Спосіб уведення реплікативних та інтегративних плазмід у штами amycolatopsis japonica dsm44213 i amycolatopsis sp. lv42-5

Реферат: Спосіб уведення реплікативних та інтегративних плазмід у штами Amycolatopsis japonica DSM44213 і Amycolatopsis sp. Lv42-5, який ґрунтується на кон'югативному перенесенні ДНК у Amycolatopsis japonicum MG417-CF17. Як реципієнти використовують Amycolatopsis japonica DSM44213 або Amycolatopsis sp. Lv42-5, як донори - штами кишкової палички із плазмідою рКС1139 або pSET152. При цьому кон'югаційні суміші висівають на вівсяне середовище. UA 80307 U (12) UA 80307 U UA 80307 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить генетики бактерій та біотехнології і може бути використана для генетичних маніпуляцій штамами Amycolatopsis japonica DSM44213 і Amycolatopsis sp. Lv42-5, що мають промислово цінні властивості, такі як продукція антибактерійних сполук і здатність акумулювати важкі метали. Відомий спосіб уведення плазмідної ДНК у клітини представників роду Amycolatopsis за допомогою трансформації [Dhingra G, Kumari R, Bala S, Majumdar S, Malhotra S, Sharma P, Lal S, Cullum J, Lal R. Development of cloning vectors and transformation methods for Amycolatopsis. J Ind Microbiol Biotechnol.-2003. - Vol. 30, N 4. - P. 195-204]. Однак, цей спосіб потребує тривалої оптимізації умов і його ефективність для Amycolatopsis japonica DSM44213 і Amycolatopsis sp. Lv42-5 є невідомою. Відомий спосіб уведення плазмідної ДНК у клітини актиноміцетів, й Amycolatopsis, зокрема, за допомогою електропорації [Wang Y, Wang Y, Zhang S. High frequency transformation of the industrial erythromycin-producing bacterium Saccharopolyspora erythraea // Biotechnol Lett.-2008. Vol. 30, N 2. - P.357-361]. Однак, цей спосіб передбачає використання складної апаратури і його ефективність для Amycolatopsis japonica DSM44213 і Amycolatopsis sp. Lv42-5 є невідомою. Відомий спосіб, що містить отримання протопластів штамів актиноміцетів, й Amycolatopsis зокрема, та їхню подальшу трансформацію плазмідною ДНК [Kieser Т., Bibb M.J., Buttner M.J., Chater K.F., Hopwood D.A. Practical Streptomyces genetics // John Innes Foundation, Norwich, United Kingdom.-2000.-613 pages]. Однак, ефективність цього способу значно варіює, навіть, для найбільш вивчених актинобактерій - стрептоміцетів, а для Amycolatopsis доведено здатність переносити лише вузьке коло ендогенних плазмід. Найближчим за технічною сутністю - прототипом - є спосіб уведення ДНК у клітини Amycolatopsis japonica DSM44213 (синонім - Amycolatopsis japonicum MG417-CF17) за допомогою кон'югативних схрещувань із донорним штамом кишкової палички Escherichia coli ET12567 (pUB307), що містить у плазміді pUB307 tra оперон, який і забезпечує перенесення корезидентної плазміди [Stegmann E, Pelzer S, Wilken К, Wohlleben W. Development of three different gene cloning systems for genetic investigation of the new species Amycolatopsis japonica MG417-CF17, the ethylenediaminedisuccinic acid producer. J Biotechnol.-2001. - Vol. 92, N 2. - P. 195-204]. Для схрещувань A. japonica - реципієнт - вирощували на середовищі ISP3 протягом 8 діб при 30 °C, а донорну культуру - на середовищі LA протягом 18 год. при 37 °C. Суспензію спор A. japonicum змішували із клітинами донора Е. coli ET12567 (pUZ8002, pSET152) у співвідношенні 1:10 і висівали на агаризоване середовище MS. Чашки інкубували упродовж 1820 год. при 30 °C, а потім заливали 1,5 мл дистильованої води, що містила 0,5 мг налідиксової кислоти та 1 мг апраміцину. Частоту появи транскон'югантів визначали через п'ять діб вирощування при 30 °C. Проте, у цьому способі не розглядалася можливість уведення реплікативних плазмід у клітини A. japonica та Amycolatopsis sp. Lv42-5, і можливість використання середовищ, простіших за MS, для схрещувань. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалити спосіб кон'югативного перенесення ДНК у штами Amycolatopsis japonica DSM44213 і Amycolatopsis sp. Lv42-5 з використанням реплікативних та інтегративних плазмід, що дасть змогу розширити коло можливих маніпуляцій із цими штамами. Поставлена задача вирішується так, що у способі кон'югативного перенесення ДНК у Amycolatopsis japonicum MG417-CF17, як реципієнти використовують Amycolatopsis japonica DSM44213 або Amycolatopsis sp. Lv42-5, і як донори - штами кишкової палички із плазмідою рКС1139 або pSET152, при цьому кон'югаційні суміші висівають на вівсяне середовище. Штам Amycolatopsis japonica DSM44213, який походить від Amycolatopsis japonicum MG417CF17, вперше описано у 1997 р. і виявлено, що він здатний продукувати етилендиаміноянтарну кислоту (EDDS) [Goodfellow M., Brown A.B., Cai J., Chun J., Collins M.D. Amycolatopsis japonicum sp. nov., an actinomycete producing (S, S)-N, N'-ethylendiamminedisuccinic acid. Syst Appl Microbiol.-1997. - Vol. 20. - P. 78-84]. EDDS - гексадентатний хелатуючий агент, аналог ЕДТА. EDDS штамом Amycolatopsis japonicum продукується виключно у біодеградабельній S, Sконфігурації. Amycolatopsis japonicum є простим і сталим джерелом хелатора для мобілізації важких металів у забруднених ґрунтах. Штам Amycolatopsis sp. Lv42-5 виділено співробітниками НДЛ-42 при кафедрі генетики та біотехнології ЛНУ імені І. Франка у 2009 р. Він продукує біологічні речовини активні проти грампозитивних бактерій, і виявляє підвищену здатність акумулювати низку важких металів. Ці властивості дають змогу використовувати штам у сфері фіторемедіації, де корисні бактерії вносять у забруднений ґрунт для сприяння росту рослин. 1 UA 80307 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Авторами вперше запропоновано використати реплікативну плазміду рКС1139 для експресії генів у клітинах Amycolatopsis japonicum, а також рКС1139 і pSET152 - у клітинах Amycolatopsis sp. Lv42-5. Плазміда pKC1139 дає змогу значно розширити діапазон можливих генетичних маніпуляцій з Amycolatopsis. Оскільки плазміда рКС1139 містить температурочутливий реплікон, то її можна використати для генних нокаутів - тип експериментів, що досі не був можливим для вищезгаданих штамів. Спосіб також дає змогу отримати транскон'юганти, що містять як автономні, так і інтегративні плазміди, що досі не було продемонстровано. Також, перевагою є можливість використання простішого середовища для виконання схрещувань. На кресленні представлена схема плазмід рКС1139 і pSET152, де 1 - ділянка ініціації реплікації плазміди pUC19; 2 - маркерний ген стійкості до апраміцину aac(3)IV; RК2 3 - ділянка ініціації кон'югативного перенесення ДНК oriT ; 4 - ділянка ініціації реплікації плазміди pSG5; 5 - ділянка клонування чужорідної ДНК (полілінкер); 6 - ген інтегрази актинофага РhіС31. Спосіб можна проілюструвати прикладами. Приклад кон'югативного перенесення плазміди рКС1139 у клітини Amycolatopsis japonica. Кон'югацію з Amycolatopsis sp. Lv42-5 виконують аналогічно. Плазмідою рКС1139 трансформують штам Е. coli ET12567 (pUB307), який за рахунок traгенів плазміди pUB307 забезпечує кон'югативне перенесення корезидентних плазмід [Flett F., Mersinias V., Smith C.P. High efficiency intergeneric conjugal transfer of plasmid DNA from Escherichia coli to methyl-DNA-restricting Streptomycetes // FEMS Microbiol. Lett.-1997. - vol. 155. P. 223-229]. Одну колонію нічної культури Escherichia coli засівають у 5 мл середовища LB із 50 мкг/мл канаміцину. Культуру вирощують до оптичної густини OD600=0,1, переносять у мікропробірки з об'ємом 1,5 мл та осаджують центрифугуванням при 10 тис. об./хв протягом 1 хв. Зливають супернантант і клітини ресуспендують у 50 мкл середовища LB. Отриману суспензію клітин охолоджують у льоді 5 хв, додають 1 мл 0,1 М розчину СаСl2 та інкубують у льоді 1 год. Клітини осаджують центрифугуванням при 10 тис. об/хв протягом 1 хв, зливають надосадову рідину та ресуспендують у 100 мкл 0.1 М розчину СаСl2. Інкубують 1 год. у льоді та додають розчин плазмідної ДНК. Інкубують 1 год. у льоді, після чого клітини піддають тепловому шоку протягом 1 хв при 40 °C, охолоджують і додають 1 мл середовища LB. Інкубують 2 год. при 37 °C для індукції експресії генів стійкості та висівають на чашки з середовищем LA з 25 мкг/мл апраміцину та 50 мкг/мл канаміцину. Чашки інкубують при 37 °C 16 год. після чого трансформанти пересівають на свіже середовище LA з 25 мкг/мл апраміцину та 50 мкг/мл канаміцину. Плазміду рКС1139 в A. japonica переносять шляхом міжродової кон'югації з відповідним штамом Е. coli ET12567 (pUB307). Суспензію спор штаму A. japonica висівають на середовище ОМ (г/л: вівсяне борошно - 30, агар - 18, вода водопровідна - до 1 л, рН до стерилізації - 7,0; після стерилізації додають розчин хлориду магнію до кінцевої концентрації 40 мМ) та вирощують 8 діб при 28 °C для отримання спорової суспензії для кон'югаційних схрещувань. Штам Е. coli ET12567 (pUB307) з плазмідою рКС1139 висівають на чашку з середовищем LA з 25 мкг/мл апраміцину та 50 мкг/мл канаміцину та вирощують 18 год. при 37 °C. Готують суспензію клітин у 4 мл середовища LB. Одночасно готують суспензію спор штаму A. japonica у 4 мл стерильного фізіологічного розчину. Спори прогрівають при 50 °C протягом 10 хв. Суспензію клітин кишкової палички та спор Amycolatopsis осаджують центрифугуванням 2 хв при 10000 об/хв, зливають надосадову рідину, розчиняють у 100 мкл середовища LB, змішують між собою та висівають на чашки з середовищем ОМ. Чашки інкубують 24 год. при 28 °C та заливають 1 мл водного розчину 25 мкг апраміцину і 50 мкг 5 6 налідиксової кислоти. Частоти появи транскон'югантів коливаються від 410- до 410- , залежно від типу плазміди та співвідношення клітин донора до спор реципієнта. Отримані транскон'юганти перевіряють на наявність плазміди за допомогою ретрансформації клітин Е. coli DH5α сумарною ДНК транскон'югантів. Вирощують транскон'юганти у 50 мл рідкого середовища TSB та виділяють сумарну ДНК [Kieser Т., Bibb M.J., Buttner M.J., Chater K.F., Hopwood D.A. Practical Streptomyces genetics // John Innes Foundation, Norwich, United Kingdom.-2000.-613 pages], зразки якої використовують для ретрансформації. Факт появи апраміцин-стійких клонів Е. coli DH5α свідчить про наявність автономних копій плазміди рКС1139 у геномі A. japonica. Використання запропонованого способу уведення реплікативних та інтегративних плазмід у штами Amycolatopsis japonica DSM44213 і Amycolatopsis sp. Lv42-5 дає змогу отримати передбачуваний технічний результат. 2 UA 80307 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 Спосіб уведення реплікативних та інтегративних плазмід у штами Amycolatopsis japonica DSM44213 і Amycolatopsis sp. Lv42-5, який ґрунтується на кон'югативному перенесенні ДНК у Amycolatopsis japonicum MG417-CF17, який відрізняється тим, що як реципієнти використовують Amycolatopsis japonica DSM44213 або Amycolatopsis sp. Lv42-5, як донори штами кишкової палички із плазмідою рКС1139 або pSET152, при цьому кон'югаційні суміші висівають на вівсяне середовище. Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3