Спосіб підвищення активності мікробних препаратів

Спосіб підвищення активності мікробних препаратів з азотфіксувальними, фосфатмобілізувальними та антипаразитарними властивостями, який відрізняється тим, що мікроорганізми - діючий чинник препаратів - вирощують в присутності регуляторів росту рослин Івіну, Емістиму С, Агростимуліну чи Агроемістиму-екстра (Біолану) або застосовують сумісно з цими регуляторами росту рослин під час обробки насіння. (19) (21) u200706868 (22) 19.06.2007 (24) 10.12.2008 (46) 10.12.2008, Бюл.№ 23, 2008 р. (72) ІУТИНСЬКА ГАЛИНА ОЛЕКСАНДРІВНА, UA, ТИТОВА ЛЮДМИЛА В'ЯЧЕСЛАВІВНА, U A, ВАЛАГУРОВА ОЛЕНА ВОЛОДИ МИРІВН А, U A, КОЗИРИЦЬКА ВАЛЕНТИНА ЄВГЕНІВНА, U A, ЛЕОНОВА НАТАЛІЯ ОСИПІВНА, U A, ПЕТРУК ТЕТЯН А ВІКТОРІВН А, U A, БІЛЯВСЬКА ЛЮДМИЛА ОЛЕКСІЇВНА, U A 3 37579 росту рослин. Завдання вирішується наступним чином: 1) внесенням у середовище культивування мікроорганізмів відповідних регуляторів росту рослин (Івін, Емістим С, Агростимулін або Біолан) у концентраціях, оптимальних для їхнього росту і біосинтетичної активності; 2) сумісним застосуванням мікробних препаратів з РРР при обробці насіння або рослин. Емістим С синтезується мікроміцетом Cylindrocarpon destructans, виділеним з ризосфери женьшеню; являє собою комплекс ростових речовин, аналогів фітогормонів ауксинової та цитокінінової дії, ненасичених жирних кислот, амінокислот, мікроелементів (K+, Mg2+, Mn2+, Fe2+, Сu2+РО43-, SO42); Івін - синтетичний аналог природних фітогормонів, створений на основі N-оксид 2,6диметилпіридину, ефективний регулятор росту овочевих (огірків, томатів, солодкого перцю, капусти, моркви, баклажанів) та технічних культур (тютюну, хлопку, е фіромасляних культур троянд); Агростимулін - комплексний препарат, який складається з 97% Емістиму С та 3% Івіну; Агроемістим-екстра (торгова марка Біолан) - відрізняється від Емістиму С підвищеним вмістом аналогів фітогормонів, поліненасичених жирних кислот і мікроелементів. Усі зазначені РРР розроблені в Інституті біоорганічної хімії і нафто хімії НАН України у Міжвідомчому науково-технологічному центрі «Агробіотех» Н АН і МОН України [7, 8]. 4 Приклад 1. Бульбочкові бактерії сої Bradyrhizobium japonicum УКМ В-6035, що характеризуються високою азотфіксувальною активністю і є основою для соєвого інокулянта [9], вирощували на рідкому живильному середовищі Ісварана наступного складу (г/л): NaCl - 0,1; К2НРО4 - 0,5; MgSO4 • 7Н2О - 0,2; FeCl3 - 0,01; маніт - 10,0; глюконат кальцію - 1,5; дріжджовий екстракт - 2,0; рН 7,2. Культивування проводили у періодичних умовах у колбах на качалках при 160об/хв та температурі 26-28°С. Досліджувані РРР вносили в живильне середовище в концентраціях від 0,1 до 10пл препарату/ мл середовища. Біомасу визначали ваговим методом. Найбільший приріст біомаси, який перевищував показники контролю у 2,2 рази, спостерігали у варіанті з внесенням Івіну у концентрації 0,1пл препарату/мл середовища (табл. 1). Максимальний приріст біомаси В. japonicum УКМ В-6035 за дії Агростимуліну становив порівняно з контролем 57% при розведенні 1,0пл препарату/ мл середовища, а Біолану - 74-91% порівняно з контролем при концентраціях 0,1-10пл. Отримані результати можуть бути використані у виробництві бактеріальних препаратів під бобові культури. Культивування промислово цінного штаму ризобій сої у присутності Івіну, Агростимуліну або Біолану дозволяє підвищити вихід його біомаси у 1,5-2,1 рази. Таблиця 1 Дія регуляторів росту рослин на ріст В. japonicum УКМ В-6035 (% до контролю) Концентрації РРР, пл. препарату/мл живильного середовища 0,1 1 10 Івін 215,0 117,0 105,0 Для підтвердження ефективності сумісного застосування ризобій і регуляторів росту рослин при передпосівній обробці насіння проводили польові дослідження. Використовували насіння сої Glycine max L. (Merr.) сортів Київська 98 (ранньостиглий) і Київська 27 (середньоранній), рекомендованих для вирощування в зоні Північного Лісостепу і Полісся України, а також РРР Емістим С, Івін, Агро Біомаса, % до контролю Емістим С Біолан 105,0 174,3 107,0 174,3 114,0 191,4 Агростимулін 133,3 157,3 131,2 стимулін та Біолан. Використання РРР сумісно з інокулянтом показало, що порівняно з варіантом інокуляції у дослідах з соєю Київська 98 органогенез бульбочок підсилювали Емістим С (на 16%) та Агростимулін (на 14%), при цьому азотфіксувальна активність не збільшувалась (табл. 2). 5 37579 6 Таблиця 2 Сумісна дія інокулянта та регуляторів росту рослин на формування та функціонування симбіотичного апарату у рослин сої Середня кількість буль- Середня маса буль- Азотфіксувальна активбочок на 10 рослинах, бочок на 1 рослину, ність, мкМ С2Н4 на 1 росшт. мг лину за годину 1 2 1 2 1 2 Варіанти обробки насіння Контроль (без інокуляції і обробки РРР) Інокулянт Івін + інокулянт Емістим С + інокулянт Біолан + інокулянт Агростимулін + інокулянт 4 40 19,5 30,7 0 3,4±0,1 110 63 128 56 126 60 40 90 130 150 380,0 240,0 456,0 160,0 355,0 78,3 53,3 74,3 211,7 158,3 19,8±0,8 13,8±0,6 17,2±0,6 10,9±0,4 17,3±0,5 15,4±0,5 5,6±0,1 12,6±0,1 23,7±0,5 9,1±0,1 Примітка. 1 - сорт Київська 98, 2 - сорт Київська 27. На сорті Київська 27 ефект інокуляції В. japonicum УКМ В-6035 підсилював Біолан: спостерігали збільшення чисельності та маси бульбочок, відповідно, у 2,2 та 2,7 рази та нітрогеназної активності - у 1,5 рази порівняно з варіантом бактеризації. Отже, формування та функціонування нодуляційного апарату у взятих для досліджень сортів сої визначалась генотипом макросимбіонта, ступенем комплементарності сортів до гомологічних ризобій та природою РРР. На етапі збору урожаю встановлено, що Івін сприяв найбільшому підвищенню збору зерна у рослин сорту Київська 98 за умов бактеризації (на 2,6ц/га більше порівняно з варіантом інокуляції); достовірні прибавки урожаю зерна (1,4-1,5ц/га) було одержано і на варіантах з Емістимом С та Агростимуліном. При застосуванні РРР на сорті Київська 27 зберігалася тенденція до підвищення урожаю зерна на варіантах із сумісним застосуванням бактеризації та Івін у або Емістиму С. Оцінка впливу інокуляції та регуляторів росту рослин на якість зерна сої показала, що на фоні інокуляції В. japonicum УКМ В-6035 обробка РРР насіння сої Київська 98 не приводила до статистично достовірного підвищення вмісту протеїну у насінні (табл. 3). На сорті Київська 27 інокуляція ефективним штамом не сприяла підвищенню цього показника, проте при сумісній обробці В. japonicum УКМ В-6035 з Івіном, Емістимом С або Агростимуліном спостерігали збільшення вмісту протеїну у зерні на 3,0-3,6% порівняно з інокуляцією. Таблиця 3 Сумісна дія інокулянта та регуляторів росту рослин на якість зерна сої Варіант обробки насіння Контроль (без інокуляції і обробки РРР) Інокулянт Івін + інокулянт Емістим С + інокулянт Біолан + інокулянт Агростимулін + інокулянт Вміст протеїну в зерні, % Київська 98 Київська 27 Вміст жиру в зерні, % Київська 98 Київська 27 37,0±0,03 39,5±0,03 18,2±0,04 19,4±0,05 39,6±0,03 38,9±0,02 39,9±0,03 39,1±0,05 39,7±0,03 37,9±0,02 41,0±0,03 41,1±0,01 37,7±0,03 41,5±0,01 21,2±0,06 21,7±0,06 21,4±0,04 21,5±0,04 21,3±0,07 21,1±0,05 21,9±0,05 21,0±0,06 20,6±0,06 20,9±0,07 Обробка насіння РРР сумісно з інокулянтом достовірно збільшувала вмісту жиру у зерні сорту Київська 98 у всі х варіантах. Обробка інокулянтом насіння сорту Київська 27 теж приводила до підвищення вмісту жиру на 1,7%, проте сумісна обробка з РРР тільки у варіанті з Івіном забезпечувала його достовірне зростання порівняно з варіантом бактеризації на 0,8%. У всіх дослідних варіантах за комплексної обробки вміст жиру у насінні сої обох сортів був ви щим за контрольні величини. Відомо, що інтегральним показником ефективності вирощування бобових культур є збір протешу з 1 гектару. При застосуванні всіх досліджених РРР було отримано підвищення ефекту інокуляції за цим параметром на сорті сої Київська 98, причому за дії Івіну, Емістиму С або Агростимуліну збір протешу зростав на 55-88кг/га. Сумісне застосування штаму - інокулянта та Івіну або Емістиму С при вирощуванні сої сорту Київська 27 сприяло збільшенню збору протеїну порівняно з контролем на 96-100кг/га. При цьому було зареєстровано підсилення ефекту інокуляції більше, ніж на 10%. Таким чином, у польових дослідах, проведених на сортах Київська 98 та Київська 27, було 7 37579 показано, що сумісна дія інокулянта та РРР сприяє формуванню активного нодуляційного апарату, підвищенню якості зерна та збільшенню збору протешу з гектара. Приклад 2. Культур у фосфатмобілізувальних бактерій Bacillus megaterium 1MB В-7168 - основу Фосфобактерину - вирощували на живильному середовищі наступного складу: розчин А - 100мл; розчин Б -0,5мл; розчин В - 1мл; 0,25мл 10%-ного спиртового розчину фенолфталеїнфосфату натрію (NaФФФ). Склад розчинів (г/л): А - NaNO3 - 2,0; КСl - 0,5 (стерилізували при 1атм); Б - MgSO4 - 100; В глюкоза - 50 (стерилізація при 0,5атм) [10]. До живильного середовища вносили розчини РРР у концентрації від 1 до 10пл препарату/мл. Культивування проводили у періодичних умовах при 220об/хв та температурі 28-30°С. Розрахунки параметрів росту культури проводили за загальноприйнятими методами [11]. Фосфатазну активність В. megaterium 1MB В-7168 визначали за швидкістю гідролізу фенолфталеїнфосфату натрію за 1 годину [10]. Паралельно визначали мікробну біомасу в 1мл суспензії. Фосфатазну активність культури виражали в мкг фенолфталеїну на 1мг мікробної 8 біомаси за 1 годину. В контрольному середовищі без РРР питома швидкість росту В. megaterium 1MB В-7168 становила 0,47 год-1. За присутності у живильному середовищі Емістиму С та Біолану в концентраціях 1пл препарату/мл, питома швидкість росту бактерій зростала до 0,51-0,54 год-1 (табл. 4). За цих умов культура накопичувала до 526-590мг/л біомаси, що було на 20-34,8% вище, ніж у контролі. Важливою промисловою ознакою штаму В. megaterium 1MB В-7168 є його здатність розкладати органофосфати ґрунту і поліпшувати фосфорне живлення сільськогосподарських культур. Для прояву штамом фосфатазної активності оптимальним було середовище, яке містило Емістим С в концентрації 10пл препарату/ мл. За таких умов фосфа тазна активність була відповідно на 31,8% вищою порівняно з контрольним варіантом (табл. 4). За присутності Біолану у концентраціях 10 та 1пл препарату/ мл фосфатазна активність була найвищою і сягала 340,0-461,58мкМоль фенолфталеїнфосфату натрію на 1г біомаси за 1год, що перевищувало контроль у 1,7-2,4 рази. Таблиця 4 Параметри росту і фосфа тазна активність В. megaterium IMB В-7168 за присутності РРР РРР, пл препара- Питома швидкість ту в 1мл росту, год-1 0 0,47 10 1 0,53 0,54 10 1 0,48 0,51 Тривалість подво- Максимальна біоФосфатазна активність, єння чисельності, мкМоль NаФФФ/г біомаси за маса, мг/л год 1 годину Контроль (без обробки РРР) 1,47 438 195,3 Емістим С 1,31 496 257,8 1,28 526 142,8 Біолан 1,44 482 340,0 1,36 590 461,58 Таким чином, додавання в живильне середовище для культивування В. megaterium IMB В-7168 Біолану може бути новим біотехнологічним прийомом підвищення промислово важливих функцій цієї культури. Приклад 3. Культур у стрептоміцетів Streptomyces avermitilis УКМ Ас-2177 вирощували на рідкому живильному середовищі наступного складу (г/л): соєве борошно - 16; крохмаль розчинний - 23; сухі дріжджі - 4; глюкоза - 70; СаСО3 4; К2НРО4 - 1, кукурудзяний екстракт - 4,8мл; рН 6,5. До живильного середовища вносили розчини РРР у концентрації від 1 до 100пл препарату/ мл. Культивування проводили у періодичних умовах при 220об/хв та температурі 28-30°С протягом 7 діб. Авермектини екстрагували з міцелію стрептоміцета етиловим спиртом і їх кількість визначали колориметричним методом з використанням орцину [12]. Максимальне накопичення авермектинів було відмічено у варіанті із Івіном у концентрації 100пл/мл середовища - 1225мкг/мл, що складало 126,3% по відношенню до контролю (табл. 5). Емістим С і Агростимулін виявляли стимулювальну дію у концентрації 1пл/мл, а саме: 1090мкг/мл і 1140мкг/мл, що по відношенню до контролю складало відповідно 112,4 і 117,5%. За лабораторних умов було досліджено дію РРР на біологічні властивості Аверкому (продуцент S. avermitilis УКМ Ас-2179), а саме на його нематоцидну активність. В дослід було взято Біолан та Емістим С в концентраціях, які використовуються в рослинництві. За тест-культур у правила фітонематода Meloidogyne incognita - збудник кореневої гнилі овочевих культур. Аверком використовували у LD50, яка дорівнювала 2мкг/мл [13]. Отримані результати представлені в таблиці 6. 9 37579 10 Таблиця 5 Дія РРР на синтез авермектину S. a vermitilis УКМ Ас-2177 РРР, пл препарату/мл живильного середовища Контроль (без РРР) 1 ІВІН 10 100 1 Емістим С 10 100 1 Агростимулін 10 100 Авермектин, мкг/мл 970 980 710 1225 1090 730 890 1140 540 340 % до контролю 100 101 73,2 126,3 112,4 75,2 91,7 117,5 55,6 35 Таблиця 6 Дія регуляторів росту рослин на нематоцидну здатність Аверкому (% нерухомих нематод) Варіант досліду Контроль (без препарату) Біолан Емістим С Аверком, 2мкг/мл Біолан: Аверком (1:1) Емістим С: Аверком (1:1) 0,5 0 58,7 62,5 50,0 100 100 Встановлено, що регулятори росту рослин самі по собі проявляють деяку нематостатичну дію в перші 0,5год дії препаратів, яка поступово за 4год культивування нематод значно знижується. Аверком в перші 0,5год культивування викликає загибель 50% нематод. Суміш 1:1 Аверкому з Біоланом і Аверкому з Емістимом С вже за 0,5год виявила 100% нематоцидну дію, в той час як при окремому використанні Аверкому такий показник загибелі нематод спостерігали лише через 3-4 години культивування нематод. Час культивування, год. 1 2 3 0 0 0 55,0 41,7 35,0 14,2 7,0 3,0 73 98 100 100 100 100 100 100 100 4 0 33,3 3,4 100 100 100 За лабораторних умов було досліджено сумісну дію Аверкому і Біолану на проростки озимої пшениці сорту Крижинка (табл. 7). Аверком було взято у концентраціях: 2,0мкг/мл, що запропонована для знищення 50% особин фітонематоди Meloidogyne incognita, і 2-10-3мкг/мл, за якої можливий прояв фіторегулювальних властивостей. Біолан було використано, виходячи з концентрації 20мл/т насіння, рекомендованої до застосування у виробництві [14]. Таблиця 7 Сумісна дія Аверкому і Біолану на проростки озимої пшениці сорту Крижинка Варіант досліду Контроль (вода; К) Аверком, 2,0мкг/мл Аверком, 2·10-3мкг/мл Біолан, 7·10-5 (препарат) Аверком, 2,0мкг/мл + Біолан (1:1) Аверком, 2·10-3мкг/мл + Біолан (1:1) Аверком у обох досліджених концентраціях сприяв росту рослин: довжина корінців за його присутності була на 23-28%, а висота стебел - на 7-9% вище за контрольні показники. За дії РРР Біолану висота стебла і довжина корінців перевищували контрольні значення відповідно на 20 і 4%. За сумісної дії Аверкому і Біолану за тих же умов дослідні показники переважали контрольні на 33 Довжина корінців мм±m % до К 43,8±0,3 100 53,8±0,1 123 56,1±0,1 128 52,4±0,2 120 58,6±0,3 134 58,2±0,3 133 Висота мм±m 29,9±0,3 32,1±0,2 32,5±0,1 31,1±0,2 34,9±0,2 34,3±0,3 стебла % до К 100 107 109 104 117 115 34% (корінці) і 15-17% (стебла). Таким чином, авермектиновий комплекс Аверком, окрім визнаних антипаразитарних властивостей, виявив себе як фіторегулятор, який може діяти на рівні комерційного РРР Біолану. Присутність РРР підсилює як фіторегулювальні, так і антипаразитарні властивості Аверкому. На базі Аверкому і Біолану можуть бути створені для рослинництва 11 37579 ефективні композиційні біопрепарати із захисною і фітостимулювальною дією. Джерела інформації: 1. Pat.4429042 US, Int. С1.3 С12Р 17/18; С12Р 17/02; C12R 1/465; C12N 1/20. Strain of Streptomyces for producing antiparasitic compounds / Albers-Schonberg G., Wallick H., Ormond R. E., Miller T. W., Burg R. W. - Publ. 1984. 2. Пат. 93057665/13 RU, МКИ С12 P1 06. Штамм актиномицета Streptomyces avermitilis ВНИИСХМ-54 - продуцента авермектинов / Дриняев B.A., Березкина Н.Е., Кругляк Е.Б., Мосин В.А., Юркив В.А., Лисовенко В.Т., Зиновьев О.А. Опубл. 20.02.96. Бюл. №5. 3. Пат. 69639 UA, МПК C12N 1/20, С12Р 17/02, С12Р 17/18, С12Р 19/62, C12R 1/465. Штам Streptomyces avermitilis - продуцент авермектинів, речовин антипаразитарної дії / Іутинська Г.О., Козирицька В.Є., Валагурова О.В., Муквич М.С., Білявська Л.О., Петрук Т.В.. - Опубл. 15.08.2006. Бюл. №8. 4. Козирицька В.Є., Валагурова О.В., Петрук Т.В., Білявська Л.О., Іутинська Г.О. Біологічні властивості авермектинового комплексу Streptomyces avermitilis УКМ Ас-2179 // Analele Stiintifice ale Universitatii de Stat din Moldova. Seria Stiinte chimico-biologice". (в друк у) 5. Петрук Т.В., Іутинська Г.О. Вплив авермектинового комплексу Streptomyces avermitilis на мікробні угруповання ґрунту // Науковий вісник Ужгородського університету. Серія «Біологія». Вип.18. - 2006. – С.161-164. 6. Андреюк К.І., Іутинська Г.О., Антипчук А.Ф., Валагурова О.В., Козирицька В.Є., Пономаренко Комп’ютерна в ерстка Л. Купенко 12 С.П. Функціонування мікробних ценозів ґрунту в умовах антропогенного навантаження. - Київ: Обереги, 2001. - 239с 7. Пономаренко С.П. Українські регулятори росту рослин // Елементи регуляції в рослинництві. Київ: Компас, 1998. – С.10-16. 8. Пономаренко С.П. Регуляторы роста растений на основе N-оксидов производных пиридина (физико-химические свойства и биологическая активность). - Киев: Техника, 1999. - 269с. 9. Пат. 3324 UA, МКІ 1 С1 С05 F 11/08, С 12 N 1/20. Штам бактерій Bradyrhizobium japonicum для одержання добрив під сою / Н. М. Скочинська, А.Ф. Антипчук, В.М. Рангелова, P.M. Канцелярук, О.В. Танцюренко // Бюл. - 1994. - №6-1. 10. Дубовенко Є.К. Особливості фосфатазної активності різних типів ґрунту УРСР // Живлення та удобрення сільськогосподарських культур. Київ: Урожай, 1964. – С.29-32. 11. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. - М.: Мир, 1978. - 331с. 12. Пат. 180635 RU, МКИ A3 G01 N 21/78. Способ определения авермектинов / Мосин В.А., Дриняев В.А., Мирзоев М.Н. - Оп убл. 1993. Бюл. 12. 13. Петрук Т.В. Синтез і біологічна активність авермектинового комплексу Streptomyces avermitilis. Автореф. дис. ...канд. біол. наук. - Київ, 2005. - 23 с. 14. Анишин Л.А., Жилкин В.О., Пономаренко С.П. Рекомендации по применению регуляторов роста растений в сельскохозяйственном производстве Украины: Методическое пособие. - К.: МНТЦ « Агробиотех». - 2001. - 19с. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601