Композиція для інтенсифікації фізіологічного потенціалу молочнокислих бактерій

Реферат: Композиція для інтенсифікації фізіологічного потенціалу молочнокислих бактерій включає комплекс мікроорганізмів і мікроелементів. Композиція є водним розчином, комплекс мікроорганізмів містить пробіотичні молочнокислі мікроорганізми, вибрані із групи, до складу якої входять Lactobacillus, а як мікроелементи включає мікроелементи на основі цинку та/або селену у формі карбоксилатів на основі харчових кислот. UA 106660 U (12) UA 106660 U UA 106660 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до технічної мікробіології молочної та харчової промисловості, а саме до композиції для інтенсифікації фізіологічного потенціалу молочнокислих бактерій у вигляді водного розчину, який може бути застосований при виробництві кисломолочних продуктів. Молочнокислі бактерії - це специфічна група мікроорганізмів, що обумовлюють молочнокисле бродіння, тобто розпад вуглеводів (цукрів) до молочної кислоти. Поряд з основним продуктом бродіння - молочною кислотою - утворюються побічні продукти: оцтова кислота, вуглекислий газ, ароматичні речовини, етиловий спирт та ін. До молочнокислих бактерій належать молочнокислі стрептококи (лактококи та лейконостоки) та молочнокислі палички (лактобактерії). Молочнокислі палички (лактобактерії) належать до родини Lactobacillales, роду Lactobacterium, який включає три підроди: Thermobacterium (термобактерії), Streptobacterium (стрептобактерії) і Betabacterium (бета-бактерії). Молочочнокислі палички зброджують молоко за 6-12 годин з утворенням щільного згустку, який має приємний кисломолочний смак та запах. Більшість видів молочнокислих паличок використовують у молочній промисловості, для виробництва кисломолочних напоїв, кисломолочного масла, сирів. Крім того, лактобактерії вводять до складу різних лікувальних та профілактичних препаратів, біодобавок для покращення діяльності шлунково-кишкового тракту людей та тварин [див. сайт http://1snau.ru/vivchennya-morfologichnoi-budovi-ta-vlastivostej-molochnokislix-bakterii/]. Найбільш близькою до пропонованої за кількістю суттєвих ознак є композиція для інтенсифікації фізіологічного потенціалу молочнокислих бактерій, що включає комплекс мікроорганізмів і мікроелементів [Заявка на винахід № 94017949/13 від 16.05.1994, Російська Федерація, МПК 6 А23С9/12, C12N1/20; Дата публікації заявки: 10.07.1996]. Згадана композиція призначена для отримання сухих бактеріальних заквасок. До складу композиції включений пепсин, що є протеолітичним ферментом тваринного походження і призначений для збагачення композиції дикарбоновими ароматичними і незамінними амінокислотами. Недоліком згаданої композиції є її недостатня ефективність щодо інтенсифікації росту та кислотоутворення молочнокислих мікроорганізмів, вибраних із групи, до складу якої входять Lactobacillus, зокрема штамів Lactobacillus acidophilus IMB В-7279, Lactobacillus casei IMB В-7280 та Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus IMB B-7281. В основу пропонованої корисної моделі поставлена задача створення такої композиції для інтенсифікації фізіологічного потенціалу молочнокислих бактерій, яка б дозволила підвищити ефективність росту та кислотоутворення молочнокислих мікроорганізмів, вибраних із групи Lactobacillus, зокрема пробіотичних штамів Lactobacillus acidophilus IMB В-7279, Lactobacillus casei IMB В-7280 та Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus IMB B-7281. Поставлена задача вирішується за рахунок доповнення композиції водними розчинами карбоксилатів мікроелементів цинку та/або селену на основі природних харчових кислот - лимонної, бурштинової, винної, яблучної, аскорбінової та інших. За своєю біохімічною структурою і хімічною чистотою отримані мікроелементні комплекси близькі до біометалоорганічних сполук, які синтезуються клітинами, а тому їх надходження до організму, практично, виключає будь-які негативні наслідки. Пропонована, як і відома композиція для інтенсифікації фізіологічного потенціалу молочнокислих бактерій, включає комплекс мікроорганізмів і мікроелементів, а, відповідно до пропонованої корисної моделі, композиція є водним розчином, комплекс мікроорганізмів містить пробіотичні молочнокислі мікроорганізми, вибрані із групи Lactobacillus, а як мікроелементи композиція включає мікроелементи на основі цинку та/або селену у формі карбоксилатів на основі харчових кислот у такій кількості, мкг/л: цинк 20-500 селен 5-100. Авторами експериментально встановлено оптимальну концентрацію мікроелементів на основі цинку та селену у формі карбоксилатів на основі харчових кислот у пропонованій композиції, яка дозволила підвищити ефективність росту та кислотоутворення молочнокислих мікроорганізмів. А саме, при концентрації карбоксилатів цинку менше за20 мкг/л або кількості карбоксилатів селену у композиції менше за 5 мкг/л, ефективність пропонованої композиції щодо росту пробіотичних штамів Lactobacillus acidophilus IMB В-7279, Lactobacillus casei IMB В-7280 та Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus IMB B-7281 порівняно з композицією-прототипом, практично, не підвищилася. Збільшення ж концентрації карбоксилатів цинку вище за 500 мкг/л або карбоксилатів селену вище за 100 мкг/л, суттєво не вплинуло на зростання пробіотичних штамів Lactobacillus acidophilus IMB В-7279 порівняно з композицією-прототипом, але суттєво підвищило собівартість отриманого продукту. 1 UA 106660 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Тому оптимальною виявилася композиція, що включає мікроелементи на основі цинку та/або селену у формі карбоксилатів на основі харчових кислот у такій кількості, мкг/л: цинк 20-500 селен 5-100. Приклад 1. Об'єктом дослідження були 3 штами бактерій роду Lactobacillus (L. acidophilus IMB В-7279, L casei IMB В-7280, L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMB B-7281), отримані від клінічно здорових людей. Дослідження проводили з використанням мікроорганізмів, ліофілізованих у Cuddon Freeze Dryer FD1500 (Нова Зеландія). Перед кожним експериментом життєздатність пробіотичних культур проходила перевірку шляхом контролю за їх зростанням на Man-RogosaSharpe (MRS) агарі при 37 °C протягом 24-48 год. Вплив тієї чи іншої концентрації карбоксилатів селену оцінювали за їх впливом на ріст лактобацил та їх здатність підвищувати кислотність середовища. Досліджували вплив наступних концентрацій карбоксилатів селену: 100; 50; 25; 12,5; 6,25; 3,125; 1,5625; 0,7813; 9 0,3906; 0,195; 0,098; 0,049 мкг/л. Досліджені штами лактобацил (1×10 кл/мл) попередньо культивували із зазначеними концентраціями мкг/л протягом 2 діб. Як контроль використовували лактобацили без карбоксилатів селену. Вплив на ріст лактобацил визначали з використанням мультискану. рН культуральної рідини вимірювали за допомогою рН-метра. Рівень кислотоутворення визначали титриметричним методом. Для визначення впливу робочої концентрації селену на антагоністичні властивості лактобацил, їх попередньо культивували із визначеною концентрацією карбоксилатів селену протягом 2 діб. Як контроль використовували лактобацили без карбоксилатів селену. Використовуючи отримані культури, проводили досліди по визначенню антагоністичних властивостей пробіотичних штамів відносно широкого спектра патогенних та умовно патогенних мікроорганізмів. Антагоністичні властивості досліджували методом відстроченого антагонізму на агаризованому живильному середовищі за загальноприйнятою методикою [Постникова Е.А. Поиск перспективных штаммов бифидобактерий и лактобацилл для разработки нових биопрепаратов / Е.А. Постникова, Б.А. Ефимов, Н.Н. Володин, Л.И. Кафарская // Журнал микробиологии эпидемиологи и иммунобиологии - 2004. - № 2. - С. 64-69]. При проведенні дослідження антагоністичної активності штамів як тест-об'єктів використано 10 тест-штамів мікроорганізмів: Staphylococcus aureus 904, S. aureus 4001, Escherichia coli 17, E. coli B-906, S. epidermidis B-919, Klebsiella pneumonia B-920, Pseudomonas aeruginosa B-900, P. aeruginosa 906, S. enterica та Candida albicans Y-1918, які були отримані з колекції відділу антибіотиків Інституту мікробіології і вірусології ім. ак. Д.К. Заболотного НАН України. Після застигання м'ясопептонного агару (МПА) в центральній частині чашки Петрі за допомогою пробивочного свердла робили лунки діаметром 15 мм, які заповнювали розплавленим MRS-агаром. На 9 поверхню MRSA засіювали суспензію (1×10 кл/мл) досліджуваного штаму. Чашки з посівами інкубували при 37 °C у повітряному середовищі з підвищеним вмістом вуглекислого газу (5 %). Через 48 год. підсівали суспензії тест-культур (штрихом, в напрямку до краю чашки). Через 24 год. культивування посівів в термостаті (37 °C) вимірювали зони затримки росту тесткультур. У результаті проведених досліджень визначено вплив карбоксилату селену на ріст лактобацил, а саме, впливу карбоксилату селену на вихід біомаси лактобацил під час культивування в середовищі MRS. Встановлено, зокрема, що карбоксилати селену у високих концентраціях, а саме - від 100 до 12,5 мкг/л пригнічував ріст L. casei IMB В-7280 та L. delbrueckii subsp. bulgahcus IMB В-7281. У концентрації від 100 до 6,5 мкг/л під впливом карбоксилату селену пригнічувався ріст L. acidophilus IMB В-7279. Однак, карбоксилати селену в інших концентраціях не впливали на вихід біомаси цих лактобацил. Як приклад, ріст L. casei IMB В-7280 та L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMB В-7281 не змінювався під впливом карбоксилату селену в концентрації від 6,25 до 0,049 мкг/л, ріст L. acidophilus IMB В-7279 не змінювався під впливом карбоксилату селену в концентрації від 3,125 до 0,049 мкг/л. Водночас вивчено вплив карбоксилатів селену в різних концентраціях на активність кислотоутворення цих штамів лактобацил.У результаті проведених досліджень було встановлено, що під впливом карбоксил атів селену дозозалежно підвищувалась активність кислотоутворення пробіотичних штамів лактобацил. Так, карбоксилати селену у концентрації від 6,25 до 0,391 мкг/л підвищували активність кислотоутворення L. acidophilus IMB В-7279. 2 UA 106660 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Активність кислотоутворення L. casei IMB В-7280 підвищувалась під впливом карбоксил атів селену в концентрації від 1,25 до 0,098 мкг/л. Карбоксилати селену у концентрації від 3,125 до 1,563 мкг/л підвищували активність кислотоутворення L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMB В-7281. Максимальне накопичення кислоти у культуральному середовищі MRS спостерігали після культивування цих пробіотичних штамів бактерій з карбоксилатами селену у концентрації 1,563 мкг/л. Так, для штаму L. acidophilus титрована кислотність була більшою, ніж у контролі на 84 Т, L. casei - на 83 Т, L. delbrueckii subsp. bulgaricus - на 27 Т. Тому карбоксилати селену саме у концентрації 1,563 мкг/л були використані в наступних дослідженнях антагоністичних властивостей цих пробіотичних штамів бактерій стосовно умовно патогенних мікроорганізмів in vitro. Наступним етапом було вивчення впливу визначених у попередніх дослідах робочих концентрації селену на антагоністичні властивості досліджених пробіотичних штамів L. acidophilus IMB В-7279, L. casei IMB В-7280 та L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMB В-7281. Вплив самого селену на ріст тест-штамів не виявлено. Тоді як карбоксилат селену після сумісного культивування з пробіотичним штамом L. acidophilus IMB В-7279 посилював його антагоністичні властивості відносно S. aureus 904, S. awreus 4001, S. epidermidis B-919 та K. рnеumоnіа В-920, так як зона затримки росту збільшувалась відповідно на 3,3; 1,3; 1,7; 2,3 мм порівняно з контролем. Влив на інші тест-штами виявлено не було. Також впливу самого селену на ріст тест-штамів не виявлено. Але після сумісного культивування L. casei IMB В-7280 із карбоксилатом селену спостерігалося посилення антагоністичних властивостей пробіотичного штаму відносно S. aureus 904, S. aureus 4001, S. epidermidis B-919 та K. pneumonia B-920, так як зона затримки росту збільшувалась відповідно на 3;2; 1,7; 1,3 мм порівняно з контролем. Влив на інші тест-штами виявлено не було. Також визначено, що впливу самого селену на тест-штами виявлено не було. Тоді як карбоксилат селену після сумісного культивування з L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMB В-7281 посилював антагоністичні властивості цього штаму відносно S. aureus 904, S. aureus 4001 та S. epidermidis B-919, так як зона затримки росту збільшувалась відповідно на 3, 3 та 2,3 мм порівняно з контролем. Влив на інші тест-штами виявлено не було. Отже, сумісне культивування досліджених штамів лактобацил із карбоксилатом селену призводило до збільшення зони затримки росту тест-штамів патогенних та умовно патогенних мікроорганізмів. Тому можна говорити про посилення карбоксилатом селену антагоністичних властивостей досліджених пробіотичних штамів лактобацил, а саме L. acidophilus IMB В-7279, L. casei IMB В-7280 та L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMB В-7281, по відношенню до S. aureus 904, S. aureus 4001, S. epidermidis B-919 та K. pneumonia B-920. Отже, встановлено, що ріст L. acidophilus IMB В-7279 не змінювався під впливом карбоксилату селену в концентрації від 3,125 до 0,049 мкМоль/л, а ріст L. casei IMB В-7280 та L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMB В-7281 - від 6,25 до 0,049 мкг/л. Водночас карбоксилат селену у концентрації від 100 до 12,5 мкг/л пригнічував ріст цих пробіотичних штамів бактерій. Карбоксилати селену підвищували активність кислотоутворення пробіотичних штамів лактобацил: L. acidophilus IMB В-7279 у концентрації від 6,25 до 0,391 мкМоль/л, L. casei IMB В7280 - від 12,5 до 0,098 мкг/л, L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMB В-7281 - від 3,125 до 1,563 мкг/л. Максимальне накопичення кислоти у середовищі MRS спостерігали після культивування L. acidophilus IMB В-7279 і L. casei IMB В-7280 з карбоксилатом селену у концентрації 1,563 мкг/л. Показано, що під впливом карбоксилату селену в концентрації 1,563 мкг/л підвищувалась антагоністична активність L. acidophilus IMB В-7279 стосовно S. epidermidis b-919, S. aureus 904 та K. pneumonia B-920, a L. casei IMB В-7280 та L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMB В-7281 стосовно S. aureus 904, S. aureus 4001 та S. epidermidis B-919. Приклад 2. Об'єктом дослідження були 3 штами бактерій роду Lactobacillus (L. acidophilus IMB В-7279, L. casei IMB В-7280, L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMB B-7281), отримані від клінічно здорових людей. Дослідження проводили з використанням мікроорганізмів, ліофілізованих у Cuddon Freeze Dryer FD1500 (Нова Зеландія). Вплив тієї чи іншої концентрації карбоксилатів цинку оцінювали за їх впливом на ріст лактобацил та їх здатність підвищувати кислотність середовища. Досліджували вплив наступних концентрацій карбоксилатів цинку: 10; 20; 40; 100, 400; 500; 550 мкг/л. Дослідження виконували аналогічно дослідженням по прикладу 1. Було встановлено, що ріст L. acidophilus IMB В-7279 не змінювався під впливом карбоксилату цинку в концентрації менше за 20 мкг/л, а ріст L. casei IMB В-7280 та L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMB В-7281 - від 20 до 40 мкг/л. Водночас карбоксилат цинку у концентрації від 100 до 400 мкг/л пригнічував ріст цих пробіотичних штамів бактерій. 3 UA 106660 U 5 Карбоксилати цинку підвищували активність кислотоутворення пробіотичних штамів лактобацил: L. acidophilus IMB В-7279 у концентрації від 20 до 100 мкг/л, L. casei IMB В-7280 від 20 до 400 мкМоль/л, L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMB В-7281 - від 40 до 500 мкг/л. Максимальне накопичення кислоти у середовищі MRS спостерігали після культивування L. acidophilus IMB В-7279 і L. casei IMB В-7280 з карбоксилатом селену у концентрації 500 мкг/л. Показано, що під впливом карбоксилату селену в концентрації 400 мкг/л підвищувалась антагоністична активність L. acidophilus IMB В-7279 стосовно S. epidermidis b-919, S. aureus 904 та K. pneumonia B-920, a L. casei IMB В-7280 та L. delbrueckii subsp. bulgaricus IMB В-7281 стосовно S. aureus 904, S. aureus 4001 та S. epidermidis B-919. 10 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 15 Композиція для інтенсифікації фізіологічного потенціалу молочнокислих бактерій, що включає комплекс мікроорганізмів і мікроелементів, яка відрізняється тим, що композиція є водним розчином, комплекс мікроорганізмів містить пробіотичні молочнокислі мікроорганізми, вибрані із групи, до складу якої входять Lactobacillus, а як мікроелементи включає мікроелементи на основі цинку та/або селену у формі карбоксилатів на основі харчових кислот у такій кількості, мкг/л: цинк 20-500 селен 5-100. 20 Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4