Штам дріжджів rноdотоrulа gluтіnіs – продуцент білково-вітамінних речовин і каратиноїдів

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к штамму, продуцирующему белково-витаминные вещества и каротиноиды. Известно, что способностью к синтезу каротиноидов характеризуются представители многих групп микроорганизмов - бактерии, актиномицеты, дрожжи, мицилиальные грибы, водоросли, Перспективными продуцентами белково-витаминных концентратов, содержащих b-каротин, являются каротинсинтезирующие дрожжи. Высокое питательное качество их белковых веществ, содержание в биомассе витаминов и, особенно, каротина, позволяют оценивать эти микроорганизмы как продуценты комплекса жизненно важных веществ. Известен штамм дрожжей Rhodotorula glutinis Б-71 ПЗ. позволяющий синтезировать биомассу дрожжей с каротиноидами. Однако этот штамм не обладает высокой продуктивностью по каротиноидам, а удельная скорость разбавления среды не превышает 0,15ч-1. Известен также штамм дрожжей Rhodotorula glutirvis 214, синтезирующий каротиноиды [2] На оптимальных средах такой штамм в полупроизводственных условиях позволяет синтезировать дрожжи с содержанием каротиноидов в биомассе от 800 мкг/г абсолютно сухих дрожжей. Но известный штамм не обеспечивает высокой продуктивности процесса и необходимой скорости разбавления среды. Известны штаммы дрожжей Rhodo-sporidium dlobovatum - продуценты белково-витаминных веществ и каротиноидов[3]. Однако при использовании этих штаммов не достигают сочетания высокого содержания в биомассе каротиноидов и удельной скорости разбавления среды выше 0,14 ч-1. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является штамм пигментных дрожжей Rhodospo-ridkim diobovatum 115 [4]. При выращивании этих дрожжей содержание каротиноидов в биомассе составляет 862 мкг/г. Продуктивность процесса по каротиноидам превышает продуктивность ранее известных штаммов, но не достигает значений выше 486 мкг/г*ч, а значение скорости разбавления среды в непрерывном процессе не выше 0,135 ч-1. В основу изобретения поставлена задача селекционирования штамма дрожжей, продуцирующего белково-витаминные вещества и каротиноиды, который превышает продуктивность известного штаммапрототипа по каротиноидам в 1,5-1,6 раза, а по скорости разбавления среды - на 10-11%, за счет чего обеспечивается конкурентноспособность штамма, его технологичность -устойчивость при непрерывном культивировании. Кроме того использование нового штамма позволяет расширить банк производственных культур. Поставленная задача решается тем, что, согласно изобретению, селекционирован штамм дрожжей Rhodotorula giutlnis, который синтезирует белково-витаминные вещества и каротиноиды. Полученный штамм депонирован в коллекции Депозитария Института микробиологии и вирусологии НАН Украины под номером 1MB Y-5002. Этот новый штамм Rhodotorula giutlnis (лабораторный номер 143) выделен из эпифитной микрофлоры Кавказа и получен путем автоселекции в непрерывном процессе культивирования при скорости разбавления среды Д=0,2 ч-1. Заявляемый штамм Rhodotorula giutlnis 1MB Y-5002 характеризуется следующими культуральноморфологическими и физиологическими признаками. Культурально-морфологические признаки. Клетки односуточной культуры, выращенной на сусловом агаре, овальные, расположены в коротких цепочках и поодиночке. Величина клеток 8-4,5 х 4,0-2,8 мкм. Содержание клеток гомогенное. Спор не образует. Способ деления - почкование, деление перетяжкой и перетяжкой-перегородкой. На пептонноглюкозном агаре псевдомицелия нет. Особенности роста на агаризованных средах. На солодовом и пептонно-глюкозном агаре колонии выпуклые, слегка шероховатые с ровным краем, влажным бликом, красно-оранжевого цвета. Диаметр колонии 11-12 мм. Особенности роста на жидкой среде. На жидком сусле через 48-96 часов образует пленку, кольцо, осадок. Физиолого-биохимические признаки. Аэроб. Оптимальная температура роста 28-31°С. Температурный диапазон 10-35°С, pH 4,0-7,5, оптимальное pH 5,0-6,0. Отношение к углеводам. Хорошо ассимилирует глюкозу, маннозу, фруктозу, рафинозу, ксилозу, трегалозу, сахарозу, мальтозу, aрибозу, a-рамнозу. Отношение к спиртам. Хорошо усваивает этанол, глицерин, маннит, сорбит. Отношение к кислотам. Хорошо усваивает янтарную, лимонную, уксусную кислоты. Отношение к источникам азота. Ассимилирует органические и неорганические формы азота, ассимилирует нитраты. Штамм в факторах роста не нуждается, растет на минеральной среде без витаминов. Сведения о патогенности. Непатогенен и нетоксичен для теплокровных животных, а также для растений. Условия хранения, Пересев клеток производят раз в два месяца. Хранят на сусловой агаризованной среде притемпературе +4°С. Каротиноидные пигменты определяют по методу Петерсона с соавторами (Peterson et al 1958) в модификации. Навеску сырой биомассы 1 г растирают в фарфоровой ступке и экстрагируют ацетоном. Экстракт сливают в пробирку, и экстракцию продолжают до полного обесцвечивания биомассы. Ацетоновые экстракты собирают, фильтруют под вакуумом через стеклянный фильтр № 4. С целью предохранения каротиноидов от окисления применяют сантохин - 0,1 мл на 1 л ацетона. После фильтрации каротиноиды переводят в делительной воронке в петролейный эфир (легкая фракция, пределы кипения при температуре 40-60°С), Для лучшего разделения смеси в нее добавляют дистиллированную воду. Нижний водноацетоновый бесцветный слой удаляют, а верхний слой -эфирный - после промывания водой, сушат над безводным сульфатом натрия и собирают в сухую градуированную пробирку с притертой пробкой. Общее количество экстракта в пробирке доводят до объема 25 мл. Экстракт фотометрируют на спектрофотометре Specord, Для выделения b-каротина из суммы пигментов проводят разделение на хроматографической пленке, наполненной окисью алюминия И степени активности с окисью кальция посередине. После разделения смеси пигментов на отдельные зоны, последние элюируют при температуре 40-60°С петролейным эфиром, смесью "петролейный эфир-серный эфир", смесью "петролейный эфир - ацетон". Идентификацию пигментов проводят по спектрам поглощения, а содержание каротиноидов в биомассе рассчитывают по формуле (мкг не 1 г АСД - абсолютно сухих дрюжжей): где Д - оптическая плотность раствора по максимуму поглощения: V - объем элюата, мл; Н - коэффициент1 экстинции для b-каротина 2500; Р - навеска сухой биомассы, взятой на экстракцию, г. Содержание биомассы в культуральной жидкости определяли весовым методом и выражают в г/л АСД (абсолютно сухих дрожжей). Определение витаминов проводят микробиологическим методом по методике Одинцовой (1959), рибофлавина - флуорометрически. Белок в биомассе определяют по методу Лоури. Липиды из клеток выделяют смесью растворителей хлороформ : этанол (1:1) при комнатной температуре путем настаивания с окончательной горячей экстинцией на водяной бане при температуре 80+1°С. В оптимальных условиях культивирования Rhodotoruia gtutints 1MB Y-5002 в периодическом процессе (субстраты - сахароза или меласса) содержание каротиноидов в биомассе составляет 900 мкг/г АСД, из них около 50% приходится на долю Д-каротина, выход каротиноидов составляет 15-16 мг/л, выход биомассы от заданного субстрата 46-47%. В непрерывном процессе при скорости разбавления среды 0,15 ч-1, общее содержание каротиноидов 680 мкг/г АСД, b-каротина -63% от суммы пигментов, содержание белка в биомассе 45%, липидов - 8,0%, тиамина -3,4 мкг/г, рибофлавина - 50,2 мкг/г, никотиновой кислоты - 300 мкг/г, пиридоксина - 3,9 мкг/г, биотина - 0,9 мкг/г. железа -2,7 мг/г АСД. Продуктивность процесса по каротиноидам - 1430,0 мкг/л*ч-1, по биомассе 2,25 г*л*ч-1 по белку - 0,9г*л*ч-1. Предлагаемый штамм дрожжей представляет собой новую культуру со стабильными свойствами, синтезирующую белково-витаминные вещества и каротиноиды. В отличие от прототипа этот штамм позволяет при высоком уровне содержания каротиноидов в 1,5-1,6 раз повысить продуктивность процесса по каротиноидам, а скорость разбавления среды повысить на 10-11 %, за счет чего обеспечивается высокая конкурентноспособность штамма, его технологичность, в том числе устойчивость при непрерывном культивировании. Создание нового штамма позволяет расширить банк производственных культур. Таким образом, предлагаемый штамм соответствует критериям "новизна", "изобретательский уровень". Практическое осуществление изобретения иллюстрируется примерами. Пример 1. Периодическое культивирование дрожжей Rhodotoruia glutinis'IMB Y-5002 осуществляют в ферментаторах фирмы "Chemap". Объем 20 л, рабочий объем 12 л Ферментер оснащен трехъярусной турбинной мешалкой с регулируемым числом оборотов. Ферментацию проводят при 600-700 об/мин, Время культивирования 48 часов, температура культивирования – Источник углерода - сахароза - 2,0 и 4,0% или меласса - 2,0 и 4,0; 7,0% по РВ. Кукурузный экстракт - 0,6%. Инокулят - 18 часовая культура дрожжей в количестве 5% от объема (инокулят получают При культивировании дрожжей В колбах на качалке). Культивирование проводят при аэрации - насыщении кислородом от 40 до 60%. Результаты исследований приведены в табл.1. Пример 2. Непрерывное культивирование дрожжей Rhodotoruia glutlnls 1MB Y-5002 проводят в ферментаторах фирмы "Chemap", рабочий объем 12 л, с постепенно увеличивающимися скоростями разбавления среды (Д) от 0,1 ч-1 до 0,2 ч-1 Длительность процесса при каждом из исследований Д - три полных цикла замены среды в ферментаторе. Состав среды тот же, чтои в примере 1, кроме NaNO3- 2,5 г/л и сахароза 4%, Результаты исследований приведены в табл.2. Пример 3. Непрерывное культивирование дрожжей Rhodotprula glütinis 1MB Y-5002 осуществляют в ферментаторах типа ЫЛОР с рабочим объемом 120 л на среде с 4% по РВ мелассы при Д = 0,15 ч-1. Минеральный состав среды такой же, как в примере 2. Культивирование осуществляют при температуре 30±1°С, pH - 5,5-6,0, скорость перемешивания среды 350 об/мин. Концентрация биомассы при засеве составляет 2-3 г/л: Длительность периодического выращивания 8 час. Максимальная удельная скорость роста в периодическом процессе 0,26 ч-1. При концентрации биомассы в ферментере 5-7 г/л переходят на йепрерывное культивирование, создавая скорость раз-, бавления среды 0,15 ч-1. Непрерывный процесс культивирования при Д = 0,15ч-1 ведут в течение 5 суток. При стабильном процессе культивирования концентрация биомассы составляет в среднем 15 г/л, содержание белка в биомассе 45%, липидов 8,0%, общее содержание каротиноидов - 680 мкг/гАСД, bкаротина - 63% от суммы пигментов, продуктивность процесса по каротиноидам -1430,0 мкг/л*ч-1, продуктивность по биомассе -2,25 г*л*ч-1. В состав биомассы, полученной при стабильном указанном режиме выращивания, дрожжей содержится в мкг/гАСД: Предлагаемый штамм позволяет получить белково-каротиноидный препарат, содержащий витамины группы В и железо. В примерах 1-3 приведены максимально достигнутые результаты продуктивности процесса по каротиноидаму В табл.1 и 2 приведены средние данные по большему массиву опытов. Таким образом, предлагаемый штамм позволяет резко повысить продуктивность процесса по каротиноидам - в 1,5-1,6 раза и позволяет осуществить процесс при скорости разбавления среды не менее 0,15 ч-1, при максимальной скорости роста 0,25 ч-1.