Профілактика або лікування запальної хвороби

Реферат: UA 100116 C2 ДЕРЖАВНА СЛУЖБА ІНТЕЛЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ УКРАЇНИ UA 100116 C2 Винахід належить до способу профілактики або лікування запальної хвороби такої як атопічний дерматит, хронічний дерматит, ревматизм або остеоартрит, який включає етап введення пацієнту із запальною хворобою антитіла або фрагмента/модифікованого фрагмента проти NR10/IL-31RA, що має NR10/IL-31RA-нейтралізуючу активність. Також винахід належить до застосування антитіла або фрагмента/модифікованого фрагмента до NR10/IL-31RA, що має NR10/IL-31RA-нейтралізуючу активність, як активного інгредієнта для профілактики або лікування запальної хвороби. UA 100116 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь техніки Цей винахід стосується нових агентів для профілактики або лікування запалювальних хвороб, які включають антагоністи NR 10 як активні інгредієнти. Цей винахід також стосується способів профілактики або лікування запалювальних хвороб, при яких застосовуються антагоністи NR 10. Попередній рівень техніки Відомо багато цитокінів, які є гуморальними факторами, що беруть участь у зростанні та диференціації різних типів клітин або в активації функцій диференційованих зрілих клітин. Цитокін-стимульовані клітини виробляють різні типи цитокінів, тим самим утворюючи мережі численних цитокінів у тілі. Біологічний гомеостаз підтримується завдяки тонкому балансу взаємної регуляції між цитокінами у цих мережах. Вважається, що багато запалювальних захворювань є результатом руйнування таких цитокінних мереж. Отже, багато уваги привертає антицитокінна терапія, що базується на моноклональних антитілах. Наприклад, продемонстровано, що антитіла до TNF та антитіла до рецептора IL-6 є надзвичайно ефективними з клінічної точки зору. З іншого боку, існує багато прикладів, де внаслідок активації компенсаторних шляхів у реальних патологічних станах не отримували ніякого терапевтичного ефекту, коли блокувався тільки єдиний цитокін, такий як IL-4. Автори цього винаходу досягли успіху у виділенні нового цитокінного рецептора NR 10, який був надзвичайно гомологічним з gp130, рецептором для сигнальної трансдукції IL-6 (патентний документ 1). NR 10 утворює гетеродимер з рецептором онкостатину М (OSMR) та функціонує як рецептор IL-31 (непатентний документ 1). Zymogenetics, Inc. повідомляли, що у трансгенних мишей, які надмірно експресують IL-31, спонтанно розвивався сверблячий дерматит (патентний документ 2). Проте, не можна стверджувати, що примусова експресія цитокіну у мишей або високий рівень цитокіну у крові у патологічній моделі-миші є насправді причиною хвороби. Не існує інформації про те, чи виникає будь-який терапевтичний ефект, коли сигнал блокується антитілом. Наприклад, сверблячий дерматит розвивається у трансгенних мишей, у яких IL-18 надмірно експресується в кератиноцитах. Крім того, концентрація IL-18 у крові підвищується з прогресуванням патологічних станів у мишачій моделі NC/Nga спонтанного атопічного дерматиту. На підставі вищезазначених даних передбачили, що надмірна експресія IL-18 є причиною хвороби. Проте, насправді, введення нейтралізуючих антитіл не призводило до будьякого терапевтичного ефекту (непатентний документ 2). Як описано вище, інгібування функції цитокіну необов’язково спричиняє терапевтичний ефект у лікуванні хвороб, при яких рівень експресії цитокіну підвищується. На підставі рівня експресії цитокіну важко передбачити хвороби, при яких терапевтичний ефект дійсно виникає. Отже, важливо визначити хвороби, при яких інгібування сигнальної трансдукції цитокіну-мішені дійсно спричиняє терапевтичні ефекти. Документи попереднього рівня галузі цього винаходу наведено далі. Патентний документ 1: WO 00/75314. Патентний документ 2: WO 03/060090. Непатентний документ 1: "IL-31 is associated with cutaneous lymphocyte antigen-positive skin homing T cells in patients with atopic dermatitis" ("IL-31 пов’язується з шкірними лімфоцитними антиген-позитивними хомінговими Т-клітинами шкіри у пацієнтів з атопічним дерматитом"), J Allergy Clin Immunol. 2006 Feb; 117(2): 418-25. Непатентний документ 2: "Administration of anti-interleukin 18 antibody fails to inhibit development of dermatitis in atopic dermatitis-model mice NC/Nga" ("Введення антитіла антиінтерлейкіну 18 не спричиняє інгібування розвитку дерматиту у мишачій моделі NC/Nga з атопічним дерматитом"), British Journal of Dermatology 149: 39-45, 2003. Суть винаходу Задачі, що вирішуються винаходом Цей винахід був розроблений внаслідок обставин, описаних вище. Завданням цього винаходу є забезпечення терапії із застосуванням анти-цитокіну на основі антагоніста рецептора цитокіну для лікування запалювальних хвороб. Більш специфічно, мета цього винаходу - визначити запалювальні хвороби,при яких можна досягти терапевтичного ефекту завдяки нейтралізуючим антитілам до NR 10, та створити нові способи лікування таких хвороб. Іншим завданням цього винаходу є створення нейтралізуючих антитіл до NR 10 людини, які можна застосовувати до людей у клінічних умовах. Засоби для вирішення задач Автори цього винаходу здійснювали точні дослідження, щоб вирішити вище зазначені задачі. Автори цього винаходу намагалися визначити на мишачих моделях різних патологічних 1 UA 100116 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 станів ефективність нейтралізуючих антитіл до NR 10 як ліків. Результати продемонстрували, що нейтралізуючі антитіла спричиняли помітний ефект пригнічення симптомів у мишачих моделях атопічного дерматиту, де застосовували мишей NC/Nga, та у мишачих моделях хронічного дерматиту, який був наслідком багаторазового прикладання пікрилхлориду. Це довело, що нейтралізуючі антитіла були насправді корисними як терапевтичні агенти. Крім того, продемонстрували, що антитіла спричиняли ефект пригнічення симптомів при індукованому колагеном артриті, у моделі ревматизму, та при індукованому колагеназою артриті, у моделі остеоартриту. Ці результати дозволяють припустити, що NR 10-нейтралізуючі антитіла цього винаходу можна застосовувати для профілактики або лікування хронічного запалення. Авторам цього винаходу також вдалося отримати нейтралізуючі антитіла до NR 10 людини. Детальніше, цим винаходом пропонуються: [1] агент для профілактики або лікування запалювальної хвороби, де агент включає антагоніст NR 10 як активний інгредієнт; [2] профілактичний або терапевтичний агент за [1], де антагоніст NR 10 - це антитіло, що має NR 10-нейтралізуючу активність; [3] профілактичний або терапевтичний агент за [2], де антитіло - це моноклональне антитіло; [4] профілактичний або терапевтичний агент за [2], де антитіло - це моноклональне антитіло, що має нейтралізуючу активність стосовно NR 10 людини; [5] профілактичний або терапевтичний агент за будь-яким від [2] до [4], де антитіло - це рекомбінантне антитіло; [6] профілактичний або терапевтичний агент за [5], де рекомбінантне антитіло - це химерне антитіло, гуманізоване антитіло або антитіло людини; [7] профілактичний або терапевтичний агент за будь-яким від [2] до [6], де агент включає, як активний інгредієнт, фрагмент та/або модифікований фрагмент антитіла з NR 10нейтралізуючою активністю; [8] профілактичний або терапевтичний агент за будь-яким від [1] до [7], де запалювальна хвороба - це атопічний дерматит; [9] профілактичний або терапевтичний агент за будь-яким від [1] до [7], де запалювальна хвороба - це хронічний дерматит; [10] профілактичний або терапевтичний агент за будь-яким від [1] до [7], де запалювальна хвороба - це ревматизм; [11] профілактичний або терапевтичний агент за будь-яким від [1] до [7], де запалювальна хвороба - це остеоартрит; [12] антитіло, що має NR 10-нейтралізуючу активність; [13] антитіло за [12], яке є моноклональним антитілом; [14] антитіло за [12], де NR 10 - це NR 10 людини; [15] антитіло за будь-яким від [12] до [14], яке є рекомбінантним антитілом; [16] антитіло за [15], де рекомбінантне антитіло - це химерне антитіло, гуманізоване антитіло або антитіло людини; [17] фрагмент та/або модифікований фрагмент антитіла у відповідності з будь-яким від [12] до [16]; [18] спосіб профілактики або лікування запалювальної хвороби, який включає етап введення антагоніста NR 10 пацієнту із запалювальною хворобою; та [19] застосування антагоніста NR 10 для виробництва агента для профілактики або лікування запалювальної хвороби. Стислий опис ілюстративних матеріалів Фіг. 1 - це графік, який демонструє результат, отриманий шляхом спостерігання ефекту пригнічення клітинного росту антитілом BM095, доданим до системи аналізу клітинного росту із застосуванням IL-31-залежних клітин Ba/F3. Горизонтальна вісь вказує розрахункові концентрації mIL-31 в аналітичній системі, а вертикальна вісь вказує кількість клітин (OD450 (оптична густина) (поглинання при 450 нм)). Кількість доданого ВМ095 (одиниця: нг/мл) наведена в умовних позначеннях до фігури. Спостерігали ефект пригнічення клітинного росту, залежний від кількості доданого ВМ095. Фіг. 2 - це графік, що демонструє терапевтичний ефект, який отримали, коли антитіла до NR 10 вводили у мишачі моделі атопічного дерматиту. Суттєвий ефект пригнічення запалення спостерігали у групі, якій ввели антитіло до NR 10, порівняно з негативною контрольною групою (група, якій вводили носій). Фіг. 3 - це графік, що демонструє послідовну зміну маси тіла після введення антитіл до NR10 мишачим моделям атопічного дерматиту. Втрату маси спостерігали у групі, якій ввели існуючий протизапальний агент. Навпаки, ніяких змін маси не визначили у групі, якій вводили антитіло до 2 UA 100116 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 NR 10. Отже, було доведено, що антитіло до NR 10 є безпечним. Фіг. 4 - це графік, що демонструє терапевтичний ефект, який є наслідком введення антитіл до NR 10 мишачим моделям хронічного дерматиту. Суттєвий ефект пригнічення набряку вушної раковини спостерігали у групі, якій ввели антитіло до NR 10. Фіг. 5 - це фотографія, що демонструє імуногістохімічне забарвлення вушної раковини у мишачій моделі хронічного дерматиту. Як і у випадку з людьми, визначили, що експресія NR 10 миші підвищується у стовщеному епідермісі. Фіг. 6 - це графік, що демонструє ефект пригнічення артриту, спричинений, коли антитіла до NR 10 вводили мишачим моделям індукованого колагеном артриту. Фіг. 7 - це графік, що демонструє взаємозв’язок між ділянкою під кривою (AUC) та концентрацією ВМ095, введеного моделі індукованого колагеназою артриту (остеоартриту). AUC означає ділянку під кривою переходу різниці між шириною правого та лівого колінного суглоба, що визначається як показник, який репрезентує опухання у правому колінному суглобі. Фіг. 8 - це графік, що демонструє кореляцію між концентрацією нейтралізуючих NR 10 антитіл людини (очищене антитіло) та активністю пригнічення клітинного росту у присутності IL31. Антитіла 1, 2 та 3 демонстрували сильну NR 10-нейтралізуючу активність. Фіг. 9 - це графік, що демонструє кореляцію між концентрацією химерного антитіла NА633 до NR 10 людини та активність пригнічення клітинного росту у присутності IL-31. NA633 демонстрував сильну NR 10-нейтралізуючу активність. Фіг. 10 - це діаграма, яка порівнює амінокислотні послідовності NR 10 людини та NR 10 мавпи cynomolgus. Подвійно підкреслена послідовність вказує на трансмембранну ділянку. Фіг. 11 - це графік, що демонструє активність химерного антитіла NA633 щодо пригнічення клітинного росту в стимульованій IL-31 людини клітинній лінії NR 10 мавпи cynomolgus / OSMR/BaF людини. NA633 також демонстрував NR 10-нейтралізуючу активність у мавпи cynomolgus. Фіг. 12 - це графік, що демонструє перебіг зміни маси тіла у відсотках у мишачих моделях коліту DSS. Фіг. 13 - це графік, що демонструє перебіг зміни товщини вушної раковини у моделі гострого контактного дерматиту при прикладанні пікрилхлориду. Переважні варіанти здійснення винаходу Цей винахід стосується агентів для профілактики або лікування запалювальних хвороб, які включають антагоністи NR 10 як активні інгредієнти. В основу цього винаходу покладено відкриття авторів цього винаходу, а саме те, що антагоністи NR 10 (наприклад, нейтралізуючі антитіла до NR 10) суттєво пригнічують симптоми у мишачих моделях атопічного дерматиту, хронічного дерматиту, ревматизму, остеоартриту тощо. NR 10 - це білок, що утворює гетеродимер з рецептором онкостатину М (OSMR) та функціонує як рецептор IL-31. Відомі також інші назви NR 10, такі як glm-r (J Biol Chem 277, 16831-6, 2002), GPL (J Biol Chem 278, 49850-9, 2003) та IL-31RA (Nat Immunol 5, 752-60, 2004). NR 10 цього винаходу включає білки, які мають такі назви. NR 10 цього винаходу також включає NR 10, що походить від людини, мишей та інших ссавців. Переважний NR 10 включає NR 10, що походить від людини та миші, проте не обмежується тільки ними. Існує багато відомих варіантів сплайсингу NR 10, що походить від людини (WO 00/075314). Одним з описаних вище варіантів сплайсингу є NR 10.1, який складається з 662 амінокислот та включає трансмембранний домен. NR 10.2 - це розчинний рецептор-подібний білок, який складається з 252 амінокислот без трансмембранного домену. Між тим, відомі варіанти сплайсингу NR 10, які функціонують як трансмембранні рецепторні білки, включають NR 10.3 та IL-31RAv3. NR 10 людини цього винаходу особливо не обмежується, доки він утворює гетеродимер з рецептором онкостатину М (OSMR) та функціонує як рецептор IL-31. Переважні NR 10 включають NR 10.3 (також називається ILRAv4 (Nat Immunol 5, 752-60, 2004)) та IL-31RAv3. NR 10.3 (IL-31RAv4) складається з 662 амінокислот (WO 00/075314; Nat Immunol 5, 752-60, 2004), а IL-31RAv3 складається з 732 амінокислот (GenBank Accession No: NM_139017). Амінокислотну послідовність IL-31RAv4 наведено у SEQ ID NO: 6, а амінокислотну послідовність IL-31RAv3 наведено у SEQ ID NO: 7. Між тим, NR 10, що походить від миші, включає білки, які включають амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 5. Антагоністи NR 10 цього винаходу відносяться до речовин, які зв’язуються з NR 10 та блокують внутрішньоклітинну сигнальну трансдукцію на основі активації NR 10, тим самим спричиняючи втрату або пригнічення фізіологічної активності клітин. У цьому описі фізіологічна активність включає, наприклад, активність індукувати або пригнічувати виробництво фізіологічно активних речовин (наприклад, хемокінів та запалювальних цитокінів), активність підвищувати або пригнічувати секрецію цих речовин, активність росту, активність, що індукує 3 UA 100116 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ріст, активність виживання, активність диференціації, активність, що індукує диференціацію, транскрипційну активність, активність мембранного транспорту, зв’язувальну активність, протеолітичну активність, активність фосфориляції/дефосфориляції, окиснювальновідновлювальну активність, активність переносу, нуклеотичну активність, активність дегідратації, активність, що індукує клітинну смерть, та активність, що індукує апоптоз, проте не обмежується цими видами активності. Наявність активності антагоніста можна визначити за способами, відомими фахівцям у галузі. Наприклад, випробувані сполуки приводять у контакт з NR 10, що експресується на поверхні клітин у присутності ліганду, та при цьому визначається, чи генерується або не генерується внутрішньоклітинна сигнальна трансдукція, яка є індикатором активності NR 10. Таке визначення можна здійснити, наприклад, за способом, описаним у документі "Dillon SR, et al., Interleukin 31, a cytokine produced by activated T cells, induces dermatitis in mice. Nat Immunol. 2004 Jul; 5(7):752-60". Вважають, що сполуки, що інгібують внутрішньоклітинну сигнальну трансдукцію у відповідь на стимуляцію лігандом, служать як антагоністи NR 10. Антагоністи цього винаходу можуть бути природними або штучними сполуками. Відомі сполуки можна застосовувати як антагоністи цього винаходу. Можна також застосовувати нові сполуки, активність антагоніста яких визначають за способами, описаними вище. У варіанті здійснення цього винаходу антагоністи NR 10 включають антитіла, що мають NR 10-нейтралізуючу активність. Вираз "антитіла, що мають NR 10-нейтралізуючу активність" цього винаходу означає антитіла, що мають активність пригнічення фізіологічної активності на основі NR 10. "Антитіла, що мають NR 10-нейтралізуючу активність" цього винаходу можуть бути поліклональними або моноклональними антитілами, та у переважному варіанті здійснення включають моноклональні антитіла. Такі моноклональні антитіла, що мають NR 10-нейтралізуючу активність, можна отримати, наприклад, шляхом виконання наступної процедури: моноклональні антитіла до NR 10 готують шляхом застосування антигену NR 10 або його фрагмента, що походить від ссавця, такого як людина або миша, застосовуючи відомі способи, а потім антитіла, які мають NR 10нейтралізуючу активність вибираються з отриманих таким способом моноклональних антитіл до NR 10. Детальніше, імунізації досягають за традиційними способами імунізації, застосовуючи як сенсибілізуючий антиген бажаний антиген або клітини, що експресують бажаний антиген. Моноклональні антитіла до NR 10 можна приготувати шляхом зливання отриманих імунних клітин з відомими батьківськими клітинами, застосовуючи традиційні способи злиття клітин, та скринінгування їх на присутність моноклональних клітин, що виробляють антитіла (гібридоми), застосовуючи традиційні способи скринінгу. Тварини, яких слід імунізувати, включають, наприклад, ссавців, таких як миші, щури, кролі, вівці, мавпи, кози, осли, корови, коні та свині. Антиген можна приготувати, застосовуючи відому генну послідовність NR 10 згідно з відомими способами, наприклад, способами, що застосовують бакуловірус (наприклад, WO 98/46777). Як далі описано у Прикладах цього опису винаходу, антитіла, що мають NR 10-нейтралізуючу активність, можна вибирати, наприклад, шляхом тестування ефекту пригнічення росту IL-31залежної клітинної лінії після того, як антитіло-кандидат додається до клітин IL-31-залежної клітинної лінії. Вважають, що антитіла, які пригнічують ріст IL-31-залежної клітинної лінії в описаних вище способах, мають NR 10-нейтралізуючу активність. Гібридоми можна приготувати, наприклад, згідно зі способом Milstein et al. (Kohler, G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46) або подібним. Коли імуногенність антигену є низькою, імунізацію можна здійснювати після зв’язування антигену з макромолекулою, що має імуногенність, такою як альбумін. У переважному варіанті здійснення цього винаходу антитіла, що мають NR 10нейтралізуючу активність, включають моноклональні антитіла, що мають активність нейтралізації NR 10 людини. Не існує жодного певного обмеження стосовно імуногену для приготування моноклональних антитіл, що мають активність нейтралізації NR 10 людини, доки існує можливість приготування антитіл, що мають активність нейтралізації NR 10 людини. Наприклад, відомо, що існує багато варіантів NR 10 людини. Будь-які варіанти можна застосовувати як імуногени, доки існує можливість приготування антитіл, що мають активність нейтралізації NR 10 людини. Альтернативно, пептидний фрагмент NR 10 або природну послідовність NR 10, що вводиться зі штучними мутаціями, можна застосовувати як імуноген за однаковими умовами. NR 10.3 людини є переважним імуногеном для приготування антитіл цього винаходу, які мають NR 10-нейтралізуючу активність. У цьому описі винаходу описаними вище антитілами цього винаходу особливо не обмежуються, доки вони мають NR 10-нейтралізуючу активність. Антитіла також включають рекомбінантні антитіла, такі як химерні антитіла, гуманізовані антитіла та антитіла людини. 4 UA 100116 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Химерні антитіла включають, наприклад, константні ділянки важкого та легкого ланцюгів антитіла людини та варіабельні ділянки важкого та легкого ланцюгів ссавця, окрім людини, такого як миша. Химерні антитіла можна отримати за відомими способами. Наприклад, антитіла можна отримати шляхом клонування гена антитіла з гібридом, вставляючи його у відповідний вектор, та введення цієї конструкції до хазяїнів (дивись, наприклад, Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, що опубліковано в Сполученому Королівстві MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990). Детальніше, кДНК варіабельних ділянок антитіла (V-ділянки) синтезують з мРНК гібридом, застосовуючи ревертазу. Якщо отримують ДНК, що кодують V-ділянки антитіла вставки, вони зв’язуються з ДНК, що кодують константні ділянки (С-ділянки) бажаного антитіла людини. Отримані конструкції вставляються у вектори експресії. Альтернативно, ДНК, що кодують варіабельні ділянки антитіла, можна вставити у вектори експресії, які включають ДНК, які кодують константні ділянки антитіла людини. ДНК вставляють у вектори експресії так, щоб вони експресувалися під керуванням ділянок регулювання експресії, наприклад, енхансерів та промоторів. На наступному кроці клітини-хазяї можна трансформувати векторами експресії, щоб сприяти експресії химерних антитіл. Гуманізоване антитіло, яке також називають антитілом людини зі зміненою формою, отримують шляхом заміни гіперваріабельної ділянки (CDR) антитіла ссавця, окрім людини, такого як миша, гіперваріабельною ділянкою антитіла людини. Є також відомими традиційні способи генної рекомбінації для приготування таких антитіл. Детальніше, послідовність ДНК, побудована для зшивання гіперваріабельної ділянки антитіла миші з рамковими ділянками (FRs) антитіла людини, синтезуються шляхом ПЛР, застосовуючи декілька олігонуклеотидів, побудованих так, щоб включати частини, що перекриваються, на їх кінцях. Гуманізоване антитіло можна отримати шляхом (1) зшивання отриманої ДНК з ДНК, що кодує константну ділянку антитіла людини; (2) включення цього у вектор експресії; та (3) трансфектування вектора в хазяїна, щоб отримати антитіло (див. заявку на європейський патент EP 239400 та публікацію міжнародної заявки на патент № WO 96/02576). Рамкові ділянки антитіла людини, які зшиваються за допомогою гіперваріабельної ділянки, вибираються там, де гіперваріабельна ділянка утворює переважний антиген-зв’язувальний сайт. При необхідності амінокислоти у рамковій ділянці варіабельної ділянки антитіла можуть бути заміщені так, щоб гіперваріабельна ділянка антитіла людини зі зміненою формою утворювала відповідний антиген-зв’язувальний сайт (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856). Також відомими є способи отримання антитіл людини. Наприклад, бажані антитіла людини з антиген-зв’язувальною активністю можна отримати шляхом (1) синтезування лімфоцитів людини з антигенами вставки або клітинами, що експресують антигени вставки in vitro; та (2) зливання синтезованих лімфоцитів з клітинами мієломи людини, такими як U266 (див. патентну заявку Японії, що успішно пройшла експертизу № (JP-B) H01-59878 (ухвалена японська патентна заявка, яка пройшла експертизу та опублікована з метою протиставлення)). Альтернативно, бажане антитіло людини можна також отримати шляхом застосування бажаного антигену з метою імунізації трансгенної тварини, яка включає повний набір генів антитіл людини (див. публікації міжнародних заявок на патент № № WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096 та WO 96/33735). Крім того, відомими є способи отримання антитіл людини шляхом пенінгу з фаговою бібліотекою антитіл людини. Наприклад, при застосуванні способу демонстрації фагу варіабельна ділянка антитіла людини експресується як антитіло з єдиним ланцюгом (scFv) на поверхні фагу, та при цьому можна вибрати фаги, які зв’язуються з антитілом. Аналізуючи гени вибраних фагів, можна визначити послідовності ДНК, що кодують варіабельні ділянки антитіл людини, які зв’язуються з антигеном. Якщо ідентифікуються послідовності ДНК scFvs, що зв’язуються з антигеном, відповідні вектори експресії, які включають ці послідовності, можна побудувати з метою отримання антитіл людини. Такі способи є добре відомими (див. WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438 та WO 95/15388). Амінокислотна послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга або варіабельної ділянки легкого ланцюга може бути амінокислотною послідовністю з заміщенням, делецією, додаванням та/або вставкою однієї або більше амінокислот в амінокислотній послідовності варіабельної ділянки важкого ланцюга або варіабельної ділянки легкого ланцюга антитіла, про яке довели, що воно має NR 10-нейтралізуючу активність, доки зберігається NR 10нейтралізуюча активність. Добре відомі фахівцям у галузі способи одержання амінокислотної послідовності варіабельної ділянки важкого ланцюга або варіабельної ділянки легкого ланцюга антитіла, що має NR 10-нейтралізуючу активність, які включають заміщення, делецію, додавання та/або вставку однієї або більше амінокислот в амінокислотній послідовності 5 UA 100116 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 варіабельної ділянки важкого ланцюга або варіабельної ділянки легкого ланцюга, включають відомі способи введення мутацій у білки. Наприклад, фахівці у галузі можуть приготувати мутанти, які є функціонально еквівалентними до варіабельної ділянки важкого ланцюга або варіабельної ділянки легкого ланцюга антитіла, що має NR 10-нейтралізуючу активність, шляхом введення відповідних мутацій в амінокислотну послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга або варіабельної ділянки легкого ланцюга антитіла, що має NR 10нейтралізуючу активність, застосовуючи сайт-спрямований мутагенез (Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, and Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275, Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors. Methods Enzymol. 100, 468-500, Kramer, W, Drutsa, V, Jansen, HW, Kramer, B, Pflugfelder, M, and Fritz, HJ (1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456,Kramer W, and Fritz HJ (1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367, Kunkel, TA (1985) Rapid and efficient sitespecific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492) або подібне. Отже, варіабельні ділянки важкого ланцюга або варіабельні ділянки легкого ланцюга, які включають мутації на одній або більше амінокислотах у варіабельній ділянці важкого ланцюга або варіабельній ділянці легкого ланцюга антитіла, що має NR 10-нейтралізуючу активність, також включені у варіабельну ділянку важкого ланцюга або варіабельну ділянку легкого ланцюга цього винаходу. Коли амінокислотний залишок змінюється, амінокислота переважно мутується для різної(их) амінокислоти(т), яка зберігає властивості амінокислотного бічного ланцюга. Приклади властивостей амінокислотного бічного ланцюга: гідрофобні амінокислоти (A, I, L, M, F, P, W, Y та V), гідрофільні амінокислоти (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S та T), амінокислоти, що включають аліфатичні бічні ланцюги (G, A, V, L, I та P), амінокислоти, що включають бічні ланцюги, що містять гідроксильну групу (S, T та Y), амінокислоти, що включають сірковмісні бічні ланцюги (С та М), амінокислоти, що включають карбоновокислотовмісні та амідвмісні бічні ланцюги (D, N, E та Q), амінокислоти, що включають основні бічні ланцюги (R, K та H), та амінокислоти, що включають ароматичні бічні ланцюги (H, F, Y та W) (амінокислоти позначено однолітерними кодами у дужках). Амінокислотні заміщення у межах кожної групи називають консервативними заміщеннями. Вже відомо, що поліпептид, який включає модифіковану амінокислотну послідовність, у якій один або більше амінокислотних залишків у даній амінокислотній послідовності вилучаються, додаються та/або заміщуються іншими амінокислотами, може зберігати первинну біологічну активність (Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA; (1984) 81:5662-6; Zoller, M. J. and Smith, M., Nucleic Acids Res. (1982) 10:6487-500; Wang, A. et al., Science (1984) 224:1431-3; Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79:6409-13). Такі мутанти включають амінокислотну послідовність, яка є принаймні на 70% ідентичною до амінокислотної послідовності варіабельної ділянки важкого ланцюга або варіабельної ділянки легкого ланцюга цього винаходу, більш переважно принаймні на 75%, навіть більш переважно принаймні на 80%, ще більш переважно принаймні на 85%, іще більш переважно принаймні на 90% та найбільш переважно принаймні на 95% ідентичною. У цьому описі ідентичність послідовності визначається як відсоткове співвідношення залишків, ідентичних до залишків в оригінальній амінокислотній послідовності варіабельної ділянки важкого ланцюга або варіабельної ділянки легкого ланцюга, що визначається після того, як порівняли послідовності та відповідним способом ввели проміжки, щоб, за необхідності, зробити ідентичність послідовностей якомога більшою. Ідентичність амінокислотних послідовностей можна визначити за способом, описаним вище. Альтернативно, амінокислотна послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга або варіабельної ділянки легкого ланцюга, яка включає заміщення, делецію, додавання та/або вставку однієї або більше амінокислот в амінокислотній послідовності варіабельної ділянки важкого ланцюга або варіабельної ділянки легкого ланцюга та зберігає NR 10-нейтралізуючу активність, можна отримати з нуклеїнової кислоти, яка гібридизується у суворих умовах з нуклеїновою кислотою, яка включає нуклеотидну послідовність, яка кодує амінокислотну послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга або варіабельної ділянки легкого ланцюга. Суворі умови гібридизації для виділення нуклеїнової кислоти, яка гібридизується у суворих умовах з нуклеїновою кислотою, що включає нуклеотидну послідовність, що кодує амінокислотну послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга або варіабельної ділянки легкого ланцюга, наприклад, - це умови 6М сечовина, 0,4% SDS, 0,5  SSC та 37С або умови гібридизації з еквівалентною до вищезазначених умов суворістю. З більш суворими умовами, наприклад, умовою: 6М сечовина, 0,4% SDS, 0,1  SSC та 42С, можна очікувати виділення 6 UA 100116 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 нуклеїнових кислот з набагато більшою гомологією. Послідовності виділених нуклеїнових кислот можна визначити за відомим способами, які описано далі. Загальна гомологія нуклеотидної послідовності виділеної нуклеїнової кислоти становить принаймні 50% або вищу ідентичність послідовності, переважно 70% або вищу, більш переважно 90% або вищу (наприклад, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% або вищу). Нуклеїнова кислота, що гібридизується при суворих умовах з нуклеїновою кислотою, яка включає нуклеотидну послідовність, що кодує амінокислотну послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга або варіабельної ділянки легкого ланцюга, можна також виділити, застосовуючи, замість вище описаних способів, які використовують техніку гібридизації, способи ампліфікації генів, які застосовують праймери, синтезовані на основі інформації нуклеотидної послідовності, що кодує амінокислотну послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга або варіабельної ділянки легкого ланцюга, наприклад, полімеразно-ланцюгову реакцію (ПЛР). Детальніше, ідентичність однієї нуклеотидної послідовності або амінокислотної послідовності з іншою можна визначити, застосовуючи алгоритм BLAST за Karlin та Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 5873-7). Програми, такі як BLASTN та BLASTX, було розроблено на основі цього алгоритму (Altschul et al., J. Mol. Biol. (1990) 215, 403-10). Для того, щоб проаналізувати нуклеотидні послідовності згідно з BLASTN на основі BLAST, застосовуються такі параметри, як наприклад, кількість = 100 та довжина слова = 12. З іншого боку, параметри, що застосовуються для аналізу амінокислотних послідовностей за допомогою BLASTX на основі BLAST, включають, наприклад, кількість = 50 та довжина слова = 3. Параметри по змовчанню для кожної програми застосовуються, коли використовують програми BLAST та Gapped BLAST. Специфічні способи таких аналізів є відомими у галузі (дивись вебсайт Національного центру з біотехнологічної інформації (NCBI), Basic Local Alignment Search Tool (BLAST); http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Альтернативно, антитіла цього винаходу можуть бути мінітілами. Такі мінітіла цього винаходу включають фрагменти антитіла, у яких відсутні деякі частини повного антитіла (наприклад, повного IgG), та їх особливо не обмежують, доки вони зберігають NR 10нейтралізуючу активність. Мінітіла цього винаходу особливо не обмежуються, доки вони є частинами повних антитіл. Мінітіла переважно включають варіабельну ділянку важкого ланцюга (VH) або варіабельну ділянку легкого ланцюга (VL). Особливо переважні мінітіла включають як VH, так і VL. Мінітіла цього винаходу переважно мають меншу молекулярну масу порівняно з повними антитілами. Проте, мінітіла можуть утворювати мультимери, наприклад, димери, тримери або тетрамери, та внаслідок цього їхня молекулярна маса може бути більшою, ніж молекулярна маса повних антитіл. Мінітіла цього винаходу включають, наприклад, антитіла scFv. Антитіла scFv - це одноланцюгові поліпептиди, побудовані шляхом з’єднання варіабельної ділянки важкого ланцюга (VH) з варіабельною ділянкою легкого ланцюга (VL) за допомогою лінкера або йому подібного (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883; Plickthun "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies" Vol. 113, eds., Resenburg and Moore, Springer Verlag, New York, pp. 269-315, (1994)). Порядок варіабельної ділянки важкого ланцюга та варіабельної ділянки легкого ланцюга, які слід з’єднати разом, особливо не обмежується, та їх можна влаштувати у будь-якому порядку. Приклади влаштування перелічені нижче. [VH] лінкер [VL] [VL] лінкер [VH] Амінокислотна послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга або варіабельної ділянки легкого ланцюга може включати заміщення, делецію, додавання та/або вставку. Крім того, варіабельна ділянка важкого ланцюга та варіабельна ділянка легкого ланцюга можуть не мати деяких частин, або до них можна додати інші поліпептиди, доки вони мають антигензв’язувальну здатність, коли вони з’єднані разом. Альтернативно, варіабельні ділянки можна химеризувати або гуманізувати. У цьому винаході лінкери, що зв’язують варіабельну ділянку антитіла, включають довільні пептидні лінкери, які можна ввести, застосовуючи способи генної інженерії, або синтетичні лінкери (наприклад, лінкери, описані у "Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996"). Переважними лінкерами у цьому винаході є пептидні лінкери. Довжина пептидних лінкерів особливо не обмежується, та фахівці у галузі зможуть вибрати відповідну довжину залежно від мети. Звичайна довжина становить від 1 до 100 амінокислот, переважно від 3 до 50 амінокислот, більш переважно від 5 до 30 амінокислот та особливо переважно від 12 до 18 амінокислот (наприклад, 15 амінокислот). Амінокислотні послідовності таких пептидних лінкерів включають, наприклад: 7 UA 100116 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Ser Gly･Ser Gly･Gly･Ser Ser･Gly･Gly Gly･Gly･Gly･Ser (SEQ ID NO: 8) Ser･Gly･Gly･Gly (SEQ ID NO: 9) Gly･Gly･Gly･Gly･Ser (SEQ ID NO: 10) Ser･Gly･Gly･Gly･Gly (SEQ ID NO: 11) Gly･Gly･Gly･Gly･Gly･Ser (SEQ ID NO: 12) Ser･Gly･Gly･Gly･Gly･Gly (SEQ ID NO: 13) Gly･Gly･Gly･Gly･Gly･Gly･Ser (SEQ ID NO: 14) Ser･Gly･Gly･Gly･Gly･Gly･Gly (SEQ ID NO: 15) (Gly･Gly･Gly･Gly･Ser (SEQ ID NO: 10))n (Ser･Gly･Gly･Gly･Gly (SEQ ID NO: 11))n де n - це ціле число, що становить 1 або більше. Синтетичні лінкери (хімічні агенти перехресного зшивання) включають агенти перехресного зшивання, які зазвичай застосовуються для перехресного зшивання пептидів, наприклад, N3 гідроксисукцинімід (NHS), дисукцинімідилсуберат (DSS), біс(сульфосукцинімідил)суберат (BS ), дитіобіс(сукцинімідилпропіонат) (DSP), дитіобіс(сульфосукцинімідилпропіонат) (DTSSP), етиленгліколь біс(сукцинімідилсукцинат) (EGS), етиленгліколь біс(сульфосукцинімідилсукцинат) (сульфо-EGS), дисукцинімідилтартрат (DST), дисульфосукцинімідилтартрат (сульфо-DST), біс[2-(сукцинімідоксикарбонілокси)етил]сульфон (BSOCOES) та біс[2(сульфосукцинімідоксикарбонілокси)етил]сульфон (сульфо-BSOCOES). Ці агенти перехресного зшивання є комерційно доступними. Антитіла цього винаходу включають антитіла, у яких два або більше амінокислотних залишків додали до амінокислотної послідовності антитіла цього винаходу. Крім того, у цей винахід включено злиті білки, які є наслідком злиття між одним з вищевказаних антитіл та другим пептидом або білком. Злиті білки можна приготувати шляхом зшивання полінуклеотиду, що кодує антитіло цього винаходу, та полінуклеотиду, що кодує другий пептид або поліпептид у рамці, вставки цього у вектор експресії та експресування злитої конструкції у хазяїні. Для виконання цього доступними є деякі способи, відомі фахівцям у цій галузі. Пептид-партнер або поліпептид, який слід злити з антитілом цього винаходу, може бути відомим пептидом, наприклад, FLAG (Hopp, T. P. et al., BioTechnology 6, 1204-1210 (1988)), 6x His, що складається з шести залишків His (гістидину), 10x His, гемаглютиніном грипу (НА), фрагментом с-myc людини, фрагментом VSV-GP, фрагментом p18HIV, T7-tag, HSV-tag, E-tag, фрагментом антигену SV40 T, lck tag, фрагментом α-тубуліну, B-tag, фрагментом білка С. Інші поліпептиди-партнери, які слід злити з антитілами цього винаходу, включають, наприклад, GST (глютатіон-S-трансферазу), НА (гемаглютинін грипу), константну ділянку імуноглобуліну, β-галактозидазу та МВР (мальтозазв’язувальний білок). Полінуклеотид, що кодує один з цих комерційно доступних пептидів або поліпептидів, можна злити з полінуклеотидом, що кодує антитіло цього винаходу. Злитий поліпептид можна приготувати шляхом експресії злитої конструкції. Антитіла цього винаходу можуть різнитися стосовно амінокислотної послідовності, молекулярної маси, ізоелектричної точки, присутності/відсутності цукрових ланцюгів та структури, що залежить від клітини або хазяїна, який виробляє антитіло, або способу очищення. Проте, отримане антитіло включається до цього винаходу, доки воно є функціонально еквівалентним з антитілом цього винаходу. Наприклад, коли антитіло цього винаходу експресується у прокаріотичних клітинах, наприклад, E. coli, залишок метіонін додається до Nзакінчення амінокислотної послідовності первинного антитіла. Такі антитіла включено до цього винаходу. Антитіло цього винаходу можна приготувати за способами, відомими фахівцям у цій галузі. Антитіло можна приготувати, наприклад, шляхом способів генетичної рекомбінації, що є відомими фахівцям у цій галузі, на основі послідовності антитіла, що розпізнає NR 10. Детальніше, таке антитіло може бути приготовано шляхом конструювання полінуклеотиду, що кодує антитіло, яке базується на послідовності антитіла, яке розпізнає NR 10, вставлянням цієї конструкції у вектор експресії, а потім експресуванням у відповідних клітинах-хазяїнах (див., наприклад, Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669; Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137). 8 UA 100116 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Вектори включають вектори М31, вектори pUC, pBR322, pBluescript та pCR-Script. Альтернативно, коли метою є субклонування та вирізання кДНК, окрім вищеописаних векторів, ці вектори включають, наприклад, pGEM-T, pDIRECT та pT7. Вектори експресії є особливо корисними, коли вектори застосовуються для отримання антитіл цього винаходу. Наприклад, коли метою є експресія в E. coli, наприклад JM109, DH5α, HB101 та XL1-Blue, вектори експресії не тільки мають вищеописані характеристики, які сприяють векторній ампліфікації в E. coli, але вони також мусять бути носіями промотора, який сприяє ефективній експресії в E. coli, наприклад, промотора lacZ (Ward et al., Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 24222427), промотора araB (Better et al., Science (1988) 240, 1041-1043), промотора T7 тощо. Окрім вищеописаних векторів, такі вектори включають pGEX-5X-1 (Pharmacia), "QIAexpress system" (Quiagen), pEGFP або pET (у цьому випадку хазяїн - це переважно BL21, що експресує РНКполімеразу Т7). Вектори можуть включати сигнальні послідовності для секреції антитіл. Як сигнальну послідовність для секреції антитіл, сигнальну послідовність pelB (Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) можна застосовувати, коли білок секретується у периплазму E. coli. Вектор можна вводити у клітини-хазяїни, наприклад, за способом з використанням хлориду кальцію або за способом електропорації. Окрім векторів для E. coli, вектори для отримання антитіл цього винаходу включають, наприклад, вектори експресії ссавців (наприклад, pcDNA3 (Invitrogen), pEF-BOS (Nucleic Acids. Res. 1990, 18(17), p5322), pEF та pCDM8), вектори експресії, що походять від клітин комах (наприклад, "Bac-to-BAC baculovirus expression system" (Gibco-BRL) та pBacPAK8), вектори експресії, що походять від рослин (наприклад, pMH1 та pMH2), вектори експресії, що походять від тваринних вірусів (наприклад, pHSV, pMV та pAdexLcw), ретровірусні вектори експресії (наприклад, pZIPneo), дріжджові вектори експресії (наприклад, "Pichia Expression Kit" (Invitrogen), pNV11 та SP-Q01) та вектори експресії Bacillus subtilis (наприклад, pPL608 та pKTH50). Коли метою є експресія у тваринних клітинах, таких як клітини CHO, COS та NIH3T3, вектори повинні мати промотор, необхідний для експресії у клітинах, наприклад, промотор SV40 (Mulligan et al., Nature (1979) 277, 108), промотор MMLV-LTR, промотор EF1α (Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322) та промотор CMV, а більш переважно вони мають ген для селекції трансформованих клітин (наприклад, ген стійкості до ліків, що дозволяє виконувати оцінку, застосовуючи агент (неоміцин, G418 тощо)). Вектори з такими характеристиками включають, наприклад, pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV та pOP13. Крім того, наступний спосіб можна застосовувати для стійкої генної експресії та генної ампліфікації у клітинах: у клітини СНО, у яких не вистачає шляху синтезу нуклеїнової кислоти, nd вводять вектор (наприклад, pSV2-dhfr (Molecular Cloning 2 edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)), який є носієм гена DHFR, який компенсує дефіцит, та вектор ампліфікується завдяки застосуванню метотрексату (МТХ). Альтернативно, наступний спосіб можна застосовувати для нетривалої генної експресії: клітини COS з геном, що експресує антиген Т SV40 на їхній хромосомі, трансформуються вектором (pcD тощо) з початком реплікації SV40. Можна також застосовувати початки реплікації, що походять від поліовірусу, аденовірусу, бичачого вірусу папіломи (BPV) тощо. Для того, щоб ампліфікувати якусь кількість генних копій у клітинах-хазяїнах, вектори експресії можуть, крім того, бути носіями селективних маркерів, таких як ген аміноглікозидтрансферази (АРН), ген тимідинкінази (ТК), ген ксантингуанін-фосфорибозилтрансферази E. Coli (Ecogpt) та ген дигідрофолатредуктази (dhfr). Бажані антитіла, отримані із застосуванням способів, описаних вище, можна виділити з середини клітин-хазяїнів або ззовні клітин (середовище або йому подібні) та очистити до гомогенного стану. Антитіла можна виділити та очистити із застосуванням способів, що зазвичай застосовуються для виділення та очищення антитіл, та тип способу не обмежується. Наприклад, антитіла можна виділити та очистити шляхом відповідного вибору та поєднання колонкової хроматографії, фільтрування, ультрафільтрування, знесолення, преципітації розчинника, екстрагування розчинника, дистиляції, імунопреципітації, електрофорезу на поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію, ізоелектричного фокусування, діалізу, рекристалізації тощо. Хроматографія включає, наприклад, афінну хроматографію, іонообмінну хроматографію, гідрофобну хроматографію, гель-фільтрацію, хроматографію з оберненою фазою та адсорбційну хроматографію (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). Способи хроматографії, описані вище, можна здійснювати, застосовуючи рідинну хроматографію, наприклад, рідинну хроматографію високого тиску (HPLC) та рідинну хроматографію швидкого 9 UA 100116 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 розрізнення (FPLC). Колонки, які можна застосовувати для афінної хроматографії, включають колонки білка А та колонки білка G. Колонки, що застосовують білок А, включають, наприклад, Hyper D, POROS та Sepharose FF (GE Amersham Biosciences). Цей винахід включає антитіла, які є високоочищеними із застосуванням цих способів очищення. Цим винаходом також пропонуються агенти для профілактики та лікування запалювальних хвороб, які включають фрагменти та/або продукти модифікації антитіла цього винаходу як активні інгредієнти. Фрагменти та/або продукти модифікації антитіла цього винаходу включають фрагменти антитіла, у яких нема деяких частин антитіл цього винаходу (повні антитіла (наприклад, повний IgG), рекомбінантні антитіла (наприклад, химерні антитіла, гуманізовані антитіла та антитіла людини) та мінітіла (наприклад, антитіла scFv)), та вони особливо не обмежуються, доки вони зберігають спроможність зв’язуватися з їх антигенами. Фрагменти антитіла цього винаходу особливо не обмежуються, доки вони є частинами повних антитіл. Фрагменти переважно включають варіабельну ділянку важкого ланцюга (VH) та/або варіабельну ділянку легкого ланцюга (VL). Амінокислотна послідовність VH або VL може включати заміщення, делеції, додавання та/або вставки. VH та/або VL можуть не мати деяких частин, доки зберігається спроможність зв’язуватися з антигеном. Крім того, варіабельна ділянка може бути химеризованою або гуманізованою. Детальніше, фрагменти антитіл включають, наприклад, Fab, Fab’, F(ab’)2 та Fv. Такі фрагменти антитіл можна отримати шляхом побудування генів, що кодують фрагменти антитіл, шляхом введення їх у вектори експресії, а потім експресування їх у відповідних клітинах-хазяїнах (див., наприклад, Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476496; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669; Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137). Крім того, антитіла цього винаходу можуть бути кон’югованими антитілами, з’єднаними з будь-якими різними молекулами, такими як поліетиленгліколь (ПЕГ), радіоактивні речовини, флуоресцентні речовини, люмінесцентні речовини, ферменти та токсини. Такі кон’юговані антитіла можна отримати шляхом хімічної модифікації отриманих антитіл. Способи модифікації антитіл були розроблені у цій галузі (наприклад, патент США № 5057313 та патент США № 5156840). Термін "антитіла" цього винаходу також включає такі кон’юговані антитіла. Активність антитіла стосовно зв’язування з NR 10 можна визначити за способами, відомими фахівцям у цій галузі. Способи визначення антиген-зв’язувальної активності антитіла включають, наприклад, ELISA (твердофазний імуноферментний аналіз), ЕІА (імуноферментний аналіз), RIA (радіоімунний аналіз) та спосіб флуоресцентного антитіла. Наприклад, коли застосовують імуноферментний аналіз, зразки, що містять антитіло, такі як очищені антитіла та культуральні надосадові рідини клітин, що виробляють антитіла, додаються до чашок, покритих антигеном. Додається вторинне антитіло, мічене ферментом, таким як лужна фосфатаза, та чашки інкубують. Після промивання додається ферментний субстрат, такий як рнітрофенілфосфат, а потім вимірюють абсорбцію з метою визначення антиген-зв’язувальної активності. Крім того, NR 10-нейтралізуючу активність антитіла можна визначити, наприклад, за способом, описаним у прикладах, при цьому спосіб застосовує тестування стосовно ефекту пригнічення росту IL-31-залежної клітинної лінії. Антагоністи NR 10 або антитіла, що мають NR 10-нейтралізуючу активність, цього винаходу можна застосовувати в агентах для профілактики або лікування запалювальних хвороб. Автори цього винаходу довели, що наслідком введення антитіл, нейтралізуючих NR 10 миші, був помітний терапевтичний ефект у тваринних моделях стосовно різних запалювальних хвороб. Крім того, повідомлялося, що експресія NR 10 людини підсилюється у стовщеному епідермісі пацієнтів з атопічним дерматитом (непатентний документ 1). Автори цього винаходу підтвердили шляхом імуногістохімічного забарвлення, що, як і у випадку з людьми, експресія мишачого NR 10 підсилювалася у стовщеному епідермісі вушної раковини у вищеописаних мишачих моделях хронічного дерматиту (Приклад 5). Ці дані дозволяють припустити, що NR 10 подібним чином залучається у запалювальні хвороби в усіх тваринних зразках, та, що подібно до антитіл, що нейтралізують мишачий NR 10, антитіла, що нейтралізують NR 10 людини, є ефективними стосовно профілактики та лікування різних запалювальних хвороб. Крім того, як і у випадку з даними, описаними у цьому прикладі, очікують, що антагоністи NR 10, відмінні від антитіл, також мають терапевтичний вплив на різні запалювальні хвороби. У цьому винаході запалювальними хворобами називаються хвороби з патологічними ознаками, що залучаються у гістологічні та цитологічні реакції, які виникають в уражених кров’яних судинах та прилеглих тканинах у відповідь на пошкодження або аномальну 10 UA 100116 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 стимуляцію, спричинену фізичними, хімічними або біологічними агентами (Stedman’s Medical Dictionary, 5th Ed., MEDICAL VIEW CO., 2005). Взагалі, запалювальні хвороби включають дерматити (атопічний дерматит, хронічний дерматит тощо), запалювальні хвороби кишечнику (коліти тощо), астму, артрити (ревматоїдний артрит, остеоартрит тощо), бронхіти, автоімунні хвороби Th2, системний червоний вовчак, міастенію гравіс, хронічну хворобу "трансплантат проти хазяїна" (GVHD), хворобу Крона (гранулематозна хвороба), деформуючий спондиліт, поперековий біль, подагру, запалення після хірургічної операції або поранення, набряк, невралгію, ларингофарингіт, цистит, гепатит (неалкогольний стеатогепатит, алкогольний гепатит тощо), гепатит В, гепатит С та атеросклероз. Переважні приклади запалювальних хвороб, які є предметом цього винаходу, включають атопічний дерматит, хронічний дерматит, ревматизм, остеоартрит та хронічну астму. Автори цього винаходу визначили, що NR 10-антагоністичні антитіла мають терапевтичний ефект проти атопічного дерматиту, хронічного дерматиту, ревматизму та остеоартриту. З іншого боку, визначили, що NR 10-антагоністичні антитіла не мають терапевтичного ефекту у моделях гострого контактного дерматиту та гострого коліту, викликаного DSS. Агенти для профілактики та лікування запалювальних хвороб цього винаходу включають як активний інгредієнт антагоніст NR 10 або антитіло, що має NR 10-нейтралізуючу активність, описану вище. Фраза "включає антагоніст NR 10 як активний інгредієнт" означає включення антагоніста NR 10 як принаймні одного з активних інгредієнтів, та вона не обмежує зміст. Крім того, агенти для профілактики або лікування запалювальних хвороб цього винаходу можуть також включати, у комбінації з антагоністом NR 10, інші інгредієнти, які підсилюють профілактику або лікування запалювальної хвороби. Антагоніста NR 10 цього винаходу можна виготовити згідно зі стандартними способами (див., наприклад, Remington’s Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, USA). Крім того, вони можуть включати фармацевтично прийнятні носії та/або домішки, якщо це необхідно. Наприклад, вони можуть містити поверхнево-активні речовини (наприклад, ПЕГ та Tween), наповнювачі, антиоксиданти (наприклад, аскорбінову кислоту), барвники, ароматизатори, консерванти, стабілізатори, буфери (наприклад, фосфорну кислоту, лимонну кислоту та інші органічні кислоти), хелатори (наприклад, ЕДТК), суспендувальні агенти, агенти ізотонічності, зв’язувальні агенти, дезінтегратори, змащувальні агенти, агенти, що сприяють плинності, та коригенти. Проте, носії, які можна включити в агенти для профілактики або лікування запалювальних хвороб цього винаходу, не обмежуються цим переліком. Фактично, можна відповідним чином включити інші носії, що зазвичай застосовуються, такі як легка безводна кремнієва кислота, лактоза, кристалічна целюлоза, маніт, крохмаль, кальцієва сіль кроскармелози, натрієва сіль кроскармелози, гідроксипропілцелюлоза, гідроксипропілметилцелюлоза, полівінілацетальдіетиламіноацетат, полівінілпіролідон, желатин, тригліцирид жирної кислоти з середнім ланцюгом, поліетиленова гідрована касторова олія 60, цукроза, карбоксиметилцелюлоза, злаковий крохмаль, неорганічна сіль тощо. Композиції можуть також включати інші поліпептиди з низькою молекулярною масою, білки, такі як сироватковий альбумін, желатин та імуноглобулін, та амінокислоти, такі як гліцин, глютамін, аспарагін, аргінін та лізин. Коли композицію готують як водний розчин для ін’єкцій, тоді антагоністи NR 10 можна розчинити в ізотонічному розчині, який включає, наприклад, фізіологічний сольовий розчин, декстрозу та інші ад’юванти. Ад’юванти можуть включати, наприклад, D-сорбіт, D-манозу, D-маніт та натрію хлорид. Крім того, поряд з ними можна застосовувати відповідні солюбілізуючі агенти, наприклад, спирти (наприклад, етанол), поліспирти (наприклад, пропіленгліколі та ПЕГ) та неіонні детергенти (полісорбат 80 та НСО50). За необхідністю, антагоністи NR 10 можуть бути інкапсульованими у мікрокапсули (мікрокапсули, виготовлені з гідроксицелюлози, желатину, поліметилметакрилату тощо), та бути включеними у компоненти колоїдних систем доставки ліків (ліпосоми, альбумінові мікрокульки, мікроемульсії, наночастинки та нанокапсули) (наприклад, див. "Remington’s Pharmaceutical Science 16th edition" &, Oslo Ed. (1980)). Крім того, відомими є способи виготовлення ліків з уповільненим вивільненням, та ці способи можна застосовувати до антагоністів NR 10 (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. (1981) 15, 167-277; Langer, Chem. Tech. (1982) 12, 98-105; патент США № 3773919; заявка на європейський патент (EP) № 58481; Sidman et al., Biopolymers (1983) 22, 547-56; EP 133988). Ці агенти для профілактики або лікування запалювальних хвороб цього винаходу можна вводити або перорально, або парентерально, проте переважно вводити їх парентерально. Детальніше, агенти вводять пацієнтам шляхом ін’єкції або крізьшкірно. Ін’єкції включають, наприклад, внутрішньовенні ін’єкції, внутрішньом’язові ін’єкції та підшкірні ін’єкції для 11 UA 100116 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 системного або локального введення. Агенти можна доставляти до ділянок, на яких слід пригнітити запалення, або до місць, що оточують ці ділянки, шляхом місцевої інфузії, зокрема внутрішньом’язової ін’єкції. Способи введення можна відповідним чином вибрати згідно з віком та станом пацієнта. Дозу одноразового введення можна вибрати, наприклад, у межах діапазону від 0,0001 до 100 мг активного інгредієнта на кілограм маси тіла. Альтернативно, коли агенти вводять пацієнтам-людям, дозу активного інгредієнта можна вибрати у межах діапазону від 0,001 до 1000 мг/кг маси тіла. Доза одноразового введення переважно включає, наприклад, від 0,01 до 50 мг антагоніста NR 10 на кілограм маси тіла. Проте, доза агента для профілактики або лікування запалювальних хвороб цього винаходу не обмежується цими прикладами. Цим винаходом також пропонуються антитіла, що мають NR 10-нейтралізуючу активність (включаючи фрагменти антитіл, що мають NR 10-нейтралізуючу активність, та/або продукти їх модифікації; таке саме визначення застосовується далі в усьому описі). Антитіла, що мають NR 10-нейтралізуючу активність, цього винаходу є корисними як активні інгредієнти у вищеописаних агентах для профілактики та лікування запалювальних хвороб. Антитіла цього винаходу, що мають NR 10-нейтралізуючу активність, можуть бути поліклональними або моноклональними антитілами, проте переважними є моноклональні антитіла. Такі моноклональні антитіла, що мають NR 10-нейтралізуючу активність, можна отримати за способами, описаними вище. Моноклональні антитіла цього винаходу мають активність нейтралізації NR 10, що походить з ссавців або їх фрагментів, переважно вони мають активність нейтралізації NR 10, що походить від людей або мишей, або їх фрагментів, та більш переважно вони мають активність нейтралізації NR 10, що походить від людей, або їх фрагментів. NR 10 людини або його поліпептидний фрагмент можна застосовувати як імуноген, щоб приготувати моноклонільні антитіла, що мають активність нейтралізації NR 10 людини. Альтернативно, антитіла цього винаходу, що мають NR 10-нейтралізуючу активність, можуть бути рекомбінантними антитілами. Рекомбінантні антитіла цього винаходу, що мають NR 10-нейтралізуючу активність, включають, проте не обмежуються тільки ними, химерні антитіла, гуманізовані антитіла, антитіла людини та мінітіла. У цьому винаході антитіла, що мають NR 10-нейтралізуючу активність, включають, наприклад, антитіла до мишачого NR 10, які включають варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 1, та варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 3. Цей винахід також включає моноклональні антитіла, що мають активність нейтралізації NR 10 людини. Моноклональні антитіла цього винаходу, що мають активність нейтралізації NR 10 людини, можна отримати шляхом приготування моноклональних антитіл, застосовуючи NR 10 людини або його пептидний фрагмент як імуноген, а потім шляхом відбору з моноклональних антитіл до NR 10 людини тих антитіл, що мають активність нейтралізації NR 10 людини, на основі вищеописаної аналітичної системи, застосовуючи IL-31-залежну клітинну лінію. У цьому винаході антитіла, що мають активність нейтралізації NR 10 людини, включають антитіла, описані у будь-якому з наступних пунктів: (а) антитіла, що мають варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка включає CDR1, CDR2 та CDR3, які складаються з амінокислотних послідовностей SEQ ID NOs: 18, 19 та 20, відповідно; (b) антитіла, що мають варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка включає CDR1, CDR2 та CDR3, які складаються з амінокислотних послідовностей SEQ ID NOs: 21, 22 та 23, відповідно; (c) антитіла, що мають варіабельну ділянку важкого ланцюга за пунктом (а) та варіабельну ділянку легкого ланцюга за пунктом (b); та (d) антитіла, що розпізнають такий самий епітоп, який розпізнається антитілами за будьяким пунктом від (а) до (c). Чи розпізнає антитіло такий самий епітоп, що розпізнається іншим антитілом, можна підтвердити шляхом здійснення конкуренції між двома антитілами стосовно епітопу. Конкуренцію між антитілами можна оцінити шляхом аналізу конкурентного зв’язування, застосовуючи засоби, такі як ELISA, флуоресцентний спосіб передачі енергії (FRET) та технологію флуоресцентного аналізу мікрооб’єму (FMAT (R)). Кількість антитіл, зв’язаних з антигеном, непрямо корелює зі зв’язувальною активністю кандидатів в антитіла-конкуренти (випробовувані антитіла), які конкурентно зв’язуються з таким самим епітопом. Інакше кажучи, якщо кількість або афінітет випробовуваних антитіл до того ж самого епітопу зростає, кількість антитіл, зв’язаних з антигеном, зменшується, а кількість випробовуваних антитіл, зв’язаних з антигеном, зростає. Детальніше, відповідним чином мічені антитіла та антитіла, які слід оцінити, одночасно додають до антигенів та, таким чином, виявляють зв’язані антитіла, застосовуючи мітку. Кількість антитіл, зв’язаних з антигеном, можна легко визначити шляхом мічення антитіл заздалегідь. Ця мітка особливо не обмежується, а спосіб мічення вибирають згідно зі способом 12 UA 100116 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 аналізу, що застосовується. Способи мічення включають флуоресцентне мічення, радіоактивне мічення, ферментне мічення тощо. Наприклад, флюоресцентно мічені антитіла та немічені антитіла або випробовувані антитіла одночасно додають до тваринних клітин, що експресують NR 10, та мічені антитіла виявляються шляхом технології флуоресцентного аналізу мікрооб’єму. ІС50 - це концентрація, при якій кількість мічених антитіл, зв’язаних з епітопом, зменшується до 50%, що зумовлюється зв’язуванням немічених антитіл. У цьому описі антитіла, що розпізнають однаковий епітоп, - це антитіла, які можуть зменшити кількість мічених антитіл, зв’язаних з епітопом, до принаймні 50%, коли концентрація випробовуваних антитіл у десять разів перебільшує ІС50 немічених антитіл. Антитіла, що мають активність нейтралізації NR 10 людини, які застосовуються у цьому винаході, переважно далі мають зв’язувальну активність щодо NR 10 мавп cynomoglus, а більш переважно мають активність нейтралізації NR 10 мавп cynomoglus. NR 10 мавп сynomoglus, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 24, можна застосовувати для вимірювання активності нейтралізації або зв’язування з NR 10 мавп cynomoglus. Цим винаходом також пропонуються терапевтичні способи, описані нижче. У способах інтерпретація NR 10, антагоністів, моноклональних антитіл, рекомбінантних антитіл, запалювальних хвороб та іншого є такою, як описано вище: (1) спосіб профілактики та лікування запалювальної хвороби, який включає етап введення антагоніста NR 10 пацієнту із запалювальною хворобою; (2) спосіб за (1), при якому антагоніст NR 10 - це антитіло, що має активність зв’язуватися з NR 10; (3) спосіб за (2), при якому антитіло - це моноклональне антитіло; (4) спосіб за (2), при якому антитіло - це моноклональне антитіло, що зв’язується з NR 10 людини; (5) спосіб за будь-яким від (2) до (4), при якому антитіло - це рекомбінантне антитіло; (6) спосіб за (5), де рекомбінантне антитіло - це химерне антитіло, гуманізоване антитіло або антитіло людини; (7) спосіб за будь-яким від (2) до (6), при якому фрагмент антитіла, що має NR 10нейтралізуючу активність, та/або продукт його модифікації включають як активний інгредієнт; (8) спосіб за будь-яким від (1) до (7), при якому запалювальна хвороба - це атопічний дерматит; (9) спосіб за будь-яким від (1) до (7), при якому запалювальна хвороба - це хронічний дерматит; (10) спосіб за будь-яким від (1) до (7), при якому запалювальна хвороба - це ревматизм; (11) спосіб за будь-яким від (1) до (7), при якому запалювальна хвороба - це остеоартрит. Цим винаходом також пропонуються винаходи, описані нижче. Визначення NR 10, антагоністів, моноклональних антитіл, рекомбінантних антитіл, запалювальних хвороб та іншого у способах є такими, як описано вище: (1) застосування антагоніста NR 10 для виробництва агента для профілактики або лікування запалювальної хвороби; (2) застосування за (1), при якому антагоніст NR 10 - це антитіло, що має активність зв’язуватися з NR 10; (3) застосування за (2), при якому антитіло - це моноклональне антитіло; (4) застосування за (2), при якому антитіло - це моноклональне антитіло, що зв’язується з NR 10 людини; (5) застосування за будь-яким від (2) до (4), при якому антитіло - це рекомбінантне антитіло; (6) застосування за (5), де рекомбінантне антитіло - це химерне антитіло, гуманізоване антитіло або антитіло людини; (7) застосування за будь-яким від (2) до (6), при якому фрагмент антитіла, що має NR 10нейтралізуючу активність, та/або продукт його модифікації включають як активний інгредієнт; (8) застосування за будь-яким від (1) до (7), при якому запалювальна хвороба - це атопічний дерматит; (9) застосування за будь-яким від (1) до (7), при якому запалювальна хвороба - це хронічний дерматит; (10) застосування за будь-яким від (1) до (7), при якому запалювальна хвороба - це ревматизм; (11) застосування за будь-яким від (1) до (7), при якому запалювальна хвороба - це остеоартрит. Усі документи попереднього рівня техніки, які процитовано тут, включено у цей опис шляхом 13 UA 100116 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 посилання. Приклади У цьому описі далі цей винахід буде специфічно описано з посиланням на приклади, проте їх не слід розглядати як обмежувальні. Приклад 1 Утворення клітинної лінії Ba/F3, що експресує NR 10 та OSMR кДНК NR 10 людини (SEQ ID NO: 1 з міжнародної публікації WO 0075314) вставили в вектор експресії pCOS1 (Biochem Biophys Res Commun. 228, p838-45, 1996), щоб отримати pCosNR 10.3. кДНК рецептора М онкостатину (OSMR, номер доступу GenBank NM003999) виділили з плацентної бібліотеки людини шляхом ПЛР, а потім подібним способом побудували вектор експресії pCos1-hOSMR. Шляхом електропорації 10 мкг кожного з векторів одночасно ввели у клітини клітинної лінії Ва/F3, що походить з мишачих IL-3-залежних про-В клітин (BioRad Gene Pulser; 960 мкФ та 0,33 кВ). Після введення додали IL-31 людини та клітини культивували. Отже, отримали клітинну лінію, яка проліферувалася IL-31-залежним чином. Подібним чином також приготували мишачу IL-31-залежну клітинну лінію з клітин Ва/F3, що було створено з метою експресії генів мишачого NR 10 та OSMR. В обох клітинних лініях визначили, що ED50 (ефективна доза) становила декілька нг/мл. Отже, отримали клітинні лінії, що добре проліферуються. IL-31-залежна клітинна лінія людини не демонструвала ніякої реакції на мишачий IL-31, та ріст пригнічувався після додавання білка NR 10 людини (зовнішньоклітинний домен). Мишача IL-31-залежна клітинна лінія не демонструвала ніякої реакції на IL-31 людини, та ріст не пригнічувався внаслідок додавання мишачого білка NR 10 (зовнішньоклітинний домен). Приклад 2. Приготування білка NR 10 (зовнішньоклітинний домен) Зовнішньоклітинний домен ампліфікували сам по собі шляхом ПЛР, застосовуючи кДНК NR 10 як матрицю, до С-закінчення приєднали послідовність FLAG tag та вставили у вектор експресії pCXND3 (WO 2005/005636) (pCXND3-NR 10-flag). 10 мкг цього лінійного вектора ввели у клітини клітинної лінії DG44 яєчників китайського хом’ячка шляхом електропорації (BioRad Gene PulserII; 25 мкФ та 1,5 кВ). Отримали клітинну лінію високого рівня експресії. Очищений зразок приготували з надосадової рідини великомасштабної культури клітинної лінії за допомогою колонки антитіла анти-FLAG (SIGMA) та фільтрації крізь гель, та застосовували в експериментах, описаних нижче. Подібним способом приготували мишачий NR 10 (зовнішньоклітинний домен) з послідовністю FLAG tag, приєднаною до С-закінчення. Приклад 3. Виділення scFv, що має нейтралізуючу активність стосовно анти-мишачого NR 10, та приготування ВМ095 як химеризованого IgG Детальніше, автори цього винаходу намагалися звузити клони-кандидати з фагової бібліотеки антитіл людини шляхом пенінгу, застосовуючи біотинілований мишачий білок NR 10 (зовнішньоклітинний домен). Секреторні scFv очистили від клонів та додали до аналітичної системи клітинного росту, застосовуючи IL-31-залежні клітини Ва/F3, описані у Прикладі 1. Внаслідок цього успішно отримали клон ВМ095, що демонструє сильну активність, спрямовану на пригнічення росту. Застосовуючи ПЛР, послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга (VH) людини ВМ095 зшили з константною ділянкою мишачого IgG2a (після СН1), а послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга (VL) людини ВМ095 зшили з константною ділянкою λланцюга миші, внаслідок цього побудували вектор експресії. Амінокислотну послідовність VH наведено у SEQ ID NO: 1, а нуклеотидну послідовність, що кодує цю амінокислотну послідовність, наведено у SEQ ID NO: 2. Амінокислотну послідовність VL наведено у SEQ ID NO: 3, а нуклеотидну послідовність, що кодує цю амінокислотну послідовність, наведено у SEQ ID NO: 4. Відповідні лінійні вектори експресії одночасно ввели у клітинну лінію DG44, а потім вибрали клітинну лінію, що експресує химеризований IgG на високому рівні. Очищений зразок отримали з надосадової рідини великомасштабної культури клітинної лінії, застосовуючи колонку білка А (rProtein A Sepharose Fast Flow, GE Amersham Biosciences) та катіон-обмінну колонкову хроматографію (SP-TOYOPEARL 650M, TOSOH). Крім того, піроген видалили, застосовуючи смолу ActiClean Etox (Sterogen), внаслідок чого концентрація знизилася до рівня, нижчого ніж межа детекції. Цей зразок застосовували в експериментах з тваринами, описаними нижче. Результат, отриманий шляхом додавання ВМ095 до аналітичної системи, описаної вище, наведено на фіг. 1. Приклад 4. Оцінка ефективності ліків у моделі атопічного дерматиту із застосуванням мишей NC/Nga Модель дерматиту отримали шляхом багаторазового прикладання пікрилхлориду (PiCl) з інтервалами у тиждень. Детальніше, через 4 дні після сенсибілізації за допомогою 5% PiCl (150 мкл) на животі та ступні викликали розвиток дерматиту шляхом багаторазового застосування 14 UA 100116 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 0,8% PiCl (150 мкл) на спині та вушній раковині з інтервалами у тиждень. Спричинені симптоми спостерігали двічі на тиждень протягом періоду від трьох до шести тижнів, та 5 видів симптомів ((1) свербіж, (2) почервоніння та кровотеча, (3) набряк, (4) поранення та пошкодження тканин та (5) лущення шкіри та сухість) незалежно підрахували за шкалою від 0 до 3. Антитіло ввели у дозі 10 мг/кг у перитонеальні порожнини за день до сенсибілізації та кожного викликання дерматиту, взагалі 6 разів (група ВМ095), або за день до кожного викликання дерматиту пікрилхлориду після третього тижня, взагалі тричі (група V/B). Як позитивну контрольну групу використовували групу, якій перорально вводили 1 мг/кг дексаметазону кожного дня після третього тижня (група DEX). Кожна група містила 10 самців мишей NC/Nga. Як показано на фіг. 2, суттєвий пригнічувальний ефект визначили у групі, якій вводили антитіло, порівняно з групою, якій вводили розчинник-носій. Крім того, як видно на фіг. 2, тоді як у групі DEX спостерігали суттєву втрату маси, у групі, якій вводили антитіло, не спостерігали жодних змін маси. Це дозволяє припустити, що це антитіло є дуже безпечним. Приклад 5. Оцінка ефективності ліків із застосуванням моделі хронічного дерматиту, викликаного шляхом багаторазового прикладання пікрилхлориду. Мишей-самок BALB/c віком шість тижнів сенсибілізували шляхом прикладання 20 мкл 0,5% пікрилхлориду (розчин ацетону/оливкової олії (1:4 в об’ємному співвідношенні)) на їхні праві вуха. Хворобу викликали шляхом багаторазового прикладання 20 мкл 0,25% пікрилхлориду (ацетон/оливкова олія (1:4 в об’ємному співвідношенні)) на їх праві вуха кожні два дні з восьмого дня після сенсибілізації. 10 мг/кг BM095 вводили в перитонеальні порожнини один раз на тиждень з дня до сенсибілізації у групі для оцінки профілактичного ефекту ВМ095 або з 20-го дня після початку виклику хвороби у групі для оцінки терапевтичного ефекту ВМ095. Набряк вушних раковин оцінювали шляхом послідовного вимірювання товщини правого вуха, застосовуючи вимірювач товщини з круглою шкалою. Внаслідок цього, суттєвий ефект пригнічення визначили у групі, якій вводили антитіло, як показано на фіг. 4. Повідомлялося, що експресія NR 10 людини підвищується у стовщеному епідермісі пацієнтів з атопічним дерматитом (непатентний документ 1). Вушні раковини вищеописаних мишачих моделей хронічного дерматиту були імуногістохімічно забарвлені. Як і у випадку з людьми, спостерігали, що експресія мишачого NR 10 підвищилася у стовщеному епідермісі (фіг. 5; у Прикладі 3 приготували ВМ095, у якому константна ділянка була заміщена константною ділянкою IgG людини, та застосовували при імуногістохімічному забарвленні. Частини, що мали коричневий колір - це сайти експресії NR 10). Ці дані дозволяють припустити, що NR 10 подібним чином залучається у запалювальні хвороби як у людей, так і у мишей. Приклад 6. Оцінка ефективності ліків із застосуванням моделі артриту (ревматизму), що індукується колагеном Приготування мишачих моделей та оцінку ефективності ліків здійснювали за процедурою, описаною нижче. 140 мкл колагенового гелю, який приготували шляхом поєднання рівної кількості повного ад’юванту H37Ra та 0,3% колагену типу ІІ, що походить від бичачого суглоба, ввели крізьшкірно мишам-самкам DBA/1JN віком 9 тижнів у хвостову верхівку (0-й день; сенсибілізація). Через три тижні після цього колагеновий гель, приготовлений за таким самим способом, ввели крізьшкірно на спині, щоб викликати початок розвитку артриту (21 день; індукція). Враховуючи масу тіл, за два дні до сенсибілізації (-2-й день) 16 мишей розподілили на дві групи, кожна містила по 8 мишей, щоб утворити групу, якій вводили середовище, та групу, якій вводили ВМ095. Застосовуючи як середовище 20 ммоль/л ацетатного буферу (рН 5,5) (200 ммоль/л NaCl), розведеного у шість разів сольовим розчином з фосфатним буфером, речовину тесту ВМ095 ввели внутрівенно 8 мишам групи, якій вводили ВМ095, у дозі 10 мг/кг маси за день до початку сенсибілізації (-1-й день). Тим часом, у -1-й день такий самий об’єм середовища на одиницю маси тіла ввели 8 мишам з групи, якій вводили середовище та яку застосовували як контрольну групу. Набряк спостерігали на 4 кінцівках та оцінили його шляхом рахування показника (за шкалою від 0 до 4 для кожної кінцівки: загальний показник 16) з дня до виклику (20-й день) з інтервалами у 2 - 3 дні. Внаслідок цього визначили, що показник набряку в 4 кінцівках зменшився після 20-го дня у групі, якій вводили ВМ095, як видно на фіг. 6. Це дозволяє припустити, що ВМ095 має ефект пригнічення початку розвитку артриту. Приклад 7. Оцінка ефективності ліків із застосуванням моделі артриту (остеоартриту), індукованого колагеназою Приготування мишачих моделей та оцінку ефективності ліків здійснювали за процедурою, описаною нижче. Контрольне середовище (20 ммоль/л ацетатного буферу (рН5,5), розведене у шість разів 15 UA 100116 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 сольовим розчином з фосфатним буфером, 200 ммоль/л NaCl (n=5)), 2 мг/кг ВМ095 (n=5) та 20 мг/кг ВМ095 (n=6) ввели (5 мл/кг) внутрівенно у хвостові вени мишей-самців C57BL/6J Jcl віком 8 тижнів (CLEA Japan Inc.). Потім 6 мкл 1,5% розчину колагенази (Тип ІІ; Sigma), профільтрованого крізь 0,45 мкм фільтр (MILLIPORE), ввели у порожнини суглоба правого коліна з анестезією шляхом інгаляції 3% ізофлурану (Am J Pathol 1989; 135(6):1001-14). Ширину суглобів правого та лівого коліна визначили за допомогою штангенциркуля (Mitsutoyo CO.) безпосередньо перед введенням колагенази та через 3, 7 та 14 днів після введення колагенази з метою підрахувати різницю між правим та лівим коліном. Різницю визначали як репрезентативний показник опухання суглоба правого коліна. Ділянку під кривою (AUC) переходу цієї різниці визначили на основі правила трапеції та визначили його як індикатор ефективності ліків. Перевірку за критерієм Стьюдента здійснювали для AUC контрольної групи, якій вводили середовище, та групи, якій вводили ВМ095, застосовуючи програмне забезпечення для статистичного аналізу (SAS Institute Inc.) (передбачається, що суттєва різниця існує, коли р