Спосіб іммобілізації трипсину

Спосіб іммобілізації трипсину, що передбачає зв'язування його з харчовими волокнами, який відрізняється тим, що спочатку змішують водні розчини пектину і трипсину, до суміші додають харчові волокна та витримують 60-180 хвилин, після чого до вказаної суміші додають розчин хітозану в 1 %-ній оцтовій кислоті, суміш витримують 60-180 хвилин і піддають ліофільному сушінню. (19) (21) u201105216 (22) 26.04.2011 (24) 26.12.2011 (46) 26.12.2011, Бюл.№ 24, 2011 р. (72) ЧЕРНО НАТАЛІЯ КИРИЛІВНА, ОЗОЛІНА СОФІЯ ОЛЕКСАНДРІВНА, КАПУСТЯН АНТОНІНА ІВАНІВНА (73) ОДЕСЬКА НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ 3 наявності операції іммобілізації ферменту трипсину методом адсорбції на харчових волокнах. Але найближчий аналог має суттєві недоліки: при іммобілізації на харчових волокнах втрачається 69-78% вихідної активності ферменту; складність способу, пов'язана з подрібненням до порошкоподібного стану іммобілізованого препарату, отриманого шляхом насичення харчових волокон 20 %-им розчином ПЕО; використання в якості середовища для іммобілізації ферменту синтетичних матеріалів (ПЕО та ПВС), які не підлягають біодеградації в організмі людини і, можливо, понижують активність ферментів. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити удосконалений спосіб іммобілізації ферменту трипсину на харчових волокнах, в якому за рахунок використання в якості середовища для іммобілізації природних полісахаридів, забезпечується значне збереження активності ферменту та досягнення синергічного ефекту протеолітичної дії ферменту. Поставлена задача вирішена в способі іммобілізації трипсину, що передбачає іммобілізацію розчину ферменту з пектином на харчових волокнах методом адсорбції з подальшою фіксацією хітозаном, тим, що спочатку змішують водні розчини пектину і трипсину та витримують 10-15 хвилин, після чого проводять процес адсорбції даного розчину на харчових волокнах протягом 60 - 180 хв, до вказаної суміші додають розчин хітозану в 1 %-ій оцтовій кислоті, суміш витримують 60 - 180 хвилин і піддають ліофільному сушінню. Новим у корисній моделі що заявляється є використання як компонентів середовища для іммобілізації таких полісахаридів як пектин і хітозан, а також режими виконання способу: час витримки, співвідношення компонентів. Пропонований спосіб отримання іммобілізованих ферментів полягає в отриманні інтерполіелектролітних комплексів (ІПЕК) хітозану та пектину з включенням до них трипсину в порах харчових волокон. При використанні в якості комплексоутворювачів природних полісахаридів, завдяки їх власній фізіологічній активності, може бути реалізований синергічний ефект - посилення активності іммобілізованої речовини. ІПЕК представляють особливий клас полімерних речовин, що утворюються в результаті кооперативних оборотних реакцій з'єднання протилежно заряджених іонів. Кооперативний характер зв'язків між полійонами надає ІПЕК високу стабільність у широкому інтервалі значень рН середовища. При різних співвідношеннях йоногенних груп вихідних компонентів можуть бути отримані як нерозчинні, так і розчинні ІПЕК. Нерозчинні (стехіометричні) ІПЕК виділяються з розчину у вигляді порівняно мало сольватованих осадів, співвідношення між протилежно зарядженими групами в них становить 1:1. Комплекси мають високу протеолітичну активність. Відмінною особливістю такого способу іммобілізації ферментів є відсутність контакту ферменту з розчинниками, які спричиняють денатуруючу дію на білки. Показано, що зв'язування ферменту з полісахаридами відбувається в основному за рахунок електростатичних взаємодій. Такий характер 66014 4 взаємодії дозволяє зберегти третинну структуру білка і, отже, його активність. Використання полісахаридів в якості середовища для іммобілізації на харчових волокнах дозволяє зберегти 80-90 % активності іммобілізованого таким чином трипсину, що володіє пролонгованою дією. Невідома технологія іммобілізації ферменту на харчових волокнах, зокрема трипсину, де включення ферменту проводиться за рахунок утворення ПЕК пектин : трипсин : хітозан в порах харчових волокон. Вказані компоненти ПЕК підібрані експериментально. В якості аніонних комплексоутворювачів, крім пектину, використовували також агар та карагінан, в якості катіонного комплексоутворювача – казеїн. При змішуванні розчинів пектину з казеїном, або хітозану з карагінаном, або хітозану з агаром – утворення гелеподібної структури не спостерігалось. Відмічалось деяке збільшення в'язкістних характеристик даних сумішей, на відміну від суміші хітозану з пектином. Змішування розчинів хітозану з пектином супроводжувалось гелеутворенням та замутненням системи, які спостерігали протягом 30 хвилин. Спектрофотометричне дослідження показало, що оптична щільність дисперсій, яку визначали через кожні 5 хвилин (=345нм) досягала постійного значення (D=0,82 опт.од) через 10 – 15 хвилин від початку поєднання компонентів комплексу, що вказує на закінчення процесу комплексоутворення. Тому в режимі обрано час витримки саме 10-15 хвилин. Співвідношення пектину, трипсину та хітозану також підібрано експериментально. Співвідношення між протилежно зарядженими групами хітозану та пектину становило 1:1, що відповідає утворенню нерозчинних (стехіометричних) інтерполіелектролітних комплексів (ІПЕК). Показано, що процес комплексоутворення носить нединамічний характер, тому отримані комплекси мають ряд переваг в порівнянні з динамічними асоціатами модифікованих хітозанів при отриманні носіїв для транспорту біологічно активних речовин, і в тому числі живих клітин мікроорганізмів (бактерій) з пролонгованим ефектом. Приклад 1. До 4 г харчових волокон пшеничних висівок (ХВПВ) додавали 30мл 1 %-го розчину трипсину в 0,5 %-му водному розчині пектину. Витримували суміш 90 хвилин, потім додавали 30 мл 0,5 %-го розчину хітозану в 1 %-ій оцтовій кислоті, витримували 60 хвилин. Включення ферменту в матрицю становило 100 %. ІПЕК з трипсином піддавали ліофільній сушці при 37 °С. Приклад 2. До 3 г харчових волокон моркви (ХВМ) додавали 30 мл 1 %-го розчину трипсину в 0,5 %-му водному розчині пектину. Витримували суміш 120 хвилин, потім додавали 30 мл 0,5 %-го розчину хітозану в 1 %-ій оцтовій кислоті, витримували 90 хвилин. Включення ферменту в матрицю становило 100%. ІПЕК з трипсином піддавали ліофільній сушці при 37 °С. Приклад 3. До 3,5 г харчових волокон гарбуза (ХВГ) додавали 30 мл 0,5 %-го розчину трипсину в 0,5 %-му водному розчині пектину. Витримували суміш 180 хвилин, потім додавали 30 мл 0,5 %-го розчину хітозану в 1 %-ій оцтовій кислоті, витри 5 66014 мували 60 хвилин. Включення ферменту в матрицю становило 100%. ІПЕК з трипсином піддавали ліофільній сушці при 37 °С. Визначали рівень ферментативної та кислотної деградації нативного та іммобілізованого трисину після 2 год перебування в умовах шлунковокишкового тракту in vitro. Рівні за активністю проби нативного та іммобілізованого трисину інкубували в розчині пепсину при рН 2 протягом 0...240 хви 6 лин, потім доводили рН розчину до оптимального значення (рН=7,4) і визначали протеолітичну активність. Дані наведено в таблиці. Зразок №1 - нативний трипсин (0,01) г; №2 - ХВПВ, трипсин (0,1 г : 0,01 г); №3 - ХВПВ, трипсин, хітозан (0,1 : 0,01 : 0,03); №4 - ХВПВ, трипсин, пектин (0,1 : 0,01 : 0,03); №5 – ХВПВ, трипсин, пектин, хітозан (0,1 : 0,01 : 0,03 : 0,03). Таблиця Протеолітична активність зразків, які піддавали кислотно-ферментативній деструкції № п/п зразка 1 2 3 4 5 30 хв 3,42 33,18 52,75 47,11 88,36 Протеолітична активність, % від максимально можливої 60 хв 90 хв 120 хв 150 хв 180 хв 210 хв 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 12,21 7,11 3,56 1,28 0,14 0,00 47,17 35,46 27,34 22,08 17,32 24,06 38,23 27,78 24,15 21,46 19,07 18,56 85,23 81,65 79,88 75,02 71,12 69,68 Комп’ютерна верстка Мацело В. Підписне 240 хв 0,00 0,00 12,44 15,82 68,49 Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601