Спосіб модулювання кальцієвих каналів у судинній та серцевій тканині

1. Спосіб модулювання кальцієвих каналів у судинній та серцевій тканині, який включає введення теплокровній тварині, яка потребує цього, фармацевтично ефективної кількості сполуки, яка має формулу: 42837 дія естрадіолу та/або його здатність пом'якшувати скорочувальні реакції може опосередкуватись шляхом інгібірування притоку кальцію через напругозалежні кальцієві канали. Див. Джанг та ін., Вr. J. Pharmacol., 104, 1033-1037 (1991); Джанг та ін., American Journal of Physiology, 32, H271-H275 (1992); Коллінз (Collins) та ін., Lancet, 341, 1264 (1993); Мак (Muck) та ін., Med. Sci. Res., 22, 19 (1994); Селас (Salas) та ін., European Journal of Pharmacol., 258, 47-55 (1994). Інші припускають, що естрадіол може підвищувати рівень вмісту циклічної аденілової кислоти (аденозин-5'-монофосфату) та циклічної гуанілової кислоти (гуанозин-5'монофосфату) або збільшувати кількість аденозин-5'-трифосфат (АТФ)-чутливих каналів калію. Див. Мюг та ін., Cardiovas. Res., 27, 1939-1942 (1993); та ін., Am. Heart J., 129, 726-732. Сполуки 2-арил-3-ароїлбензо[b]тіофену, які використовують у методах цього винаходу, були вперше утворені Джонсом (Jones) та Суарезом (Suarez) як протизаплідні речовини. Див. патент США № 4133814 (виданий 9 січня 1979 p.). Ці сполуки, загалом, придатні для інгібірування росту пухлин грудної залози. Пізніше Джонс виявив, що група цих сполук особливо придатна для антиестрогенної та антиандрогенної терапії, зокрема, при лікуванні пухлин грудної залози та простати. Див. патент США № 4418068 (виданий 29 листопада 1983 р.). Одну з цих сполук, 6-гідрокси-2-(4-гідроксифеніл)-3-[4-(2-піперидино-етокси)бензоїл]бензо[b]тіофен, було піддано клінічному дослідженню при лікуванні раку грудної залози. Цю сполуку називають ралоксифеном, у минулому - кеоксифен. Цей винахід надає методи модулювання кальцієвих каналів шляхом підвищення густоти кальцієвих каналів у судинній та серцевій тканині без змін інотропної та пресорної реакції, які включають введення теплокровній тварині, яка потребує цього, ефективної кількості сполуки формули: находу є метод лікування серцевих "захворювань" з використанням, але без обмеження, варіантної стенокардії, стенокардії напруження, нестійкої стенокардії, ішемічно-реперфузного пошкодження міокарду та аритмії. Другим аспектом є метод лікування розладів функціонування судин головного мозку, з включенням, але без обмеження, спазму судин головного мозку внаслідок розриву артерії, "удару" та мігрені. Наступним аспектом є метод лікування ниркових розладів шляхом підвищення ниркового кліренсу внаслідок посилення ниркового кровотоку, придатний для затримки ниркової недостатності. Наступним аспектом є метод лікування розладів шлунково-кишкового тракту, з включенням, але без обмеження, захворювань, пов'язаних з діареєю, наприклад, синдрому подразненої товстої кишки та інфекційного бурситу, з перевагою діареї. Терапевтичні методи лікування, які надаються цим винаходом, здійснюються шляхом введення теплокровній тварині, яка потребує цього, фармацевтично ефективної кількості сполуки формули І або її фармацевтично прийнятної солі. У вищезгаданій формулі термін "C1-C6 алкіл" означає прямий, циклічний або розгалужений алкільний ланцюг, який має від одного до шести атомів вуглецю. До типових С1-С6 алкільних груп належать метил, етил, n-пропіл, ізопропіл, n-бутил, ізобутил, втор-бутил, t-бутил, n-пентил, ізопентил, n-гексил, циклопропіл, циклобутан, циклопентил, циклогексил та інші. Термін "C1-C6 алкіл" означає прямий або розгалужений алкільний ланцюг, який має від одного до чотирьох атомів вуглецю. До типових С1-С6 алкільних груп належать метил, етил, n-пропіл, ізопропіл, n-бутил, ізобутил, втор-бутил, t-бутил. Термін "Аr" означає такі групи, як феніл та заміщений феніл. Термін "заміщений феніл", який використовують у цьому описі, означає фeнільну групу, заміщену однією або більша складовими, які вибирають з групи, до складу якої належить галоген, гідрокси, циано, нітро, С1-С6, алкіл, С1-С4 алкокси, ацетил, форміл, трихлорметил, або трифторметил. До прикладів заміщеної фенільної групи належить 4-хлорфеніл, 2,6-хлорфеніл, 2,6-дихлорфеніл, 2,5-дихлорфеніл, 3,4-дихлорфеніл, 3-хлорфеніл, 3-бромфеніл, 4-бромфеніл, 3,4-дибромфеніл, 3-хлор-4-фторфеніл, 2-фторфеніл, 4-гідроксифеніл, 4-нітрофеніл, 4-цианофеніл, 4-метилфеніл, 4-етилфеніл, 4-метоксифеніл, 4-пропілфеніл, 4-n-бутилфеніл, 4-t-бутилфеніл, 3-фтор-2метилфеніл, 2,3-дифторфеніл, 2,6-дифторфеніл, 2,6-диметилфеніл, 2-фтор-5-метил-феніл, 2,4,6трифторфеніл, 2-трифтормeтилфeніл, 2-хлор-5трифторметилфеніл, 3,5-біс(трифторметил)феніл, 2-метоксифеніл, 3-метоксифеніл, 3,5-диметоксифеніл, 4-гідрокси-3-метилфеніл, 3,5-диметил-4гідроксифеніл, 2-метил-4-нітрофеніл, 4-метокси-2нітрофеніл, 2,4-динітрофсніл та інші. Термін "С1-С4 алкокси" означає такі групи, як метокси, етокси, nпропокси, ізопропокси, n-бутокси та інші. Термін "галоген" означає фтор, хлор, бром та йод. Термін "фармацевтично ефективна кількість" використовують у цьому описі для означення кількості сполуки формули І, яка може підвищувати густоту кальцієвих каналів у судинній та серцевій тканині. Конкретна доза сполуки формули І буде, звичайно, визначатися конкретними умовами ви (І) де: R1 та R3, незалежно, - водень, С1-С4 алкіл, -СО-(С1-С6 алкіл), -CН2Ar або -СО-Аr, де Аг - феніл або заміщений феніл; R2 вибирають з групи, до складу якої входить піролідино, гексаметиленіміно та піперидино; або її фармацевтично прийнятної солі. Цей винахід також надає використання сполук формули І або їх фармацевтично прийнятних солей, для виготовлення медикаменту для модулювання кальцієвих каналів у серцевій тканині. Цей винахід має відношення до відкриття, що обрана група 2-арил-3-ароїлбензо[b]тіофенів(бензо[b]тіофен), сполук формули I є ефективною у відношенні модулювання кальцієвих каналів, оскільки підвищує густоту кальцієвих каналів у судинній та серцевій тканині без змін інотропної або пресорної реакції. Таким чином, цей винахід надає методи модулювання кальцієвих каналів у судинній та серцевій тканині. Одним з аспектів цього ви 2 42837 падку, у тому числі введеною сполукою, шляхом введення, конкретним станом, який піддається лікуванню та подібними міркуваннями. Термін "модулювання", який використовують у цьому описі, означає підвищення густоти кальцієвих каналів у судинній та серцевій тканині без змін інотропної або пресорної реакції. Термін "теплокровні тварини", який використовують у цьому описі, означає людей, хатніх тварин, наприклад, собак та кішок, та свійських тварин, наприклад, коней, велику рогату худобу, овець, свиней, кіз та курчат. Теплокровною твариною, переважно, є людина або хатня тварина. Теплокровною твариною, у більш переважному випадку, є людина. Незважаючи на те, що усі сполуки формули І є придатними для модулювання кальцієвих каналів у судинній та серцевій тканині, певні з них є переважними. У переважному випадку, R1 та R3, незалежно, є водень, С1-С4 алкіл, -СО-(С1-С6 алкіл) або бензил, R2 - піперидино або піролідино. До репрезентативних сполук з цієї переважної групи належать 6-гідрокси-2-(4-гідроксифеніл)-3-[4-(2-піролідинетокси)бензоїл]-бензо[b]тіофен, 6-метокси-2-(4мeтоксифeніл)-3-[4-(2-піперидинeтокси)бензоїл]бензо[b]тіофен, 6-ацетокси-2-(4-ацетоксифеніл)3-[4-(2-піролідинетокси)бензоїл]-бензо[b]тіофен та 6-бензилокси-2-(4-бензилоксифеніл)-3-[4-(2-піперидинeтокси)бензоїл]-бензо[b]тіофен. Більш переважно, R1 та R3, незалежно, - водень або С1-С4 алкіл, R2 - піперидино або піролідино. До репрезентативних сполук з цієї більш переважної групи належать 6-гідрокси-2-(4-гідроксифеніл)-3-[4-(2-піролідинетокси)бензоїл]-бензо[b] тіофен, 6-гідрокси-2-(4-гідроксифеніл)-3-[4-(2-піперидинетокси)-бензоїл]бензо[b]тіофен, 6-метокси-2(4-метоксифеніл)-3-[4-(2-піролідинетокси)-бензоїл]бензо[b]тіофен та 6-метокси-2-(4-метоксифеніл)3-[4-(2-піперидинетокси)бензоїл]бензо[b]тіофен. Найбільш переважно, R1 та R3 - водень, R2 – піролідино. Найбільш переважною сполукою є 6-гідрокси-2-(4-гідроксифеніл)-3-[4-(2-піролідинетокси)бензоїл]-бензо[b]тіофен. Сполуки формули І, які використовують у методах цього винаходу, можна виготовляти відповідно до встановлених процедур, наприклад, таких, які описано у Патентах США № 4133814, 4418068 та 4380635. Всі вони включені до цього опису, як посилання. У цілому, процес починають з 6-гідрокси-2-(4-гідроксифеніл)бензо[b]тіофену. Цю вихідну сполуку захищають, ацилюють у С-3 за допомогою 4-(2-аміноетокси)бензольної групи та, факультативно, лишають захисту для утворення сполук формули І. Приклади утворення таких сполук наведено у вищезгаданих патентах США. Сполуки, які використовують у методах цього винаходу, утворюють фармацевтично прийнятні солі, одержані додаванням кислот, а там, де R1 та/або R3 - водень, основ з різними органічними та неорганічними кислотами і до їх числа належать фізіологічнo прийнятні солі, які часто використовують у фармацевтичній хімії. До типових неорганічних кислот, які використовують для утворення таких солей, належать хлористоводнева, хлористобромова, хлористойодна, азотна, сірчана, фосфорна, гіпофосфорна та інші. Можна також використовувати солі, які є похідними від органічних кислот, наприклад, аліфатичних моно- та дікарбоксильних кислот, феніл-заміщених алканових кислот, гідроксиалканових та гідроксиалкандіонових кислот, ароматичних кислот, аліфатичних та ароматичних сульфонових кислот.До таких фармацевтичнo прийнятних солей, таким чином, належить ацетат, фенілацетат, трифторацетат, акрилат, аскорбат, бензоат, хлорбензоат, динітробензоат, гідроксибензоат, метоксибензоат, метилбензоат, оацетоксибензоат, нафталін-2-бензоат, бромід, ізобутират, фенілбутират та b-гідроксибутират, бутин-1,4-діоат, гексин-1,6-діоат, капрат, каприлат, хлорид, цинамат, цитрат, формат, фумарат, гліколят, гептаноат, деканоат, гіпурат, лактат, малат, малеат, гідроксималеат, малонат, мандeлат, мезилат, нікотинат, ізонікотинат, нітрат, оксалат, фталат, терефталат, фосфат, моногідрогенфосфат, дигідрогенфосфат, метафосфат, пірофосфат, пропіолат, пропіонат, фенілпропіонат, саліцилат, себацат, сукцинат, суберат, сульфат, бісульфат, піросульфат, сульфіт, бісульфіт, сульфонат, бeнзолсульфонат, p-бромфенілсульфонат, хлорбензолсульфонат, етансульфонат, 2-гідроксиетансульфонат, мeтансульфонат, нафталін-1-сульфонат, нафталін-2-сульфонат, р-толуолсульфонат, ксилолсульфонат, тартрат та інші. Найбільш переважною сіллю є хлористоводнева сіль. Фармацевтично прийнятні солі, одержані додаванням кислоти, утворюють, звичайно, внаслідок реакції сполуки формули І з еквімолярною або надлишковою кількістю кислоти. Реагенти, як правило, об'єднуються органічним розчинником, наприклад, метанолом, діетиловим ефіром або бензолом. Сіль, при нормальних обставинах, випадає в осад з розчину на протязі, приблизно, 1 години 10 днів і може бути виділена фільтруванням або розчинник може бути видалений традиційними засобами. До основ, які звичайно використовують для утворення солей, належать гідроксид амонію та гідроксиди лужних та лужноземельних металів, карбонати, а також аліфатичні первинні, вторинні та третинні аміни, аліфатичні діаміни. До основ, особливо придатних для утворення солей, належать гідроксид амонію, карбонат калію, метиламін, діетиламін, етилендіамін та циклогексиламін. Ці солі утворюють, як правило, шляхом реагування сполуки формули І, у якої R1 та/або R3 - водень, з однією з вищезгаданих основ у органічному розчиннику, наприклад, метанолі, діетиловому ефірі або бензолі. Солі виділяють, як описано у попередньому параграфі. Ці фармацевтично прийнятні солі, загалом, мають підвищені характеристики розчинності у порівнянні зі сполукою, похідним якої вони є, і, таким чином, вони частіше, є більш придатні для утворення таких лікарських форм, як рідини та емульсії. Сполуки формули І, переважно, вводять до складу лікарської форми перед введенням, наприклад, до складу фармацевтичної лікарської форми, яка включає сполуку формули І та фармацевтично прийнятний носій, розріджувач або наповнювач. Ці фармацевтичні лікарські сполуки виготовляють за відомими методами з використанням добре відомих та легкодоступних інгредієнтів. При виготовленні таких композицій активний інгредієнт, 3 42837 звичайно, змішують з носієм, розводять носієм або вкладають в носій, який може бути у формі капсули, мішечку, контейнеру з паперу або іншого матеріалу. Коли носій використовують, як розріджувач, це може бути твердий, напівтвердий або рідкий матеріал, який є носієм, наповнювачем або середовищем для активного інгредієнту. Композиції можуть бути у формі таблеток, порошків, коржиків, саше, крохмальних облаток, еліксирів, суспензій, емульсій, розчинів, сиропів, аерозолей, мазей, до складу яких входить до 10 мас. % активної сполуки, м'яких та твердих желатинових капсул, шкірних пластирів, супозиторіїв, стерильних розчинів для впорскування та стерильних розфасованих порошків. Деякими прикладами придатних носіїв, наповнювачів та розріджувачів є лактоза, декстроза, цукроза, сорбіт, мані, крохмалі, аравійська камедь, фосфат кальцію, альгінати, трагакант, желатина, силікат кальцію, мікрокристалічна целюлоза, полівінілпіролідон, структурований полівінілпіролідон, целюлоза або її похідні, водний розчин сиропу, метилцелюлоза, метил- та пропілгідроксибензоати, тальк, стеарат магнію та мінеральне масло. До складу лікарських форм можуть додатково входити змащувальні речовини, зволожуючі речовини (наприклад, поверхнево-діючі речовини), емульгатори та суспендуючі речовини, подрібнювачі, консерванти, підсолоджуючі речовини або коригенти. Композиції цього винаходу можна виготовити таким чином, щоб забезпечити прискорене, подовжене або уповільнене виділення активного інгредієнту після введення пацієнтові за допомогою методів, добре відомих у цій галузі. Конкретне дозування сполуки формули І, необхідне для модулювання кальцієвих каналів у судинній та серцевій тканині, відповідно до цього винаходу, буде залежати від тяжкості стану, шляху введення та пов'язаних факторів і вирішуватись лікарем. Загалом, ефективні денній дози будуть складати, приблизно, від 0,1 до 1000 мг/день, більш типово, приблизно, від 10 до 100 мг/день. Такі дози будуть вводитись суб'єктові, який потребує цього, від одного до, приблизно, трьох разів на день, або частіше у залежності від потреби ефективного лікування або симптому. Перевага, звичайно, надається введенню сполуки формули І у вигляді солі, одержаної додаванням кислоти, що є звичайним при введенні фармацевтичних препаратів, до складу яких входить основна група, наприклад, піперидинова група. Для таких цілей доступними є наступні пероральні дозовані лікарські форми. У наступних лікарських формах "активний інгредієнт" означає сполуку формули І. Лікарська форма 1: Желатинові капсули Тверді желатинові капсули виготовляють з використанням наведеного далі: Інгредієнт Активний інгредієнт Крохмаль, державна фармакопея Рухлива крохмальна пудра Силіконова рідина, 350 сантистоксів Інгредієнти змішують, пропускають через сито № 45 (0,353 мм) і засипають у тверді желатинові капсули. Приклади специфічних лікарських форм, виготовлених у вигляді ралоксифенових капсул, включають наведені далі: Лікарська форма 2: Ралоксифенова капсула Інгредієнт Активний інгредієнт Крохмаль, державна фармакопея Рухлива крохмальна пудра Силіконова рідина, 350 сантистоксів Кількість (мг/капсулу) 1 112 225,3 1,7 Лікарська форма 3: Ралоксифенова капсула Інгредієнт Активний інгредієнт Крохмаль, державна фармакопея Рухлива крохмальна пудра Силіконова рідина, 350 сантистоксів Кількість (мг/капсулу) 5 108 225,3 1,7 Лікарська форма 4: Ралоксифенова капсула Інгредієнт Активний інгредієнт Крохмаль, державна фармакопея Рухлива крохмальна пудра Силіконова рідина, 350 сантистоксів Кількість (мг/капсулу) 10 103 225,3 1,7 Лікарська форма 5: Ралоксифенова капсула Інгредієнт Активний інгредієнт Крохмаль, державна фармакопея Рухлива крохмальна пудра Силіконова рідина, 350 сантистоксів Кількість (мг/капсулу) 50 150 397 3,0 Специфічні, наведені вище лікарські форми можна змінювати у відповідності до розумних передбачених варіантів. Лікарську форму у вигляді таблетки готують з використанням наведених нижче інгредієнтів: Лікарська форма 6: Таблетки Інгредієнт Активний інгредієнт Целюлоза мікрокристалічна Кремнію діоксид, фумігований Стеаринова кислота Кількість (мг/капсулу) Активний інгредієнт 0-650 0-650 0-15 4 Кількість (мг/таблетку) 0,1-1000 0-650 0-650 0-15 42837 Компоненти змішують і пресують до утворення таблеток. У альтернативному варіанті, таблетки, до складу кожної з яких входить 0,1-1000 мг активного інгредієнту, виготовляють наступним чином: Лікарська форма 7: Таблетки Інгредієнт Активний інгредієнт Крохмаль Целюлоза мікрокристалічна Полівінілпіролідон (у вигляді 10% розчину у воді) Натрійкарбоксиметильована целюлоза Магнію стеарат Тальк пресують на таблетковій машині до утворення таблеток. Суспензії, кожна з яких включає 0,1-1000 мг активного інгредієнту на 5 мл дозу, виготовляють наступним чином: Лікарська форма 8: Суспензії Кількість (мг/таблетку) 0,1-1000 45 35 Інгредієнт Активний інгредієнт Натрійкарбоксимeтильована целюлоза Сироп Розчин бензойної кислоти Коригент Барвник Дистильована вода до 4 4,5 0,5 1 Кількість (мг/5 мл) 0,1-1000 мг 50 мг 1,25 мг 0,10 мг за потребою за потребою 5 мл Активний інгредієнт пропускають через сито № 45 і змішують з натрійкарбоксиметильованою целюлозою та сиропом до утворення гомогенної пасти. Розчин бензойної кислоти, коригент та барвник розводять деякою кількістю води і додають з перемішуванням. Після цього додають воду у кількості, достатній для отримання необхідного об'єму. Ілюстративні сполуки, які можна використовувати у методах цього винаходу, наведено у таблиці. Активний інгредієнт, крохмаль та целюлозу пропускають через сито № 45 (0,353 мм), ретельно змішують. Розчин полівінілпіролідону змішують з утвореними порошками, які після цього пропускають через сито № 14 (1,41 мм). Утворені таким чином гранули висушують при 50-60°С і пропускають через сито № 18 (1,00 мм). Натрійкарбоксиметильований крохмаль, стеарат магнію та тальк, попередньо пропущені через сито № 60 (0,248 мм) додають до гранул, котрі, після перемішування, Таблиця R2 піперидино Форма основа 2 піперидино СНІ 3 піперидино основа 4 піперидино СНІ 5 піперидино основа 6 піперидино СНІ 7 8 9 10 піперидино піперидино піперидино піперидино основа СНІ основа СНІ 11 піперидино СНІ піперидино основа піперидино піперидино піролідино піролідино гексаметиленіміно піперидино основа СНІ основа СНІ СНІ СНІ Сполука № 1 R1 та R2 12 13 14 15 16 17 18 Н Н Н Н Н СН3 Придатність сполук формули І ілюструється позитивним впливом, який вони мають, щонайменше, у одному з експериментів, опис якого наведено далі. Матеріали та методи Відбір та дозування пацюків здійснювали, по суті, як описано Сато (Sato) та іншими. Сато та інші, J. Bone and Mineral Research? 9? 715-724 (1994). Стисло, оваріоектомізованих незайманих пацюків-самиць (6-місячного віку) ділили на 3 гру пи по 6 тварин і позначали наступним чином: оваріоектомізовані; етинілестрадіол (ЕЕ2, 0,1 мг/кг/день per os); та ралоксифен (сполука 14, 1,0 мг/кг/день per os). Четверту групу самиць з симуляцією оперативного втручання (СОВ) використовували, як другий контроль. Дози ЕЕ2 та 14 підбирали для співпорівняльного впливу на параметри густини кісткової тканини (Сато та інші); випадково, вони спричинювали східний значущий (Р, 0,05 у порівнянні з оваріоектомізованими) ефект 5 42837 та Гордон (Gordon), у Receptor Binding in Drug Research, 31-49, 1986. Реакцію серцево-судинних гемодинамічних параметрів на ВауК 8644 визначали на пацюках (проколом спинного мозку) з кожної з 4 груп (СОВ, оваріоектомізованих, ЕЕ2 та 14), як описана Хейсом (Hayes) та Боулінгом (Bowling) з наступними модифікаціями: лікарський препарат вводили через стегнову вену; безпосередні виміри систолічного тиску крові лівого шлуночку здійснювали шляхом введення невеликого відтинку трубки РЕ90, прикріпленої до датчику тиску, безпосередньо до лівого шлуночку. Хейс та Боулінг, J. Pharmacol. and Exp. Ther., 241, 861-869 (1987). Вимірювали середній діастоличний та систолічний кров'яний тиск, кількість серцевих скорочень, систолічний тиск лівого шлуночку та dp/dt лівого шлуночку. Результати Визначали вплив ЕЕ2 та 14 на зв'язування ([3H] PN 200-110) у кальцієвих каналах серцевих та аортальних тканин та in vivo гемодинамічні реакції на ВауК 8644 у порівнянні до оваріоектомізованих та СОВ контролів. У той час, як кількість високоспоріднених ділянок зв'язування дигідропіридину (Вmax) у серцевих та аортальних тканинах ЕЕ2- та 14-оброблених пацюків була значно підвищена у порівнянні до оваріоектомізованих пацюків, спорідненість щодо зв'язування (Kd) ні у серцевих, ні у аортальних тканин тварин різних груп суттєво не розрізнялось. при зниженні загального холестеролу (36±2 та 38±4 мг/дл, ЕЕ2 та 14, відповідно, у порівнянні до 85±7 та 87±7 мг/дл, оваріоектомізовані та СОВ, відповідно). СОВ та оваріоектомізованим пацюкам вводили носій (100 мкг/г маси тіла 20% гідроксипропіл-S-циклодекстрину). Тварин обробляли впродовж 35 днів і забивали надлишком СО2. Серця та аорти обережно видаляли, швидко заморожували і тримали при -70°С у разі, якщо мембрани не готувались негайно. Мікросомні мембранні пухирці видаляли з 3-4 г подрібнених сердець та аорт з кожної групи, як описано перед тим. Джонс (Jones) та інші, J. Biol. Chem., 254, 530-535 (1979). Препарати зберігали у суміші 0,25 М цукрози/30 мМ гістидину при -70°С. Дослідження зв'язування з використанням підвищених концентрацій ліганду кальцієвих каналів [3Н] PN 200-110 (0,014,0 нМ) здійснювали у 12´75 мм скляних пробірках (загальним об'ємом 500 мкл) при 23°С впродовж 2 годин з використанням 100 (серце) або 200 (аорта) мкг білку/пробірку. Досліди завершувались експрес-фільтруванням на фільтрувальному папері Whatman GF/C. Для випробувань та промивки використовували буфер наступного складу: 50 мМ Трис/НСІ (рН 7,3), 1 мМ ЕДТФ та 12 мМ МgС2. Неспецифічне зв'язування визначали, як зв'язування, яке залишається у присутності 1 мкМ ніфедипіну. Спорідненість радіолігандів щодо зв'язування та густоту рецепторів визначали за ізотермами насичення за допомогою програми LUNDON-1 по нелінійному регресивному аналізу. Ландін (Lundeen) Холестерол мг/дл Група, яку піддавали обробці Оваріектомізовані СОВ ЕЕ2 Ралоксифен (n=5-7) (n=4-6) (n=5-7) (n-4-5) Серцева Вmах (fмоль/мг) [3Н] PN 200110 Kd (пМ) Аортальна Bmax (fмоль/мг) 85±7 87±7 36±2* 38±4* 296±51 385±76 525±65* 535±80* 200±19 188±32 204±21 171±18 61±15 46±14 133±26 124±18* Незважаючи на підвищення Вmaх кальцієвих каналів, in vivo скорочувальні та пресорні реакції, а також частота серцевих скорочень на ВауК 8644 у ЕЕ2-оброблених пацюків не підвищилась у порівнянні до відповідних показників оваріоектомізова *P