Експрес-спосіб кількісного визначення основних фракцій вуглеводного комплексу інулінвмісної сировини

Експрес-спосіб кількісного визначення основних фракцій вуглеводного комплексу інулінвмісної сировини, що включає розподіл вуглеводів зразку соку на колонці з сефадексом Г-25 і визначення екстинції елюатів після проведення реакції Селіванова, який відрізняється тим, що для розподілу 30377 з використанням рідинного хроматографа і чутливого детектора. Недоліками цього методу є: по-перше, та ж невизначеність в СП цукрів; по-друге, використання рідкого азоту; по-третє, необхідність складного і дорогого обладнання, що не кожна лабораторія може собі дозволити. Найближчим технологічним рішенням до запропонованого є спосіб розподілу вуглеводів зразку соку з вмістом сухи х речовин 5% на колонці з сефадексом Г-25, визначення екстинції елюатів після проведення реакції Селіванова та визначення концентрації вуглеводів методом накладання гельхроматограми на калібровочний графік залежності екстинції стандартних розчинів фруктози від її концентрації (Гриненко И.Г. Физико-химические свойства инулина и получение его производных : Автореф. ... канд. техн. наук, К. - 1993. - 24с.), який дає можливість одержати гель-хроматограму вуглеводного комплексу в координатах Е-Ve, де Е екстинція елюату, a Ve - об'єм ви ходу елюату. Порівняння гель-хроматограм різних зразків дає можливість оцінити фракційний склад вуглеводного комплексу в межах "більше - менше", а накладання гель-хроматограми на калібровочний графік визначити вміст фруктози в певній фракції елюату. Недоліки цього методу в тому, що по-перше, необхідно суворо дотримуватись постійного вмісту сухи х речовин в пробах соку, що наносяться на колонку з сефадексом, бо при коливаннях цього показника порівняльна характеристика буде необ'єктивною; по-друге, кількісна характеристика найбільш важливих фракцій вуглеводного комплексу сировини методом накладання неточна; по-третє. необхідність вибору і аналізу великої кількості проб. В основу винаходу поставлено завдання створення експрес-методу кількісного визначення основних фракцій вуглеводного комплексу інулінвмісткої сировини шляхом використання зразку соку з концентрацією сухи х речовин в певних межах і відбору укрупнених проб елюату забезпечити простоту, швидкість і точність визначення вмісту основних фракцій вуглеводного комплексу. Поставлене завдання вирішується тим, що в експрес-методі кількісного визначення основних фракцій вуглеводного комплексу інулінвмісткої сировини, що включає розподіл вугле водів зразку соку на колонці з сефадексом Г-25 і визначення екстинції елюатів після проведення реакції Селіванова згідно винаходу для виділення певної фракції вуглеводів використовують зразок соку з концентрацією в межах 3-5% сухи х речовин, проводять відбір 2-3 потрібних укрупнених проб елюатів і визначають екстинцію зразку соку, розбавленого в 20-25 разів, і вміст фракцій розраховують за формулою (1): (1) Аф =(Еф ×Vф :Ес×К р)×100, де Аф - вміст фракції, % до загальної кількості вуглеводів; Еф - екстинція проби фракції; Vф - об'єм фракції, мл; Ес - екстинція загального зразку соку; Кр - коефіцієнт розбавлення зразка соку. Причинно-наслідковий зв'язок між запропонованими ознаками та очікуваним технічним результатом буде в наступному. Відомо, що в топінамбурі та іншій інулінвмісткій сировині присутній широкий спектр вуглеводів від моносахарида фруктози до поліфруктанів зі ступенем полімеризації СП=30 і більше. Але при вивченні метаболізму рослин, оцінці харчових і технологічних якостей сировини в харчовій промисловості, сільському господарстві та наукових дослідженнях важливо знати вміст не 30 вуглеводів, а окремих гр уп, що мають спільні властивості в метаболічних перетвореннях, а саме: фруктози (Ф), що використовується при синтезі сахарози; низькомолекулярних олігосахаридів: сахарози та трисахаридів (ТС), що беруть участь в синтезі вищих олігосахаридів та високомолекулярних фруктанів; вищи х олігосахаридів (ВОС з СП 4-10), що присутні в сировині в найбільшій кількості і використовуються для синтезу високомолекулярних фруктанів; високомолекулярних фруктанів (ВМФ з СП 11-35), які виявляють найбільший вплив на дієтичну та лікувальну цінність продуктів з топінамбура та мають велике значення для виробництва інуліну. Розподіл описаних вище фракцій ВМФ, ОС та ТС на підгрупи, а саме: ВМФ на інулін, фруктани; ОС на олігосахариди з СП більше 6 із СП менше 6; ТС на трисахариди і сахарозу - дозволить глибше вивчити механізм метаболізму вуглеводів в період вегетації і зберігання топінамбура та зміни вуглеводного комплексу при його переробці. При вивченні кількісних змін певної фракції досить відібрати загальний об'єм елюату, що передує цій фракції, та потрібну фракцію (цілу чи розбиту на підгрупи). Для визначення меж розподілу цих фракцій на колонці з сефадексом необхідно провести калібровку колонки (як і в способі-прототипі), використавши фр уктозу, рафінозу та інулін. На калібровочній прямій Ve=f[lg М] (фіг. 1), де Ve - об'єм максимального виходу певного вуглеводу, а М – молекулярна маса вуглеводу, визначаємо Ve для М з СП=10 і СП=2 та інших вуглеводів, які важливі для характеристики сировини (СП=М:180). Згідно даних, приведених на фіг. 1, розділяють об'єм елюювання, на групи, приведені в табл. 1 Концентрація сухи х речовин в соку інулінвмісткої сировини коливається в межах 16-22%. Щоб одержати сік з концентрацією сухих речовин 5%, щоразу треба підбирати коефіцієнт розведення це вимагає певного часу. А гель-хроматограми зразків соку з різною концентрацією СВ не дають можливості зробити об'єктивну порівняльну характеристику фракційного складу різних зразків (фіг. 2, кр. 1, 2). Об'єктивн у оцінку може дати приведена величина екстинції (Епр), яка обчислюється за формулою (2): (2) ЕПР=(Еф :åЕф )×100, де Еф - значення екстинції фракції після проведення реакції. З даних фіг. 2 видно, що для фракції Vc=36 мл значення Е1=0,570; Е2=0,335 - дуже відрізняються і здається, що в першому зразку вміст вуглеводів в цій фракції набагато вищий. Обчислення "приведеної" величини естинції показали, що (Е1)пр= = Е3=8,50% (кр. 3), a (Е2)пр=E4=8,60% (кр. 4), тобто 2 30377 в другому зразку вміст вуглеводів в цій фракції більший на 0,1%. При однаковому об'ємі всіх проб елюату величина Епр характеризує відсоток певної групи вуглеводів до їх загальної кількості. При різних об'ємах проб елюату необхідні додаткові розрахунки, а саме: визначення абсолютної кількості вуглеводів в кожній фракції. Для цього визначили концентраційний коефіцієнт К за формулою (4): К=B:Vпp, (4) де В - коефіцієнт переводу значення екстинції в мг вуглеводів; Vпр - об'єм проби фракції для проведення аналізу, мл. Визначають коефіцієнт В по калібровочному графіку Е=f(Сфруктози) після проведення реакції Селіванова з розчинами фруктози відомої концентрації. В даному випадку при використанні колориметру КФК-2 і умов проведення реакції Селіванова, приведених в модифікованому методі визначення фруктози (Федоренченко Л.А., Бобровник Л.Д. Модифицированный метод колориметрического определения фруктозы // Хранение и переработка сельхозсырья. - 1997. - № 6. - С. 34-35): В=1,371 мг: Vпр =0,5 мл; К=2,742 мг/мл. З даних, одержаних після аналізу укрупнених проб елюатів, кількість вуглеводів в кожній фракції елюату (Gф , мг) можна розрахувати за формулою (4): (4) Gф =K×Eф ×Vф , де K - концентраційний коефіцієнт, мг/мл. Еф - екстинція проби фракції; Vф - об'єм фракції елюату, мл. Загальну кількість вуглеводів (Gс), нанесених на колонку, можна визначити по екстинції проби соку, що наносився на колонку. Але умови проведення реакції Селіванова вимагають, щоб концентрація вуглеводів в сфері реакції не перевищувала 0,25%. Тому пробу соку, що містить 3-5% СР, перед аналізом необхідно розбавити в 20-25 разів (Кр=20-25). Тоді кількість вуглеводів нанесених на колонку (Gc) можна обчислити за формулою (5): (5) Gc=К×Ес×Кр Вміст кожної фракції в відсотках до загальної кількості вуглеводів (Аф ) визначаємо по відношенню (Gф :Gc), тобто за формулою (1): Аф =(К×Еф ×Vф :К×Ес×К р)×100=(Еф ×Vф :Ес×Кр)×100 Визначення кількісного вмісту фракції високомолекулярних фр уктанів вуглеводного комплексу зразку соку, розбавленого до концентрації 4,4% СР, експрес-методом показали, що одержані результати об'єктивно характеризують цей показник, тобто значення вмісту ВМФ характерне для топінамбура (табл. 2). Порівняння значень Аф(2), одержаних з використанням даних по кількості вуглеводів в елюатах, і Аф(1), одержаних по екстинції проби елюату, практично однакові. Але перший спосіб дає економію часу і знижує похибку визначення за рахунок зменшення кількості обчислень і заокруглень. На фіг. 1 приведено калібровочний графік для колонки з сефадексом Г-25 (об'єм сефадексу 69 см 3) в координатах "об'єм виходу - логарифм молекулярної маси". Для більшої зручності додат ково приведена абсциса - ступінь полімеризації (СП)=М:180. На фіг. 2 приведені гель-хроматограми соку топінамбура різних концентрацій, одержані при відборі фракцій елюатів 1-24 мл і 20 фракцій по 2 мл: 1, 2 - значення екстинцій фракцій; 3, 4 – значення "приведених" екстинцій, розрахованих за формулою (2). Експрес-метод кількісного визначення основних фракцій вуглеводного комплексу інулінвмісткої сировини здійснюється таким чином. Сировину подрібнюють, потім проводять екстрагування соку при кімнатній температурі при гідромодулі 2,0. В одержаний екстракт добавляють кизельгур і фільтр ують. Доводять концентрацію фільтрованого соку до 3-5% сухих речовин. Наносять 1 мл соку на колонку з сефадексом Г-25 і проводять елюювання. Відбирають потрібний об'єм фракції елюату, визначений за допомогою калібровочного графіку. Сік, що наносився на колонку, розбавляють в 20-25 разів. Визначають екстинцію проб елюату і розбавленого соку після проведення реакції Селіванова та обчислюють вміст даної фракції вуглеводного комплексу в відсотках до загальної кількості вуглеводів - Аф за формулою (1): Аф =(Еф ×Vф :Ес×К р)×100 Приклади здійснення способу Приклад 1. Топінамбур подрібнюють, проводять екстрагування соку при гідромодулі 2,0. В одержаний екстракт добавляють кизельгур і фільтрують. Доводять концентрацію фільтрованого соку до 4% СР. На заповнену сефадексом колонку наносять 1 мл фільтрованого соку топінамбура. Для визначення, наприклад, фракції олігосахаридів при елююванні відбирають такі проби: 1-36 мл (вільний об'єм колонки та фракція, що передує фракції олігосахаридів), 2-10 мл (власне фракцію олігосахаридів). Залишок соку, що наносився на колонку, розбавляють в 20-25 разів. Визначають екстинцію проб елюату та соку після проведення реакції Селіванова: Еф =0,390; Ес=0,355; обчислюють Еф ×Vф = =0,390×10=3,90 та Ес×Kp=0,355×25=8,875 і визначають величину Аф для даної фракції за формулою (1): Аф =(Еф ×Vф :Ес×К р)×100 Аф =(3,90:8,875)×100=28,39. Результати прикладу 1 та прикладів 2-5, виконаних по аналогічній схемі, але з соком різних концентрацій, зведені в табл. 3. Дані табл. 3 свідчать, що значення екстинції при проведенні колориметричного аналізу знаходяться в межах шкали колориметру, що відзначаються найбільшою точністю: 0,2-0,5. Одержані значення Аф об'єктивно характеризують вміст олігосахаридів в вуглеводному комплексі топінамбура. Результати табл. 3 свідчать, що при концентрації зразку соку 3-5% СР значення екстинцій проб елюату та соку знаходяться в діапазоні шкали колориметру, що відзначається високою точністю. А при СР соку 2% значення екстинції проб елюату та соку вже менше 0,2. В цьому діапазоні шкали колориметру велика похибка визначення екстинції, а значить і концентрації вуглеводів. При СР соку 6% значення екстинції проб елюату та соку більше 0,5. В цьому діапазоні шкали колориметру похибка визначення теж більша, ніж в межах 0,2-0,5. 3 30377 Отже, запропонований експрес-метод кількісного визначення основних фракцій вуглеводного комплексу інулінвмісткої сировини простий в виконанні і забезпечує швидке і точне визначення вміс ту будь-якої фракції вуглеводного комплексу, важливої для вивчення метаболізму рослинної сировини та її технологічної характеристики. Таблиця 1 Розподіл об’єму елюювання на укрупнені проби Номер проби Назва фракції Значення СП Межі відбору фракцій елюату Об'єм елюювання - Vф , мл 1 вільний об'єм колонки ВМФ ОС ТС Ф 0-24 24 35-11 10-4 3-2 1 25-36 37-46 47-54 55-64 12 10 8 10 2 3 4 5 Таблиця 2 Дані аналізів укрупненої проби елюату та розрахунки вмісту фракції, % до загальної кількості вуглеводів Номер і назва фракції 1 - вільний об'єм 2I - інулін 2II - фруктани або: 2=2І+2ІІ-ВМФ Сік, Кр=25 Аналітичні дані Vф , мл Eф 24 5 0,185 7 0,225 12 0,208 Е=0,410 Розрахунки Еф Vф Аф(1) Gф Аф(2) 0,925 9,02 2,54 9,04 1,575 15,37 4,32 15,37 2,50 24,39 6,86 24,41 ЕсКр=10,25 Gc=28,10 Таблиця 3 Дані прикладів здійснення способу Приклади Приклад № 1(СР 4%) Приклад № 2 (СР 3%) Приклад № 3 (СР 5%) Приклад № 4 (СР 2%) Приклад № 5 (СР 6%) Еф 0,390 0,280 0,480 0,195 0,580 Показники при VФ=10 і Кр=25 Еф Vф Ec 3,90 0,355 2,80 0,255 4,80 0,435 1,95 0,180 5,80 0,530 4 Ec Кp 8,875 6,375 10,875 4,500 13,250 Аф 43,94 43,92 44,14 43,33 43,77 30377 Фіг. 1 Фіг. 2 __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2002 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 35 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 5