Застосування ресвератролу як інгібітора jnk

Реферат: Застосування ресвератролу формули: OH HO OH як інгібітора JNK. UA 120455 U (54) ЗАСТОСУВАННЯ РЕСВЕРАТРОЛУ ЯК ІНГІБІТОРА JNK UA 120455 U UA 120455 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Корисна модель належить до галузі фармації та медицини, зокрема до способів застосування відомої сполуки за новим призначенням, а саме застосування ресвератролу як інгібітора JNK. У наукових дослідженнях останніх років у сфері медико-біологічних дисциплін загострюється увага на механізмах розвитку пошкоджень та адаптації клітинних систем при патологічних станах різного ґенезу. Особлива увага науковців сконцентрована на ключових механізмах регуляції апоптозу і дисбалансу окисного метаболізму одних з ключових позицій у ланці патогенезу різних патологій. Розвиток окисного стресу при ряді захворювань обумовлений інтенсифікацією процесів вільно-радикального окислення, що у свою чергу призводить до накопичення активних форм кисню (ЛФК) при дисфункції антиоксидантної системи, що обумовлює порушення функціонування редокс-чутливих внутрішньоклітинних систем регуляції апоптозу. До редоксчутливих систем належать мітоген активовані протеїнкінази (МАР-кінази або МАРК): JNK та р38, які фосфорилюють білки-мішені, що відповідають за реалізацію апоптозу, у тому числі впливають па фактори транскрипції і регуляції запрограмованої клітинної гибелі: NF-кВ, р53, АР1 та ін. JNK або c-JunN-кінцеві кінази - це група серин-треонінових протеїнкіназ, що залучені до сигнальних механізмів, які регулюють ріст, диференціювання клітин та процеси апоптозу. Активація JNK тісно корелює із запуском летальної програми клітини у відповідь па розвиток стресу, який викликаний прозапальними цитокінами, процесами вільнорадикального окиснення та інгібуванням синтезу білків. На теперішній час доведений кореляційний зв'язок активації JNK та розвитку метаболічних захворювань: метаболічного синдрому, цукрового діабету 2 типу, атеросклерозу та інших, які, зокрема, лідирують за темпами поширення та обумовлюють прогресування серцево-судинних патологій, ускладнення яких є першою з причин смерті населення індустріально розвинених країн. Статистичні дані Всесвітньої організації охорони здоров'я свідчать про актуальність пошуку препаратів для фармакологічної корекції даних патологій, у першу чергу на молекулярному рівні [1]. На користь цього свідчить той факт, що наявні на сьогоднішній день препарати не можуть у повній мірі забезпечити реконвалесценцію та знизити темпи поширення чи смертність внаслідок вищезазначених захворювань та їх ускладнень. Механізми розвитку інсулінорезистентності, як основної патогенетичної ланки ряду метаболічних захворювань, тісно пов'язані з активністю МАР-залежної JNK, яка прямо фосфорилює безпосередній субстрат інсулінового рецептора білок IRS (insulin receptorsubstrate). Саме тому, актуальним та перспективним напрямом сучасної фармації та медицини є пошук і дослідження речовин, які виявляють інгібуючий вплив на c-JunN-кінцеву кіназу. Відомими аналогами є синтетичні інгібітори JNK[2] такі, як 1,3-бензотіазол-2-іл-(2-[[2-(3піридиніл)етил]аміно}-4-піримідиніл)ацетонітрил 55; AS601245 та ін., мають ряд недоліків, серед яких основним є висока токсичність, що суттєво обмежує їх застосування. Відомим аналогом є речовина природного походження - кверцетин, здатна інгібувати JNK кінази [3]. Разом з тим доведено, що тривале застосування високих доз кверцетину активує процеси мутагенезу [4]. В основу корисної моделі поставлена задача розширення арсеналу засобів природного походження, які здатні інгібувати активність JNK і можуть бути використані для фармакологічної корекції ряду захворювань та патологічних станів, патогенез яких пов'язаний з активацією сигнальних кіназ, зокрема інсулінорезистентності, проатерогенезу, ожиріння та ін. Поставлена задача вирішується тим, що застосовують ресвератролу формулу: OH HO OH 50 як інгібітора JNK. Авторами вперше було виявлено та досліджено механізм реалізації фармакологічної ефективності ресвератролу, який полягає у інгібуючому впливі на активність JNK, що дозволяє його використовувати як інгібітор зазначеного виду сигнальних кіназ. 1 UA 120455 U 5 10 15 20 Приклад 1. Дослідження проводили в умовах in vitro нa ізольованих гепатоцитах щурів. Для виділення окремих гепатоцитів з печінки дослідних щурів-самців популяції Wistar використовували модифікований метод Seglen [5]. Для попередження руйнування клітин протягом всього процесу гепатоцити утримували на льоду. Печінку подрібнювали до появи однорідної маси (гомогенату) за допомогою електричного гомогенізатора. Отриману суспензію з фрагментами печінки інкубували 1-2 хвилини, потім фільтрували клітини через нейлоновий сітчастий фільтр з діаметром пор 100 мкм. Таким чином, отримана маса осаду містила до 90 % окремих гепатоцитів. Далі, відповідно до мети експерименту, клітини печінки експериментальних тварин були розподілені на 4 експериментальні групи: перша група - клітини печінки інтактного контролю, середовище яких не містило додаткових компонентів для інкубації; друга група клітини печінки контрольної патології, інкубаційне середовище яких містило активатор JNK: ацетамінофен (2,5 мМ); третя група клітини печінки, інкубаційне середовище яких містило кверцетин (30 µМ); четверта група - клітини печінки, інкубаційне середовище яких містило ресвератрол (30 (µМ). Потім їх інкубували в середовищі Кребса-Хенселейта протягом 20 годин, при температурі 37 °C, в атмосфері О2/СО2 (95 %:5 %). Визначали рівень загальної JNK за допомогою набору реактивів Total JNK PanSpecificDuoSet ICELISA (R&DSystems, Inc., USA). Для визначення рівня фосфорильованої JNK (p-JNK) використовували набір реактивів [pThrl 83/Tyr 1851 JNK 1/2 EIAkit (EnzoLifeSciencies). Результати дослідження наведенні у таблиці 1. Таблиця 1 Вплив кверцетину та ресвератролу на активацію JNK, обумовлену ацетамінофеном, в ізольованих гепатоцитах щурів Рівень Рівень загальної JNK, фосфорильованої JNK, нг/мг білка нг/мг білка Інтактні гепатоцити 286±2,13 92±0,17 Гепатоцити + ацетамінофен 294±2,09* 154±1,01* Гепатоцити + ацетамінофен + кверцетин 288±1,88** 126±1,21** # Гепатоцити +ацетамінофен + ресвератрол 286±2,03** 107±0,98**/ Примітки: * - відхилення достовірне відносно інтакту (р0,05), ** - відхилення достовірне відносно ацетамінофену (р0,05), # відхилення достовірне відносно кверцетину (р0,05). 25 30 35 40 45 Аналіз даних таблиці 1 свідчить, що ацетамінофен не змінював рівень загальної JNK у клітинах печінки, проте він викликав її активацію, про що свідчить зростання рівня фосфорильованої JNK (p-JNK) у 1,67 рази у гепатоцитах, ізольованих з АРАР у порівнянні з інтактними клітинами. Таким чином, можна припустити, що токсичний вплив ацетамінофену на гепатоцити обумовлений активацією JNK сигнального шляху. Внесення до середовища інкубації досліджуваних речовин кверцетину та ресвератролу супроводжувалося достовірним зниженням рівня p-JNK у гепатоцитах па 18,2 % та 30,6 % відповідно, що свідчить про наявність у речовин пригнічу вального впливу па активацію JNK кінази, обумовлену додаванням ацетамінофену. Наведенні данні свідчать, що ресвератрол достовірно більш активно впливав на зниження рівня p-JNK у порівнянні з референтпрепаратом, що свідчить про виражені антиоксидантні та фітоестрогенні властивості. Приклад 2. Біологічну активність ресвератролу вивчали в дослідах на щурах популяції Wistar на моделі експериментальної інсулінорезистентності (IP) [6]. IP відтворювали шляхом 5тижневого внутрішньочеревинного введення низьких доз дексаметазону та утримання тварин на гіперкалорійній високофруктозній дієті. Тварини були розділені на 4 експериментальні групи по 10 щурів у кожній: І група - інтактний контроль; II група - щури, у яких моделювали IP; III група - щури, які на фоні введення дексаметазону та гіперкалорійної високофруктозної дієти отримували кверцетин; IV група - щури, які на фоні введення дексаметазону та гіперкалорійної високофруктозної дієти отримували ресвератрол. Кверцетин та ресвератрол вводили щурам внутрішньошлунково щодня протягом 4 тижнів з розрахунку 3 мг на 100 г маси тіла, починаючи з 3 тижня введення дексаметазону. 2 UA 120455 U 5 10 Висновки щодо біологічної активності кверцетину та ресвератролу робили за динамікою наступних показників: вміст вільних жирних кислот (ВЖК), триацилгліцеролів (ТАГ), апоВвмісних ліпопротеїнів (апоВ-ЛП) та ліпопротеїнів високої щільності (ЛПВЩ). Результати дослідження наведені у таблиці 2. Аналіз даних, наведених у таблиці 2, свідчить про те, що кверцетин та ресвератрол у значній мірі нівелюють патологічні зміни ліпідного обміну, обумовлені, в тому числі, активацією JNK, що проявляється достовірними змінами відповідних показників. При цьому за виразністю корегуючого впливу на вміст ВЖК, ТАГ і апоВ-ЛП ресвератрол перевищував дію кверцетину. Обидві сполуки нормалізували вміст антиастрогенної фракції ЛПВЩ, що на тлі зниження рівня апоВ-ЛП, свідчить про їх здатність попереджати розвиток проатерогенних змін, характерних для IP. Таблиця 2 Вплив кверцетину та ресвератролу на показники обміну ліпідів у крові щурів за експериментальної інсулінорезистентності Показники ВЖК, ммоль/л ТАГ, ммоль/л апоВ-ЛП, мг/мл ЛПВЩ, мг/мл Інтактний контроль (І група) 0,41±0,05 0,82±0,06 4,68±0,23 1,14±0,05 IP (II група) 0,78±0,04* 2,76±0,08* 6,88±0,15* 0,91±0,07* ІР+кверцетин (III група) 0,61±0,01** 1,38±0,06** 5,39±0,14** 1,07±0,06 ІР+ресвератрол (IV група) 0,57±0,02**/*** 1,26±0,04**/*** 5,25±0,10**/*** 1,12±0,03** Примітки: * - р0,05 відносно групи І, ** - р0,05 відносно групи II, *** - р0,05 відносно групи III. 15 20 25 30 35 Таким чином, проведені дослідження показали, що ресвератрол в умовах in vitro достовірно знижує рівень фосфорильованої JNK, за умов активації JNK у культурі гепатоцитів ацетамінофеном. В умовах in vivо на моделі експериментальної інсулінорезистентності ресвератрол нівелює порушення обміну ліпідів, перевищуючи за біологічною ефективністю відомий інгібітор JNK кверцетин, що свідчить про його здатність інгібувати сигнальні кінази, зокрема - JNK. Джерела інформації: 1. Johnson Gary L., Kazuhiro Nakamura. The c-jun kinase/stress-activated pathway: regulation, function and role in human disease. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 2007. - 1773 (8). - 1341-1348. 2. Carboni S., Hiver A., Szyndralewiez C., Gaillard P., Gotteland J.P., Vitte P. A. AS601245 (1,3benzothiazol-2-yl-(2-[|2-(3-pyridinyl)ethyl]amino}-4-pyrimidinyl)acetonitrile): a c-Jun NH2-terminal 15 protein kinase inhibitor with neuroprotective properties: //J. Pharmacol. Exp. Ther. 2004. - 310, (1). Р. 25-32, PMID: 14988419. 3. Патент № 101057, Україна. MПK (2015.01) A61P 3/00, C12N 9/12. Застосування кверцетину як інгібітора JNK-кіназ. - з. № u 2015 01790; заявл. 02.03.2015; опубл. 25.08.2015, бюл. № 16. 4. Иванченко О.Б., Карамова И.О., Хабибуллин Р.Э. Токсикогенетические характеристики в оценке качества пищевых продуктов. Известия высших учебных заведений. - Пищевая технология, 2002. - 4. - С. 66-68 (2002). 5. Seglen, P. О. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13,29-83 (1976). 6. Модифікація методу моделювання експериментальної інсулінорезистентності у щурів: інформ. лист МОЗ України / А.Л.Загайко, Т.О.Брюханова, А.І.Шкапо; Український центр наукової медичної інформації та патентоліцензійної роботи (Укрпатентінформ). - К., 2015. - № 86. - 7 с. 3 UA 120455 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 Застосування ресвератролу формули: OH HO OH як інгібітора JNK. Комп’ютерна верстка О. Гергіль Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4