Поживне середовище для вирощування мікроорганізмів роду bartonella

Поживне середовище для вирощування мікроорганізмів роду Bartonella, до складу якого входить живильна основа та стимулятор росту чумного мікроба (СРЧМ), яке відрізняється тим, що як живильну основу містить 94-95% (об'єм/об'єм) 2,0%-го бактоагару "Difco" та як стимулятор росту містить 5-6% (об'єм/об'єм) стандартизованого біопрепарату СРЧМ Середньоазіатського науководослідного протичумного інституту МОЗ Казахстану. (19) (21) u200806849 (22) 19.05.2008 (24) 25.11.2008 (46) 25.11.2008, Бюл.№ 22, 2008 р. (72) ПОХИЛ СЕРГІЙ ІВАНОВИЧ, UA, КОЗЬКО ВОЛОДИМИР МИКОЛАЙОВИЧ, U A, БОНДАРЕНКО ОЛЕНА ВАЛЕРІЇВН А, U A, БОНДАРЕНКО АНДРІЙ ВОЛОДИМИРОВИЧ, U A, ТИ МЧЕНКО ОЛЕН А МИКОЛАЇВНА, UA, ЧИГИРИНСЬКА НІЛА АН АТОЛІЇВНА, UA, КАЦАПОВ ДМИТРО ВОЛОДИМИРОВИЧ, UA (73) ДЕРЖАВНА УСТАНОВА "ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ІМУНОЛОГІЇ ІМ. І.І. МЕЧНИКОВА АМН УКРАЇНИ", U A, ПОХИЛ СЕРГІЙ ІВАНОВИЧ, U A, БОНДАРЕНКО ОЛЕНА ВАЛЕРІЇВН А, U A, ТИМЧЕНКО ОЛЕНА МИКОЛАЇВН А, U A, ЧИГИРИНСЬКА 3 37277 сування останнього методу дає можливість описувати нові види Bartonella, які здатні спричиняти захворювання у людей, вивчати біологічні властивості збудника, досліджувати механізми патогенезу БІ на лабораторних моделях, визначати чутливість клінічних штамів до протимікробних препаратів, то що. Проте, і до теперішнього часу мікробіологічний метод діагностики бартонельозу не знайшов широкого застосування в практиці охорони здоров'я через необхідність проведення надзвичайно тривалого культивування посівів із застосуванням високозбагачених нутрітивними компонентами поживних середовищ. Бартонели не ростуть (не утворюють макроколоній видимих неозброєним оком впродовж 40-ка діб в оптимальних умовах вирощування, при t°=(35±0,5)°С в атмосфері з 5% СО2) на переважній більшості поживних середовищ, які в теперішній час найбільш широко застосовуються в практиці бактеріологічних лабораторій установ охорони здоров'я України: м'ясопептонному агарі - МП А, середовищі для визначення антибіотикочутливості - АГВ, агарі із мозково-серцевим екстрактом - ВНІА, Луріа-Бертані агарі - LBA, буферному вугільно-дріжджовому агарі ВСУЕ, середовищі для виділення і культивування бруцел - еритрит-агарі - ЕА, бордетел - козеїновугільному агарі - КВА, стафілококів - молочножовтково-сольовому агарі - МЖСА, гемокультур і стрептококів - СВГКС, мікроорганізмів роду Candida - агарі Сабуро - СабА, ентеробактерій агарі Ендо - ЕндоА, сальмонел - вісмут-сульфітагарі - ВСА, шигел - агарі Плоскірєва - ПлА, середовищі для виділення і культивування нейсерій та коринебактерій - сироватковий агар - СА, молочнокислих бактерій - МРС4. Для вирощування бартонел використовують кров'яний агар (КА) та шоколадний агар (ША), виготовлені із використанням в якості живильної агаризованої основи триптиказного агару, бактоагару, середовища із серцево-мозковим екстрактом та інших [12-15]. Відмінність самих живильних основ обумовлена природними особливостями сировини, із якої їх виготовляють, якісними та кількісними відмінностями вмісту в них основних н утритивних компонентів (вуглеводів, білків, фосфоліпідів), а також мікроелементів і стимуляторів росту. В якості останніх використовують гемін (синоніми назви: Х-фактор росту, хлороферріпротопорфирін), додавання якого до середовищ LBA, ЕА і ВНІА в кількості від 50мкг/мл до 250мкг/мл забезпечує їх ріст, а в кількості 500мкг/мл і більше - призупиняє; та D-глюкозу (її оптимальна концентрація в середовищі становить 0,5% (маса/об'єм). Джерелом геміну в поживних середовищах можуть бути еритроцити свіжоприготовленої (КА) або прогрітої крові (ША). Ознаками, які збігаються з суттєвими ознаками корисної моделі, що заявляється, є використання в якості живильної агаризованої основи комерційних мікробіологічних поживних середовищ загального призначення (наприклад, бактоагар фірми "Difco", США). Аналогом середовища що пропонується є КА [16, 17]. Основною причиною, яка заважає отриманню бажаного технічного результату при вико 4 ристанні КА є той факт, що на КА за оптимальних умов вирощування ростуть лише клони типового штаму В.henselae CCUG 30454 ВТ (макроколонії стають ледь видимими неозброєним оком лише через 8-10 діб інкубування), а клінічні штами бартонел зовсім не дають росту. Прототипом середовища що пропонується, є ША який найчастіше застосовується для вирощування мікроорганізмів роду Bartonella [12-15]. Середовище ША містить [16, 17]: D-глюкози 5,0г/л; продукти теплового гемолізу дефібринованої крові барана або кролика 80,0мл/л; живильної агаризованої основи 915,0мл/л. В якості живильної агаризованої основи можна використовува ти: 2%-ий м'ясо-пептонний агар, 2%ий бактоагар або 2%-ий триптиказний агар та інші, що готуються у відповідності із настановами підприємств-виробників. Факторами, що заважають отриманню бажаного те хнічного результату є наступні: прогрівання крові, з одного боку, сприяє звільненню із еритроцитів факторів росту X, V (нікотинамідаденіндинуклеотид) та інших, а з другого -в суттєвій мірі їх інактивує [16]; використання ША для вирощування бартонел (при первинному їх виділенні та послідуючих пасажах чистих культур) потребує тривалого (14-40 діб) інкубування посівів з періодичним (через добу) переглядом чашок Петрі для виявлення макроколоній бартонел; ША є непрозорим середовищем, при перегляді посівів необхідно здійснювати відкривання кришок чашок Петрі, що призводить до значної контамінації і заростанню поверхні середовища сторонньою мікрофлорою та ускладнює оцінку результату досліджень - виявлення макроколоній і відбір бактерійної маси для отримання чистих культур цих мікроорганізмів. В основу корисної моделі поставлено завдання: розробити поживне середовище для культивування мікроорганізмів роду Bartonella, в якому за рахунок заміни продуктів теплового гемолізу дефібринованої крові барана або кролика на комерційний біопрепарат забезпечуються покращення ростових власти востей цих мікроорганізмів, скорочується термін культивування, підвищується рівень біологічної безпеки в цілому. Поставлене завдання вирішується наступним чином: в якості живильної основи використано уніфіковану живильну агаризовану основу (2,0%ий бактоагару фірми "Difco", США); в якості стимулятору росту необхідного і достатнього для вирощування мікроорганізмів роду Bartonella використано стимулятор росту чумного мікробу (СРЧМ, Середньоазіатського науково-дослідного протичумного інституту МОЗ Казахстану, м.Алма-Ати). СРЧМ - стерильний біопрепарат гемолізованої крові барана, який містить X і V фактори росту, очищений від залишків клітинного дебрісу та інших компонентів крові, що можуть утворювати непрозорі конгломерати при виготовленні поживного середовища. 5 37277 В експерименті досліджено вплив різної концентрації СРЧМ на ріст бартонел та визначено її діапазон, в межах якої може бути досягнутий бажаний технічний результат; - підтверджено, що при вирощуванні на поживному середовищі із СРЧМ, штами бартонел зберігають типові біологічні характеристики (морфологію клітин, тинкторіальні, культуральні, біохімічні, серотипічні властивості); - при проведенні лабораторно-клінічного випробування встановлено достатній рівень ефективності поживного середовища із СРЧМ. При визначенні діапазону концентрації СРЧМ, що робило його придатним для вирощування мікроорганізмів роду Bartonella виготовляли по три 6 серії середовищ із різним вмістом СРЧМ (таблиця 1), на які дозовано (по 10-1-10-4мл) висівали суспензії штамів бартонел. Стандартизацію суспензій бактерійних клітин проводили шляхом їх розведення стерильним 0,15М фосфатно-сольовим буфером (рН=7,0) до 0,023 за показником одиниць оптичної щільності. Останній показник вимірювали на колориметрі фотоелектричному концентраційному КФК - 2МП - УХЛЧ при λ=590нм. Культивування посівів здійснюється при t°=(35±0,5)°С в атмосфері з 5% СО2 впродовж 10-40-ка діб. Результати досліджень щодо впливу різних концентрацій СРЧМ на ріст бартонел представлені в таблиці 1. Таблиця 1 Вплив різних концентрації СРЧМ в поживному середовищі на ріст мікроорганізмів роду Bartonella Концентрація СРЧМ в2%-му агарі (%) 1-4 5-6 7-8 9-10 Показники впливу СРЧМ на ріст бартонел кількість утворених макроко- характеристика макроколоній швидкість росту (доба лоній при дозованому висіві утворення макроколоній робочих суспензій КУО/мл, (% типових колоній основного видимих неозброєним - - морфологічного типу), (m± d) оком) (m± d) 4-5 (8,9±3,5·106 (82,8+9,2) 3-4 (1,1±0,3)·107 (72,4±8,2) 3-4 (1,15±0,4·107 (70,3+8,0) 3-4 (1,4±0,7)·107 (68,8±10,4) Оптимальною концентрацією є 5-6% (об'єм/об'єм) вмісту СРЧМ у поживному агаризованому середовищі для вирощування бартонел. У порівнянні із ША, використання поживного середовища із 5-6% (об'єм/об'єм) СРЧМ забезпечує прискорення утворення видимих неозброєним оком макроколоній бартонел в (2,3-3,0) рази, зростання показника кількості утворених макроколоній бартонел (КУО/мл) на (59,0-62,7)% і незначне, відносне зменшення на (8,3-10,0)% кількості макроколоній з типовою морфологією. Типовою для бартонел є R-форма макроколоній з неправильною округлою формою (0,5-1,2мм в діаметрі), виразно випуклим профілем, чітким нерівним краєм, горбкуватою поверхнею, напівпрозорих, сіробілого кольору (в науковій літературі таку форму макроколоній порівнюють з голівкою кольорової капусти) (рисунок 1), Атипові RS- та S-форми макроколоній бартонел характеризуються широким спектром відмінностей від типових: можуть мати правильну округлу форму, чіткий рівний край, трохи шорстку або, навіть, гладку блискучу поверхню, плоский, високий, випуклий, пупкоподібний чи інший профіль, менший або значно більший від типового розмір. Для дослідження впливу поживного середовища із СРЧМ на біологічні властивості штамів бартонел вивчено 100 їх субклонів (50 - із типовою та 50 із атиповою морфологією макрокодоній), отриманих при вирощуванні семи різних штамів В. henselae на ША і середовищі із СРЧМ. При цьому були вивчені: морфологія клітин з допомогою світлової та електронної мікроскопії; тинкторіальні характеристики цих бактерій (здатність фарбува тись за методом Грама, Романовського-Гімзе, Здрадовського, Warthin-Starry в модифікації Морозова); культуральні властивості (здатність рости на типових поживних середовищах: біо хімічні властивості: оскидазну, каталазну, фосфатазну, ліпазну активність, здатність гідролізувати сечовину і желатин, відновлювати нітрати в нітрити, давати позитивний результат в реакції Фогеса-Проскауера (РФП) та утворювати сірководень (H2S) при розщепленні білків, ферментувати вуглеводні сполуки - цукри (D-глюкозу, L-арабінозу, лактозу, D-манозу, мальтозу, L-рамнозу, D-галактозу, рафінозу, сахарозу, D-ксилозу), спирти (D-маніт, адоніт, саліцин, гліцерин, дульцит, ескулін, D-сорбіт, L-інозит), солі органічних кислот (L-тартрат, сукцинат Na, цитрат Na, глутамат Na, малонат Na, піруват Na, глюконат Na, гіпурат Na), полісахариди (крохмаль, амілодекстрин, декстрин) та амінокислоти (DLфенілаланін, L-аргінін, DL-лізин, DL-гліцин, пролін, DL-серін, L-аспарагін, DL-валін, DL-норвалін, Lорнітін, DL-метіонін, L-цистеїн, DL-тирозин, Lгістідін, L-глютамін, DL-лейцин, DL-аланін, тіонін); серотипічні властивості (здатність давати позитивний і негативний результат, відповідно, в реакціях непрямої імуно-флюоресценції (РНІФ), зв'язування компліменту (РЗК), мікроаглютинації (РМА), імунофлюоресценції (РІФ) з гомологічними та гетерологічними щодо В.henselae діагностичними імуноглобулінами та сироватками). Усі досліджені субклони штамів бартонел, вирощених на ША і на середовищі із СРЧМ характеризувались монотипністю морфології клітин, тинкторіальних, культуральних, біохімічних та серологічних властивостей. Методом просвічуючої 7 37277 електронної мікроскопії визначено розмір та морфологічні особливості клітин бартонел в препаратах-відбитках із молодих колоній вирощених на ША і середовищі із СРЧМ (рисунок 2). Встановлено, що клітини В. henselae вирощені на обох типах середовищ мають правильну овоїдну форму із закругленими кінцями довжиною (1,0±0,2)мкм, діаметром (0,6±0,2)мкм. Дистальні зони овоїдів є більш електроннощільними у порівнянні із їх центральною зоною, що проявляється на мікрофотографіях характерною біполярністю клітин. Клітини розмножуються поперечним діленням з формуванням добре вираженої перетинки. При електронномікроскопічному дослідженні не виявлена здатність бартонел утворювати джгутики, фімбрії, спори та цисти. При світловому мікроскопічному дослідженні тинкторіальних характеристик клонів бартонел, вирощених на ША і середовищі із СРЧМ, в препаратах пофарбованих за Грамом виявляються грамнегативні (слабо пофарбовані фуксином) невеликі прямі, інколи трохи зігнуті палички та кокопалички. При фарбуванні препаратів методами Романовського-Гімза клітини бартонел виглядали як палички і кокопалички синьо-блакитного кольору із нерівномірним забарвленням деяких ділянок клітин бактерій; методом Здрадовського клітини цих мікроорганізмів виглядали як палички і кокопалички рубіново-червоного кольору з рівномірною інтенсивністю їх фарбування; при посрібленні препаратів за методом Warthin-Starry в модифікації Морозова клітини виглядали як палички і кокопалички суттєво більшого розміру - довжиною (1,0-3,0)мкм, діаметром (0,8-1,0)мкм, від світлокоричневого до темно-коричневого кольору. За біохімічними властивостями субклони штамів бартонел, вирощені на ША і середовищі із СРЧМ були ферментативно малоактивними і монотипними, всі вони є оксидазо-, каталазо- (при використанні для відтворення тесту 3%-го H2O 2) і уреазонегативними, однак дають позитивний результат в тесті на каталазу при застосуванні 10%го H2O2. Субклони бартонел не відновлюють нітрати в нітрити, не утворюють H2S при розщепленні білків, гідролізують желатин, не виявляють ліпазної і фосфатазної активності, дають негативний результат в РФП. Всі вони не ферментують переважну більшість вуглеводних сполук: цукрів (Dглюкозу, L-арабінозу, лактозу, D-манозу, мальтозу, L-рамнозу, D-галактозу, рафінозу, са харозу, Dксилозу), спиртів (D-маніт, адоніт, саліцин, гліцерин, дульцит, ескулін, D-сорбіт, L-інозит), солей органічних кислот (L-тартрат, цитрат Na, малонат Na, глюконат Na), полісахаридів (крохмаль, амілодекстрин, декстрин) та амінокислот (DLфенілаланін, L-аргінін, DL-лізин, DL-гліцин, пролін, DL-серін, L-аспарагін, DL-валін, DL-норвалін, Lорнітін, DL-метіонін, L-цистеїн, DL-тирозин, Lгістідін, L-глютамін, DL-лейцин, DL-аланін, тіонін). Як слабо позитивний оцінено результат ферментації субклонами штамів бартонел D-фруктози. Близько 13% субклонів, вирощених на ША та на середовищі із СРЧМ, ферментували D-манозу і, 8 майже, 20% із них - L-рамнозу. Всі субклони штамів бартонел розщепляли гіпурат Na, давали слабкий позитивний результат з піруватом Na (відмічається зсув рН в напрямку лугоутворення) і сукцинатом Na (відмічається зсув рН в напрямку кислотоутворення). Серотипічні властивості досліджених субклонів штамів бартонел, вирощених на ША і середовищі із СРЧМ були схожими. Так як, у відповідності із сучасною класифікацією, бактерії виду В.henselae віднесені до α-2 підгрупи Proteobacteria [2, 5, 10, 15]. Для підтвердження збереження субклонами бартонел своєї сероспецифічності в серологічних (імунологічних) реакціях із субклональними бартонельозними антигенами були використані як гомологічні (видоспецифічні проти В.henselae), так і гетерологічні діагностичні сироватки та імуноглобуліни проти філогенетично найбільш близьких до В.henselae видів Proteobacteria: a-2 підгрупи - В.Quintana; a-1 підгрупи - Rickettsia prowazekii, R.typhi, R.mooser, Brucella abortus. Додатково субклональні бартонельозні антигени були протестовані в серологічних (імунологічних) реакціях із діагностичними сироватками та імуноглобулінами проти мікроорганізмів інших гр уп Proteobacteria: g-групи - Coxiella burnetii, Legionella pneumophila, Escherichia coli, Shigella spp., Salmonella spp.; b-групи Bartonella spp.; d-гр упи Campylobacter spp. Результати досліджень показали збереження високого рівня сероспецифічності субклонами штамів бартонел вирощеними на середовищі із СРЧМ, у порівнянні з вирощеними на ША. Лише при відтворенні РНІФ із використанням видоспецифічних бартонельозах сироваток та імуноглобулінів субклональні бартонельозні антигени давали позитивний результат із рівнем специфічної активності (титром) протибартонельозних антитіл від 1:(20±0) до 1:(192±21). В усіх інши х випадках ці ж самі антигени не вступали у специфічну взаємодію із гетерологічними діагностичними сироватками та імуноглобулінами, про що свідчать негативні результати відповідних РНІФ, РЗК, РМА, РІФ. Лабораторно-клінічне випробовування поживного середовища для вирощування мікроорганізмів роду Bartonella проведено шляхом бактеріологічного дослідження 29-ти зразків клінічного матеріалу, які мали таке походження: 9 зразків крові та біоптату нашкірних ангіом від хворих з клінічною картиною БІ; 10 зразків крові від хворих з картиною септичного процесу, в яких були відсутні анамнестичні дані щодо контактів з тваринами та прояви БІ; 10 зразків крові від клінічно здорових людей. Результати мікробіологічних досліджень зразків клінічного матеріалу при використанні ША і середовища із СРЧМ представлено в таблиці 2. Результати виявлення в зразках клінічного матеріалу мікроорганізмів роду Bartonella показують, що середовище із СРЧМ забезпечує не нижчий рівень виділення збудника бартонельозної інфекції, ніж ША. 9 37277 10 Таблиця 2 Частота виділення Bartonella spp. від хворих і клінічно здорових людей 3 позитивним результатом досліджень (виділені штами бартонел) на середовищі із СРЧМ абс.ч., На ША абс.ч., (%) (%) Клінічний матеріал. Нозологічна форма захворювання Кількість досліджених зразків Кров та біоптат із нашкірних ангіом від хворих на бартонельоз Кров від хворих з проявами сепсису Кров від клінічно здорових людей 9 8 (88,9) 8 (88,9) 10 10 0 0 0 0 При цьому, на ША колонії бартонел виявляли після 12-16 діб, а на середовищі із СРЧМ на 4-8 добу інкубування висівів. Кількість макроколоній бартонел, які виявляли при первинному висіві різних зразків крові та біоптату із ангіом коливалась в широких межах - від декількох сотень до 5-10 КУО на чашку. На середовищі із СРЧМ виростала більша кількість (р