деяких станів та захворювань, при яких EZH2 відіграє певну роль. Згідно з даним винаходом запропоновані способи лікування станів та захворювань, на перебіг яких можна впливати шляхом модуляції статусу метилування гістонів або інших білків, при цьому вказаний статус метилування опосередковується принаймні почасти активністю EZH2. Модуляція статусу метилування гістонів може в свою чергу впливати на рівень експрессії цільових генів, активованих шляхом метилування, та/або цільових генів, пригнічуваних шляхом метилування. Вказаний спосіб включає введення суб’єкту, що потребує такого лікування, терапевтично ефективної кількості сполуки згідно з даним винаходом або її фармацевтично прийнятної солі, поліморфа, сольвату або стереоізомера. Якщо не вказане інше, будь-якій опис способу лікування включає застосування сполук для забезпечення такого лікування або профілактики, як вказано в даному описі, а також застосування сполук для одержання лікарського засобу для лікування або запобігання такого стану. Вказане лікування включає лікування тварин, що належать до людини або не належать до людей, включаючи гризунів, та інших моделей захворювань. Іншій аспект даного винаходу стосується способу модулювання активності EZH2, каталітичної субодиниці комплексу PRC2, яка каталізує від моно- до триметилування лізину 27 в гістоні Н3 (Н3-K27), у суб’єкта, що потребує цього. Наприклад, вказаний спосіб включає етап введення суб’єкту, хворому на рак, що експресує мутантний EZH2, терапевтично ефективної кількості сполуки, описаної в даному документі, при цьому вказана сполука (сполуки) інгібує гістонметилтрансферазну активність EZH2, здійснюючи тим самим лікування раку. Наприклад, EZH2-опосередковуваній рак вибраний з групи, що складається з фолікулярної лімфоми та дифузної великоклітинної В-клітинної лімфоми (ДВВЛ) підтипу, який є лімфомою з В-клітин гермінативного центра (germinal center B cell-like subtype, GCB). Наприклад, рак є лімфомою, лейкозом або меланомою. Краще, лімфома є неходжкінською лімфомою (НХЛ), фолікулярною лімфомою або дифузною великоклітинною В-клітинною лімфомою. Як альтернатива, лейкоз є хронічним мієлогенним лейкозом (ХМЛ), гострим мієлоїдним лейкозом, гострим лімфоцитарним лейкозом або недиференційованим лейкозом. Наприклад, EZH2-опосередковуваний передраковий стан є мієлодиспластичними синдромами (МДС, раніше відомі як передлейкоз). Наприклад, EZH2-опосередковуваній рак є гематологічною злоякісною пухлиною. Сполука (сполуки) згідно з даним винаходом інгібує гістонметилтрансферазну активність EZH2 або його мутанта і, відповідно, згідно з даним винаходом також запропоновані способи лікування станів та захворювань, на перебіг яких можна впливати шляхом модуляції статусу метилування гістонів або інших білків, при цьому вказаний статус метилування опосередковується принаймні почасти активністю EZH2. Згідно з одним з аспектів даного винаходу деякі сполуки, описані в даному документі, є кандидатами для лікування або запобігання деяких станів та захворювань. Модуляція статусу метилування гістонів може в свою чергу впливати на рівень експрессії цільових генів, активованих шляхом метилування, та/або цільових генів, пригнічуваних шляхом метилування. Вказаний спосіб включає введення суб’єкту, що потребує такого лікування, терапевтично ефективної кількості сполуки згідно з даним винаходом. В даному описі терміни «суб’єкт» та «суб’єкт, що потребує цього», є взаємозамінними та обидва стосуються суб’єкта, хворого на порушення, при якому EZH2-опосередковуване метилування білка відіграє певну роль, або суб’єкта, що зазнає підвищеного ризику розвитку такого порушення порівняно з населенням в цілому. Термін «суб’єкт» включає ссавця. Вказаний ссавець може бути, наприклад, людиною або придатним ссавцем, що не є людиною, таким як примат, миша, щур, собака, кішка, корова, кінь, коза, верблюд, вівця або свиня. Суб’єкт може також бути птахом або домашньою птицею. В одному з варіантів реалізації ссавець є людиною. Суб’єкт, що потребує цього, може бути суб’єктом, у якого раніше був діагностований або визначений рак або передраковий стан. Суб’єкт, що потребує цього, може також бути суб’єктом, що має рак або передраковий стан (наприклад, хворіє). Як альтернатива, суб’єкт, що потребує цього, може бути суб’єктом, що зазнає підвищеного ризику розвитку такого порушення порівняно з населенням в цілому (тобто суб’єкт, схильний до розвитку такого порушення 9 UA 115074 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 порівняно з населенням в цілому). Суб’єкт, що потребує цього, може потерпати від передракового стану. Суб’єкт, що потребує цього, може хворіти раком, що не піддається лікуванню, або резистентним раком (тобто раком, який не відповідає або ще не відповів на лікування). Суб’єкт може бути несприйнятливим на початку лікування або може стати несприйнятливим під час лікування. В деяких варіантах реалізації суб’єкт, що потребує цього, демонструє рецидив раку після ремісії в процесі останньої терапії. В деяких варіантах реалізації суб’єкт, що потребує цього, отримував і на нього не подіяли усі відомі ефективні види терапії для лікування раку. В деяких варіантах реалізації суб’єкт, що потребує цього, отримував принаймні одну попередню терапию. В кращому варіанті реалізації суб’єкт хворіє на рак або раковий стан. Наприклад, рак є лімфомою, лейкозом, меланомою або рабдоміосаркомою. Краще, лімфома є неходжкінською лімфомою, фолікулярною лімфомою або дифузною великоклітинною В-клітинною лімфомою. Як альтернатива, лейкоз є хронічним мієлогенним лейкозом (ХМЛ). Передраковий стан є мієлодиспластичними синдромами (МДС, раніше відомі як передлейкоз). В даному описі термін «лікування» або «лікувати» описує надання допомоги та догляд за пацієнтом з метою боротьби із захворюванням, станом або порушенням, і включає введення сполуки згідно з даним винаходом або її фармацевтично прийнятної солі, поліморфа або сольвату для полегшення симптомів або ускладнень захворювання, стану чи порушення, або для усунення вказаного захворювання, стану чи порушення. Термін «лікувати» може також включати обробку клітини in vitro або лікування моделі у тварини. Сполуку згідно з даним винаходом або її фармацевтично прийнятну сіль, поліморф або сольват можна або також можна застосовувати для запобігання відповідного захворювання, стану чи порушення, або застосовувати для ідентифікації придатних кандидатів для даних цілей. В даному описі термін «запобігання», «запобігати» або «захист від» описує зменшення або усунення появи симптомів або ускладнень такого захворювання, стану чи порушення. Існують дані про те, що точкові мутації гена EZH2 в одному амінокислотному залишку (наприклад, Y641, A677 та A687) EZH2 зв’язані з лімфомою. Додаткові приклади мутантів EZH2 та способів детектування мутації, і способів лікування порушень, пов’язаних з мутаціями, описані, наприклад, в публікації заявки на патент США № US 20130040906, повний зміст якої включений до даного опису шляхом посилання. Фахівець в даній галузі техніки може звернутися до загальних еталонних посібників для детального опису відомих методів, розглянутих в даному документі, або еквівалентних методів. Дані посібники включають Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and rd Sons, Inc. (2005); Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3 edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2000); Coligan et al., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, N.Y.; Enna et al., Current Protocols in Pharmacology, John Wiley & Sons, N.Y.; Fingl et al., The Pharmacological Basis of Therapeutics (1975), Remington's Pharmaceutical th Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 18 edition (1990). До даних посібників можна, звичайно, також звертатися при одержанні або використанні аспекта даного винаходу. В даному описі термін «комбінована терапія» або «спільна терапія» включає введення сполуки згідно з даним винаходом або її фармацевтично прийнятної солі, поліморфа чи сольвату та принаймні другого агента в рамках конкретної схеми лікування, спрямованої на забезпечення корисного ефекту в результаті спільної дії даних терапевтичних агентів. Кориснійефект такої комбінації включає, без обмеження ними, фармакокінетичну або фармакодинамічну спільну дію, обумовлену комбінацією терапевтичних агентів. Згідно з даним винаходом також запропоновані фармацевтичні композиції, що містять сполуку, описану в даному документі, в комбінації принаймні з однією фармацевтично прийнятною допоміжною речовиною або носієм. «Фармацевтична композиція» є сумішшю, що містить сполуки згідно з даним винаходом у формі, придатній для введення суб’єкту. В одному з варіантів реалізації фармацевтична композиція представлена в нерасфасованій формі або в одиничній лікарській формі. Одинична лікарська форма є будь-якою з множини форм, включаючи, наприклад, капсулу, пакет для внутрішньовенного введення, таблетку, дозований картридж в аерозольному інгаляторі або флакон. Кількість активного інгредієнта (наприклад, суміші описаної сполуки або її солі, гідрату, сольвату або ізомеру) в однократній дозі композиції є ефективною кількістю та варіюється згідно з конкретним застосовуваним лікуванням. Для фахівця в даній галузі техніки очевидно, що інколи необхідно проводити звичайні зміни дози в залежності від віку та стану пацієнта. Доза буде також залежати від шляху введення. Предбачені різні шляхи, включаючи пероральний, легеневий, ректальний, парентеральний, трансдермальний, підшкірний, внутрішньовенний, внутрішньом’язовий, інтраперитонеальний, інгаляційний, трансбукальний, сублінгвальний, 10 UA 115074 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 внутрішньоплевральний, інтратекальний, інтраназальний тощо. Лікарські форми для топічного або трансдермального введення сполуки згідно з даним винаходом включають порошки, спреї, мазі, пасти, креми, лосьйони, гелі, розчини, пластири та препарати для інгаляції. В одному з варіантів реалізації активна сполука змішано в стерильних умовах з фармацевтично прийнятним носієм та з будь-якими консервантами, буферами або пропелентами, що є необхідними. В даному описі термін «фармацевтично прийнятний» стосується сполук, аніонів, катіонів, речовин, композицій, носіїв та/або лікарських форм, які з медичної точки зору придатні для застосування в контакті з тканинами людей та тварин, не викликаючи при цьому надмірної токсичності, подразнення, алергічної реакції або іншої проблеми чи ускладнення, згідно з розумним співвідношенням користь/ризик. Термін «фармацевтично прийнятна допоміжна речовина» означає допоміжну речовину, яка є придатною для одержання фармацевтичної композиції, яка є в цілому безпечною, нетоксичною та не є ані біологічно, ані в іншому відношенні небажаною, і включає допоміжну речовину, прийнятну для застосування в ветеринарії, а також для застосування у фармацевтиці. В даному описі та формулі винаходу термін «фармацевтично прийнятна допоміжна речовина» включає як одну, так і декілька таких допоміжних речовин. Фармацевтичну композицію згідно з даним винаходом виготовляють таким чином, щоб вона була сумісною з гаданим шляхом введення. Приклади шляхів введення включають парентеральне, наприклад, внутрішньовенне, внутрішньошкірне, підшкірне, пероральне (наприклад, інгаляційне), трансдермальне (топічне) введення та введення через слизову. Розчини або суспензії, використовувані для парентерального, внутрішньошкірного або підшкірного застосування, можуть містити такі компоненти: стерильний розріджувач, такий як вода для ін’єкцій, фізіологічний розчин, нелеткі масла, поліетиленгліколі, гліцерин, пропіленгліколь або інші синтетичні розчинники; антибактеріальні агенти, такі як бензиловий спирт або метилпарабени; антиоксиданти, такі як аскорбінова кислота або бісульфіт натрію; хелатуючі агенти, такі як етилендіамінтетраоцтова кислота; буфери, такі як ацетати, цитрати або фосфати, та агенти регулювання тонічності, такі як хлорид натрію або декстроза. рН можна регулювати кислотами або основами, такими як хлористоводнева кислота або гідроксид натрію. Препарат для парентерального введення може міститися в ампулах, одноразових шприцах або виготовлених зі скла або пластику флаконів, що містять декілька доз. Сполуку або фармацевтичну композицію згідно з даним винаходом можна вводити суб’єкту багатьма добре відомими способами, використовуваними зараз для хіміотерапевтичного лікування. Наприклад, для лікування ракових пухлин сполуку згідно з даним винаходом можна вводити шляхом ін’єкції безпосередньо в пухлини, вводити шляхом ін’єкції в кровотік або порожнини тіла, або приймати перорально, або застосовувати через шкіру за допомогою пластирів. Вибрана доза повинна бути достатньою для забезпечення ефективного лікування, але не настільки високою, щоб викликати неприйнятні побічні ефекти. Краще, слід уважно спостерігати за перебігом захворювання (наприклад, раку, передракового стану тощо) та станом здоров’я пацієнта під час лікування та протягом розумного періоду часу після лікування. В даному описі термін «терапевтично ефективна кількість» стосується кількості фармацевтичного агента для лікування, полегшення або запобігання визначеного захворювання чи стану, або для створення виявлюваного терапевтичного або інгібуючого ефекту. Вказаний ефект може бути виявлений за допомогою будь-якого методу аналізу, відомого в даній галузі техніки. Точна ефективна кількість для суб’єкта буде залежати від маси тіла, розмірів та стану здоров’я суб’єкта; характеру та ступеня стану; та лікарського засобу або комбінації лікарських засобів, вибраних для введення. Терапевтично ефективні кількості для конкретної ситуації можуть бути визначені шляхом проведення рутинних експериментів в межах компетенції та на розсуд лікаря-клініциста. Згідно з кращим аспектом захворювання або стан, який лікують, є раком. Згідно з іншим аспектом захворювання або стан, який лікують, є клітинним проліферативним порушенням. Для будь-якої сполуки терапевтично ефективна кількість може бути первісно визначена чи то в аналізах культур клітин, наприклад, неопластичних клітин, чи то в моделях у тварин, як правило, щурів, мишей, кролів, собак або свиней. Тваринну модель можна також використовувати для визначення відповідного діапазону концентрацій та шляху введення. Таку інформацію потім можна використовувати для визначення придатних доз та шляхів введення у людей. Терапевтична/профілактична ефективність та токсичність можуть бути визначені за допомогою стандартних фармацевтичних процедур в культурах клітин або у експериментальних тварин, наприклад, ED50 (доза, яка є терапевтично ефективною у 50% популяції) та LD50 (доза, яка є летальною для 50% популяції). Співвідношення доз, що 11 UA 115074 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 відповідають токсичному та терапевтичному ефектам, є терапевтичним індексом, і він може бути виражений у вигляді співвідношення LD50/ED50. Кращими є фармацевтичні композиції, які демонструють більші терапевтичні індекси. Доза може варіювати в межах даного діапазону в залежності від використовуваної лікарської форми, чутливості пацієнта та шляху введення. Дозу та введення коригують для забезпечення достатніх рівнів активного агента (агентів) або для підтримання бажаного ефекту. Фактори, які можна враховувати, включають тяжкість хворобливого стану, загальний стан здоров’я суб’єкта, вік, масу тіла та стать суб’єкта, харчування, час та частоту введення, комбінацію (комбінації) лікарських засобів, чутливість реакції та переносність/відповідь на терапію. Тривало діючі фармацевтичні композиції можна вводити кожні 3-4 дні, кожен тиждень або один раз на два тижні в залежності від періоду напіввиведення та швидкості кліренсу конкретної композиції. Фармацевтичні композиції, що містять активні сполуки згідно з даним винаходом, можуть бути одержані загальновідомим способом, наприклад, за допомогою традиційних способів змішування, розчинення, гранулювання, виготовлення драже, розтирання в порошок, емульгування, інкапсулювання, захоплення або ліофілізації. Фармацевтичні композиції можуть бути одержані традиційним способом з використанням одного чи декількох фармацевтично прийнятних носіїв, що включають допоміжні речовини та/або додаткові речовини, які полегшують переробку активних сполук в препарати, придатні для фармацевтичного застосування. Відповідній склад, звичайно, залежить від вибраного шляху введення. Фармацевтичні композиції, придатні для застосування шляхом ін’єкцій, включають стерильні водні розчини (у випадку розчинності у воді) або дисперсії та стерильні порошки для негайного приготування стерильних розчинів або дисперсій для ін’єкцій. Для внутрішньовенного введення TM придатні носії включають фізіологічний розчин, бактеріостатичну воду, Cremophor EL (BASF, Парсіппані, Нью-Джерсі, США) або фосфатний буферний розчин (ФБР). В усіх випадках композиція повинна бути стерильною та текучою в такому ступені, щоб існувала можливість легкого введення через шприц. Вона повинна бути стабільною в умовах виготовлення та зберігання, та повинна бути захищена від забруднюючої дії мікроорганізмів, таких як бактерії та гриби. Носій може бути розчинником або дисперсійним середовищем, що містить, наприклад, воду, етанол, поліол (наприклад, гліцерин, пропіленгліколь та рідкий поліетиленгліколь тощо) і придатні суміші вказаних речовин. Необхідна плинність може бути збережена, наприклад, шляхом використання покриття, такого як лецитин, шляхом підтримання потрібного розміру частинок у випадку дисперсії та шляхом використання поверхнево-активних речовин. Запобігання дії мікроорганізмів може бути забезпечене різними антибактеріальними та протигрибковими агентами, наприклад, парабенами, хлорбутанолом, фенолом, аскорбіновою кислотою, тимеросалом тощо. В багатьох випадках буде кращим включення в композицію ізотонічних агентів, наприклад, цукрів, поліспиртів, таких як маніт та сорбіт, та хлориду натрію. Пролонговану абсорбцію композицій для ін’єкцій можна забезпечити шляхом включення в композицію агента, який відтерміновує абсорбцію, наприклад, моностеарату алюмінію та желатину. Стерильні розчини для ін’єкцій можуть бути приготовлені шляхом включення активної сполуки в потрібній кількості у відповідний розчинник разом з одним інгредієнтом або комбінацією інгредієнтів, перелічених вище, при необхідності, з подальшою стерилізацією шляхом фільтрації. Як правило, дисперсії готують шляхом включення активної сполуки в стерильний носій, що містить основне дисперсійне середовище та інші потрібні інгредієнти з перелічених вище. У випадку стерильних порошків для приготування стерильних розчинів для ін’єкцій способами одержання є вакуумне сушіння та сушіння методом сублімації, яке дозволяє одержати порошок активного інгредієнта, а також будь-якого бажаного додаткового інгредієнта з його попередньо стерилізованого шляхом фільтрації розчину. Композиції для перорального введення, як правило, містять інертний розріджувач або придатний до застосування фармацевтично прийнятний носій. Дані композиції можуть бути поміщені в желатинові капсули або спресовані в таблетки. Для цілей перорального терапевтичного введення активну сполуку можна включати спільно з допоміжними речовиними та застосовувати у формі таблеток, пастилок або капсул. Композиції для перорального введення також можуть бути одержані з використанням рідкого носія для застосування у вигляді рідини для полоскання роту, у випадку якої сполуку в рідкому носії застосовують перорально для полоскання роту, з подальшим випльовуванням або проковтуванням. Фармацевтично сумісні зв’язуючі агенти та/або речовини, які є адъювантами, можуть бути включені в композицію як її частини. Таблетки, пілюлі, капсули, пастилки тощо можуть містити будь-який з таких інгредієнтів або сполук схожої природи: зв’язуюча речовина, така як мікрокристалічна целюлоза, трагакантова камедь або желатин; допоміжна речовина, така як крохмаль або 12 UA 115074 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 лактоза, розпушувач, такий як альгінова кислота, Примогель або кукурудзяний крохмаль; змащувальна речовина, така як стеарат магнію або Sterotes; речовина, що сприяє ковзанню, така як колоїдний діоксид кремнію; підсолоджувач, такий як сахароза чи сахарин; або ароматизатор, такий як перцева м’ята, метилсаліцилат або апельсиновий ароматизатор. Для введення шляхом інгаляції сполуки доставляють у формі спрея-аерозолю з ємності, що перебуває під тиском або дозуючого пристрою, що містить придатний пропелент, наприклад, газ, такий як діоксид вуглецю, або розпилювача. Системне введення можна також здійснювати через слизову або трансдермальним способом. Для введення через слизову або трансдермального введення в суміші використовують проникні речовини, необхідні для проходження через відповідний бар’єр. Такі проникні речовини, в цілому, відомі в даній галузі техніки та включають, наприклад, для введення через слизову, детергенти, солі жовчних кислот та похідні фусидової кислоти. Введення через слизову можна здійснювати шляхом застосування назальних спреїв або супозиторіїв. Для трансдермального введення активні сполуки включають до складу мазей, бальзамів, гелей або кремів, загальновідомих в даній галузі техніки. Активні сполуки можуть бути одержані спільно з фармацевтично прийнятними носіями, які будуть захищати сполуку від швидкого виведення з організму, наприклад, у вигляді суміші з контрольованим вивільненням, включаючи імплантати та мікроінкапсуловані системи доставки. Можуть бути використані біорозкладані біосумісні полімери, такі як етиленвінілацетат, поліангідриди, полігліколева кислота, колаген, складні поліортоефіри та полімолочна кислота. Способи одержання таких сумішей очевидні фахівцю в даній галузі техніки. Вказані речовини також можуть бути придбані у Alza Corporation та Nova Pharmaceuticals, Inc. Ліпосомальні суспензії (включаючи ліпосоми, спрямовані на інфіковані клітини, з моноклональними антитілами до вирусних антигенів) також можна застосовувати як фармацевтично прийнятні носії. Вони можуть бути одержані згідно зі способами, відомими фахівцю в даній галузі техніки, наприклад, описаними в патенті США №4522811. Особливо кращим є одержання композицій для перорального або парентерального введення в одиничній лікарській формі для зручності введення та однорідності дози. В даному описі термін «одинична лікарська форма» стосується фізично розділених об’єктів, придатних для використання як однократні дози для введення суб’єкту, якого лікують; причому кожна доза містить заздалегідь визначену кількість активної сполуки, розраховану таким чином, щоб забезпечити бажаний терапевтичний ефект, спільно з необхідним фармацевтичним носієм. Опис одиничних лікарських форм згідно з даним винаходом обумовлений та залежить безпосередньо від унікальних характеристик активної сполуки та конкретного терапевтичного ефекту, що досягається. При терапевтичному застосуванні дози фармацевтичних композицій, застосовуваних згідно з даним винахідом, варіюються в залежності від агента, віку, маси тіла та клиничного стану пацієнта-реципієнта, і досвіду та рішення лікаря-клініциста або практикуючого лікаря, який проводить терапію, поряд з іншими факторами, що впливають на вибирану дозу. В цілому, доза повинна бути достатньою для того, щоб привести до уповільнення та краще регресії росту пухлин, а також краще до повной регресії раку. Дози можуть перебувати в діапазоні від приблизно 0,01 мг/кг на добу до приблизно 5000 мг/кг на добу. Згідно з кращими аспектами дози можуть перебувати в діапазоні від приблизно 1 мг/кг на добу до приблизно 1000 мг/кг на добу. Згідно з одним з аспектів доза буде перебувати в діапазоні від приблизно 0,1 мг/добу до приблизно 50 г/добу; від приблизно 0,1 мг/добу до приблизно 25 г/добу; від приблизно 0,1 мг/добу до приблизно 10 г/добу; від приблизно 0,1 мг до приблизно 3 г/добу; або від приблизно 0,1 мг до приблизно 1 г/добу, у вигляді однократних, розділених або неперервних доз (при цьому доза може бути скоригована з урахуванням маси тіла пацієнта в кг, площі поверхні тіла в 2 м та віку в роках). Ефективна кількість фармацевтичного агента є такою кількістю, що забезпечує поліпшення, яке можна об’єктивно визначити, і яке спостерігається лікаремклініцистом або іншим кваліфікованим спостерігачем. Наприклад, регресію пухлини у пацієнта можна виміряти на підставі діаметра пухлини. Зменшення діаметра пухлини вказує на регресію. На регресію також вказує відсутність повторної появи пухлин після припинення лікування. В даному описі термін «спосіб ефективної дози (dosage effective manner)» стосується кількості активної сполуки для досягнення бажаної біологічної дії у суб’єкта або клітини. Фармацевтичні композиції можуть бути поміщені в ємність, упаковку або дозатор разом з інструкціями з введення. Сполуки згідно з даним винаходом є також здатними утворювати солі. Усі дані форми також предбачені в межах обсягу заявленого винаходу. В даному описі термін «фармацевтично прийнятні соли» стосується похідних сполук згідно з 13 UA 115074 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 даним винаходом, в яких вихідна сполука модифікована шляхом одержання її кислих або основних солей. Приклади фармацевтично прийнятних солей включають, без обмеження ними, солі, утворені неорганічними або органічними кислотами з основними залишками, такими як аміни, лужні або органічні солі кислих залишків, таких як карбонові кислоти, тощо. Фармацевтично прийнятні солі включають звичайні нетоксичні солі або четвертинні амонієві солі вихідної сполуки, одержані, наприклад, з нетоксичних неорганічних або органічних кислот. Наприклад, такі звичайні нетоксичні солі включають, без обмеження ними, солі, одержані з неорганічних та органічних кислот, вибраних з 2-ацетоксибензойної, 2-гідроксіетансульфонової, оцтової, аскорбінової, бензолсульфонової, бензойної, бікарбонової, вугільної, лимонної, етилендіамінтетраоцтової, етандисульфонової, 1,2-етансульфонової, фумарової, глюкогептонової, глюконової, глутамінової, гліколевої, гліколіларсанілової, гексилрезорцинової, гідрабамінової, бромистоводневої, хлористоводневої, йодистоводневої, гідроксималеїнової, гідроксинафтойної, ізетіонової, молочної, лактобіонової, лаурилсульфонової, малеїнової, яблучної, мигдалевої, метансульфонової, напсилової (napsylic), азотної, щавлевої, памової, пантотенової, фенілоцтової, фосфорної, полігалактуронової, пропіонової, саліцилової, стеаринової, підоцтової (subacetic), бурштинової, сульфамінової, сульфанілової, сірчаної, дубильної, винної, толуолсульфонової, та широко поширених амінокислот, наприклад, гліцину, аланіну, фенілаланіну, аргініну і т.д. Інші приклади фармацевтично прийнятних солей включають гексанову кислоту, циклопентанпропіонову кислоту, піровиноградну кислоту, малонову кислоту, 3-(4гідроксибензоїл)бензойну кислоту, коричну кислоту, 4-хлорбензолсульфонову кислоту, 2нафталінсульфонову кислоту, 4-толуолсульфонову кислоту, камфорсульфонову кислоту, 4метилбіцикло[2.2.2]окт-2-ен-1-карбонову кислоту, 3-фенілпропіонову кислоту, триметилоцтову кислоту, трет-бутилоцтову кислоту, муконову кислоту тощо. Даний винахід також включає солі, що утворюються при заміщенні присутнього у вихідній сполуці кислого протону іоном металу, наприклад, іоном лужного металу, іоном лужноземельного металу або іоном алюмінію; або координуванні з органічною основою, такою як етаноламін, діетаноламін, триетаноламін, трометамін, N-метилглюкамін тощо. Очевидно, що у формі солі відношення сполуки до катіону або аніону солі може складати 1:1, або будь-яке інше відношення, відмінне від 1:1, наприклад, 3:1, 2:1, 1:2 або 1:3. Слід розуміти, що усі посилання на фармацевтично прийнятні солі включають форми приєднання розчинника (сольвати) або кристалічні форми (поліморфи) цієї солі, визначені в даному описі. Сполуки або їх фармацевтично прийнятні солі вводять перорально, назально, трансдермально, через легені, шляхом інгаляції, трансбукально, сублінгвально, інтраперитонеально, підшкірно, внутрішньом’язово, внутрішньовенно, ректально, внутрішньоплеврально, інтратекально та парентерально. В одному з варіантів реалізації сполуку вводять перорально. Для фахівця в даній галузі техніки очевидні переваги конкретних шляхів введення. Режим дозування із застосуванням сполук вибирають згідно з різними факторами, включаючи тип, вид, вік, масу тіла, стать та стан пацієнта; тяжкість стану,який лікують; шлях введення; функцію нирок та печінки пацієнта; та конкретну використовувану сполуку або її сіль. Кваліфікований лікар або ветеринар може легко визначити та призначити ефективну кількість лікарського засобу, необхідну для запобігання, протидії або зупинення прогресування стану. Способи включення до складу композицій та введення описаних сполук згідно з даним th винаходом можна знайти в Remington: the Science and Practice of Pharmacy, 19 edition, Mack Publishing Co., Easton, PA (1995). В одному з варіантів реалізації сполуки, описані в даному документі, та їх фармацевтично прийнятні солі застосовують в фармацевтичних препаратах в комбінації з фармацевтично прийнятним носієм або розріджувачем. Придатні фармацевтично прийнятні носії включають тверді інертні наповнювачі або розріджувачі та стерильні водні або органічні розчини. Сполуки будуть присутніми в таких фармацевтичних композиціях в кількостях, достатніх для забезпечення бажаної величини дози в діапазоні, наведеному в даному описі. Усі проценти та співвідношення, використовувані в даному описі, якщо не вказане інше, наведені по масі. Інші ознаки та переваги даного винаходу очевидні з різних прикладів. Наведені приклади ілюструють різні компоненти та методику, придатну для практичного застосування даного винаходу. Вказані приклади не обмежують заявлений винахід. Виходячи з даного опису, фахівець в даній галузі техніки може визначити та використовувати інші компоненти та методику, придатну для практичного застосування даного винаходу. На схемах синтезу та в хімічних структурах, описаних в даному документі, сполуки для 14 UA 115074 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 простоти можуть бути зображені в одній конкретній конфигурації (наприклад, з або без конкретного вказаного стереоізомера). Такі конкретні конфигурації або їх відсутність не обмежують даний винахід тим чи іншим ізомером, таутомером, регіоізомером або стереоізомером, а також не виключають суміші ізомерів, таутомерів, регіоізомерів або стереоізомерів; однак очевидно, що конкретний ізомер, таутомер, регіоізомер або стереоізомер може мати більш високий рівень активності, ніж інший ізомер, таутомер, регіоізомер або стереоізомер. Сполуки, розроблені, вибрані та/або оптимізовані способами, описаними вище, після одержання можуть бути охарактеризовані з використанням різних аналізів, відомих фахівцю в даній галузі техніки, для визначення, чи виявляють вказані сполуки біологічну активність. Наприклад, молекули можуть бути охарактеризовані за допомогою звичайних аналізів, включаючи, без обмеження ними, аналізи, описані нижче, для визначення, чи виявляють вони очікувану активність, активність зв’язування та/або специфичність зв’язування. Крім того, може бути використаний високопродуктивний скринінг для прискорення аналізу з використанням таких методів аналізу. Завдяки цьому, стає можливим швидкий скринінг молекул, описаних в даному документі, на предмет активності з використанням методів, відомих в даній галузі техніки. Загальні методики проведення високопродуктивного скринінгу описані, наприклад, в Devlin (1998) High Throughput Screening, Marcel Dekker; та в патенті США №5763263. В високопродуктивних аналізах можна використовувати один чи декілька різних методів аналізу, включаючи, без обмеження ними, ті, що описані нижче. Зміст усіх публікацій та патентних документів, наведених в даному описі, включений в даний опис шляхом посилання так само, як би зміст кожної такої публікації або документа був спеціально включений в даний опис окремо. Посилання на публікації та патентні документи не є визнанням того, що будь-який з вказаних документів стосується відповідного рівня техніки, а також не є визнанням цього по відношенню до змісту чи дати. Після опису даного винаходу в письмовій формі, для фахівця в даній галузі техніки очевидно, що даний винахід можна практично застосовувати в різних варіантах, та що вищенаведений опис та приклади нижче наведені в цілях ілюстрації та не обмежують формулу винаходу, що йде далі. Приклади Приклад 1. Синтези сполук згідно з даним винаходом Загальні експерименти ЯМР 1 H-ЯМР-спектри одержували з використанням CDCl3, якщо не вказано інше, та реєстрували на 400 або 500 МГц з використанням магнітних інструментів (500 МГц) Varian або Oxford instruments. Вказана мультиплетність позначає: s = синглет, d = дублет, t = триплет, q = квартет, quint = квінтет, sxt = секстет, m = мультиплет, dd = дублет дублетів, dt = дублет триплетів; br означає широкий сигнал. РХ-МС та ВЕРХ Маса: надефективна РХ Waters Acquity. ВЕРХ: Продукти аналізували за допомогою Shimadzu SPD-20A з колонкою YMC ODS-M80 150 × 4,5 мм або колонкою YMC-Pack Pro C18 150 × 4,6 мм при 1,0 мл/хв. Рухома фаза була сумішшю MeCN:H2O=3:2 (що містить 0,3% SDS та 0,05% H3PO4). Продукти очищали шляхом ВЕРХ/МС (MeOH-H2O, що містить 0,1 % гідроксид амонію) з використанням Waters AutoPurification System з мас-детектором 3100. HCl сіль 3-(амінометил)-4,6-диметил-1,2-дигідропіридин-2-ону До розчину 2-ціаноацетаміду (8,40 г, 100 ммоль) та ацетилацетону (10,0 г, 100 ммоль) в H 2O (200 мл) додавали K2CO3 (4,00 г, 28,9 ммоль). Суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 22 годин. Потім тверду речовину, що випала до осаду, фільтрували з використанням лійки Бюхнера, промивали льодяною H2O та сушили під вакуумметричним тиском з одержанням 4,6-диметил-2-оксо-1,2-дигідропіридин-3-карбонітрилу (13,5 г, вихід 91%). До розчину 4,6-диметил-2-оксо-1,2-дигідропіридин-3-карбонітрилу (10,0 г, 67,5 ммоль) в МеОН (1,50 л) та конц. HCl (30 мл) додавали 10% Pd(OH) 2 (19 г) в атмосфері N2. Газоподібний N2 витісняли газоподібним H2, і суміш перемішували протягом 26 годин при кімнатній температурі в атмосфері водню. Газоподібний H2 витісняли газоподібним N2. Суміш фільтрували через целіт, промивали MeOH та концентрували. Залишок розтирали з EtOH, збирали за допомогою лійки Бюхнера та сушили під вакуумметричним тиском з одержанням 1 сполуки, вказаної в заголовку, у вигляді білої твердої речовини (11,5 г, 90%). H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): δ ppm 11,86 (brs, 1H), 5,98 (s, 1H), 3,78 (m, 2H), 2,20 (s, 3H), 2,16 (s, 3H). 15 UA 115074 C2 5-Бром-2-метил-3-нітробензойна кислота 5 10 15 20 25 До перемішуваного розчину 2-метил-3-нітробензойної кислоти (5,00 г, 27,6 ммоль) в H2SO4 (20 мл) додавали 1,3-дибром-5,5-диметилгідантоїн (4,34 г, 15,20 ммоль) при 0 °С. Реакційну суміш перемішували при 0 °С протягом 5 годин. Реакційну суміш вливали в льодяну воду, одержану тверду речовину, що випала до осаду, збирали, промивали водою та сушили в вакуумі з одержанням сполуки, вказаної в заголовку, у вигляді білої твердої речовини (7,28 г, 1 кількісний вихід). H-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ ppm; 8,31 (s, 1H), 8,17 (s, 1H), 2,43 (s, 3H). Метил-5-бром-2-метил-3-нітробензоат До перемішуваного розчину 5-бром-2-метил-3-нітробензойної кислоти (7,28 г, 28,0 ммоль) в ДМФА (100 мл) додавали натрію карбонат (11,9 г, 112 ммоль) та метилйодид (15,9 г, 112 ммоль). Реакційну суміш перемішували при 60 °С протягом 8 годин. Після завершення реакції реакційну суміш фільтрували та промивали етилацетатом. Об’єднаний фільтрат промивали водою і водну фазу повторно екстрагували етилацетатом. Об’єднані органічні фази сушили над безводним сульфатом натрію, фільтрували та концентрували при зниженому тиску з одержанням сполуки, вказаної в заголовку, у вигляді твердої речовини. (7,74 г, кількісний вихід). 1 H-ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ (ppm); 8,17 (s, 1H), 7,91 (s, 1H), 3,96 (s, 3H), 2,59 (s, 3H). Метил-3-аміно-5-бром-3-метилбензоат До перемішуваного розчину метил-5-бром-2-метил-3-нітробензоату (7,60 г, 27,7 ммоль) в водн. EtOH (100 мл EtOH та 20 мл H2O) додавали амонію хлорид (4,45 г, 83,1 ммоль) та залізо (4,64 г, 83,1 ммоль). Реакційну суміш перемішували при 80 °С протягом 5 годин. Потім суміш фільтрували через целіт і шар целіту промивали етилацетатом. Об’єднаний фільтрат концентрували в вакуумі. Одержаний залишок розчиняли в етилацетаті та воді. Водну фазу екстрагували етилацетатом (два рази). Об’єднану органічну фазу сушили над безводним сульфатом натрію, фільтрували та концентрували при зниженому тиску з одержанням сполуки, 1 вказаної в заголовку, у вигляді масла коричневого кольору (6,67 г, 99%). H-ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ ppm; 7,37 (s, 1H), 6,92 (s, 1H), 3,94 (s, 3H), 3,80 (brs, 2H), 2,31 (s, 3H). 30 16 UA 115074 C2 Сполука 1: 5 10 15 20 25 30 35 40 1 етап: Синтез метил-5-(((транс)-4-((трет-бутоксикарбоніл)аміно)циклогексил)(етил)аміно)-4'гідрокси-4-метил-[1,1'-біфеніл]-3-карбоксилату До перемішуваного розчину метил-5-бром-3-(((транс)-4-((трет-бутоксикарбоніл)аміно)циклогексил)(етил)аміно)-2-метилбензоату (10 г, 21,3 ммоль, див., наприклад, WO2012142504 (номер патентного реєстру 41478-507001WO)) та (4-гідроксифеніл)боронової кислоти (3,5 г, 25,3 ммоль) в суміші діоксану (225 мл) та води (75 мл) додавали Na 2CO3 (8,01 г, 75,5 ммоль), і розчин продували аргоном протягом 30 хвилин. Потім додавали Pd(PPh 3)4 (2,4 г, 2,07 ммоль) та снова продували аргоном протягом ще 15 хвилин. Реакційну масу нагрівали при 100 °С протягом 4 годин. Після завершення реакційну суміш разбавляли водою та екстрагували етилацетатом. Об’єднану органічну фазу сушили над сульфатом натрію. В результаті видалення розчинника при зниженому тиску з подальшою очисткою шляхом колонкової хроматографії одержували сполуку, вказану в заголовку (8,9 г, вихід 87%). 2 етап: Синтез метил-5-(((транс)-4-((трет-бутоксикарбоніл)аміно)циклогексил)(етил)аміно)-4'(2-метоксіетокси)-4-метил-[1,1'-біфеніл]-3-карбоксилату До перемішуваного розчину метил-5-(((транс)-4-((трет-бутоксикарбоніл)аміно)циклогексил)(етил)аміно)-4'-гідрокси-4-метил-[1,1'-біфеніл]-3-карбоксилату (0,6 г, 1,24 ммоль) та 1-бром-2-метоксіетану (0,519 г, 3,73 ммоль) в ацетонітрилі (6 мл) додавали Cs 2CO3 (0,485 г, 1,49 ммоль), та реакційну суміш перемішували при 80 °С протягом 12 годин. Після завершення до неї додавали воду та екстрагували етилацетатом. Об’єднані органічні фази сушили над безводним сульфатом натрію та концентрували при зниженому тиску. Неочищену сполуку очищали шляхом колонкової хроматографії з одержанням сполуки, вказаної в заголовку (0,6 г, вихід 76,5%). 3 етап: Синтез трет-бутил-((транс)-4-((5-(((4,6-диметил-2-оксо-1,2-дигідропіридин-3-іл)метил)карбамоїл)-4'-(2-метоксіетокси)-4-метил-[1,1'-біфеніл]-3-іл(етил)аміно)циклогексил)карбамату Водний NaOH (0,066 г, 1,66 ммоль в 5 мл H2O) додавали до розчину метил-5-(((транс)-4((трет-бутоксикарбоніл)аміно)циклогексил)(етил)аміно)-4'-(2-метоксіетокси)-4-метил-[1,1'біфеніл]-3-карбоксилату (0,6 г, 1,11 ммоль) в EtOH (10 мл) та перемішували при 60 °С протягом 1 години. Після завершення реакції видаляли етанол при зниженому тиску та залишок підкислювали з використанням лимонної кислоти та доводили до рН 4 з використанням лимонної кислоти. Здійснювали екстракцію з використанням 10% метанолу в ДХМ. Об’єднані органічні фази сушили, концентрували з одержанням відповідної кислоти (0,5 г, вихід 85,6%). Потім вищевказану кислоту (0,5 г, 0,95 ммоль) розчиняли в ДМСО (5 мл) та до неї додавали 3-(амінометил)-4,6-диметилпіридин-2(1Н)-он (0,288 г, 1,90 ммоль) та триетиламін (0,096 г, 0,950 ммоль). Реакційну суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 15 хвилин перед додаванням до неї PyBop (0,741 г, 1,42 ммоль) та продовжували перемішувати протягом ночі при кімнатній температурі. Після завершення реакції реакційну масу виливали на лід та 17 UA 115074 C2 5 10 15 20 25 здійснювали екстракцію з використанням 10% MeOH/ДХМ. Об’єднані органічні фази сушили над сульфатом натрію та концентрували при зниженому тиску з одержанням неочищеної речовини, яку потім очищали шляхом колонкової хроматографії з одержанням сполуки, вказаної в заголовку (0,45 г, вихід 71,8%). 4 етап: Синтез N-((4,6-диметил-2-оксо-1,2-дигідропіридин-3-іл)метил)-5-(((транс)-4(диметиламіно)циклогексил)(етил)аміно)-4'-(2-метоксіетокси)-4-метил-[1,1'-біфеніл]-3карбоксаміду До перемішуваного розчину трет-бутил-((транс)-4-((5-(((4,6-диметил-2-оксо-1,2дигідропіридин-3-іл)метил)карбамоїл)-4'-(2-метоксіетокси)-4-метил-[1,1'-біфеніл]-3-іл(етил)аміно)циклогексил)карбамату (0,45 г, 0,681 ммоль) в ДХМ (5 мл) при 0 °С додавали ТФОК (1 мл) та реакційну суміш перемішували протягом 2 годин при кімнатній температурі. Після завершення реакційну суміш концентрували досуха. Потім залишок підлуговували Na2CO3 (водн.) до рН 8 та водну фазу екстрагували 20% метанолом в ДХМ. Об’єднані органічні фази сушили над Na2SO4 та розчинник видаляли при зниженому тиску з одержанням Воснезахищеної сполуки (0,3 г, вихід 78,7%). До перемішуваного розчину Вос-незахищеної сполуки (0,3 г, 0,535 ммоль) в дихлорметані (3 мл) додавали розчин формальдегіду (35-41% водн.) (0,056 г, 1,87 ммоль) при 0 °С та перемішували протягом 20 хвилин. Потім додавали NaBH(OAc) 3 (0,28 г, 1,33 ммоль) та перемішували протягом 2 годин при 0 °С. Після завершення реакції додавали воду та екстрагували 20% метанолом в ДХМ. Об’єднані органічні фази сушили над Na 2SO4 та видаляли розчинник при зниженому тиску. Неочищену сполуку очищали шляхом преп. ВЕРХ з одержанням сполуки, вказаної в заголовку (0,1 г, вихід 31,7%). + 1 РХ-МС: 589,75 (M+1) ; ТФОК-сіль: H ЯМР (ДМСО-d6, 400 МГц) δ 11,47 (brs, 1H), 9,48 (brs, 1H), 8,21 (brs, 1H), 7,57 (d, 2H, J=8,0 Гц), 7,40 (s, 1H), 7,23 (s, 1H), 7,03 (d, 2H, J=8,8 Гц), 5,87 (s, 1H), 4,29 (d, 2H, J=4,4 Гц), 4,14-4,12 (m, 2H), 3,69-3,66 (m, 2H), 3,32 (s, 3H), 3,13 (m, 4H), 2,692,68 (m, 6H), 2,24 (s, 3H), 2,21 (s, 3H), 2,11 (s, 3H), 1,96 (m, 4H), 1,44 (m, 4H), 0,85 (t, 3H, J=6,8 Гц). Сполука 2: 30 35 1 етап: Синтез метил-5-бром-3-(((транс)-4-((трет-бутоксикарбоніл)(метил)аміно)циклогексил)(етил)аміно)-2-метилбензоату 18 UA 115074 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 До перемішуваного розчину метил-5-бром-3-(((транс)-4-((трет-бутоксикарбоніл)аміно)циклогексил)(етил)аміно)-2-метилбензоату (3 г, 6,41 ммоль, див., наприклад, WO2012142504) в ТГФ (30 мл) додавали NaH (0,184 г, 7,69 ммоль) при 0 °С та перемішували при цій самій температурі протягом 20 хвилин. Потім додавали метилйодид (9,10 г, 64,10 ммоль) при 0 °С та реакційну суміш перемішували протягом ночі при кімнатній температурі. Після завершення реакційну суміш гасили льодяною водою та екстрагували дихлорметаном. Об’єднані органічні фази промивали водою, сушили, концентрували при зниженому тиску. Неочищену сполуку очищали шляхом колонкової хроматографії з одержанням неочищеної сполуки, вказаної в заголовку, яку використовували без додаткової очистки (3 г, вихід 97,4%). 2 етап: Синтез метил-3-(((транс)-4-((трет-бутоксикарбоніл)(метил)аміно)циклогексил)(етил)аміно)-5-(3-гідроксипроп-1-ін-1-іл)-2-метилбензоату До перемішуваного розчину метил-5-бром-3-(((транс)-4-((трет-бутоксикарбоніл)(метил)аміно)циклогексил)(етил)аміно)-2-метилбензоату (2 г, 4,14 ммоль) в сухому толуолі додавали CuI (0,015 г, 0,079 ммоль), PPh3 (0,043 г, 0,165 ммоль), PdCl2(PPh3)2 (0,058 г, 0,082 ммоль), N,N-діізопропіламін (1,08 г, 10,78 ммоль) та реакційну суміш продували аргоном протягом 15 хвилин. До неї додавали проп-2-ін-1-ол (0,46 г, 8,29 ммоль), реакційну суміш нагрівали при 80 °С в герметичних умовах протягом 5 годин. Після завершення її гасили водою та екстрагували етилацетатом. Органічну фазу сушили над Na2SO4. Неочищену сполуку очищали шляхом колонкової хроматографії з одержанням сполуки, вказаної в заголовку (1,2 г, вихід 63,2%). 3 етап: Синтез метил-5-(3-бромпроп-1-ін-1-іл)-3-(((транс)-4-((трет-бутоксикарбоніл)(метил)аміно)циклогексил)(етил)аміно)-2-метилбензоату: До перемішуваного розчину метил-3-(((транс)-4-((трет-бутоксикарбоніл)(метил)аміно)циклогексил)(етил)аміно)-5-(3-гідроксипроп-1-ін-1-іл)-2-метилбензоату (1,2 г, 2,62 ммоль) в ДХМ (15 мл) додавали PPh3 (1,37 г, 5,22 ммоль) та CBr4 (1,7 г, 5,10 ммоль) при 0 °С, та реакційну суміш перемішували протягом 4 годин при кімнатній температурі. Після завершення реакцію гасили льодяною водою та екстрагували дихлорметаном. Об’єднані органічні фази промивали водою, сушили, концентрували при зниженому тиску. Неочищену речовину очищали шляхом колонкової хроматографії з одержанням сполуки, вказаної в заголовку (0,5 г, вихід 38,5%). 4 етап: Синтез метил-3-(((транс)-4-((трет-бутоксикарбоніл)(метил)аміно)циклогексил)(етил)аміно)-2-метил-5-(3-морфолінопроп-1-ін-1-іл)бензоату До перемішуваного розчину метил-5-(3-бромпроп-1-ін-1-іл)-3-(((транс)-4-((третбутоксикарбоніл)(метил)аміно)циклогексил)(етил)аміно)-2-метилбензоату (1 екв.) в ДМФА додавали морфолін (5 екв.) та реакційну суміш перемішували протягом 12 годин при кімнатній температурі. Після завершення реакцію гасили льодяною водою та екстрагували дихлорметаном. Об’єднані органічні фази промивали водою, сушили, концентрували при зниженому тиску з одержанням бажаної неочищеної сполуки, вказаної в заголовку, яку використовували на наступному етапі без додаткової очистки (вихід 98,7%) 5 етап: Синтез трет-бутил-((транс)-4-((3-(((4,6-диметил-2-оксо-1,2-дигідропіридин-3іл)метил)карбамоїл)-2-метил-5-(3-морфолінопроп-1-ін-1-іл)феніл)(етил)аміно)циклогексил)(метил)карбамату NaOH (1,5 екв.) додавали до розчину метил-3-(((транс)-4-((трет-бутоксикарбоніл)(метил)аміно)циклогексил)(етил)аміно)-2-метил-5-(3-морфолінопроп-1-ін-1-іл)бензоату (1 екв.) в EtOH:H2O (9:1) та перемішували при 60 °С протягом 1 години. Після завершення реакції видаляли етанол при зниженому тиску та підкислювали з використанням розбавленої HCl до рН 6, та доводили до рН 4 з використанням лимонної кислоти. Здійснювали екстракцію з використанням 10% метанолу в ДХМ. Об’єднані органічні фази сушили, концентрували з одержанням відповідної кислоти. Потім вищевказану кислоту (1 екв.) розчиняли в ДМСО та до неї додавали 3-(амінометил)4,6-диметилпіридин-2(1Н)-он (2 екв.) та триетиламін (1 екв.). Реакційну суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 15 хвилин перед додаванням до неї PyBop (1,5 екв.) та продовжували перемішувати протягом ночі при кімнатній температурі. Після завершення реакції реакційну масу виливали на лід та здійснювали екстракцію з використанням 10% MeOH/ДХМ. Об’єднані органічні фази сушили над Na2SO4 та концентрували при зниженому тиску з одержанням неочищеної речовини, яку потім очищали спочатку водою, а потім промивали ацетонітрилом з одержанням бажаної сполуки, вказаної в заголовку (вихід 69,4%). 6 етап: Синтез N-((4,6-диметил-2-оксо-1,2-дигідропіридин-3-іл)метил)-3-(етил((транс)-4(метиламіно)циклогексил)аміно)-2-метил-5-(3-морфолінопроп-1-ін-1-іл)бензаміду До перемішуваного розчину трет-бутил-((транс)-4-((3-(((4,6-диметил-2-оксо-1,2 19 UA 115074 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 дигідропіридин-3-іл)метил)карбамоїл)-2-метил-5-(3-морфолінопроп-1-ін-1-іл)феніл)(етил)аміно)циклогексил)(метил)карбамату (1 екв.) в ДХМ при 0 °С додавали ТФОК (3 екв.) та реакційну суміш перемішували протягом 2 годин при кімнатній температурі. Після завершення реакційну суміш концентрували досуха. Потім залишок підлуговували Na 2CO3 (водн.) до рН 8 та водну фазу екстрагували 20% метанолом в ДХМ. Об’єднані органічні фази сушили над Na 2SO4 та розчинник видаляли при зниженому тиску з одержанням сполуки, вказаної в заголовку (вихід 99%), яку використовували в наступній реакції без додаткової очистки. 7 етап: Синтез N-((4,6-диметил-2-оксо-1,2-дигідропіридин-3-іл)метил)-3-(етил((транс)-4-((2метоксіетил)(метил)аміно)циклогексил)аміно)-2-метил-5-(3-морфолінопроп-1-ін-1-іл)бензаміду До перемішуваного розчину N-((4,6-диметил-2-оксо-1,2-дигідропіридин-3-іл)метил)-3(етил((транс)-4-(метиламіно)циклогексил)аміно)-2-метил-5-(3-морфолінопроп-1-ін-1-іл)бензаміду (1 екв.) в дихлоретані додавали 2-метоксіацетальдегід (10 екв.) та оцтову кислоту (6 екв.) при 0 °С, та перемішували протягом 20 хвилин. Потім додавали NaBH(OAc) 3 (3 екв.) та перемішували протягом 2 годин при 0 °С. Після завершення реакції додавали воду та екстрагували 20% метанолом в ДХМ. Об’єднані органічні фази сушили над Na 2SO4 та видаляли розчинник при зниженому тиску. Неочищену сполуку очищали шляхом преп. ВЕРХ з одержанням цільової молекули (0,1 г, вихід 33,6%). + 1 РХ-МС: 606,65 (M+1) ; ТФОК-сіль: H ЯМР (ДМСО-d6, 400 МГц) δ 11,50 (brs, 1H), 9,22 (brs, 1H), 8,18 (t, 1H), 7,24 (s, 1H), 7,09 (s, 1H), 5,86 (s, 1H), 4,26-4,25 (m, 4H), 3,66-3,59 (m, 4H), 3,483,36 (m, 3H), 3,29-3,17 (m, 7H), 3,04-3,01 (m, 3H), 2,69-2,68 (m, 4H), 2,20 (s, 3H), 2,19 (s, 3H), 2,11 (s, 3H), 2,00-1,92 (m, 2H), 1,82-1,73 (m, 3H), 1,46 (m, 4H), 0,78 (t, 3H, J=6,4 Гц). Альтернативна схема синтезу сполуки 2: Етап А: Синтез 4-(проп-2-ін-1-іл)морфоліну: До перемішуваного розчину пропаргилброміду (50 г, 420 ммоль) в ацетоні (300 мл) додавали Cs2CO3 (136,5 г, 420 ммоль) при 0 °С. Потім по краплинах додавали морфолін (36,60 г, 420 ммоль) в ацетоні (200 мл) та реакційну суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 16 годин. Після завершення фільтрували реакційну масу, і фільтрат концентрували при зниженому тиску з одержанням сполуки, вказаної в заголовку (50 г, неочищена). Виділену сполуку використовували безпосередньо на наступному етапі сполучення без додаткової очистки. 1 етап: Синтез метил-5-бром-3-(етил((транс)-4-(метиламіно)циклогексил)аміно)-2метилбензоату: До перемішуваного розчину метил-5-бром-3-(((транс)-4-((трет-бутоксикарбоніл)(метил)аміно)циклогексил)(етил)аміно)-2-метилбензоату (30 г, 62,24 ммоль) в метанолі (100 мл) при 0 °С додавали розчин HCl в метанолі (500 мл) та реакційну суміш перемішували протягом 2 годин при кімнатній температурі. Після завершення реакційну суміш концентрували досуха. Залишок підлуговували Na2CO3 (водн.) до рН 8 та водну фазу екстрагували 10% метанолом в ДХМ (200 мл × 3). Об’єднані органічні фази сушили над Na2SO4 та видаляли розчинник при зниженому тиску з одержанням сполуки, вказаної в заголовку, у вигляді безбарвного масла (25 г, 20 UA 115074 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 неочищене). Виділену сполуку використовували на наступному етапі без додаткової очистки. 2 етап: Синтез метил-5-бром-3-(етил((транс)-4-((2-метоксіетил)(метил)аміно)циклогексил)аміно)-2-метилбензоату: До перемішуваного розчину неочищеного метил-5-бром-3-(етил((транс)-4-(метиламіно)циклогексил)аміно)-2-метилбензоату (25 г, 65,44 ммоль), 1-бром-2-метоксіетану (18,19 г, 130,8 ммоль) в ацетонітрилі (250 мл) додавали K2CO3 (18,06 г, 130,8 ммоль) та KI (6,51 г, 39,21 ммоль). одержану реакційну масу перемішували при 65 °С протягом 16 годин. Після завершення реакційну суміш разбавляли водою (300 мл) та екстрагували ДХМ (500 мл × 3). Об’єднані органічні фази промивали водою, сушили над Na2SO4 та концентрували при зниженому тиску. Неочищену сполуку очищали шляхом колонкової хроматографії на силикагелі з одержанням сполуки, вказаної в заголовку (20 г, вихід 69,3%). 1 H ЯМР (ДМСО-d6, 400 МГц) δ 7,55 (s, 1H), 7,45 (s, 1H), 3,82 (s, 3H), 3,32 (m, 4H), 3,20 (s, 3H), 3,05 (q, 2H), 2,61 (m, 1H), 2,32 (s, 3H), 2,30 (m, 1H), 2,15 (s, 3H), 1,77-1,67 (m, 4H), 1,37-1,31(m, 2H), 1,24-1,18 (m, 2H), 0,78 (t, 3H, J=6,8 Гц). 3 етап: Синтез метил-3-(етил((транс)-4-((2-метоксіетил)(метил)аміно)циклогексил)аміно)-2метил-5-(3-морфоїлинопроп-1-ін-1-іл)бензоату: Розчин метил-5-бром-3-(етил((транс)-4-((2-метоксіетил)(метил)аміно)циклогексил)аміно)-2метилбензоату (30 г, 68,02 ммоль), 4-(проп-2-ін-1-іл)морфоліну (25,51 г, 204 ммоль) та триетиламіну (20,61 г, 204 ммоль) в ДМФА (300 мл) барботували аргоном протягом 20 хвилин. Потім додавали CuI (3,87 г, 20,36 ммоль) та Pd (PPh3)4 (7,85 г, 6,79 ммоль), та барботували аргоном протягом ще 20 хвилин. Реакційну суміш нагрівали при 105 °С протягом 4 годин, а потім охолоджували до кімнатної температури. Реакцію гасили водою (100 мл) та водну фазу екстрагували 10% МеОН/ДХМ (400 мл × 3). Об’єднані органічні екстракти сушили над Na 2SO4, фільтрували та концентрували. Залишок очищали шляхом колонкової хроматографії на силикагелі з одержанням сполуки, вказаної в заголовку (21 г, вихід 63,7%) 1 H ЯМР (ДМСО-d6, 400 МГц) δ 7,46 (s, 1H), 7,32 (s, 1H), 3,82 (s, 3H), 3,62-3,57 (m, 6H), 3,50 (s, 2H), 3,35-3,32 (m, 2H), 3,21 (s, 3H), 3,17 (m, 1H), 3,05 (q, 2H), 2,61-2,58 (m, 2H), 2,38 (s, 3H), 2,33 (m, 1H), 2,18 (m, 2H), 1,77-1,70 (m, 4H), 1,36-1,20 (m, 4H), 0,77 (t, 3H, J=6,8 Гц), 3H злився з піком розчинника. 4 етап: Синтез N-((4,6-диметил-2-оксо-1,2-дигідропіридин-3-іл)метил)-3-(етил((транс)-4-((2метоксіетил)(метил)аміно)циклогексил)аміно)-2-метил-5-(3-морфолінопроп-1-ін-1-іл)бензаміду: Водний NaOH (2,59 г, 64,91 ммоль в 10 мл H2O) додавали до розчину метил-3-(етил((транс)4-((2-метоксіетил)(метил)аміно)циклогексил)аміно)-2-метил-5-(3-морфолінопроп-1-ін-1іл)бензоату (21 г, 43,29 ммоль) в EtOH (100 мл) та перемішували при 60 °С протягом 1 години. Після завершення реакції видаляли етанол при зниженому тиску, і залишок підкислювали з використанням розбавленої HCl до рН 4 з використанням лимонної кислоти. Здійснювали екстракцію з використанням 10% MeOH/ДХМ (200 мл × 3). Об’єднані органічні фази сушили, концентрували з одержанням відповідної кислоти (15,5 г, вихід 76%). До розчину вищевказаної кислоти (15,5 г, 32,90 ммоль) в ДМСО (50 мл) додавали 3(амінометил)-4,6-диметилпіридин-2(1Н)-он (10 г, 65,80 ммоль) та триетиламін (23 мл, 164,5 ммоль). Реакційну суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 15 хвилин перед додаванням до неї PyBop (25,66 г, 49,34 ммоль) при 0 °С та додатково перемішували протягом ночі при кімнатній температурі. Після завершення реакційну масу вливали в льодяну воду (100 мл) та здійснювали екстракцію з використанням 10% MeOH/ДХМ (200 мл × 3). Об’єднані органічні фази сушили над Na2SO4 та концентрували при зниженому тиску. Неочищену сполуку очищали шляхом колонкової хроматографії на лужному оксиді алюмінію, елююючи MeOH:ДХМ, з одержанням сполуки, вказаної в заголовку (11 г, вихід 55,3%). + 1 РХ-МС: 606,50 (M + 1) ; H ЯМР (MeOD, 400 МГц) δ 7,23 (s, 1H), 7,09 (s, 1H), 6,11 (s, 1H), 4,46 (s, 2H), 3,74-3,72 (m, 4H), 3,51 (s, 2H), 3,47 (t, 2H, J=5,6 Гц,), 3,32 (s, 3H), 3,07 (q, 2H, J=7,2 Гц), 2,64-2,63 (m, 7H), 2,38 (m,1H), 2,37 (s, 3H), 2,27 (s, 3H), 2,26 (s, 3H), 2,25 (s, 3H), 1,89-1,86 (m, 4H), 1,50-1,30 (m, 4H), 0,83 (t, 3H, J=7,2 Гц). Сполука 105: Метил-5-бром-2-метил-3-[(оксан-4-іл)аміно]бензоат До перемішуваного розчину метил-3-аміно-5-бром-2-метилбензоату (40,2 г, 165 ммоль) в 21 UA 115074 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 CH2Cl2 (500 мл) та АсОН (60 мл) додавали дигідро-2H-піран-4-он (17,3 г, 173 ммоль) та триацетоксиборгідрид натрію (73,6 г, 330 ммоль). Реакційну суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 20 годин. Потім додавали насичений водний розчин NaHCO 3 та суміш розділяли. Водну фазу екстрагували CH 2Cl2 та об’єднану органічну фазу концентрували в вакуумі. Залишок розтирали з етиловим ефіром та збирали одержаний осад з одержанням 1 сполуки, вказаної в заголовку, у вигляді білої твердої речовини (39,1 г, 72%). H-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ ppm; 7,01 (s, 1H), 6,98 (s, 1H), 5,00 (d, J = 7,6 Гц, 1H), 3,84-3,87 (m, 2H), 3,79 (s, 3H), 3,54-3,56 (m, 1H), 3,43 (m, 2H), 2,14 (s, 3H), 1,81-1,84 (m, 2H), 1,47-1,55 (m, 2H). Метил-5-бром-3-[етил(оксан-4-іл)аміно]-2-метилбензоат До перемішуваного розчину метил-5-бром-2-метил-3-[(оксан-4-іл)аміно]бензоату (39,1 г, 119 ммоль) в CH2Cl2 (400 мл) та АсОН (40 мл) додавали ацетальдегід (24,7 г, 476 ммоль) та триацетоксиборгідрид натрію (79,6 г, 357 ммоль). Реакційну суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 24 годин. Потім додавали насичений водний розчин NaHCO 3 та суміш розділяли. Водну фазу екстрагували CH 2Cl2 та об’єднану органічну фазу концентрували в вакуумі. Залишок очищали шляхом колонкової хроматографії на силикагелі (SiO 2 гептан/EtOAc = 3/1) з одержанням сполуки, вказаної в заголовку, у вигляді в’язкого масла (44,1 г, кількісний 1 вихід). H-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ ppm; 7,62 (s, 1H), 7,52 (s, 1H), 3,80 (m, 5H), 3,31 (m, 2H), 2,97-3,05 (m, 2H), 2,87-2,96 (m, 1H), 2,38 (s, 3H), 1,52-1,61 (m, 2H), 1,37-1,50 (m, 2H), 0,87 (t, J = 6,8 Гц, 3H). Трет-бутил-4-((3-(етил(тетрагідро-2H-піран-4-іл)аміно)-5-(метоксикарбоніл)-4метилфеніл)етиніл)піперидин-1-карбоксилат До розчину метил-5-бром-3-(етил(тетрагідро-2Н-піран-4-іл)аміно)-2-метилбензоату (1,80 г, 5,05 ммоль) та трет-бутил-4-етинілпіперидин-1-карбоксилату (1,80 г, 8,59 ммоль) в ДМФА (40 мл) додавали триетиламін (2,82 мл, 20,2 ммоль) та йодид міді(I) (0,096 г, 0,505 ммоль). Реакційну суміш дегазували шляхом барботування азотом протягом 15 хвилин. Потім вводили тетракіс(трифенілфосфін)паладій(0) (0,292 г, 0,253 ммоль) та дегазували протягом ще 10 хвилин шляхом барботування азотом. Реакційну суміш нагрівали при 80 °С протягом 6 годин. Реакцію гасили насиченим розчином NaHCO3, екстрагували МТБЕ (3×40 мл), сушили над Na2SO4, фільтрували та концентрували. Залишок очищали шляхом хроматографії (0%-40% 1 AcOEt/гептан) з одержанням сполуки, вказаної в заголовку (2,40 г, вихід 98%). H-ЯМР (500 МГц) δ ppm; 7,65 (s, 1H), 7,28 (s, 1H), 3,97 (brd, J = 11,3 Гц, 2H), 3,90 (s, 3H), 3,76 (m, 2H), 3,34 (dt, J = 2,0, 11,7 Гц, 2H), 3,24 (ddd, J = 3,4, 8,8, 12,2 Гц, 2H), 3,08 (brs, 2H), 2,98 (brs, 1H), 2,80 (dddd, J=3,9, 3,9, 3,9, 3,9 Гц, 1H), 2,52 (s, 3H), 1,87 (m, 2H), 1,60-1,74 (m, 6H), 1,48 (s, 9H), 0,89 (t, + J = 6,8 Гц, 3H) ); МС (ESI) [M+H] 485,4. 5-((1-(Трет-бутоксикарбоніл)піперидин-4-іл)етиніл)-3-(етил(тетрагідро-2H-піран-4-іл)аміно)-2метилбензойна кислота До розчину трет-бутил-4-((3-(етил(тетрагідро-2H-піран-4-іл)аміно)-5-(метоксикарбоніл)-4метилфеніл)етиніл)піперидин-1-карбоксилату (2,4 г, 4,95 ммоль) в етанолі (20,0 мл) додавали розчин гідроксиду натрію (0,565 г, 14,1 ммоль) у воді (3,0 мл) при кімнатній температурі. Реакційну суміш нагрівали при 60 °С протягом 6 годин. Реакційну суміш гасили 1 М HCl (5 мл), а потім надлишком розчину лимонної кислоти з доведенням рН до 5. Суміш концентрували з видаленням EtOH і водну фазу, що залишилася, екстрагували AcOEt (2×40 мл). Органічні фази об’єднували, сушили над Na2SO4, фільтрували та концентрували. Залишок очищали шляхом 22 UA 115074 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 хроматографії (10%-100% AcOEt/гептан) з одержанням сполуки, вказаної в заголовку (2,30 г, 1 вихід 99%). H-ЯМР (500 МГц) δ ppm; 7,82 (s, 1H), 7,35 (s, 1H), 3,98 (brd, J = 11,3 Гц, 2H), 3,77 (m, 2H), 3,35 (dt, J = 1,5, 11,3 Гц, 2H), 3,25 (ddd, J = 3,4, 8,3, 12,2 Гц, 2H), 3,11 (brs, 2H), 3,00 (brs, 1H), 2,81 (dddd, J=3,9, 3,9, 3,9, 3,9 Гц, 1H), 2,60 (s, 3H), 1,88 (m, 2H), 1,60-1,78 (m, 6H), 1,48 (s, 9H), + 0,90 (t, J = 6,8 Гц, 3H); МС (ESI) [M+H] 471,4. Трет-бутил-4-((3-(((4,6-диметил-2-оксо-1,2-дигідропіридин-3-іл)метил)карбамоїл)-5(етил(тетрагідро-2H-піран-4-іл)аміно)-4-метилфеніл)етиніл)піперидин-1-карбоксилат До розчину 5-((1-(трет-бутоксикарбоніл)піперидин-4-іл)етиніл)-3-(етил(тетрагідро-2H-піран-4іл)аміно)-2-метилбензойної кислоти (1,06 г, 2,25 ммоль) в ДМСО (5,8 мл) при кімнатній температурі додавали триетиламін (0,90 мл, 6,44 ммоль) та (4,6-диметил-2-оксо-1,2дигідропіридин-3-іл)метанамінію хлорид (0,405 г, 2,15 ммоль). Прозорий розчин робився гетерогенним. Потім додавали HOBT (0,493 г, 3,22 ммоль) та EDC (0,617 г, 3,22 ммоль), і одержану реакційну суміш перемішували при кімнатній температурі протягом ночі. Реакцію гасили водою (80 мл) та суспензію перемішували протягом 1 години при кімнатній температурі. Фільтрували суспензію та осад на фільтрі промивали водою (2×20 мл). Сушили зібрану тверду 1 речовину під вакуумом з одержанням сполуки, вказаної в заголовку (1,27 г, вихід 98%). H-ЯМР (500 МГц, CD3OD) δ ppm; 7,22 (s, 1H), 7,08 (d, J = 1,0 Гц 1H), 6,11 (s, 1H), 4,45 (s, 2H), 3,92 (brd, J = 10,8 Гц, 2H), 3,78 (dd, J =4,4, 5,4 Гц, 1H), 3,75 (dd, J =4,4, 5,4 Гц, 1H), 3,36 (t, J = 11,7 Гц, 2H), 3,21 (br t, J=8,3 Гц, 2H), 3,07 (q, J = 7,3 Гц, 2H), 3,01 (dddd, J=3,9, 3,9, 11,3, 11,3 Гц, 1H), 2,84 (dddd, J=3,4, 3,4, 3,9, 3,9 Гц, 1H), 2,38 (s, 3H), 2,28 (s, 3H), 2,25 (s, 3H), 1,88 (m, 2H), 1,70 ((brd, J + = 12,2 Гц, 2H), 1,60 (m, 4H), 1,47 (s, 9H), 0,87 (t, J = 7,3 Гц, 3H); МС (ESI) [M+H] 605,6. N-((4,6-Диметил-2-оксо-1,2-дигідропіридин -3-іл)метил)-3-(етил(тетрагідро-2H-піран-4іл)аміно)-2-метил-5-(піперидин-4-ілетиніл)бензамід До розчину трет-бутил-4-((3-(((4,6-диметил-2-оксо-1,2-дигідропіридин-3-іл)метил)карбамоїл)5-(етил(тетрагідро-2H-піран-4-іл)аміно)-4-метилфеніл)етиніл)піперидин-1-карбоксилату (250 мг, 0,413 ммоль) в ДХМ (3 мл) додавали 4 М HCl в 1,4-діоксані (3 мл, 12,0 ммоль) при 20 °С. Суміш перемішували при 20 °С протягом 1 години. РХ-МС показувала завершення реакції. Реакційну суміш напряму концентрували та залишок розчиняли в ДХМ, а потім нейтралізували насич. NaHCO3/сольовим розчином. Органічну фазу сушили (Na2SO4) та фільтрували. і фільтрат концентрували. Залишок використовували для алкілування без додаткової очистки (209 мг, 1 100%). H-ЯМР (500 МГц, CD3OD) δ ppm 7,21 (brs, 1H), 7,07 (brs, 1H), 6,11 (s, 1H), 4,46 (s, 2H), 3,95-3,89 (m, 2H), 3,39-3,34 (m, 2H), 3,08 (q, J = 7,0 Гц, 2H), 3,06-2,98 (m, 3H), 2,79-2,72 (m, 1H), 2,72-2,65 (m, 2H), 2,38 (s, 3H), 2,28 (s, 3H), 2,25 (s, 3H), 1,94-1,88 (m, 2H),1,73-1,68 (m, 2H), 1,68+ 1,56 (m, 4H), 0,85 (t, J = 7,0 Гц, 3H); МС (ESI) [M+H] 505,5. N-((4,6-Диметил-2-оксо-1,2-дигідропіридин-3-іл)метил)-3-(етил(тетрагідро-2H-піран-4іл)аміно)-2-метил-5-((1-метилпіперидин-4-іл)етиніл)бензамід До розчину N-((4,6-диметил-2-оксо-1,2-дигідропіридин-3-іл)метил)-3-(етил(тетрагідро-2Hпіран-4-іл)аміно)-2-метил-5-(піперидин-4-іл-етиніл)бензаміду (100 мг, 0,198 ммоль) в метанолі (5 23 UA 115074 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 мл) додавали 35% формальдегід в Н2О (0,155 мл, 1,98 ммоль) при 0 °С. Після перемішування при 0 °С протягом 10 хвилин додавали ціаноборогідрид натрію (24,9 мг, 0,396 ммоль). Одержану суміш перемішували при 0 °С протягом 1 години. РХ-МС показувала завершення реакції. Реакцію гасили насич. NaHCO3/сольовим розчином та екстрагували EtAOc/гептаном. Органічну фазу сушили (Na2SO4), фільтрували та концентрували. Залишок очищали шляхом хроматографії (10 г колонка, МеОН/ДХМ=1:9, а потім МеОН/7 М NH 3 в MeOH/ДХМ=1:1:8) з 1 одержанням сполуки, вказаної в заголовку (96,0 мг, 93%). H-ЯМР (500 МГц, CD3OD) δ ppm 7,22 (brs, 1H), 7,08 (brs, 1H), 6,10 (s, 1H), 4,46 (s, 2H), 3,94-3,87 (m, 2H), 3,35-3,30 (m, 2H), 3,07 (q, J = 7,0 Гц, 2H), 3,04-2,97 (m, 1H), 2,79-2,71 (m, 2H), 2,67-2,58 (m, 1H), 2,38 (s, 3H), 2,28 (s, 3H), 2,28 (s, 3H), 2,25 (s, 3H), 2,28-2,21 (m, 2H), 1,97-1,91 (m, 2H), 1,78-1,67 (m, 4H), 1,64-1,54 (m, 2H), 0,85 + (t, J = 7,0 Гц, 3H); МС (ESI) [M+H] 519,4. Приклад 2: Протокол та загальні методи біологічного аналізу Протокол аналізів ферментів дикого типу та мутантних ферментів PRC2 Загальні матеріали. S-аденозилметіонін (SAM), S-аденозилгомоцистеїн (SAH), біцин, KCl, Твін 20, диметилсульфоксид (ДМСО) та желатин шкіри великої рогатої худоби (BSG) придбали у 3 Sigma-Aldrich з максимально високим рівнем чистоти. Дитіотреїтол (DTT) придбали у EMD. HSAM придбали у American Radiolabeled Chemicals з питомою активністю 80 Кі/ммоль. 384лункові покриті стрептавідином планшети Flashplates придбали у PerkinElmer. Субстрати. Пептиди, характерні для залишків 21-44 гістону H3 людини, що містять чи то немодифікований лізин 27 (H3K27me0), чи то диметилований лізин 27 (H3K27me2), були синтезовані з С-кінцевою афінною міткою, що складається з гліцинового (G) лінкера та st біотинілованого лізину (K), та С-кінцевим амідним кепом компанією 21 Century Biochemicals. Вказані пептиди очищали шляхом високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) до ступеня чистоти, що становить більше 95%, та підтверджували шляхом рідинної хроматографії-масспектрометрії (РХ-МС). Послідовності наведені нижче. H3K27me0: ATKAARKSAPATGGVKKPHRYRPGGK(біотин)-амід (SEQ ID NO: 101) H3K27me2: ATKAARK(me2)SAPATGGVKKPHRYRPGGK(біотин)-амід (SEQ ID NO: 102) Олігонуклеосоми еритроцитів курчати виділяли з крові курчати згідно з визначеними процедурами. Рекомбінантні комплекси PRC2. Комплекси PRC2 людини очищали у вигляді 4компонентних ферментних комплексів, спільно експресованих в клітинах Spodoptera frugiperda (sf9) з використанням бакуловірусної системи експресії. Експресованими субодиницями були EZH2 (NM_004456) дикого типу або Y641F, N, H, S або C-мутанти EZH2, одержані з конструкції EZH2 дикого типу, EED (NM_003797), Suz12 (NM_015355) та RbAp48 (NM_005610). Субодиниця EED містила N-кінцеву FLAG-мітку, яку використовували для очистки усього 4-компонентного комплексу від клітинних лізатів sf9. Чистота комплексів відповідала або перевищувала 95% за даними електрофорезу в поліакриламідному гелі в присутності додецилсульфату натрію (SDSПААГ) та аналізу на Agilent Bioanalyzer. Вихідні концентрації ферментів (як правило, 0,3 - 1,0 мг/мл) визначали з використанням аналізу методом Бредфорда відносно стандарту - бичачого сироваткового альбуміну (BSA). Загальна процедура аналізів ферментів PRC2 з використанням пептидних субстратів. Усі аналізи виконували в буфері, що складається з 20 мМ біцину (рН = 7,6), 0,5 мМ DTT, 0,005% BSG та 0,002% Твін 20, приготовленому в день використання. Сполуки в 100% ДМСО (1 мкл) вносили в поліпропіленові 384-лункові планшети з V-подібним дном (Greiner) з використанням Platemate 2 X 3, обладнаного 384-канальною піпетуючою головкою (Thermo). ДМСО (1 мкл) додавали в колонки 11, 12, 23, 24, рядки А - H для контролю максимального сигналу, і SAH, відомий продукт та інгібітор PRC2 (1 мкл), додавали в колонки 11, 12, 23, 24, рядки I - P для контролю мінімального сигналу. Додавали коктейль (40 мкл), що містить фермент PRC2 дикого типу та пептид H3K27me0 або будь-який з Y641-мутантних ферментів та пептид H3K27me2, за допомогою Multidrop Combi (Thermo). Сполуки залишали інкубуватися спільно з PRC2 протягом 30 хвилин при 25 °С, потім додавали коктейль (10 мкл), що містить суміш нерадіоактивного та 3 H-SAM, для ініціації реакції (кінцевий об’єм = 51 мкл). В усіх випадках кінцеві концентрації були такими: концентрація ферменту дикого типу або мутантного ферменту PRC2 становила 4 нМ, концентрація SAH в лунках контролю мінімального сигналу становила 1 мМ, і концентрація ДМСО становила 1%. Кінцеві концентрації решти компонентів вказані в таблиці 2 нижче. Аналізи припиняли шляхом додавання нерадіоактивного SAM (10 мкл) до звичайної 3 концентрації 600 мкМ, який розводив H-SAM до рівня, при якому його включення в пептидний субстрат більше не було детектованим. Потім 50 мкл реакційної суміші з 384-лункового поліпропіленового планшета переносили в 384-лунковий планшет Flashplate та біотиніловані пептиди залишали зв’язуватися з покритою стрептавідином поверхнею протягом принаймні 1 24 UA 115074 C2 5 години перед промиванням три рази 0,1% Твін 20 в пристрої для промивання планшетів Biotek ELx405. Потім планшети зчитували на планшет-ридері TopCount PerkinElmer з вимірюванням 3 кількості H-міченого пептиду, зв’язаного з поверхнею Flashplate, вимірюваного як число розпадів за хвилину (dpm) або, як альтернатива, розглядуваного як число імпульсів за хвилину (cpm). Таблиця 2: Кінцеві концентрації компонентів для кожного варіанта аналізу на основі ідентичності EZH2 (EZH2 дикого типу або Y641-мутантний EZH2) Фермент PRC2 (позначений за ідентичністю EZH2) Дикий тип Y641F Y641N Y641H Y641S Y641C 10 15 20 25 30 35 40 Пептид (нM) 185 200 200 200 200 200 Нерадіоактивний SAM (нM) 1800 850 850 1750 1300 3750 3 H-SAM (нМ) 150 150 150 250 200 250 Загальна процедура аналізу ферменту PRC2 дикого типу з використанням субстрату, який є олігонуклеосомою. Аналізи виконували в буфері, що складається з 20 мМ біцину (рН = 7,6), 0,5 мМ DTT, 0,005% BSG та 0,002% Твін 20, приготовленому в день використання. Сполуки в 100% ДМСО (1 мкл) вносили в поліпропіленові 384-лункові планшети з V-подібним дном (Greiner) з використанням Platemate 2 X 3, обладнаного 384-канальною піпетуючою головкою (Thermo). ДМСО (1 мкл) додавали в колонки 11, 12, 23, 24, рядки А – H, для контролю максимального сигналу, і SAH, відомий продукт та інгібітор PRC2 (1 мкл) додавали в колонки 11, 12, 23, 24, рядки I – P, для контролю мінімального сигналу. Додавали коктейль (40 мкл), що містить фермент PRC2 дикого типу та олігонуклеосому еритроцитів курчати, за допомогою Multidrop Combi (Thermo). Сполуки залишали інкубуватися спільно з PRC2 протягом 30 хвилин при 25 °С, 3 потім додавали коктейль (10 мкл), що містить суміш нерадіоактивного та H-SAM, для ініціації реакції (кінцевий об’єм = 51 мкл). Кінцеві концентрації були такими: концентрація ферменту PRC2 дикого типу становила 4 нМ, концентрація нерадіоактивного SAM становила 430 нМ, 3 концентрація H-SAM становила 120 мМ, концентрація олігонуклеосоми еритроцитів курчати становила 120 нМ, концентрація SAH в лунках контролю мінімального сигналу становила 1 мМ, і концентрація ДМСО становила 1%. Аналіз припиняли шляхом додавання нерадіоактивного 3 SAM (10 мкл) до звичайної концентрації 600 мкМ, який розводив H-SAM до рівня, при якому його включення в субстрат, який був олігонуклеосомою еритроцитів курчати, більше не було детектованим. Потім 50 мкл реакційної суміші з 384-лункового поліпропіленового планшета переносили в 384-лунковий планшет Flashplate та нуклеосоми еритроцитів курчати іммобілізували на поверхні планшета, який потім три рази промивали 0,1% Твін 20 в пристрої для промивання планшетів Biotek ELx405. Потім планшети зчитували на планшет-ридері 3 TopCount PerkinElmer з вимірюванням кількості H-міченої олігонуклеосоми еритроцитів курчати, зв’язаної з поверхнею Flashplate, вимірюваної як число розпадів за хвилину (dpm) або, як альтернатива, розглядуваного як число імпульсів за хвилину (cpm). Розрахунок % інгібування Де dpm = число розпадів за хвилину, сп. = сигнал в аналітичній лунці, і min та max є відповідними контролями мінімального та максимального сигналу. Чотирипараметричне підганяння IC50 Де звичайно допускаються коливання максимального значення та мінімального значення, але вони можуть бути зафіксовані на рівні 100 або 0 відповідно при 3-параметричному підганянні. Звичайно допускається коливання коефіцієнта Хілла, але він також може бути зафіксований на рівні 1 при 3-параметричному підганянні. Y є % інгібування, а Х є концентрацією сполуки. 25 UA 115074 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Значення IC50 для аналізів ферментів PRC2 з використанням пептидних субстратів (наприклад, EZH2 дикого типу та Y641F) представлені в таблиці 3 нижче. Аналіз метилування WSU-DLCL2 Суспензію клітин WSU-DLCL2 придбали у Німецької колекції мікроорганізмів та клітинних культур (DSMZ, Брауншвейг, Німеччина). Середовище RPMI/Glutamax, пеніцилін-стрептоміцин, термоінактивовану фетальну бичачу сироватку та Д-ФБР придбали у Life Technologies, ГрандАйленд, Нью-Йорк, США. Буфер для екстракції та буфер для нейтралізації (5×) придбали у Active Motif, Карлсбад, Каліфорнія, США. Антитіла кроля до гістону H3 придбали у Abcam, Кембридж, Масачусетс, США. Антитіла кроля до H3K27me3 та HRP-кон’юговані антитіла до IgG кроля придбали у Cell Signaling Technology, Данверс, Масачусетс, США. «Суперчутливий» субстрат TMB одержували від BioFX Laboratories, Оуїнгс Мілс, Меріленд, США. Бичачий сироватковий альбумін, що не містить IgG, придбали у Jackson ImmunoResearch, Вест Грув, Пенсільванія, США. ФБР з Твін (10× ФБР-T) придбали у KPL, Гейтерсберг, Меріленд, США. Сірчану кислоту придбали у Ricca Chemical, Арлінгтон, Техас, США. Планшети Immulon для твердофазового імуноферментного аналізу (ELISA) придбали у Thermo, Рочестер, Нью-Йорк, США. Планшети для культур клітин з V-подібним дном придбали у Corning Inc., Корнінг, НьюЙорк, США. Поліпропіленові планшети з V-подібним дном придбали у Greiner Bio-One, Монро, Північна Кароліна, США. Суспензію клітин WSU-DLCL2 витримували в живильному середовищі (RPMI 1640 з додаванням 10% об./об. термоінактивованої фетальної бичачої сироватки та 100 одиниць/мл пеніциліну-стрептоміцину) та культивували при 37 °С в атмосфері 5% СО 2. В умовах аналізу клітини інкубували в середовищі для аналізу (RPMI 1640 з додаванням 20% об./об. термоінактивованої фетальної бичачої сироватки та 100 одиниць/мл пеніциліну-стрептоміцину) при 37 °С в атмосфері 5% СО2 на шейкері для планшетів. Клітини WSU-DLCL2 висівали в середовищі для аналізу в концентрації 50000 клітин на мл в 96-лункові планшети для культур клітин з V-подібним дном по 200 мкл на лунку. Сполуку (1 мкл) з 96-лункових вихідних планшетів додавали безпосередньо в клітинний планшет з V-подібним дном. Планшети інкубували на шейкері для титрувальних планшетів при 37 °С, 5% СО2 протягом 96 годин. Після чотирьох днів інкубації планшети центрифугували при 241×g протягом п’яти хвилин та середовище обережно аспірували з кожної лунки клітинного планшета, не розбурхуючи осад клітин. Осад ресуспендували в 200 мкл Д-ФБР та планшети снова центрифугували при 241×g протягом п’яти хвилин. Аспірували надосадову рідину та в кожну лунку додавали холодний (4 °С) буфер для екстракції (100 мкл). Планшети інкубували при 4 °С на орбітальному шейкері протягом двох годин. Планшети центрифугували при 3427×g×10 хвилин. Надосадову рідину (80 мкл на лунку) переносили в відповідну лунку в 96-лунковий поліпропіленовий планшет з V-подібним дном. В поліпропіленовий планшет з V-подібним дном, що містить надосадову рідину, додавали буфер для нейтралізації 5× (20 мкл на лунку). Поліпропіленові планшети з V-подібним дном, що містять неочищений препарат гістонів (CHP), інкубували на орбітальному шейкері × п’ять хвилин. Неочищені препарати гістонів додавали (2 мкл на лунку) в кожну відповідну лунку в паралельні 96-лункові планшети (дублікати) для ELISA, що містять 100 мкл покриваючого буфера (1× ФБР + BSA 0,05% мас./об.). Планшети герметизували та інкубували протягом ночі при 4 °С. Наступного дня планшети три рази промивали 1X ФБР-T 300 мкл на лунку. Лунки блокували протягом двох годин 300 мкл на лунку розріджувача для ELISA ((ФБР (1×) BSA (2% мас./об.) та Твін 20 (0,05% об./об.)). Планшети три рази промивали 1× ФБР-T. Для планшета для детектування гістону Н3 додавали 100 мкл на лунку антитіл до гістону Н3 (Abcam, ab1791), розведених 1:10000 в розріджувачі для ELISA. Для планшета для детектування триметилування H3K27 додавали 100 мкл на лунку антиH3K27me3, розведених 1:2000 в розріджувачі для ELISA. Планшети інкубували протягом 90 хвилин при кімнатній температурі. Планшети три рази промивали 300 мкл 1X ФБР-T на лунку. Для детектування гістону H3 додавали 100 мкл HRP-кон’югованих антитіл до IgG кроля, розведених 1:6000 в розріджувачі для ELISA, на лунку. Для детектування H3K27me3 додавали 100 мкл HRP-кон’югованих антитіл до IgG кроля, розведених 1:4000 в розріджувачі для ELISA, на лунку. Планшети інкубували при кімнатній температурі протягом 90 хвилин. Планшети чотири рази промивали 300 мкл 1× ФБР-T на лунку. Додавали 100 мкл субстрату TMB на лунку. Планшети з гістоном H3 інкубували протягом п’яти хвилин при кімнатній температурі. Планшети H3K27me3 інкубували протягом 10 хвилин при кімнатній температурі. Реакцію зупиняли 1Н сірчаною кислотою (100 мкл на лунку). Поглинання для кожного планшета зчитували при 450 нм. Спочатку визначали співвідношення для кожної лунки: 26 UA 115074 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 Кожен планшет містив вісім контрольних лунок для обробки тільки ДМСО (мінімальне інгібування), а також вісім контрольних лунок для максимального інгібування (фонові лунки). Розраховували середні значення співвідношення для кожного контрольного типу та використовували їх для визначення процента інгібування для кожної тестованої лунки в планшеті. Тестовану сполуку піддавали серійному трикратному розведенню в ДМСО для одержання усього десяти тестованих концентрацій, починаючи з 25 мкМ. Визначали процент інгібування та одержували криві IC50 з використанням дублікатів лунок для кожної концентрації сполуки. Значення IC50 для даного аналізу представлені в таблиці 3 нижче. Процент інгібування = 100 Аналіз проліферації клітин Суспензію клітин WSU-DLCL2 придбали у DSMZ (Німецька колекція мікроорганізмів та клітинних культур, Брауншвейг, Німеччина). Середовище RPMI/Glutamax, пеніцилінстрептоміцин, термоінактивовану фетальну бичачу сироватку придбали у Life Technologies, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США. Поліпропіленові 384-лункові планшети з V-подібним дном придбали у Greiner Bio-One, Монро, Північна Кароліна, США. 384-лункові білі непрозорі планшети для культур клітин придбали у Perkin Elmer, Уолтем, Масачусетс, США. Cell-Titer Glo® придбали у Promega Corporation, Медісон, Вісконсин, США. Планшет-ридер SpectraMax M5 придбали у Molecular Devices LLC, Саннівейл, Каліфорнія, США. Суспензію клітин WSU-DLCL2 витримували в живильному середовищі (RPMI 1640 з додаванням 10% об./об. термоінактивованої фетальної бичачої сироватки) та культивували при 37 °С в атмосфері 5% СО2. В умовах аналізу клітини інкубували в середовищі для аналізу (RPMI 1640 з додаванням 20% об./об. термоінактивованої фетальної бичачої сироватки та 100 одиниць/мл пеніциліну-стрептоміцину) при 37 °С в атмосфері 5% СО2. Для оцінки впливу сполук на проліферацію лінії клітин WSU-DLCL2 клітини, що експоненціально ростуть, висівали в 384-лункові білі непрозорі планшети з щільністю 1250 клітин/мл в звичайному об’ємі 50 мкл середовища для аналізу. Підготовлювали вихідний планшет зі сполукою шляхом проведення 3-кратних серійних розведень з одержанням розчинів 9 концентрацій, одержаних в трьох повторах, в ДМСО, починаючи з 10 мМ (кінцева максимальна концентрація сполуки в аналізі становила 20 мкМ, а для ДМСО становила 0,2%). 100 нл аліквоту з вихідного планшета зі сполукою додавали в відповідну лунку в клітинному планшеті. Контроль, що демонструє 100% інгібування, складався з клітин, оброблюваних 200 нМ звичайною концентрацією стауроспорину, та контроль, що демонструє 0% інгібування, складався з клітин, оброблюваних ДМСО. Після додавання сполук аналітичні планшети інкубували протягом 6 днів при 37 °С, 5% СО 2, відносній вологості >90% протягом 6 днів. Життєздатність клітин вимірювали по квантуванню АТФ, присутнього в культурах клітин, додаючи 35 мкл реагенту Cell Titer Glo® в клітинні планшети. Люмінесценцію зчитували на SpectraMax M5. Концентрацію, що інгібує життєздатність клітин на 50%, визначали з використанням 4-параметричного підганяння нормалізованих кривих доза-відповідь. Значення IC50 для даного аналізу також представлені в таблиці 3 нижче. Мас-спектральні дані для даних сполук також наведені в таблиці 3 нижче. Таблиця 3 № сполуки 1 2 105 45 50 IC50 EZH2, ELISA H3K27me3, Проліферація WSU, WT EZH2, IC50 пептид v2 IC50 (мкM) IC50 (мкM) (мкM) (мкM) 0,077 0,0230