Спосіб іммобілізації трипсину

Реферат: Винахід належить до способу іммобілізації трипсину, що передбачає включення ферменту в полімерну матрицю гелеподібної структури, де спочатку змішують водні розчини пектину і трипсину та витримують 10-15 хвилин, після цього додають розчин хітозану в 1 %-ній оцтовій кислоті, після чого отриману суміш витримують 10-15 хвилин і піддають ліофільному сушінню, при цьому розчин пектину, трипсину і хітозану беруть в масовому співвідношенні, рівному (0,52) : (0,25-1) : (0,5-2) відповідно. UA 99542 C2 (12) UA 99542 C2 UA 99542 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до біотехнології, зокрема до способу отримання іммобілізованих ферментів, і може бути використаний в харчовій промисловості, а також в медичній та лабораторній практиці. Відомий спосіб іммобілізації комплексу ферментів, до складу яких входить ліпаза, на харчових волокнах з використанням як середовища насиченого 20 %-го розчину поліетиленоксиду (ПЕО) та 10 %-го полівінілового спирту (ЛВС), приготованих на 5 %-му розчині бури (тетраборату натрію) (див Кравченко І.А. та ін. Іммобілізація ферментів замісної терапії на харчових волокнах. Доповіді НАН України, 1997, № 3, С. 182-186). Але відомий спосіб має суттєві недоліки: при іммобілізації на харчових волокнах втрачається 69-78 % вихідної ліполітичної активності; складність способу, пов'язана з подрібненням до порошкоподібного стану іммобілізованого препарату, отриманого шляхом насичення харчових волокон 20 %-им розчином ПЕО. Існує спосіб іммобілізації ліполітичних ферментів, який передбачає включення ферменту в полівініловий спирт і подальше нанесення його на матрицю, попередньо насичену 2 %-им розчином бури. Як матрицю використовують активований вуглецево-волокнистий матеріал з 3 сумарним об'ємом пор 0,41-1,3 см /г, а процес ведуть при співвідношенні фермент:полівініловий спирт:матриця - (0,8-1,2):(0,11-0,17):(24-72) відповідно (див. патент України № 7861 (51) МПК (2005): C12N 11/00 Спосіб іммобілізації ліполітичних ферментів). Недоліком даного способу є використання полівінілового спирту для включення ферменту. Даний компонент є синтетичним матеріалом і не підлягає біодеградації. Відомий спосіб іммобілізації ферментів на органічному носії. Спосіб полягає в тому, що хемосорбційне волокно на основі співполімеру акрилонітрилу з 2,5-вінілпіридину (марка ВИОН АН-1) обробляють водними розчинами різних ферментів: лужна фосфатаза, пероксидаза, папаїн, -хімотрипсин. Активність іммобілізованих ферментів складає 45-75 % від нативної величини залежно від природи ферменту та субстрату (див. заявку на патент Росії № 93008907 Спосіб отримання іммобілізованих ферментів). Недоліком даного способу є використання в якості носія синтетичного матеріалу, при застосуванні якого можуть виникнути алергічні реакції, а також низька активність деяких іммобілізованих ферментів в порівнянні з нативними. Найбільш близьким до заявленого є спосіб іммобілізації протеази С (див. патент України на корисну модель № 31802). Іммобілізацію протеази С проводять наступним чином: готують 1 суспендований розчин протеази С, для чого 35 мг ферменту розчиняють в 5 см натрій3 фосфатного буферного розчину (0,033 моль/дм , рН 7, 4). Отриману суспензію при температурі 3 37 °C і ретельному перемішуванні повільно вливають в 3 см гелеподібного продукту з бурих морських водоростей "Ламідан". В результаті включення отримують іммобілізовану протеазу С у вигляді суміші, якій надалі в залежності від потреб можна надати необхідну форму. Зберігають іммобілізованій препарат у холодильнику при температурі 0-4 °C. Даний спосіб вибрано прототипом. Фермент трипсин належить до класу протеаз. Прототип і спосіб, що заявляється, співпадають в наявності операції включення ферменту з полімерною матрицею гелеподібної структури. Але спосіб за прототипом має суттєві недоліки: наявність великої іонної сили розчину, що створюється в гелі, унеможливлює ймовірність іммобілізації на ньому лужних протеаз (нульовий % збереження активності), збереження активності трипсину у складі гелеподібного продукту з бурих морських водоростей "Ламідан" зберігається всього на 19,5 %. Другим недоліком є те, що іммобілізована протеаза С у вигляді продукту гелеподібної структури деяким чином є несприятною за органолептичними показниками для вживання перорально. Окрім того, проведення процесу іммобілізації ферменту при температурі 37 °C передбачає додаткові затрати енергії. В основу винаходу поставлено задачу розробити удосконалений спосіб іммобілізації трипсину, в якому шляхом включення його в іншу полісахаридну матрицю забезпечити значне збереження активності ферменту та отримати продукт зі сприятливими органолептичними характеристиками. Поставлена задача вирішена в способі іммобілізації трипсину, що передбачає включення ферменту в полімерну матрицю гелеподібної структури, тим, що спочатку змішують водні розчини пектину і трипсину та витримують 10-15 хвилин, після чого до вказаної суміші додають розчин хітозану в 1 %-ій оцтовій кислоті, суміш витримують 10-15 хвилин і піддають ліофільному сушінню. Розчини пектину, трипсину і хітозану беруть в масовому співвідношенні (0,5-2):(0,251):(0,5-2) відповідно. Новим у винаході, що заявляється, є використання як компонентів полімерної матриці таких полісахаридів як пектин і хітозан, а також режими виконання способу: час витримки, співвідношення компонентів. 1 UA 99542 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Відомо, що хітозан застосовується як носій різних біологічно активних сполук (див. Ж. Прикладна біохімія та мікробіологія, 2007, Т. 43, № 2, С. 169-171). Цьому значною мірою сприяє наявність в молекулі хітозану активної аміногрупи, яка в м'яких умовах може взаємодіяти з функціональними групами іммобілізованої сполуки. Однак при цьому завжди виникає необхідність вибору поєднувального агента, що забезпечує максимальну біологічну активність речовини в іммобілізованому стані. В літературі відсутні дані про результати порівняльних досліджень впливу способу іммобілізації на біологічну активність кінцевого продукту. Пропонований спосіб отримання іммобілізованих ферментів полягає в отриманні інтерполіелектролітних комплексів (ІПЕК) хітозану та пектину з включенням до них трипсину. При використанні як комплексоутворювачів природних полісахаридів, завдяки їх власній фізіологічній активності, може бути реалізований синергічний ефект - посилення активності іммобілізованої речовини. ІПЕК представляють особливий клас полімерних речовин, що утворюються в результаті кооперативних оборотних реакцій з'єднання протилежно заряджених іонів. Кооперативний характер зв'язків між полійонами надає ІПЕК високу стабільність у широкому інтервалі значень рН середовища. При різних співвідношеннях йоногенних груп вихідних компонентів можуть бути отримані як нерозчинні, так і розчинні ІПЕК. Нерозчинні (стехіометрічні) ІПЕК виділяються з розчину у вигляді порівняно мало сольватованих осадів, співвідношення між протилежно зарядженими групами в них становить 1:1. Комплекси мають високу протеолітичну активність. Відмінною особливістю такого способу іммобілізації ферментів є відсутність контакту ферменту з розчинниками, які спричиняють денатуруючу дію на білки. Показано, що зв'язування ферменту з матрицею відбувається в основному за рахунок електростатичних взаємодій. Такий характер взаємодії дозволяє зберегти третинну структуру білка і, отже, його активність. Використання полісахаридів в якості полімерної матриці дозволяє зберегти 80-90 % активності іммобілізованого таким чином трипсину, що володіє пролонгованою дією. Невідома технологія іммобілізації ферменту, зокрема трипсину, в якій як полімерні полісахариди використовуються пектин і хітозан в суміші. Вказані компоненти полімерної матриці підібрані експериментально. Як аніонні комплексоутворювачі, крім пектину, використовували також агар та карагінан, як катіонний комплексоутворювач - казеїн. При змішуванні розчинів пектину з казеїном або хітозану з карагінаном, або хітозану з агаром утворення гелеподібної структури не спостерігалось. Відмічалось деяке збільшення в'язкісних характеристик даних сумішей, на відміну від суміші хітозану з пектином. Змішування розчинів хітозану з пектином супроводжувалось гелеутворенням та замутненням системи, які спостерігали протягом 30 хвилин. Спектрофотометричне дослідження показало, що оптична щільність дисперсій, яку визначали через кожні 5 хвилин (=345 нм) досягала постійного значення (D=0,82 опт. од) через 10-15 хвилин від початку поєднання компонентів комплексу, що вказує на закінчення процесу комплексоутворення. Тому в режимі вибрано час витримки саме 10-15 хвилин. Співвідношення пектину, трипсину та хітозану також підібрано експериментально. Комплекс з протеолітичною активністю отримували послідовним змішуванням розчинів пектину, трипсину і хітозану. Використовували хітозан з молекулярною масою 245 кДа і ступенем деацетилювання 67,2 %, яблучний пектин з молекулярною масою 12 кДа і ступенем метоксилювання 66,4 %, трипсин з активністю 90 од/мг. Співвідношення між протилежно зарядженими групами хітозану та пектину становило 1:1, що відповідає утворенню нерозчинних (стехіометрічних) інтерполіелектролітних комплексів (ІПЕК). Показано, що процес комплексоутворення носить нединамічний характер, тому отримані комплекси мають ряд переваг в порівнянні з динамічними асоціатами модифікованих хітозанів при отриманні носіїв для транспорту біологічно активних речовин, і в тому числі живих клітин мікроорганізмів (бактерій) з пролонгованим ефектом. Масове співвідношенні компонентів у комплексі (пектин, трипсин: хітозан) становило (0,52):(0,25-1):(0,5-2). Концентрацію полісахаридів-комплексоутворювачів варіювали в інтервалі від 0,5 до 2 %, трипсину - від 0,2 до 1 %. Процес взаємодії компонентів супроводжувався гелеутворенням, в той час як кожен з полісахаридів окремо при взаємодії з трипсином в даних умовах не здатен до утворення гелю. Процес комплексоутворення завершується через 10-15 хвилин з моменту з'єднання компонентів комплексу. Включення ферменту в матрицю становило 100 %. ІПЕК з трипсином піддавали ліофільному сушінню при 37 °C, після чого визначали протеолітичну активність. Приклад 1 В ємність помістили 30 мл 0,25 %-го водного розчину пектину і додали 15 мл 0,5 %-го водного розчину трипсину. Суміш перемішали і витримали протягом 15 хв. Після цього до 2 UA 99542 C2 5 10 15 суміші додали 30 мл 1 %-го рзчину хітозану в 1 %-ій оцтовій кислоті, перемішали і витримали протягом 15 хвилин. Отриману гелеву масу після цього помістили в металеві бюкси і піддали ліофільному сушінню при 37 °C протягом 10 год. Отриманий продукт мав губчату пористу структуру, колір від світло-сірого до кремового. Вміст вологи складав 8-10 %. Отримані ІПЕК з трипсином характеризуються збереженням активності 94,08 % від максимально можливої. Встановлено, що найбільшою активністю володіє комплекс, отриманий з використанням 0,25 %их розчинів пектину і хітозану і 0,5 %-го розчину трипсину при масовому співвідношенні пектин: трипсин: хітозан 2:1:2. Приклад 2-7 здійснювали аналогічно тому, як наведено в прикладі 1, але компоненти брали в різних співвідношеннях. Результати наведені в таблиці. Як видно з даних таблиці, оптимальне співвідношення пектину і хітозану, щодо протеолітичої активності комплексу, становить 1:1, що відповідає утворенню стехіометричного ІПЕК (кількість аніонних карбоксильних груп пектину є еквівалентною кількості катіонних аміногруп хітозану). При співвідношення пектину та хітозану в комплексі 1:3 та 3:1, спостерігається зменшення протеолітичої активності комплексів. Погіршення протеолітичних властивостей ІПЕК пояснюється утворенням нестехіометричних динамічних асоціатів, в котрих включення трипсину здійснюється не повністю. Таблиця Вплив масового співвідношення компонентів пектину, трипсину та хітозану на протеолітичну активність комплексу № прикладу 1 2 3 4 5 6 7 Пектин, 0,5 % 0,25 0,5 2,0 0,3 (-) 3,0 (-) 1,0 1,0 Компоненти, % Трипсин, 0,5 % 0,5 0,5 1,0 0,15 1,0 0,25 0,5 Хітозан, 0,5 % 0,25 0,5 2,0 0,5 2,0 0,3 (-) 3,0 (-) Протеолітична активність, % від максимальної 94,8 71,27 54,3 28,6 (-) 32,5 (-) 31,8 (-) 24,0 (-) 20 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 25 1. Спосіб іммобілізації трипсину, що передбачає включення ферменту в полімерну матрицю гелеподібної структури, який відрізняється тим, що спочатку змішують водні розчини пектину і трипсину та витримують 10-15 хвилин, після чого додають розчин хітозану в 1 %-ній оцтовій кислоті, суміш витримують 10-15 хвилин і піддають ліофільному сушінню, при цьому розчин пектину, трипсину і хітозану беруть в масовому співвідношенні, рівному (0,5-2) : (0,25-1) : (0,5-2) відповідно. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що пектин і хітозан беруть в концентрації 0,25-1 %. Комп’ютерна верстка М. Ломалова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3