Спосіб одержання ферментного препарату пероксидази штаму agrocybe cylindracea 167

Реферат: UA 91413 U UA 91413 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до мікології та біотехнології і може бути використана на підприємствах мікробіологічної, фармацевтичної та інших галузях промисловості, де отримується та використовується фермент пероксидаза. Отримання біологічно активних речовин (БАР) з природних джерел та створення на їх основі високоефективних, нетоксичних лікарських препаратів чи компонентів харчових продуктів є актуальним завданням розвитку сучасної біотехнології [1]. Гриби, в тому числі і базидіоміцети, здатні до синтезу БАР широкого спектру дії [12]. Вищий базидіальний гриб Agrocybe cylindracea (DC.) Gillet відомий у країнах південної Європи ще з стародавніх часів, де використовувався в якості делікатесного гриба, а у країнах Азії - в якості профілактичного та лікарського засобу завдяки його антибактеріальній, противірусній та імуномодулюючій активності [13]. Скринінгові дослідження пероксидазної активності (POX-activity) базидіальних грибів дозволили виявити культури - активні продуценти цього ферменту. Так, максимальне значення POX-activity серед досліджених 14 штамів 10 видів базидіоміцетів зафіксовано для шт. Agrocybe cylindracea 167 у культуральному фільтраті та міцелії на 12 добу ферментації [3]. Пероксидази (КФ 1.1.11.7) - це ферменти класу оксидоредуктаз, що каталізують окиснення різних електрон-донорних субстратів за допомогою Н2О2 [9]. Пероксидази знайшли широке практичне застосування і є основним реагентом в медичних діагностичних тест-системах імуноферментного аналізу і препаратах для лікування цілого ряду вірусних, бактеріальних, онкологічних захворювань. Цей фермент також застосовується у фундаментальних дослідженнях в області біотехнології і медицини, загальної біології і екології та є основою біосенсорів, хемі- та біолюмінесцентних датчиків. Наукові розробки стали базою широкого використання пероксидази в різних галузях промисловості [4, 8, 11]. Відомий спосіб отримання пероксидази з коренів хрону Аrmоrасіа rusticana, що включає гомогенізацію рослинної тканини хрону, екстракцію ферменту, відділення екстракту з проведенням осадження ферменту сульфатом амонію, очищення ферменту концентруванням ультрафільтрацією і гельфільтрацією, подальшу ліофілізацію цільового продукту [6]. На вирощування рослин Аrmоrасіа rusticana витрачається багато часу та великі площі сільськогосподарських земель, що є економічно невигідним. Відомий спосіб отримання пероксидази, що передбачає твердофазне культивування гриба Phellinus igniarius ВКПМ F-686. В якості твердої фази використовують частки виноградної лози або соняшникове лушпиння, зволожені до вмісту вологи 80 %, водою, що містить 1 % пептону. Активність пероксидази - 11-13 мкмоль/хв [5]. Метод отримання ферменту пероксидази не передбачає його очищення та висушування. Пероксидазна активність отриманого екстракту ферменту є нижчою, ніж POX-activity ферментного препарату пероксидази штаму Agrocybe cylindracea 167. Найбільш близький за технічною суттю і досяжності результату є спосіб отримання ферментних препаратів пероксидази базидіоміцету Flammulina velutipes, який передбачає культивування продуценту на глюкозо-пептонному середовищі, вилучення міцелію фільтруванням, осадження ферменту сульфатом амонію при 40-60 % насиченні культурального фільтрату і 40-70 % насиченні гомогенату міцелію та очистку фракцій білків діалізом проти дистильованої води [7]. В основу корисної моделі поставлена задача розробки способу одержання ферментного препарату пероксидази штаму Agrocybe cylindracea 167, який відрізняється від прототипу продуцентом, складом модифікованого глюкозо-пептонного середовища та додатковими етапами очищення ферментного препарату методом гель-фільтрації на гранулах молселекту G50 тa G-75. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб одержання ферментного препарату пероксидази штаму Agrocybe cylindracea 167 передбачає культивування продуценту на глюкозопептонному середовищі, відділення біомаси шляхом фільтрування, осадження ферменту з культурального фільтрату та водного екстракту попередньо зруйнованих клітин міцелію сульфатом амонію, первинне очищення фракцій білків діалізом проти дистильованої води, згідно з корисною моделлю, культивування проводять на модифікованому глюкозо-пептонному середовищі, осадження ферменту проводять при 40-70 % насиченні сульфатом амонію та очищення ферментного препарату шляхом гель-фільтрації на гранулах молселекту G-50 та G75, після чого ензимний препарат висушують на ліофільній сушці. Запропонований спосіб є новим тому, що він не відомий з рівня техніки, ферментного препарату та об'єкту продуценту. Приклад конкретного виконання 1. Спосіб отримання ферментного препарату пероксидази штаму Agrocybe cylindracea 167 відповідно до заявленого рішення здійснюють наступним чином. 1 UA 91413 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Вирощування штаму Agrocybe cylindracea 167 здійснюють поверхневим методом в колбах об'ємом 1 або 2 літри. Колби містять 350 чи 700 мл, відповідно, стерильного модифікованого глюкозо-пептонного середовища (ГПСм) наступного складу, г/л: глюкоза 10,0 пептон 3,0 КН2РО4 0,6 К2НРО4 0,4 MgSO4×7Н2О 0,5 СаСl2 0,05 ZnSO4×7Н2О 0,001 казеїн 0,5 дистильована вода до 1 л. [2] Культивування проводять до набуття культурою максимальних значень POX-activity зазвичай протягом 12 діб в термостаті при 27,5±0,5 °C. Після чого, відділяють біомасу від культуральної рідини шляхом фільтрування, отримуючи культуральний фільтрат (КФ) та міцелій. Клітини міцелію піддають механічній деградації та екстрагують дистильованою водою 1:10. Фракціонування ферментів в екстракті міцелію (ЕМ) та КФ проводять шляхом розчинення сульфату амонію до 40-70 % насичення. Використовують цей метод завдяки великій розчинності у воді та стабілізуючій дії на білкову молекулу (NH 4)2SO4. Фракцію білку, яка утворила осад, відділяють центрифугуванням на рефрижераторній центрифузі при 5±1 °C, відцентровому прискоренні 2000 g протягом 15 хвилин. Наступним етапом проводять первинне очищення отриманої білкової фракції за допомогою діалізу проти охолодженої до 5±1 °C дистильованої води протягом 24 годин. В якості напівпроникної мембрани використовують целофанову плівку з порами, які пропускають речовини молекулярною масою до М=7000-10000. Таким чином, сульфат амонію та низькомолекулярні сполуки переходять в розчинник дистильовану воду, а білки - в водорозчинну фазу. Для прискорення дифузії, розчинник декілька раз замінюють до повного очищення розчину білків від сульфату амонію. Завдяки осмосу, молекули розчинника частково потрапляють до дослідного розчину білків. Отримані фракції білків піддають подальшому очищенню шляхом гель-фільтрації на гранулах молселекту G-50 та G-75. Завершальним етапом, білкові розчини піддають ліофільній сушці, отримуючи таким чином ферментні препарати екстра- та інтрацелюлярного походження (ФПE та ФПI або ЕРЕ and EPI), які мають вид порошку від світло-сірого до світло-кремового забарвлення. Вихід ферментних препаратів пероксидаз становив 0,16±0,02 г/кг сирої маси міцелію та 0,15±0,03 г/л КФ. Визначають POX-activity культурального фільтрату і вегетативного міцелію штаму Agrocybe cylindracea 167 за інтенсивністю забарвлення продукту окислення о-діанізидіну Н2О2 та виражали в ум. од. кількості ферменту, яка каталізує окислення 1 мкмоль о-діанізидіну за 1 хвилину [10]. Пероксидазна активність ферментних препаратів дорівнює: ЕРI=2,13±0,12 од/мг, ЕРЕ=6,20±0,17 од/мг. Таким чином, отримані результати показали, що спосіб одержання ферментного препарату пероксидази як з культурального фільтрату так і з вегетативного міцелію штаму Agrocybe cylindracea 167 є новим та придатним для застосування в лабораторних дослідженнях та промисловому виробництві. Джерела інформації:, які використані при укладанні заявки 1. Буценко Л.М. Технології мікробного синтезу лікарських засобів: Навч. посіб. / Л.М. Буценко, Ю.М. Пенчук, Т.П Пирог. - К.: НУХТ, 2010. - 323 с. 2. Волошко Т.Є. Вплив джерел азотного живлення на активність оксидоредуктаз деяких штамів базидіоміцетів / Т.Є. Волошко, О.В. Федотов // Актуальні проблеми ботаніки та екології / Матер. міжнародної конф. молодих учених (Ужгород 19-23 вересня 2012) - Ужгород, 2012. - С. 197-198. 3. Волошко Т.Є. Скринінг штамів базидіоміцетів за активністю антиоксидантних оксидоредуктаз / Т.Є. Волошко, О.В. Федотов // Мікробіологія і біотехнологія. - Одеса, ОНУ, 2011. - № 4 (16). - С. 69-81. 4. Давыдова Г.Ф. Лекарственные препараты из растительного сырья. Пероксидаза / Г.Ф. Давыдова, О.А. Ермаков, А.И. Панасенко, A.M. Тищенко // Химия растительного сырья. - 1998. № 1. - С. 15-18. 2 UA 91413 U 5 10 15 20 25 5. Патент 2073716 Российской Федерации. Способ получения пероксидазы / Егоров A.M., Газарян И.Г. Решетникова И.А. Заявка № 93057591/13 от 24.12.1993, кл. C12N9/08, C12N9/08, C12R1:645, от 20.02.1997. 6. Патент 2130070 Российской Федерации. Способ получения пероксидазы / Гусев А.А., Борзионов В.Д., Красоткина А.С. Заявка № 97119125/13 от 24.11.1997, кл. C12N9/08, от 10.05.1999. 7. Патент 8739 України. Спосіб одержання ферментного препарату пероксидази Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) Sing. / Федотов О.В. Заявка № u200501510, від 18.02.2005, кл. А01Н15/00, C12N9/00, C12N1/14 (2006.01), C12R1/645 (2006.01), Бюл. № 8/2005, від 15.08.2005. (прототип) 8. Преснова Г.В. Электрохимические биосенсоры на основе пероксидазы хрена / Г.В. Преснова, М.Ю. Рубцова, A.M. Егоров // Российский химический журнал. - 2008. - Т. 3., № 2. - С. 60-65. 9. Рогожин В.В. Пероксидаза как компонент антиоксидантной системы живых организмов / В.В. Рогожин. - СПб: ГИОРД, 2004. - 240 с. 10. Рогожин В.В. Физиолого-биохимические механизмы прорастания зерновок пшеницы / В.В. Рогожин, Т.В. Рогожина // Вестник Алтайского государственного аграрного университета. 2011. - № 8 (82). - С. 17-21. 11. Шугалей Н.А. Поиск промышленных источников выделения растительных пероксидаз, области практического использования полученного фермента / Н.А. Шугалей, А.Б. Власова, А.Т. Федорова, А.Л. Федулов, Е.В. Спиридович // Труды БГУ. - 2010. - Т. 5. - С. 53-61. 12. Fedotov O.V. Wood-destroying fungi as bio-sources of ferments for medicinal and nutritional purposes / O.V. Fedotov-Plant and Microbial Enzymes: isolation, characterization and biotechnology applications-Tbilisi: Myza, 2007. - P. 125-126. 13. Wasser S.P. Mushroom Pharmacy. / S.P. Wasser // In: McGraw Hill Encyclopedia of Science & Technology. 10 edition, NY, USA, 2010. - P. 678-683. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 30 35 Спосіб одержання ферментного препарату пероксидази штаму Agrocybe cylindracea 167, що включає культивування продуценту на глюкозо-пептонному середовищі, відділення біомаси шляхом фільтрування, осадження ферменту з культурального фільтрату та водного екстракту попередньо зруйнованих клітин міцелію сульфатом амонію, первинне очищення фракцій білків діалізом проти дистильованої води, який відрізняється тим, що культивування проводять на модифікованому глюкозо-пептонному середовищі, осадження ферменту проводять при 40-70 % насиченні сульфатом амонію та очищення ферментного препарату шляхом гель-фільтрації на гранулах молселекту G-50 та G-75, після чого ензимний препарат висушують на ліофільній сушці. Комп’ютерна верстка М. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3