Спосіб іммобілізації трипсину

1. Спосіб іммобілізації трипсину, що передбачає включення ферменту в полімерну матрицю 3 надалі в залежності від потреб можна надати необхідну форму. Зберігають іммобілізованій препарат у холодильнику при температурі 0-4 °C. Даний спосіб вибрано найближчим аналогом. Фермент трипсин належить до класу протеаз. Аналог і спосіб, що заявляється, співпадають в наявності операції включення ферменту з полімерною матрицею гелеподібної структури. Але спосіб за найближчим аналогом має суттєві недоліки: наявність великої іонної сили розчину, що створюється в гелі, унеможливлює ймовірність іммобілізації на ньому лужних протеаз (нульовий % збереження активності), збереження активності трипсину у складі гелеподібного продукту з бурих морських водоростей "Ламідан" зберігається всього на 19,5 %. Другим недоліком є те, що іммобілзована протеаза С у вигляді продукту гелеподібної структури деяким чином є несприятною за органолептичними показниками для вживання перорально. Окрім того, проведення процесу іммобілізації ферменту при температурі 37 °C передбачає додаткові затрати енергії. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити удосконалений спосіб іммобілізації трипсину, в якому шляхом включення його в іншу полісахаридну матрицю забезпечити значне збереження активності ферменту та отримати продукт зі сприятливими органолептичними характеристиками. Поставлена задача вирішена в способі іммобілізації трипсину, що передбачає включення ферменту в полімерну матрицю гелеподібної структури, тим, що спочатку змішують водні розчини пектину і трипсину та витримують 10-15 хвилин, після чого до вказаної суміші додають розчин хітозану в 1 %-ій оцтовій кислоті, суміш витримують 10-15 хвилин і піддають ліофільному сушінню. Розчини пектину, трипсину і хітозану беруть в масовому співвідношенні (1-2):(0,5-1):(1-2) відповідно. Новим у корисній моделі що заявляється є використання як компонентів полімерної матриці таких полісахаридів як пектин і хітозан, а також режими виконання способу: час витримки, співвідношення компонентів. Відомо, що хітозан застосовується як носій різних біологічно активних сполук (див. Ж. Прикладна біохімія та мікробіологія, 2007, том 43, №2, с. 169-171). Цьому значною мірою сприяє наявність в молекулі хітозану активної аміногрупи, яка в м'яких умовах може взаємодіяти з функціональними групами іммобілізованої сполуки. Однак при цьому завжди виникає необхідність вибору поєднувального агента, що забезпечує максимальну біологічну активність речовини в іммобілізованому стані. В літературі відсутні дані про результати порівняльних досліджень впливу способу іммобілізації на біологічну активність кінцевого продукту. Пропонований спосіб отримання іммобілізованих ферментів полягає в отриманні інтерполіелектролітних комплексів (ІПЕК) хітозану та пектину з включенням до них трипсину. При використанні як комплексоутворювачі природних полісахаридів, завдяки їх власній фізіологічній активності, може бути реалізований синергічний ефект - посилення активності іммобілізованої речовини. ІПЕК пред 66429 4 ставляють особливий клас полімерних речовин, що утворюються в результаті кооперативних оборотних реакцій з'єднання протилежно заряджених іонів. Кооперативний характер зв'язків між полііонами надає ІПЕК високу стабільність у широкому інтервалі значень рН середовища. При різних співвідношеннях іоногенних груп вихідних компонентів можуть бути отримані як нерозчинні, так і розчинні ІПЕК. Нерозчинні (стехіометрічні) ІПЕК виділяються з розчину у вигляді порівняно мало сольватованих осадів, співвідношення між протилежно зарядженими групами в них становить 1:1. Комплекси мають високу протеолітичну активність. Відмінною особливістю такого способу іммобілізації ферментів є відсутність контакту ферменту з розчинниками, які спричиняють денатуруючу дію на білки. Показано, що зв'язування ферменту з матрицею відбувається в основному за рахунок електростатичних взаємодій. Такий характер взаємодії дозволяє зберегти третинну структуру білка і, отже, його активність. Використання полісахаридів як полімерну матрицю дозволяє зберегти 8090 % активності іммобілізованого таким чином трипсину, що має пролонговану дію. Невідома технологія іммобілізації ферменту, зокрема трипсину, в якій як полімерні полісахариди використовуються пектин і хітозан в суміші. Вказані компоненти полімерної матриці підібрані експериментально. Як аніонні комплексоутворювачі, крім пектину, використовували також агар та карагінан, як катіонний комплексоутворювач - казеїн. При змішуванні розчинів пектину з казеїном або хітозану з карагінаном, або хітозану з агаром утворення гелеподібної структури не спостерігалось. Відмічалось деяке збільшення в'язкісних характеристик даних сумішей, на відміну від суміші хітозану з пектином. Змішування розчинів хітозану з пектином супроводжувалось гелеутворенням та замутненням системи, які спостерігали протягом 30 хвилин. Спектрофотометричне дослідження показало, що оптична щільність дисперсій, яку визначали через кожні 5 хвилин (=345 нм) досягала постійного значення (D=0,82 опт. од) через 10-15 хвилин від початку поєднання компонентів комплексу, що вказує на закінчення процесу комплексоутворення. Тому в режимі вибрано час витримки саме 10-15 хвилин. Співвідношення пектину, трипсину та хітозану також підібрано експериментально. Комплекс з протеолітичною активністю отримували послідовним змішуванням розчинів пектину, трипсину і хітозану. Використовували хітозан з молекулярною масою 245 кДа і ступенем деацетилювання 67,2 %, яблучний пектин з молекулярною масою 12 кДа і ступенем метоксилювання 66,4 %, трипсин з активністю 90 од/мг. Співвідношення між протилежно зарядженими групами хітозану та пектину становило 1:1, що відповідає утворенню нерозчинних (стехіометричних) інтерполіелектролітних комплексів (ІПЕК). Показано, що процес комплексоутворення носить нединамічний характер, тому отримані комплекси мають ряд переваг в порівнянні з динамічними асоціатами модифікованих хітозанів 5 при отриманні носіїв для транспорту біологічно активних речовин, і в тому числі живих клітин мікроорганізмів (бактерій) з пролонгованим ефектом. Масове співвідношенні компонентів у комплексі (пектин:трипсин: хітозан) становило (1-2):(0,51):(1-2). Концентрацію полісахаридівкомплексоутворювачів варіювали в інтервалі від 0,25 до 1 %, трипсину - від 0,2 до 1 %. Процес взаємодії компонентів супроводжувався гелеутворенням, в той час як кожен з полісахаридів окремо при взаємодії з трипсином в даних умовах не здатен до утворення гелю. Процес комплексоутворення завершується через 10-15 хв. з моменту з'єднання компонентів комплексу. Включення ферменту в матрицю становило 100 %. ІПЕК з трипсином піддавали ліофільному сушінню при 37 °C, після чого визначали протеолітичну активність. Приклад 1 В ємність помістили 30 мл 0,25 %-го водного розчину пектину і додали 15 мл 0,5 %-го водного розчину трипсину. Суміш перемішали і витримали протягом 15 хв. Після цього до суміші додали 30 мл 0,25 %-го розчину хітозану в 1 %-ій оцтовій ки 66429 6 слоті, перемішали і витримали протягом 15 хв. Отриману гелеву масу після цього помістили в металеві бюкси і піддали ліофільному сушінню при 37 °C протягом 10 год. Отриманий продукт мав губчату пористу структуру, колір від світло-сірого до кремового. Вміст вологи складав 8-10 %. Приклад 2-7 здійснювали аналогічно тому як наведено в прикладі 1, але компоненти брали в різних співвідношеннях. Результати наведені в таблиці. Встановлено, що найбільшою активністю (94,8 % від максимально можливої) має комплекс, отриманий з використанням 0,25 %-их розчинів пектину і хітозану і 0,5 %-го розчину трипсину при масовому співвідношенні пектин: трипсин: хітозан 2:1:2, при цьому співвідношення функціональних груп пектину і хітозану становить 1:1, що відповідає утворенню стехіометричного ІПЕК. При різному співвідношенні функціональних груп пектину та хітозану в комплексі спостерігається зменшення протеолітичої активності ІПЕК. Така тенденція пояснюється утворенням нестехіометричних асоціатів, в котрих включення трипсину здійснюється не повністю. Таблиця Протеолітична активність (ПА) ІПЕК в залежності від співвідношення та концентрації його складових Пектин Трипсин Хітозан ПА, % від № зразка Концентрація, С, Об'єм, V, Концентрація, С, Об'єм, V, Концентрація, С, Об'єм, V, max % мл % мл % мл 1 0,25 30 0,5 15 0,25 30 94,8 2 0,5 20 0,5 20 0,5 20 71,27 3 1,0 30 1,0 15 1,0 30 54,3 4 0,3 30 0,15 15 0,5 15 28,6 5 0,75 15 1,0 15 0,25 30 32,5 6 0,25 20 0,25 20 0,75 20 31,8 7 1,0 20 0,5 10 1,0 40 24,0 Комп’ютерна верстка А. Рябко Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601