Штам дріжджів рісніа guіllіеrмоndіі sy 6/5, що нагромаджує в клітинах великі кількості рибофлавіну при культивуванні в середовищах з промисловими субстратами

Винахід відноситься до біотехнології і є новим штамом дріжджів Pichia guilliermondii SY 6/5 з блокованою рибофлавін-екскретазою, в геном якого введена мутація rib81 [1]; поєднання цих мутацій забезпечує надсинтез рибофлавіну (РФ) і нагромадження великих кількостей цього вітаміну в клітинах при культивуванні в середовищах з промисловими субстратами. Найбільш близьким до запропонованого є штам P.guilliermondii SS-16 - 8, здатний при культивуванні в синтетичному середовищі, яке містить як джерело вуглецю сахарозу або етанол, нагромаджувати в клітинах майже весь синтезований РФ (8 - 12мг РФ/г сухої ваги) [2]. Штам SS-16 - 8 рекомендувався авторами цього винаходу для отримання кормових препаратів вітаміну B2. Проте відомо, що кормові дріжджі вирощуються у виробництві в середовищах, які містять ферментативний або кислотний гідролізат зернофуражу [3], відходи спиртового виробництва (брага), харчової промисловості (меляса) і ін. [4]. Штам SS-16 - 8 не був адаптований до цих субстратів. Завданням винаходу була селекція штаму дріжджів P.guilliermondii, здатного до синтезу і нагромадження в клітинах значно більших кількостей РФ в порівнянні зі штамом-прототипом SS-16 - 8, при культивуванні не тільки в цукровомінеральному середовищі з високими концентраціями заліза, айв середовищах, котрі містять промислові субстрати. Основні етапи селекції: 1) гібридизація штаму P.guilliermondii SS-21 (отриманий за допомогою різних селекційних методів зі штаму SS-16 - 8) з штамом P.guilliermondii 131 - 6 генотипу rib81, що виділяв синтезований РФ (100 - 240мкг/мл) в культуральне середовище; 2) відбір жовтих клонів мейотичних сегрегантів типу SY (super yellow), здатних синтезувати і нагромаджувати в клітинах більше РФ, ніж SS штам при вирощуванні в синтетичному середовищі з високим вмістом заліза; 3) адаптація за допомогою мутагенезу (УФпромені, два етапи) одного із сегрегантів - SY-21 до середовищ, котрі містять відходи (брага) спиртової промисловості. Культурально-морфологічні та фізіологобіохімічні особливості штаму. При вирощуванні на сусло-агарі (29°C, 2 доби) більшість клітин P.guilliermondii SY 6/5 є видовженими, розміром 2,3 - 3,0 ´ 5,6 - 13,1мкм, зустрічаються овальні і округлі, їх розмір - 3,0 - 3,3 ´ 4,5 - 7,5мкм. Спор не утворює. Розмір клітин, вирощених при 29°C (5 діб) в рідкому солодовому суслі (7° Б) на качалці: круглі і овальні - 4,2 - 6,6 ´ 6,6 - 8,6мкм, видовжені - 2,2 3,7 ´ 7,8 - 13,3мкм. Клітини вакуолізовані. Більшість клітин мають у вакуолях кристали РФ. Розмноження клітин - брунькуванням. На агаризованому середовищі сусло + брага (1 : 1) колонії віком 7 діб круглі, розмір 2 - 4мм, профіль припіднятий, характер краю гладкий, поверхня концентрично покреслена, центр гладкий блискучий; м'які, жовтого кольору. Деякі клони яскраво жовті, забарвлення зберігається на протязі тривалого часу. Ця ознака є маркером запропонованого штаму і відрізняє його від штаму SS-16 - 8. Ріст на рідкому суслі: на 1 - й тиждень осад, щільний. При посіві уголом в сусло-агар ріст у формі цвяха. На скошеному сусло-агарі 3 - х добовий штрих гладкий, блискучий, світло-жовтий; агар забарвлений в жовтий колір (вітамін B2) в УФпроменях має жовто-зелену флюоресценцію. Штам SY 6/5 здатний асимілювати сахарозу, мальтозу, маннозу, ксилозу, глюкозу, галактозу, лимонну та янтарну кислоти, глутамат, манніт, гліцерин, етанол, слабше сорбозу, арабінозу, дульцит. Не засвоює рамнозу, лактозу, сорбозу. Джерела азоту - сульфат амонію, сечовина, аспарагін, гідролізат казеїну, пептон. Штам активно росте при температурі 22 - 34°C, оптимум температури 28 - 30°C, оптимум pH 4,0 6,0. Штам зберігається на агаризованому суслоагарі або агаризованому середовищі сусло + брага (1 : 1) в холодильнику. Клонується два рази на рік і відсівається 4 - 5 клонів на 7 - 10 день вирощування, використовуючи маркерну ознаку штаму. Штам P.guilliermondii SY 6/5 пройшов лабораторне випробування. Приклад. Дріжджі вирощували: 1) в синтетичному середовищі Беркгольдера, яке містило (г/л) сахарозу - 20, KH2PO4 - 0,5, MgSO4 0,2, CaCl2 ´ 5H2O - 0,1, сечовину - 1; біотин - 1мкг/л, суміш мікроелементів, залізо у формі солі Мора 0,2мг/л; 2) пивне сусло (7° Б) + сечовина (1г/л); 3) пшенична брага (фільтрат) + сечовина (1г/л), 4) сусло (14° Б) + пшенична брага (1 : 2) + сечовина (1г/л); pH 5,5 - 5,8. Колби Ерленмейєра об'ємом 100 - 750мл, які містили, відповідно, 25 - 150мл середовища, засівали суспензією дріжджів, культивували на круговій качалці (220об/хв) протягом 5 діб при 29°C. РФ визначали в культуральній рідині та водних екстрактах клітин (80°C, 20 хв) флюориметричним і колориметричним методами. Дані експериментів представлені в таблиці. Як видно із даних таблиці, селекціонований штам P.guilliermondii SY-21 (II етап селекції) при культивуванні в синтетичному середовищі 17° Б суслі нагромаджує в клітинах 23,0 - 24,0мг РФ/г сухої ваги, що в 2,5 рази перевищує вміст цього вітаміну в клітинах прототипу P.guilliermondil SS-16 - 8. Біля 30% синтезованого РФ виділялось в середовище. Таким чином, отриманий штам характеризувався високим рівнем флавіногенезу, проте при вирощуванні в середовищі з брагою в клітинах нагромаджувалось значно менше РФ, ніж виділялось в культуральну рідину. В результаті проведення III етапу селекції був отриманий штам P.guilliermondii SY 6/5, котрий при культивуванні в середовищах з брагою, суслом і їх сумішшю здатний синтезувати великі кількості РФ, більшу частину якого нагромаджувати в клітинах. Вміст РФ в клітинах становив 24,3мг/г (брага) і 36,3мг/г (сусло 7° Б), що суттєво відрізняє штам SY 6/5 від штаму SY-21. Клітини штаму SS-16 - 8 (прототип), вирощеного в середовищі з брагою, синтезований РФ не акумулювали (див. таблицю). Таким чином, селекціонований флавіногенний штам P.guilliermondii SY 6/5, клітини якого характеризуються високим вмістом РФ, можна вирощувати на середовищах, які використовуються при промисловому виробництві дріжджів, з метою створення кормових препаратів вітаміну B2. Штам Pichia guilliermondii SY 6/5 зберігається в депозитарії Інституту мікробіології та вірусології НАН України під N.Pichia guilliermondii Y-5006, в колекції культур Відділення регуляторних систем клітини Інституту біохімії їм. О.В. Палладіна НАН України під N PG 53. Джерела інформації 1. Бабяк Л.Я., Сибирный А.А., Шавловский Г.М. // Цитология и генетика. - 1993. - Т.27. - №6. С.28 - 32. 2. Авторское свидетельство СССР №207914, кл. C12N1/16, C12P25, 1984. 3. Олешко B.C., Стахеев И.В., Важинская И.С., Батурина Т.Я. Экспресс-информация. - М., 1988. Вып.11. - С.20 - 26. 4. Квасников Е.И., Щелокова И.Ф. Дрожжи. Биология. Пути использования. - К.: Наук. думка, 1991. - С.324.