Злитий білок біоспецифічного антитіла, який зв’язується з ox40 людини та сироватковим альбуміном людини

Реферат: Винахід стосується злитого білка біоспецифічного антитіла, який зв'язується з ОХ40 людини та сироватковим альбуміном людини, виділеної молекули нуклеїнової кислоти, що його кодує, вектора, клітини-хазяїна, способу одержання даного білка. Винахід також стосується фармацевтичної композиції, що його містить, та застосування злитого білка у виготовленні лікарського препарату для лікування або профілактики патологічного порушення, опосередкованого ОХ40. UA 112203 C2 (12) UA 112203 C2 UA 112203 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Даний винахід стосується молекул антитіл, які мають специфічність щодо антигенних детермінант OX40, і композицій, які містять такі. Даний винахід також стосується терапевтичних застосувань молекул антитіл, композицій і способів одержання зазначених молекул антитіл. ОХ40 (також відомий як CD134, TNFRSF4, ACT35 або TXGP1L) є членом суперсімейства рецепторів TNF, яке включає 4-1ВВ, CD27, CD30 і CD40. Позаклітинний ліганд-зв'язувальний домен ОХ40 складається з 3 повних багатих цистеїном доменів (CRD) і неповного четвертого Скінцевого CRD (Bodmer et al., 2002, Trends Biochem. Sci., 27, 19-26). Лігандом для OX40 є OX40L, а 3 копії OX40 зв'язуються із тривимірним лігандом з утворенням комплексу OX40-OX40L (Compaan and Hymowitz, 2006, Structure, 14, 1321-1330). ОХ40 є мембранозв'язаним рецептором; однак, також була виявлена розчинна ізоформа (Taylor and Schwarz, 2001, J. Immunol. Methods, 255, 67-72). Функціональне значення розчинної форми на цей час невідоме. OX40 не експресується на спочиваючих Т-клітинах, але тимчасово експресується на активованих Т-клітинах після зв'язування Т-клітинного рецептора (TCR). Ліганд для OX40, OX40L є членом сімейства TNF і експресується на активованих клітинах, що представляють антиген (АРС), у тому числі на В-клітинах, макрофагах, ендотеліальних клітинах і дендритних клітинах (DC). ОХ40 є одним з основних костимулюючих рецепторів з наступним залученням CD28, при цьому ОХ40 є необхідним для оптимальної проліферації та виживання Т-клітин. Зв'язування OX40 на активованих Т-клітинах приводить до підвищеного продукування цитокінів і + + проліферації як CD4 , так і CD8 Т-клітин (Gramaglia et al., 2000, J. Immunol., 165, 3043-3050, Bansal-Pakala et al., 2004, J. Immunol., 172, 4821-425), і може приймати участь як у Th1, так і Th2 відповідях, що відбуваються (Gramaglia et al., 1998, J. Immuno., 161, 6510-6517, Arestides et al., 2002, Eur. J. Immunol. 32, 2874-2880). Костимуляція OX40 продовжує виживаність Т-клітин на початковій ефекторній фазі імунної відповіді та збільшує кількість Т-клітин пам'яті за допомогою інгібування загибелі ефекторних Т-клітин. Коли імунна активація є надмірною або неконтрольованою, то може виникнути патологічна алергія, астма, запалення, автоімунні та інші споріднені захворювання. Оскільки ОХ40 діє для підсилення імунної відповіді, це може ускладнити автоімунні та запальні захворювання. Роль взаємодій OX40/OX40L у моделях захворювання була продемонстрована на OX 40нокаутних мишах. При експериментальному алергійному енцефаломієліті (ЕАЕ), моделі розсіяного склерозу, в ОХ 40-нокаутних мишей були відмічені менш важкі клінічні ознаки захворювання та зменшення запального інфільтрату в ЦНС (Carboni et al., 2003, J. Neuroimmunology, 145, 1-11). Також ОХ 40-нокаутні миші, первинно вакциновані та імунізовані овальбуміном, демонструють зменшене запалення легенів (80-90 % зниження еозинофілії), зменшене продукування слизу та значно зменшену гіперреактивність дихальних шляхів (Jember et al., 2001, J. Exp. Med., 193, 387-392). Моноклональні антитіла до мишачого ліганду OX40 показали позитивні ефекти на моделі колаген-індукованого артриту, а саме ревматоїдного артриту (Yoshioka et al., 2000, Eur. J. Immunol., 30, 2815-2823), EAE (Nohara et al., 2001, J. Immunol., 166, 2108-2115), у мишей з діабетом, які не страждають ожирінням (NOD) (Pakala et al., 2004, Eur. J. Immunol., 34, 3039-3046), при коліті у мишей з відновленими Т-клітинами (Malmstrom et al., 2001, J. Immunol., 166, 6972-6981, Totsuka et al., 2003, Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 284, G595-G603) і на моделях запалення легенів (Salek-Ardakani et al., 2003, J. Exp. Med., 198, 315-324, Hoshino et al., 2003, Eur. J. Immunol, 33, 861-869). Визначали профіль антитіла до OX40L людини на моделі запалення легенів у макак-резусів і отримали в результаті знижені рівні IL-5, IL-13 і ефекторних Т-клітин пам'яті в рідині бронхоальвеолярного лаважа після імунізації алергеном (Seshasayee et al., 2007, J. Clin. Invest, 117, 3868-3878). Підвищення експресії OX40 було відмічене при деяких автоімунних і запальних захворюваннях. Сюди входить підвищення експресії OX40 на Т-клітинах, виділених із синовіальної рідини пацієнтів з ревматоїдним артритом (Brugnoni D. et al., 1998, Br. J. Rheum., 37, 584-585; Yoshioka et al., 2000, Eur. J. Immunol., 30, 2815-2823; Giacomelli R. et al., 2001, Clin. Exp. Rheumatol., 19, 317-320). Аналогічно, підвищення експресії OX40 було відмічене в шлунково-кишковій тканині пацієнтів з виразковим колітом та хворобою Крона (Souza et al., 1999, Gut, 45, 856-863; Stuber et al., 2000,Eur. J. Clin. Invest., 30, 594-599) і в активних осередках ураження пацієнтів з розсіяним склерозом (Carboni et al., 2003, J. Neuroimmunology, 145, 1-11). OX40L також може бути виявлений на гладких м'язах дихальних шляхів людини (ASM), а клітини ASM хворих на астму демонструють більш сильну запальну реакцію на зв'язування OX40L, ніж такі у здорових донорів, що вказує на роль каскаду OX40/OX40L при астмі (Burgess et al., 2004, J. Allergy Clin. Immunol., 113, 683-689; Burgess et al., 2005, J. Allergy Clin. Immunol., + 115, 302-308). Крім того, стало відомо, що CD4 Т-клітини, виділені з периферичної крові 1 UA 112203 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 пацієнтів із системним червоним вовчаком (SLE), експресують підвищені рівні ОХ40, які пов'язані з активністю захворювання (Patschan et al., 2006, Clin. Exp. Immunol., 145, 235-242). Враховуючи роль OX40 при алергії, астмі та захворюваннях, пов'язаних з автоімунітетом і запаленням, один із підходів щодо терапії при цих захворюваннях полягає в блокуванні передачі сигналу OX40-OX40L із застосуванням антитіл до OX40L або антагоністичних антитіл до OX40. Див., наприклад, WO2006/029879, де були описані антитіла до OX40L. Були описані численні агоністичні антитіла до OX40, але відомі далеко не всі антагоністичні антитіла до OX40. Було отримане поліклональне антитіло кролика до OX40 миші, Stuber et al., 1996, J. Exp. Med, 183, 979-989, яке блокує взаємодію між OX40 і OX40L. Були створені моноклональні антитіла 131 і 315 миші, які зв'язують OX40 людини, Imura et al., 1996, J. Exp. Med, 2185-2195. Повністю антагоністичні антитіла людини були описані в WO2007/062245, при цьому найвищою афінністю цих антитіл була афінність по відношенню до експресованого на клітинній поверхні OX40 (активовані Т-клітини) в 11 нМ. Гуманізовані антагоністичні антитіла були описані в WO2008/106116, при цьому антитіло з найкращою афінністю по відношенню до OX40 мало афінність 0,94 нМ. Були описані інші антитіла до OX40, у тому числі L106 миші (патент США № 6277962) і ACT35 миші, комерційно доступні від eBioscience. Раніше у міжнародній заявці на патент під номером WO2010/096418 були описані високоафінні антагоністичні антитіла до ОХ40. Також раніше в міжнародній заявці на патент під номером WO2010/035012 була описана нова злита молекула мультиспецифічного антитіла, яка надалі в даному документі згадується як Fab-dsFv і проілюстрована на Фігурі 1. В цій же заявці передбачені корисні варіабельні ділянки для зв'язування з альбуміном, які можуть бути використані для продовження періоду напіврозпаду молекули. У даному винаході ці варіабельні ділянки для зв'язування з альбуміном були вдосконалені та об'єднані в формат Fab-dsFv з антитілами до OX40, описаними в WO2010/096418. Нова біспецифічна молекула за даним винаходом у ряді описаних у даному документі аналізів in vitro та in vivo має покращену ефективність у порівнянні з ефективністю раніше описаної в WO2010/096418 молекули Fab'-PEG. Відповідно, даний винахід передбачає злитий білок біспецифічного антитіла, який зв'язує як OX40 людини, так і сироватковий альбумін людини, та придатний для застосування в лікуванні або профілактиці патологічних порушень, опосередкованих OX40 або пов'язаних з підвищеним рівнем OX40. Короткий опис графічних матеріалів На Фігурі 1 показане злите біспецифічне антитіло за даним винаходом (формат Fab-dsFv). На Фігурах 2-8 показані певні послідовності амінокислот або ДНК, що стосуються антитіла згідно даному розкриттю. На Фігурі 9a показане зв'язування А26 Fab-dsFv, міченого AlexaFluor 488, з активованими + + CD4 OX40 Т-клітинами людини. На Фігурі 9b показане зв'язування A26 Fab', A26 Fab-Fv і A26 Fab'-PEG при наявності 5 % + + HSA на активованих CD4 , OX40 Т-клітинах людини. На Фігурі 10a показаний вплив А26 Fab-dsFv на продукування цитокінів з PBMC, підданих дії алергенного екстракту Dermatophagoides pteronyssinus. + + На Фігурі 10b показана здатність А26 Fab-dsFv інгібувати проліферацію CD4 і CD8 Т-клітин у моделі мишей Hu-NSG. + + На Фігурі 11a показане інгібування зв'язування OX40L з активованими CD4 OX40 Тклітинами людини за допомогою А26 Fab-dsFv. + + На Фігурі 11b показане інгібування зв'язування OX40L з активованими CD4 OX40 Тклітинами людини за допомогою A26Fab', А26 Fab-dsFv, A26 Fab'-PEG і двох контролів. На Фігурі 12a показане інгібування A26 Fab-Fv реакції змішаних лімфоцитів (MLR) людини. На Фігурі 12b показане інгібування A26 Fab-Fv продукування IFN-гама під час MLR людини. + + На Фігурі 13 показане зниження A26 Fab-Fv відсотка активованих (CD25 ) CD4 Т-клітин після вторинної рестимуляції антигеном за допомогою алергенного екстракту Dermatophagoides pteronyssinus. + + На Фігурі 14 показане інгібування проліферації CD4 і CD8 Т-клітин у моделі Hu-NSG за допомогою Fab-Fv і Fab-PEG, уведеними до клітинного переносу залежним від дози способом. Гуманізоване антитіло до OX40 CA044_00026 згадується в даному документі як A26. Злита молекула антитіла за даним винаходом, згадана в даному документі як Fab-dsFv, проілюстрована на Фігурі 1. У даному винаході Fab-фрагмент (що містить перші варіабельні 2 UA 112203 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ділянки важкого та легкого ланцюгів і константні домени) зв'язується з OX40 людини, а dsFvфрагмент (що містить другі варіабельні ділянки важкого та легкого ланцюгів, з'єднані дисульфідним зв'язком) зв'язується із сироватковим альбуміном людини. Зокрема, Fabфрагмент містить CDR, отримані з антагоністичного антитіла до OX40, а Fv-фрагмент містить варіабельні ділянки важкого та легкого ланцюгів гуманізованого антитіла до альбуміну, причому такі альбумін-зв'язувальні варіабельні ділянки з'єднані дисульфідним зв'язком. Відповідно, даний винахід передбачає злитий білок біспецифічного антитіла, який зв'язується з OX40 людини та сироватковим альбуміном людини та містить: важкий ланцюг, що містить у послідовності від N-кінця перший варіабельний домен важкого ланцюга (VH1), СН1-домен і другий варіабельний домен важкого ланцюга (VH2), легкий ланцюг, що містить у послідовності від N-кінця перший варіабельний домен легкого ланцюга (VL1), CL-домен і другий варіабельний домен легкого ланцюга (VL2), де зазначені важкий та легкий ланцюги вирівняні таким чином, що VH1 і VL1 утворюють перший антиген-зв'язувальний центр, а VH2 і VL2 утворюють другий антиген-зв'язувальний центр, де антигеном, що зв'язується першим антиген-зв'язувальним центром, є OX40 людини, а антигеном, що зв'язується другим антиген-зв'язувальним центром, є сироватковий альбумін людини, зокрема, де перший варіабельний домен важкого ланцюга (VH1) містить послідовність, наведену в SEQ ID NO:1 для CDR-H1, послідовність, наведену в SEQ ID NO:2 для CDR-H2, і послідовність, наведену в SEQ ID NO:3 для CDR-H3, а перший варіабельний домен легкого ланцюга (VL1) містить послідовність, наведену в SEQ ID NO:4 для CDR-L1, послідовність, наведену в SEQ ID NO:5 для CDR-L2, і послідовність, наведену в SEQ ID NO:6 для CDR-L3, де другий варіабельний домен важкого ланцюга (V H2) має послідовність, наведену в SEQ ID NO:11, а другий варіабельний домен легкого ланцюга (VL2) має послідовність, наведену в SEQ ID NO:12, і другий варіабельний домен важкого ланцюга (V H2) і другий варіабельний домен легкого ланцюга (VL2) з'єднані дисульфідним зв'язком. Залишки у варіабельних доменах антитіла умовно пронумеровані згідно із системою, розробленою Kabat et al. Ця система викладена в Kabat et al., 1987, в Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA (далі "Kabat et al. (вище)"). Ця система нумерації використовується в даному описі, якщо не зазначене інше. Позначення залишків за Kabat не завжди чітко відповідають лінійній нумерації амінокислотних залишків. Фактична лінійна амінокислотна послідовність може містити меншу кількість амінокислот або додаткові амінокислоти у порівнянні зі строгою нумерацією за Kabat, що відповідає укорочуванню або вставці в структурний компонент, будь то каркасна або гіперваріабельна ділянка (CDR), основної структури варіабельного домену. Правильна нумерація залишків за Kabat може бути визначена для даного антитіла шляхом вирівнювання залишків по гомології в послідовності антитіла зі "стандартною" послідовністю, пронумерованої за Kabat. CDR варіабельного домену важкого ланцюга розташовані в положенні залишків 31-35 (CDRH1), залишків 50-65 (CDR-H2) і залишків 95-102 (CDR-H3) згідно із системою нумерації за Kabat. Проте, згідно зі Chothia (Chothia С. and Lesk A.M., J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987)) петля, еквівалентна CDR-H1, простягається від залишку 26 до залишку 32. Таким чином, якщо не зазначене інше, "CDR-H1", використане в даному документі, призначене для позначення залишків з 26 по 35, як описано при поєднанні системи нумерації за Kabat і топологічного визначення петлі за Chothia. CDR варіабельного домену легкого ланцюга розташовані в положенні залишків 24-34 (CDRL1), залишків 50-56 (CDR-L2) і залишків 89-97 (CDR-L3) згідно із системою нумерації за Kabat. Біспецифічний злитий білок за даним винаходом містить Fab-фрагмент антагоністичного антитіла до OX40, раніше описаного в WO2010/096418. Використаний у даному документі термін "антагоністичний" описує злитий білок антитіла, який здатний інгібувати та/або нейтралізувати біологічну сигнальну активність OX40, наприклад, блокуючи зв'язування або суттєво зменшуючи зв'язування OX40 з лігандом OX40 і, таким чином, інгібуючи активацію ОХ40. Скринінг антитіл для виявлення тих, які зв'язуються з ОХ40, можна виконати із використанням аналізів для вимірювання зв'язування з ОХ40 людини та/або аналізів для вимірювання здатності блокувати зв'язування ОХ40 з його лігандом, OX40L. Прикладом аналізу на основі зв'язування є ELISA, зокрема із використанням злитого білка ОХ40 людини та Fc людини, який імобілізують на планшетах, і з використанням кон'югованого вторинного антитіла 3 UA 112203 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 для виявлення антитіла до OX40, зв'язаного зі злитим білком. Прикладом аналізу на основі блокування є аналіз на основі проточної цитометрії з вимірюванням блокування зв'язування злитого білка OX 40-ліганда з OX40 на CD4 клітинах людини. Флуоресцентно мічене вторинне антитіло використовують для визначення кількісного показника зв'язування злитого білка OX 40ліганда із клітиною. За допомогою цього аналізу шукають зниження сигналу, оскільки антитіло в супернатанті блокує зв'язування злитого білка ліганда з ОХ40. Ще одним прикладом аналізу блокування є аналіз, де блокування костимуляції наївних Т-клітин людини, опосередковане злитим білком OX 40-ліганда, нанесеним на планшет, вимірюють шляхом вимірювання включення міченого тритієм тимідину. У даному винаході варіабельні ділянки є гуманізованими. Гуманізовані антитіла (які включають CDR-привиті антитіла) є молекулами антитіл, що мають одну або декілька гіперваріабельних ділянок (CDR) від видів за винятком людини та каркасну ділянку із молекули імуноглобуліну людини (див., наприклад, патент США № 5585089; WO91/09967). Слід мати на увазі, що може бути необхідно перенести тільки залишки CDR, які визначають специфічність, а не весь CDR (див., наприклад, Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34). Гуманізовані антитіла можуть необов'язково додатково містити один або декілька каркасних залишків, отриманих від видів за винятком людини, від яких були отримані CDR. У даному винаході CDR з VH1 і VL1 отримані з антитіла, відомого як A26 та описаного в WO2010/096418. Відповідно, у злитому білку біспецифічного антитіла за даним винаходом перший варіабельний домен важкого ланцюга (VH1) містить послідовність, наведену в SEQ ID NO:1 для CDR-H1, послідовність, наведену в SEQ ID NO:2 або SEQ ID NO:23 для CDR-H2, і послідовність, наведену в SEQ ID NO:3 для CDR-H3, а перший варіабельний домен легкого ланцюга (VL1) містить послідовність, наведену в SEQ ID NO:4 або SEQ ID NO:24 для CDR-L1, послідовність, наведену в SEQ ID NO:5 для CDR-L2, і послідовність, наведену в SEQ ID NO:6 для CDR-L3. Слід мати на увазі, що заміни однієї або декількох амінокислот, додавання та/або делеції можуть бути зроблені в CDR, передбачених даним винаходом, без значної зміни здатності антитіла до зв'язування з OX40 і нейтралізації активності OX40. Вплив будь-яких амінокислотних замін, додавань і/або делецій може бути легко перевірений фахівцем у даній галузі, наприклад, з використанням способів, описаних в WO2010/096418, для визначення зв'язування OX40 та інгібування взаємодії OX40/OX40L. Відповідно, даний винахід передбачає біспецифічне антитіло, яке має специфічність по відношенню до ОХ40 людини, що містить CDRH-1 (SEQ ID NO:1), CDRH-2 (SEQ ID NO:2), CDRH-3 (SEQ ID NO:3), CDRL-1 (SEQ ID NO:4), CDRL-2 (SEQ ID NO:5) і CDRL-3 (SEQ ID NO:6), як показано на Фігурі 2(с), наприклад, у якому одна або декілька амінокислот, наприклад, 1 або 2 амінокислоти, в одному або декількох з CDR була замінена іншою амінокислотою, такою як подібна амінокислота, визначена в даному документі нижче. В одному варіанті здійснення злитий білок біспецифічного антитіла за даним винаходом містить важкий ланцюг, де перший варіабельний домен важкого ланцюга містить три CDR, де послідовність CDRH-1 має щонайменше 90 % ідентичність або подібність із послідовністю, наведеною в SEQ ID NO:1, CDRH-2 має щонайменше 90 % ідентичність або подібність із послідовністю, наведеною в SEQ ID NO:2, і/або CDRH-3 має щонайменше 90 % ідентичність або подібність з послідовністю, наведеною в SEQ ID NO:3. В іншому варіанті здійснення злитий білок біспецифічного антитіла за даним винаходом містить важкий ланцюг, де варіабельний домен важкого ланцюга містить три CDR, де послідовність CDRH-1 має щонайменше 95 % або 98 % ідентичність або подібність із послідовністю, наведеною в SEQ ID NO:1, CDRH-2 має щонайменше 95 % або 98 % ідентичність або подібність із послідовністю, наведеною в SEQ ID NO:2, і/або CDRH-3 має щонайменше 95 % або 98 % ідентичність або подібність із послідовністю, наведеною в SEQ ID NO:3. "Ідентичність", використана в даному документі, означає, що в будь-якому конкретному положенні у вирівнюваних послідовностях амінокислотний залишок ідентичний серед послідовностей. "Подібність", використана в даному документі, означає, що в будь-якому конкретному положенні у вирівнюваних послідовностях амінокислотний залишок серед послідовностей є залишком аналогічного типу. Наприклад, лейцин може бути замінений на ізолейцин або валін. Інші амінокислоти, які часто можуть бути замінені одна на одну, включають без обмеження: - фенілаланін, тирозин і триптофан (амінокислоти, що мають ароматичні бічні ланцюги); - лізин, аргінін і гістидин (амінокислоти, що мають основні бічні ланцюги); - аспартат і глутамат (амінокислоти, що мають кислотні бічні ланцюги); - аспарагін і глутамін (амінокислоти, що мають амідні бічні ланцюги) та 4 UA 112203 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 - цистеїн і метіонін (амінокислоти, що мають сірковмісні бічні ланцюги). Ступені ідентичності та подібності можуть бути легко розраховані (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M. and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991, програмне забезпечення BLAST™, доступне від NCBI (Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. & States, D.J. 1993, Nature Genet. 3:266-272. Madden, T.L. et al., 1996, Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang J. & Madden, T.L. 1997, Genome Res. 7:649-656). В іншому варіанті здійснення злитий білок біспецифічного антитіла за даним винаходом містить легкий ланцюг, де перший варіабельний домен легкого ланцюга містить три CDR, де послідовність CDRL-1 має щонайменше 90 % ідентичність або подібність із послідовністю, наведеною в SEQ ID NO:4, CDRL-2 має щонайменше 90 % ідентичність або подібність із послідовністю, наведеною в SEQ ID NO:5, і/або CDRL-3 має щонайменше 90 % ідентичність або подібність із послідовністю, наведеною в SEQ ID NO:6. В іншому варіанті здійснення злитий білок біспецифічного антитіла за даним винаходом містить легкий ланцюг, де перший варіабельний домен легкого ланцюга містить три CDR, де послідовність CDRL-1 має щонайменше 95 % або 98 % ідентичність або подібність із послідовністю, наведеною в SEQ ID NO:4, CDRL-2 має щонайменше 95 % або 98 % ідентичність або подібність із послідовністю, наведеною в SEQ ID NO:5, і/або CDRL-3 має щонайменше 95 % або 98 % ідентичність або подібність із послідовністю, наведеною в SEQ ID NO:6. В одному варіанті здійснення Fab-фрагмент злитого білка біспецифічного антитіла, передбачений даним винаходом, є гуманізованою або CDR-щепленою молекулою антитіла, яка містить один або декілька CDR, представлених у SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 і/або 6 (Фігура 2(с)), або її варіантами. Використовуваний у даному документі термін "молекула CDR-привитого антитіла" стосується молекули антитіла, у якій важкий та/або легкий ланцюг містить один або декілька CDR (у тому числі, якщо бажано, один або декілька модифікованих CDR) з донорного антитіла (наприклад, моноклонального антитіла миші), привитого на каркас варіабельної ділянки важкого та/або легкого ланцюга акцепторного антитіла (наприклад, антитіла людини). У якості огляду див. Vaughan et al, Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998. В одному варіанті здійснення замість переносу повного CDR, на каркас антитіла людини переносять тільки один або декілька залишків, що визначають специфічність, із будь-якого з CDR, описаних у даному документі вище (див., наприклад, Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34). В одному варіанті здійснення на каркас антитіла людини переносять тільки залишки, що визначають специфічність, із одного або декількох CDR, описаних у даному документі вище. В іншому варіанті здійснення на каркас антитіла людини переносять тільки залишки, що визначають специфічність, із кожного з CDR, описаних у даному документі вище. Якщо CDR або залишки, що визначають специфічність, є привитими, то може бути використана будь-яка прийнятна акцепторна послідовність каркаса варіабельної ділянки з урахуванням класу/типу донорного антитіла, з якого отримані CDR, включаючи каркасні ділянки миші, примата та людини. Відповідно, CDR-привите антитіло згідно з даним винаходом має варіабельний домен, який містить акцепторні каркасні ділянки людини, а також один або декілька CDR або залишків, що визначають специфічність, описаних вище. Таким чином, в одному варіанті здійснення передбачене нейтралізуюче CDR-привите антитіло, де варіабельний домен містить акцепторні каркасні ділянки людини та донорні CDR, отримані не від людини. Прикладами каркасів людини, які можуть бути використані в даному винаході, є KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY і POM (Kabat et al., вище). Наприклад, KOL і NEWM можуть бути використані для важкого ланцюга, REI може бути використаний для легкого ланцюга, а EU, LAY і РОМ можуть бути використані як для важкого ланцюга, так і для легкого ланцюга. Альтернативно, можуть бути використані послідовності зародкової лінії людини; вони доступні за адресою:http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/. В CDR-привитому антитілі за даним винаходом акцепторні важкі та легкі ланцюги не обов'язково повинні бути отримані з того ж антитіла та можуть, якщо бажано, містити складені ланцюги, які мають каркасні ділянки, отримані з різних ланцюгів. Придатну каркасну ділянку для першого варіабельного домена важкого ланцюга (VH1) за даним винаходом одержують із послідовності 1-3 3-07 підгрупи VH3 людини разом з JH4. Придатну каркасну ділянку легкого ланцюга для першого варіабельного домена легкого 5 UA 112203 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ланцюга (VL1) одержують із послідовності зародкової лінії людини 2-1 1-02 підгрупи VK1 разом з JK4. Крім того, у варіабельній ділянці CDR-привитого антитіла за даним винаходом каркасні ділянки не повинні мати точно ту ж саму послідовність, що і каркасні ділянки акцепторного антитіла. Наприклад, нетипові залишки можуть бути замінені на залишки, що більш часто зустрічаються в акцепторному ланцюзі цього класу або типу. Альтернативно, вибрані залишки в акцепторних каркасних ділянках можуть бути змінені таким чином, щоб вони відповідали залишку, виявленому в тому ж положенні в донорному антитілі (див. Reichmann et al., 1998, Nature, 332, 323-324). Такі зміни мають бути зведені до мінімуму, необхідного для відновлення афінності донорного антитіла. Протокол для вибору залишків в акцепторних каркасних ділянках, які необхідно змінити, викладені в WO 91/09967. Відповідно, у першій варіабельній ділянці важкого ланцюга (VH1) за даним винаходом, якщо акцепторний важкий ланцюг має послідовність 1-3 3-07 VH3 людини разом з JH4, то акцепторні каркасні ділянки важкого ланцюга містять, на додаток до одного або декількох донорних CDR, донорний залишок у щонайменше одному з положень 37, 73, 78 або 94 (відповідно до Kabat et al. (вище)). Таким чином, забезпечується злитий білок біспецифічного антитіла, де щонайменше залишки в положеннях 37, 73, 78 і 94 першого варіабельного домена важкого ланцюга є донорними залишками. Відповідно, у першій варіабельній ділянці легкого ланцюга (VL1) за даним винаходом, якщо акцепторний легкий ланцюг має послідовність 2-1 1-02 підгрупи VK1 людини разом з JK4, то акцепторні каркасні ділянки легкого ланцюга містять, на додаток до одного або декількох донорних CDR, донорний залишок у щонайменше одному з положень 64 або 71. Таким чином, забезпечується злитий білок біспецифічного антитіла, де щонайменше залишки в положеннях 64 і 71 першого варіабельного домена легкого ланцюга є донорними залишками. Донорні залишки є залишками з донорного антитіла, тобто антитіла, з якого були спочатку отримані CDR. В одному варіанті здійснення злитий білок біспецифічного антитіла за даним винаходом містить важкий ланцюг, де перший варіабельний домен важкого ланцюга (V H1) містить послідовність, наведену в SEQ ID NO:8 Фігури 2 (b). Слід розуміти, що в перших варіабельних доменах важкого та легкого ланцюгів, передбачених даним винаходом, можуть бути зроблені заміни, додавання та/або делеції по одній або декільком амінокислотам, наприклад, 1 або 2 амінокислотам, без значної зміни здатності злитого білка антитіла до зв'язування з OX40 і нейтралізації активності OX40. Вплив будь-яких амінокислотних замін, додавань і/або делецій може бути легко перевірений фахівцем у даній галузі, наприклад, із застосуванням способів, описаних в WO2010/096418, для визначення зв'язування з OX40 і блокування ліганда. В одному варіанті здійснення злитий білок біспецифічного антитіла за даним винаходом містить важкий ланцюг, де перший варіабельний домен важкого ланцюга містить послідовність, що має щонайменше 60 % ідентичність або подібність із послідовністю, наведеною в SEQ ID NO:8 Фігури 2(b). В одному варіанті здійснення злитий білок антитіла за даним винаходом містить важкий ланцюг (VH1), де перший варіабельний домен важкого ланцюга містить послідовність, що має щонайменше 70 %, 80 %, 90 %, 95 % або 98 % ідентичність або подібність із послідовністю, наведеною в SEQ ID NO: 8. В одному варіанті здійснення злитий білок біспецифічного антитіла за даним винаходом містить легкий ланцюг, де перший варіабельний домен легкого ланцюга (VL1) містить послідовність, наведену в SEQ ID NO:7 Фігури 2 (а). В іншому варіанті здійснення злитий білок біспецифічного антитіла за даним винаходом містить легкий ланцюг, де перший варіабельний домен легкого ланцюга містить послідовність, що має щонайменше 60 % ідентичність або подібність із послідовністю, наведеною в SEQ ID NO:7. В одному варіанті здійснення злитий білок антитіла за даним винаходом містить легкий ланцюг, де перший варіабельний домен легкого ланцюга містить послідовність, що має щонайменше 70 %, 80 %, 90 %, 95 % або 98 % ідентичність або подібність із послідовністю, наведеною в SEQ ID NO:7. В одному варіанті здійснення злитий білок біспецифічного антитіла за даним винаходом містить важкий ланцюг, де перший варіабельний домен важкого ланцюга (VH1) містить послідовність, наведену в SEQ ID NO:8, і легкий ланцюг, де перший варіабельний домен легкого ланцюга (VL1) містить послідовність, наведену в SEQ ID NO:7. В іншому варіанті здійснення даного винаходу злитий білок антитіла містить важкий ланцюг і легкий ланцюг, де перший варіабельний домен важкого ланцюга містить послідовність, що має щонайменше 60 % ідентичність або подібність із послідовністю, наведеною в SEQ ID NO:8, а 6 UA 112203 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 перший варіабельний домен легкого ланцюга містить послідовність, що має щонайменше 60 % ідентичність або подібність із послідовністю, наведеною в SEQ ID NO:7. Відповідно, злитий білок антитіла містить важкий ланцюг, де перший варіабельний домен важкого ланцюга містить послідовність, що має щонайменше 70 %, 80 %, 90 %, 95 % або 98 % ідентичність або подібність із послідовністю, наведеною в SEQ ID NO:8, і легкий ланцюг, де перший варіабельний домен легкого ланцюга містить послідовність, що має щонайменше 70 %, 80 %, 90 %, 95 % або 98 % ідентичність або подібність із послідовністю, наведеною в SEQ ID NO:7. У злитому білку біспецифічного антитіла за даним винаходом важкий ланцюг містить CH1домен, а легкий ланцюг містить CL-домен, каппа або лямбда. В одному варіанті здійснення злитий білок біспецифічного антитіла за даним винаходом містить важкий ланцюг, де важкий ланцюг містить послідовність, наведену в SEQ ID NO:10, і легкий ланцюг, де легкий ланцюг містить послідовність, наведену в SEQ ID NO:9. Слід розуміти, що у варіабельних та/або константних доменах антитіла, передбачених даним винаходом, можуть бути зроблені заміни, додавання та/або делеції по одній або декільком амінокислотам, наприклад, 1 або 2 амінокислотам, без значної зміни здатності антитіла до зв'язування з OX40 і нейтралізації активності OX40. Вплив будь-яких амінокислотних замін, додавань і/або делецій може бути легко перевірений фахівцем у даній галузі, наприклад, із застосуванням способів, описаних у WO2010/096418, для визначення зв'язування з OX40 і блокування взаємодії ОХ40/ОХ40L. В одному варіанті здійснення даного винаходу злитий білок антитіла містить важкий ланцюг, де VН1- і CH1-домени важкого ланцюга містять послідовність, що має щонайменше 60 % ідентичність або подібність із послідовністю, наведеною в SEQ ID NO:10. Відповідно, злите антитіло містить важкий ланцюг, де VН1- і CH1-домени важкого ланцюга містять послідовність, що має щонайменше 70 %, 80 %, 90 %, 95 % або 98 % ідентичність або подібність із послідовністю, наведеною в SEQ ID NO:10. В одному варіанті здійснення злита молекула біспецифічного антитіла згідно із даним винаходом містить легкий ланцюг, що містить послідовність, наведену в SEQ ID NO:9 Фігури 2(d). В одному варіанті здійснення даного винаходу злитий білок антитіла містить легкий ланцюг, де VL1- і CH1- домени легкого ланцюга містять послідовність, що має щонайменше 60 % ідентичність або подібність із послідовністю, наведеною в SEQ ID NO: 9. Наприклад, злитий білок антитіла містить легкий ланцюг, де VL1- і CL-домени легкого ланцюга містять послідовність, що має щонайменше 70 %, 80 %, 90 %, 95 % або 98 % ідентичність або подібність із послідовністю, наведеною в SEQ ID NO:9. Другим антигеном, що зв'язується злитим білком біспецифічного антитіла за даним винаходом, є сироватковий альбумін людини. З ним зв'язується Fv-фрагмент із Fab-dsFv, який складений із других варіабельних доменів важкого та легкого ланцюга, V H2 і VL2. У даному винаході VH2 і VL2 отримані із одного з описаних в WO2010/035012 антитіл і являють собою покращений, більш гуманізований трансплантат цього антитіла. В одному варіанті здійснення другий варіабельний домен важкого ланцюга (VH2) має послідовність, наведену в SEQ ID NO:11 Фігури 3(а). В одному варіанті здійснення другий варіабельний домен легкого ланцюга (V L2) має послідовність, наведену в SEQ ID NO:12 Фігури 3(b). Таким чином, даний винахід передбачає злитий білок біспецифічного антитіла, який зв'язується з OX40 людини та сироватковим альбуміном людини та містить: важкий ланцюг, що містить у послідовності від N-кінця перший варіабельний домен важкого ланцюга (VH1), СН1-домен і другий варіабельний домен важкого ланцюга (VH2), легкий ланцюг, що містить у послідовності від N-кінця перший варіабельний домен легкого ланцюга (VL1), CL-домен і другий варіабельний домен легкого ланцюга (VL2), де зазначені важкий та легкий ланцюги вирівняні таким чином, що VH1 і VL1 утворюють перший антиген-зв'язувальний центр, а VH2 і VL2 утворюють другий антиген-зв'язувальний центр, де антигеном, що зв'язується першим антиген-зв'язувальним центром, є OX40 людини, а антигеном, що зв'язується другим антиген-зв'язувальним центром, є сироватковий альбумін людини, де перший варіабельний домен важкого ланцюга (VH1) містить послідовність, наведену в SEQ ID NO:1 для CDR-H1, послідовність, наведену в SEQ ID NO:2 для CDR-H2, і послідовність, наведену в SEQ ID NO:3 для CDR-H3, а перший варіабельний домен легкого ланцюга (VL1) містить послідовність, наведену в SEQ ID NO:4 для CDR-L1, послідовність, наведену в SEQ ID NO:5 для CDR-L2, і послідовність, наведену в SEQ ID NO:6 для CDR-L3, 7 UA 112203 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 де другий варіабельний домен важкого ланцюга (V H2) має послідовність, наведену в SEQ ID NO:11, а другий варіабельний домен легкого ланцюга (VL2) має послідовність, наведену в SEQ ID NO:12, і другий варіабельний домен важкого ланцюга (V H2) і другий варіабельний домен легкого ланцюга (VL2) з'єднані дисульфідним зв'язком. Переважно CH1-домен і другий варіабельний домен важкого ланцюга (VH2) з'єднані за допомогою лінкера, а CL-домен і другий варіабельний домен легкого ланцюга (V L2) з'єднані за допомогою лінкера. Може бути використана будь-яка придатна послідовність пептидного лінкера, і вона в кожному ланцюзі може бути однаковою або ж відрізнятися. Придатні лінкери раніше були описані в WO2010/035012 і включені в даний документ за допомогою посилання. Приклади придатних лінкерів показані на Фігурах 3(с) і (d). В одному варіанті здійснення лінкер між CH1-доменом і другим варіабельним доменом важкого ланцюга (V H2) містить послідовність, наведену в SEQ ID NO:13 Фігури 3 (с), або складається з такої. В одному варіанті здійснення лінкер між CH1-доменом і другим варіабельним доменом важкого ланцюга (V H2) містить послідовність, наведену в SEQ ID NO:14 Фігури 3(с), або складається з такої. В одному варіанті здійснення лінкер між CL-доменом і другим варіабельним доменом легкого ланцюга (VL2) містить послідовність, наведену в SEQ ID NO:14 Фігури 3(d), або складається з такої. В одному варіанті здійснення лінкером у легкому ланцюзі є послідовність із 15 амінокислот, зокрема GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:29). В одному варіанті здійснення лінкером у важкому ланцюзі є послідовність із 16 амінокислот, зокрема SGGGGSGGGGTGGGGS (SEQ ID NO:30). В одному варіанті здійснення даний винахід передбачає злитий білок біспецифічного антитіла, у якому важкий ланцюг містить послідовність, наведену на Фігурі 3(е) (SEQ ID NO:15), або складається з такої, а легкий ланцюг містить послідовність, наведену на Фігурі 3(f) (SEQ ID NO:16), або складається з такої. В одному варіанті здійснення даного винаходу злитий білок біспецифічного антитіла містить важкий ланцюг і легкий ланцюг, де важкий ланцюг містить послідовність, що має щонайменше 60 % ідентичність або подібність із послідовністю, наведеною в SEQ ID NO:15, а легкий ланцюг містить послідовність, що має щонайменше 60 % ідентичність або подібність із послідовністю, наведеною в SEQ ID NO: 16. Як правило, злите антитіло містить важкий ланцюг, де важкий ланцюг містить послідовність, що має щонайменше 70 %, 80 %, 90 %, 95 % або 98 % ідентичність або подібність із послідовністю, наведеною в SEQ ID NO:15, і легкий ланцюг, де легкий ланцюг містить послідовність, що має щонайменше 70 %, 80 %, 90 %, 95 % або 98 % ідентичність або подібність із послідовністю, наведеною в SEQ ID NO:16. Злиті молекули антитіла за даним винаходом відповідно мають високу афінність зв'язування, зокрема, пікомолярну афінність по відношенню до OX40 людини та наномолярну афінність по відношенню до сироваткового альбуміну людини. Афінність може бути виміряна із застосуванням будь-якого придатного способу, відомого в даній галузі техніки, включаючи поверхневий плазмонний резонанс, наприклад, Biacore™, як описано для OX40 в WO2010096418 і для сироваткового альбуміну в WO2010/035012, із застосуванням виділеного природного або рекомбінантного OX40, або сироваткового альбуміну, або придатного злитого білка/поліпептиду. В одному прикладі афінність вимірюють із використанням позаклітинного домена рекомбінантного ОХ40 людини, як описано в WO2010/096418. В одному прикладі використаний позаклітинний домен рекомбінантного ОХ40 людини являє собою димер, наприклад, злитий димер Fc. Відповідно, злиті молекули антитіла за даним винаходом мають афінність зв'язування по відношенню до виділеного ОХ40 людини приблизно 200 пМ або менше. В одному варіанті здійснення молекула антитіла за даним винаходом має афінність зв'язування приблизно 100 пМ або менше. В одному варіанті здійснення молекула антитіла за даним винаходом має афінність зв'язування приблизно 50 пМ або менше. В одному варіанті здійснення злита молекула антитіла за даним винаходом має афінність зв'язування приблизно 40 пМ або менше. Злиті молекули антитіла за даним винаходом відповідно мають високу афінність зв'язування по відношенню до ОХ40 людини, експресованого на поверхні активованих Т-клітин, наприклад, наномолярну або пікомолярну афінність. Афінність може бути виміряна із застосуванням будьякого придатного способу, відомого в даній галузі техніки, включаючи спосіб, описаний в + + WO2010096418, із застосуванням активованих CD4 OX40 Т-клітин людини. Зокрема, злиті молекули антитіла за даним винаходом мають афінність зв'язування по відношенню до експресованого на клітинній поверхні ОХ40 людини приблизно 2 нМ або більше. В одному прикладі молекули антитіла за даним винаходом мають афінність зв'язування по відношенню до експресованого на клітинній поверхні ОХ40 людини приблизно 1 нМ або більше. В іншому 8 UA 112203 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 прикладі молекули антитіла за даним винаходом мають афінність зв'язування по відношенню до експресованого на клітинній поверхні ОХ40 людини приблизно 0,5 нМ або більше. В іншому прикладі молекули антитіла за даним винаходом мають афінність зв'язування по відношенню до експресованого на клітинній поверхні ОХ40 людини приблизно 0,2 нМ або більше. Відповідно, злиті молекули антитіла за даним винаходом мають афінність зв'язування по відношенню до виділеного сироваткового альбуміну людини приблизно 50 нМ або менше. Відповідно, злиті молекули антитіла за даним винаходом мають афінність зв'язування по відношенню до виділеного сироваткового альбуміну людини приблизно 20 нМ або менше. В одному варіанті здійснення молекула антитіла за даним винаходом має афінність зв'язування приблизно 10 нМ або менше. В одному варіанті здійснення молекула антитіла за даним винаходом має афінність зв'язування приблизно 5 нМ або менше. В одному варіанті здійснення злита молекула антитіла за даним винаходом має афінність зв'язування приблизно 2 нМ або менше. Злиті молекули антитіла за даним винаходом можуть зв'язуватися із сироватковим альбуміном людини та сироватковим альбуміном яванського макака, миші та пацюка. В одному варіанті здійснення злитий білок антитіла за даним винаходом зв'язується із сироватковим альбуміном яванського макака з афінністю 5 нМ або менше. В одному варіанті здійснення злитий білок антитіла за даним винаходом зв'язується із сироватковий альбумін миші з афінністю 5 нМ або менше. Злиті молекули антитіла за даним винаходом здатні одночасно зв'язуватися з OX40 людини та сироватковим альбуміном людини. Переважно злиті молекули за даним винаходом мають високу афінність по відношенню до ОХ40, а також мають достатній період напіврозпаду in vivo для того, щоб бути терапевтично придатними, наприклад, період напіврозпаду в діапазоні 5-15 днів, наприклад, 7-11 днів. Слід мати на увазі, що афінність злитого білка антитіла, передбаченого даним винаходом, по відношенню до OX40 людини та/або сироваткового альбуміну людини може бути змінена із застосуванням будь-якого придатного способу, відомого в даній галузі техніки. Тому даний винахід також стосується варіантів молекул антитіла за даним винаходом, які мають поліпшену афінність по відношенню до OX40 або сироваткового альбуміну людини. Такі варіанти можуть бути отримані за допомогою ряду протоколів дозрівання афінності, включаючи мутацію CDR (Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), перетасування ланцюгів (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), застосування штамів-мутаторів E. coli (Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), перетасування ДНК (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), фаговий дисплей (Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) і "статеву" ПЛР (Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998). Vaughan et al. (вище) розглядають ці способи дозрівання афінності. В одному варіанті здійснення злиті молекули біспецифічного антитіла за даним винаходом блокують взаємодію між OX40 і OX40L. Численні аналізи, придатні для визначення здатності антитіла блокувати цю взаємодію, описані в WO2010/096418. В одному варіанті здійснення даний винахід передбачає злитий білок антитіла, що має специфічність по відношенню до ОХ40 людини, який здатний на 50 % інгібувати зв'язування ОХ40L людини (досліджують при кінцевій концентрації 2 мкг/мл) з активованими CD4+OX40+ Т-клітинами людини при концентрації менше 0,5 нМ. В одному варіанті здійснення OX40L людини, використаний в аналізі, є природним OX40 людини. В одному варіанті здійснення OX40 людини, використаний в аналізі, є рекомбінантним OX40 людини. Якщо необхідно, антитіло для застосування в даному винаході може бути кон'юговане з однією або декількома ефекторними молекулами. Слід мати на увазі, що ефекторна молекула може включати одну ефекторну молекулу, або дві або більше таких молекул, зв'язаних з утворенням єдиного фрагмента, який може бути приєднаний до антитіл за даним винаходом. Якщо необхідно одержати фрагмент антитіла, з'єднаний з ефекторною молекулою, то його можна отримати за допомогою стандартних хімічних процедур або процедур рекомбінантної ДНК, у яких фрагмент антитіла з'єднують з ефекторною молекулою або безпосередньо, або через фактор сполучення. Методики кон'югації таких ефекторних молекул з антитілами добре відомі в даній галузі техніки (див. Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2nd Ed., Robinson et al., eds., 1987, pp. 623-53; Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev., 62:119-58, та Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123). Конкретні хімічні процедури включають, наприклад, описані в WO 93/06231, WO 92/22583, WO 89/00195, WO 89/01476 і WO 03/031581. Альтернативно, якщо ефекторна молекула являє собою білок або поліпептид, з'єднання можна досягти із застосуванням процедур рекомбінантної ДНК, наприклад, як описано в WO 86/01533 і EP0392745. 9 UA 112203 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Термін "ефекторна молекула", використаний у даному документі, включає, наприклад, протипухлинні засоби, лікарські засоби, токсини, біологічно активні білки, наприклад ферменти, інші антитіла або фрагменти антитіл, синтетичні або природні полімери, нуклеїнові кислоти та їх фрагменти, наприклад, ДНК, РНК та їх фрагменти, радіонукліди, зокрема радіоктивний йод, радіоізотопи, хелатні метали, наночастинки та репортерні групи, такі як флуоресцентні сполуки або сполуки, які можуть бути виявлені за допомогою ЯМР або ESR-спектроскопії. Приклади ефекторних молекул можуть включати цитотоксини або цитотоксичні засоби, у тому числі будь-який засіб, який завдає шкоди клітинам (наприклад, убиває). Приклади включають комбрестатини, доластатини, епотилони, стауроспорин, майтанзиноїди, спонгістатини, ризоксин, галіхондрини, роридини, геміастерліни, таксол, цитохалазин В, граміцидин D, бромід етидію, еметин, мітоміцин, етопозид, тенопозид, вінкристин, вінбластин, колхіцин, доксорубіцин, даунорубіцин, дигідроксіантрациндіон, мітоксантрон, мітраміцин, актиноміцин D, 1-дегідротестостерон, глюкокортикоїди, прокаїн, тетракаїн, лідокаїн, пропранолол і пуроміцин та їх аналоги або гомологи. Ефекторні молекули також включають, але без обмеження, антиметаболіти (наприклад, метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тіогуанін, цитарабін, 5-фторурацил декарбазин), алкілувальні засоби (наприклад, мехлоретамін, тіоепахлорамбуцил, мелфалан, кармустин (BSNU) і ломустин (CCNU), циклотосфамід, бусульфан, дибромоманітол, стрептозотоцин, мітоміцин C і цисдихлордіамін платина (II) (DDP) цисплатин), антрацикліни (наприклад, даунорубіцин (раніше дауноміцин) і доксорубіцин), антибіотики (наприклад, дактиноміцин (раніше актиноміцин), блеоміцин, мітраміцин, антраміцин (AMC), каліхеаміцини або дуокарміцини) та антимітотичні засоби (наприклад, вінкристин і вінбластин). 111 90 177 Інші ефекторні молекули можуть включати хелатні радіонукліди, такі як In і Y, Lu , 213 252 192 188 188 вісмут- , каліфорній- , іридій- і вольфрам- /реній- ; або лікарські засоби, такі як, але без обмеження, алкілфосфохоліни, інгібітори топоізомерази I, таксоїди та сурамін. Інші ефекторні молекули включають білки, пептиди та ферменти. Ферменти, що представляють інтерес, включають, але без обмеження, протеолітичні ферменти, гідролази, ліази, ізомерази, трансферази. Білки, поліпептиди та пептиди, що представляють інтерес, включають, але без обмеження, імуноглобуліни, токсини, такі як абрин, рицин A, екзотоксин синьогнійної палички або дифтерійний токсин, білок, такий як інсулін, фактор некрозу пухлини, α-інтерферон, βінтерферон, фактор росту нервів, тромбоцитарний фактор росту або тканинний активатор плазміногена, тромботичний засіб або антиангіогенний засіб, наприклад, ангіостатин або ендостатин, або модифікатор біологічної відповіді, такий як лімфокін, інтерлейкін-1 (IL-1), інтерлейкін-2 (IL-2), гранулоцитарно-макрофагальний колонієстимулюючий фактор (GM-CSF), гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор (G-CSF), фактор росту нервів (NGF) або інший фактор росту та імуноглобуліни. Інші ефекторні молекули можуть включати виявлювані речовини, корисні, наприклад, у діагностиці. Приклади виявлюваних речовин включають різні ферменти, простетичні групи, флуоресцентні матеріали, люмінесцентні матеріали, біолюмінесцентні матеріали, радіонукліди, позитронно-активні метали (для застосування в позитронно-емісійній томографії) та іони нерадіоактивних парамагнітних металів. Щодо іонів металів, які можуть бути кон'юговані з антитілами для застосування в якості діагностичних, див. здебільшого патент США № 4741900. Придатні ферменти включають пероксидазу хріну, лужну фосфатазу, бета-галактозидазу або ацетилхолінестеразу; придатні простетичні групи включають стрептавідин, авідин і біотин; придатні флуоресцентні матеріали включають умбеліферон, флуоресцеїн, ізотіоціанат флуоресцеїну, родамін, дихлортриазиніламін флуоресцеїн, дансилхлорид і фікоеритрин; придатні люмінесцентні матеріали включають люмінол; придатні біолюмінесцентні матеріали 125 131 включають люциферазу, люциферин та екворин; а придатні радіонукліди включають I, I, 111 99 In і Tc. Якщо ефекторна молекула є полімером, то вона, як правило, може бути синтетичним або природним полімером, наприклад, необов'язково заміщеним поліалкіленом із прямим або розгалуженим ланцюгом, поліалкенільним або поліоксіалкіленовим полімером або розгалуженим або нерозгалуженим полісахаридом, наприклад, гомо- або гетерополісахаридом. Конкретні необов'язкові замісники, які можуть бути представлені на зазначених вище синтетичних полімерах, включають одну або декілька гідроксигруп, метилових груп або метоксигруп. Конкретні приклади синтетичних полімерів включають необов'язково заміщений із прямим або розгалуженим ланцюгом полі(етиленгліколь), полі(пропіленгліколь), полі(вініловий спирт) або їх похідні, особливо необов'язково заміщений полі(етиленгліколь), такий як метоксиполі(етиленгліколь), або їх похідні. 10 UA 112203 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Конкретні природні полімери включають лактозу, амілозу, декстран, глікоген або їх похідні. Передбачається, що термін "похідні", використаний у даному документі, включає реакційноздатні похідні, наприклад тіол-селективні реакційно-здатні групи, такі як малеїміди та подібні. Реакційно-здатна група може бути з'єднана з полімером безпосередньо або за допомогою лінкерного сегмента. Слід мати на увазі, що залишок такої групи буде в деяких випадках утворювати частину продукту у вигляді сполучної групи між фрагментом антитіла та полімером. Розміром полімеру можна при бажанні варіювати, але зазвичай він перебуває в діапазоні середньої молекулярної ваги від 500 Да до 50000 Да, наприклад, від 5000 до 40000 Да, а саме від 20000 до 40000 Да. В одному прикладі придатні ефекторні молекули можуть бути приєднані через будь-який доступний амінокислотний бічний ланцюг або кінцеву амінокислотну функціональну групу, розташовану в злитому білку антитіла, наприклад, через будь-яку вільну аміно-, іміногрупу, тіолову, гідроксильну або карбоксильну групу. Такі амінокислоти у фрагменті антитіла можуть бути природного походження, або ж їх можна вбудовувати у фрагмент із застосуванням способів рекомбінантної ДНК (див., наприклад, US 5219996; US 5667425, WO98/25971). Даний винахід також забезпечує виділену послідовність ДНК, що кодує важкий та/або легкий ланцюг(и) молекули антитіла за даним винаходом. Відповідно, послідовність ДНК кодує важкий або легкий ланцюг молекули антитіла за даним винаходом. Послідовність ДНК за даним винаходом може містити синтетичну ДНК, наприклад, отриману в результаті хімічної обробки, кДНК, геномну ДНК або будь-яку їх комбінацію. Послідовності ДНК, які кодують молекулу антитіла за даним винаходом, можуть бути отримані способами, добре відомими фахівцям у даній галузі. Наприклад, послідовності ДНК, що кодують частину або всі з важких та легких ланцюгів антитіла, можуть бути синтезовані відповідно до побажань із визначених послідовностей ДНК або на основі відповідних амінокислотних послідовностей. ДНК, що кодує акцепторні каркасні послідовності, широко доступна фахівцям у даній галузі та може бути легко синтезована на основі її відомих амінокислотних послідовностей. Для підготовки послідовностей ДНК, що кодують молекулу антитіла за даним винаходом, можуть бути використані стандартні методики молекулярної біології. Бажані послідовності ДНК можуть бути синтезовані повністю або частково із використанням методик синтезу олігонуклеотидів. При необхідності можуть бути використані сайт-направлений мутагенез і методики полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Приклади придатних послідовностей наведені в SEQ ID NO:21 Фігури 5 (а); SEQ ID NO:22 Фігури 5 (b); SEQ ID NO:23 Фігури 6 (а); SEQ ID NO:24 Фігури 6 (b). Нуклеотиди 1-63 в SEQ ID NO21 і 1-63 в SEQ ID NO:23 кодують послідовність сигнального пептиду OmpA, який розщеплюється з одержанням злитої молекули антагоністичного антитіла за даним винаходом. Даний винахід також передбачає виділену послідовність ДНК, яка кодує важкий ланцюг злитого білка антитіла за даним винаходом, що містить SEQ ID NO:21 або SEQ ID NO:22. Даний винахід також передбачає виділену послідовність ДНК, яка кодує легкий ланцюг злитої молекули антитіла за даним винаходом, що містить SEQ ID NO:23 або SEQ ID NO:24. Інші приклади придатних послідовностей наведені в SEQ ID NO:25 Фігури 7 (а); SEQ ID NO:26 Фігури 7 (b); SEQ ID NO:27 Фігури 8 (а); SEQ ID NO:28 Фігури 6 (b). Нуклеотиди 1-57 в SEQ ID NO:25 і 1-60 в SEQ ID NO:27 кодують послідовність сигнального пептиду з антитіла миші B72.3 (Whittle et al., 1987, Protein Eng. 1 (6) 499-505.), що розщеплюється із одержанням злитої молекули антагоністичного антитіла за даним винаходом. Даний винахід також передбачає виділену послідовність ДНК, яка кодує важкий ланцюг злитого білка антитіла за даним винаходом, що містить SEQ ID NO:25 або SEQ ID NO:26. Даний винахід також передбачає виділену послідовність ДНК, яка кодує легкий ланцюг злитої молекули антитіла за даним винаходом, що містить SEQ ID NO:27 або SEQ ID NO:28. Даний винахід також стосується векторів клонування або експресії, що містять одну або декілька послідовностей ДНК за даним винаходом. Таким чином, забезпечується вектор клонування або експресії, що містить одну або декілька послідовностей ДНК, які кодують злитий білок антитіла за даним винаходом. Відповідно, вектор клонування або експресії містить дві послідовності ДНК, що кодують легкий ланцюг і важкий ланцюг молекули антитіла за даним винаходом, відповідно. Таким чином, вектор згідно із даним винаходом містить послідовності, представлені в SEQ ID NO:21 і SEQ ID NO:23. Нуклеотиди 1-63 в SEQ ID NO:21 і 1-63 в SEQ ID NO:23 кодують послідовність сигнального пептиду з OmpA. Загальні способи, за допомогою яких можуть бути сконструйовані вектори, способи трансфекції та способи культивування добре відомі фахівцям у даній галузі. Щодо цього робиться посилання на "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed.), Wiley Interscience, New York, і Maniatis Manual, представлений Cold Spring Harbor Publishing. 11 UA 112203 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Також забезпечується клітина-хазяїн, яка містить один або декілька векторів клонування або експресії, що містять одну або декілька послідовностей ДНК, які кодують злитий білок антитіла за даним винаходом. Для експресії послідовностей ДНК, що кодують молекулу антитіла за даним винаходом, може бути використана будь-яка придатна клітина-хазяїн/векторна система. Можуть бути використані бактеріальні, наприклад E.coli, та інші мікробні системи, або ж також можуть бути використані еукаріотичні системи експресії на основі клітини-хазяїна, наприклад клітини ссавців. Придатні клітини-хазяї ссавців включають CHO, клітини мієломи або гібридоми. Даний винахід також передбачає спосіб одержання злитої молекули антитіла згідно із даним винаходом, який включає культивування клітини-хазяїна, що містить вектор за даним винаходом, в умовах, придатних для забезпечення експресії білка із ДНК, яка кодує молекулу антитіла за даним винаходом, і виділення молекули антитіла. Для одержання продуктів, що містять як важкі, так і легкі ланцюги, клітинна лінія може бути трансфікована двома векторами, при цьому перший вектор кодує поліпептид легкого ланцюга, а другий вектор кодує поліпептид важкого ланцюга. Альтернативно, можна використовувати один вектор, при цьому вектор містить послідовності, що кодують поліпептиди легкого ланцюга та важкого ланцюга. Оскільки злиті білки антитіла за даним винаходом є корисними для лікування та/або профілактики патологічного стану, даний винахід також передбачає фармацевтичну або діагностичну композицію, що містить молекулу антитіла за даним винаходом у комбінації з одним або декількома із фармацевтично прийнятного наповнювача, розріджувача або носія. Відповідно, передбачається застосування злитого білка антитіла за даним винаходом для виготовлення лікарського препарату. Композиція зазвичай поставлятиметься як частина стерильної фармацевтичної композиції, яка, як правило, буде включати фармацевтично прийнятний носій. Фармацевтична композиція за даним винаходом може додатково містити фармацевтично прийнятний ад'ювант. Даний винахід також передбачає спосіб підготовки фармацевтичної або діагностичної композиції, який включає додавання та змішування злитої молекули антитіла за даним винаходом з одним або декількома із фармацевтично прийнятного наповнювача, розріджувача або носія. Злита молекула антитіла може бути єдиним активним інгредієнтом у фармацевтичній або діагностичній композиції, або ж може доповнюватися іншими активними інгредієнтами, у тому числі іншими інгредієнтами-антитілами, наприклад, антитілом до TNF, антитілом до IL-1β, антитілом до Т-клітин, антитілом до IFNγ або антитілом до LPS, або інгредієнтами, що не є антитілами, такими як ксантини. Інші придатні активні інгредієнти включають антитіла, здатні індукувати толерантність, наприклад, антитіла до CD3 або антитіла до CD4. У додатковому варіанті здійснення використовують злитий білок антитіла або композицію згідно розкриттю в комбінації з додатковим фармацевтично активним засобом, наприклад, кортикостероїдом (таким як флутиказону пропіонат) і/або бета-2-агоністом (таким як сальбутамол, сальметерол або формотерол), або інгібіторами росту та проліферації клітин (такими як рапаміцин, циклофосфамід, метотрексат), або альтернативним інгібітором CD28 і/або CD40. В одному варіанті здійснення інгібітор являє собою невелику молекулу. В іншому варіанті здійснення інгібітор є антитілом, специфічним до мішені. Фармацевтичні композиції відповідно містять терапевтично ефективну кількість злитого білка антитіла за даним винаходом. Термін "терапевтично ефективна кількість", використаний у даному документі, стосується кількості терапевтичного засобу, необхідного для лікування, полегшення або профілактики цільового захворювання або стану, або для досягнення виявлюваного терапевтичного або профілактичного ефекту. Для будь-якого антитіла терапевтично ефективна кількість спершу може бути оцінена або в аналізах на клітинних культурах, або на тваринних моделях, як правило, у гризунів, кроликів, собак, свиней або приматів. Тваринна модель також може бути використана для визначення відповідного діапазону концентрацій і шляху введення. Така інформація згодом може бути використана для визначення придатних доз і шляхів уведення у людей. Точна терапевтично ефективна кількість для суб'єкта-людини буде залежати від тяжкості хворобливого стану, загального стану здоров'я суб'єкта, віку, ваги та статі суб'єкта, від дієти, часу та частоти введення, комбінації (комбінацій) лікарського засобу, чутливості реакції та толерантності/відповіді на терапію. Ця кількість може бути визначена шляхом рутинного експериментування та є в компетенції лікаря-клініциста. Як правило, терапевтично ефективна кількість буде становити від 0,01 мг/кг до 50 мг/кг, наприклад, від 0,1 мг/кг до 20 мг/кг. Фармацевтичні композиції задля зручності можуть бути представлені у формі стандартних доз, що містять заздалегідь визначену кількість активного засобу за даним винаходом на дозу. 12 UA 112203 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Композиції можна вводити пацієнтові окремо, або можна вводити у комбінації (наприклад, одночасно, послідовно або роздільно) з іншими засобами, лікарськими засобами або гормонами. Доза, у якій уводять злиту молекулу антитіла за даним винаходом, залежить від природи стану, що підлягає лікуванню, від наявного ступеня запалення і від того, використовується молекула антитіла профілактично або для лікування існуючого стану. Частота дозування буде залежати від періоду напіврозпаду злитої молекули антитіла та тривалості її ефекту. Якщо молекула антитіла має короткий період напіврозпаду (наприклад, від 2 до 10 годин), то може бути необхідним уводити одну або декілька доз на день. Альтернативно, якщо молекула антитіла має тривалий період напіврозпаду (наприклад, від 2 до 15 днів), то може бути необхідним уводити дозу тільки один раз на день, один раз на тиждень або навіть один раз в 1 або 2 місяці. Фармацевтично прийнятний носій не повинен сам по собі викликати продукування антитіл, шкідливих для суб'єкта, що одержує композицію, і не повинен бути токсичним. Придатні носії можуть бути великими, повільно метаболізованими макромолекулами, такими як білки, поліпептиди, ліпосоми, полісахариди, полімери молочної кислоти, полігліколева кислота, полімерні амінокислоти, співполімери амінокислот і неактивні вірусні частинки. Можуть бути використані фармацевтично прийнятні солі, наприклад, солі мінеральних кислот, такі як гідрохлориди, гідроброміди, фосфати та сульфати, або солі органічних кислот, такі як ацетати, пропіонати, малонати та бензоати. Фармацевтично прийнятні носії в терапевтичних композиціях можуть додатково містити рідини, такі як воду, фізіологічний розчин, гліцерин і етанол. Крім того, у таких композиціях можуть бути наявні допоміжні речовини, такі як змочувальні або емульгувальні засоби або буферні речовини, що регулюють рН. Такі носії дозволяють складати фармацевтичні композиції у вигляді таблеток, пігулок, драже, капсул, рідин, гелів, сиропів, зависей і суспензій для прийому внутрішньо пацієнтом. Придатні форми для введення включають форми, придатні для парентерального введення, наприклад, шляхом ін'єкції або інфузії, наприклад, шляхом болюсної ін'єкції або тривалої інфузії. У випадках, коли продукт призначений для ін'єкції або інфузії, йому можна придати форму суспензії, розчину або емульсії в масляному або водному носії,а також він може містити засоби для складання, такі як суспендуючі, консервуючі, стабілізуючі та/або диспергуючі засоби. Альтернативно, зважаючи на те, що молекула антитіла може бути у сухій формі, то перед застосуванням її відновлюють за допомогою відповідної стерильної рідини. Після складання, композиції за даним винаходом можна безпосередньо вводити суб'єктові. Суб'єктами, що підлягають лікуванню, можуть бути тварини. Однак в одному або декількох варіантах здійснення композиції адаптують для введення людям. Відповідно, у складах згідно із даним розкриттям рН кінцевого складу не аналогічний величині ізоелектричної точки антитіла або фрагмента; наприклад, якщо рН складу дорівнює 7, то доцільною може бути pI 8-9 або вище. Не бажаючи бути зв'язаними теорією, вважають, що це, зрештою, може забезпечити кінцевий склад з покращеною стабільністю, наприклад, коли антитіло або фрагмент залишається в розчині. В одному аспекті переважно, щоб злита молекула за даним розкриттям не мала рI, яка б відповідала повністю нейтральній молекулі. Це робить молекулу менш схильною до агрегації. Фармацевтичні композиції за даним винаходом можна вводити найрізноманітнішими шляхами, включаючи, але без обмеження, пероральний, внутрішньовенний, внутрішньом'язовий, внутрішньоартеріальний, інтрамедулярний, інтратекальний, інтравентрикулярний, трансдермальний, через шкіру (див., наприклад, WO98/20734), підшкірний, внутрішньочеревинний, інтраназальний, ентеральний, місцевий, сублінгвальний, вагінальний або ректальний шлях. Для введення фармацевтичних композицій за даним винаходом також може бути використаний безголковий інжектор. Як правило, терапевтичні композиції можуть бути підготовлені у вигляді лікарських засобів для ін'єкцій, або як рідкі розчини, або як суспензії. Також можуть бути підготовлені тверді форми, придатні для розчинення або суспендування в рідких носіях перед ін'єкцією. Безпосередня доставка композицій зазвичай буде здійснюватися шляхом ін'єкції, підшкірно, внутрішньочеревинно, внутрішньовенно або внутрішньом'язово, або ж композиція доставлятиметься в інтерстиціальний простір тканини. Композиції також можуть бути введені в місце ураження. Лікування за допомогою дозування лікарського засобу може являти собою схему з однократним уведенням дози або схему з багаторазовим уведенням дози. Слід мати на увазі, що активним інгредієнтом у композиції буде молекула антитіла. Сама по собі вона буде схильна до руйнування в шлунково-кишковому тракті. Таким чином, якщо 13 UA 112203 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 композиція призначена для введення шляхом шлунково-кишкового тракту, то композиція повинна містити засоби, які захищають антитіло від руйнування, але які вивільняють антитіло після його усмоктування зі шлунково-кишкового тракту. Докладне обговорення фармацевтично прийнятних носіїв доступне в Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, New Jersey, 1991). В одному варіанті здійснення склад забезпечується у вигляді складу для місцевих уведень, включаючи інгаляцію. Придатні препарати для інгаляції включають порошки для інгаляції, дозувальні аерозолі, що містять гази-пропеленти, або розчини для інгаляції без газів-пропелентів. Порошки для інгаляції згідно із даним розкриттям, що містять активну речовину, можуть складатися тільки із зазначених вище активних речовин або із суміші зазначених вище активних речовин з фізіологічно прийнятним наповнювачем. Ці порошки для інгаляції можуть включати моносахариди (наприклад, глюкозу або арабінозу), дисахариди (наприклад, лактозу, сахарозу, мальтозу), оліго- та полісахариди (наприклад, декстрани), поліспирти (наприклад, сорбіт, маніт, ксиліт), солі (наприклад, хлорид натрію, карбонат кальцію) або їх суміші один з одним. Придатними для застосування є моноабо дисахариди, особливо застосування лактози або глюкози, зокрема, але не винятково, у формі їх гідратів. Розмір частинок для відкладання в легенях має становити менше 10 мікронів, наприклад 1-9 мікронів, наприклад, від 0,1 до 5 мкм, зокрема, від 1 до 5 мкм. Розмір частинок активного інгредієнта (такого як антитіло або фрагмент) має першорядне значення. В даній галузі техніки відомі гази-пропеленти, які можуть бути використані з метою підготовки аерозолів для інгаляції. Придатні гази-пропеленти вибирають серед вуглеводнів, таких як н-пропан, н-бутан або ізобутан, і галогенвуглеводнів, таких як хлоровані та/або фторовані похідні метану, етану, пропану, бутану, циклопропану або циклобутану. Зазначені вище гази-пропеленти можуть бути використані самі по собі або в їх сумішах. Особливо придатними газами-пропелентами є галогеновані похідні алканів, вибрані з TG 11, TG 12, TG 134а та TG227. Серед вказаних вище галогенованих вуглеводнів особливо придатними є TG134a (1,1,1,2-тетрафторетан), TG227 (1,1,1,2,3,3,3-гептафторпропан) та їх суміші. Аерозолі для інгаляції, які містять газ-пропелент, також можуть містити інші інгредієнти, такі як співрозчинники, стабілізатори, поверхнево-активні речовини (сурфактанти), антиоксиданти, змащувальні речовини та засоби для регулювання рН. Усі ці інгредієнти відомі в даній галузі техніки. Аерозолі для інгаляції згідно із даним винаходом, які містять газ-пропелент, можуть містити до 5 % за вагою активної речовини. Аерозолі згідно із даним винаходом містять, наприклад, від 0,002 до 5 % за вагою, від 0,01 до 3 % за вагою, від 0,015 до 2 % за вагою, від 0,1 до 2 % за вагою, від 0,5 до 2 % за вагою або від 0,5 до 1 % за вагою активного інгредієнта. Альтернативно, місцеві введення у легені можуть також здійснюватися шляхом введення рідкого розчину або складу суспензії, наприклад, з використанням пристрою, такого як небулайзер, наприклад, небулайзер, з'єднаний з компресором (наприклад, небулайзер Pari LCJet Plus (R), з'єднаний з компресором виробництва Pari Respiratory Equipment, Inc., Richmond, Va.). Злитий білок антитіла за даним винаходом може бути доставлений диспергованим у розчиннику, наприклад, у вигляді розчину або суспензії. Він може бути суспендований у відповідному фізіологічному розчині, наприклад, сольовому розчині або іншому фармацевтично прийнятному розчиннику або буферному розчині. Відомі в даній галузі техніки буферні розчини можуть містити від 0,05 мг до 0,15 мг динатрію едетату, від 8,0 мг до 9,0 мг NaCl, від 0,15 мг до 0,25 мг полісорбату, від 0,25 мг до 0,30 мг безводної лимонної кислоти та від 0,45 мг до 0,55 мг цитрату натрію на 1 мл води, щоб досягти рН від приблизно 4,0 до 5,0. У суспензії можна використовувати, наприклад, ліофілізоване антитіло. Терапевтичні суспензії або склади розчинів можуть також містити один або декілька наповнювачів. Наповнювачі добре відомі в даній галузі техніки та включають буфери (наприклад, цитратний буфер, фосфатний буфер, ацетатний буфер і бікарбонатний буфер), амінокислоти, сечовину, спирти, аскорбінову кислоту, фосфоліпіди, білки (наприклад, сироватковий альбумін), EDTA, хлорид натрію, ліпосоми, маніт, сорбіт і гліцерин. Розчини або суспензії можуть бути інкапсульовані в ліпосоми або мікросфери, що піддаються біорозкладанню. Склад, як правило, буде забезпечуватися практично в стерильній формі з використанням стерильних процесів виробництва. 14 UA 112203 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Це може включати одержання та стерилізацію шляхом фільтрування буферного розчинника/розчину, використовуваного для складу, асептичне суспендування антитіла в стерильному розчині буферного розчинника та розподіл складу в стерильні ємкості за допомогою добре відомих фахівцям у даній галузі способів. Склад, що розпилюється, згідно із даним розкриттям може бути забезпечений, наприклад, у вигляді разових дозованих одиниць (наприклад, герметичних пластикових контейнерів або флаконів), упакованих у обгортку з фольги. Кожний флакон містить стандартну дозу буферного розчинника/розчину об'ємом, наприклад, 2 мл. Злиті білки антитіла, розкриті в даному документі, можуть бути придатні для доставки шляхом розпилення. Також передбачається, що антитіло за даним винаходом можна вводити із застосуванням генної терапії. Щоб цього досягти, послідовності ДНК, які кодують важкий і легкий ланцюги молекули антитіла під контролем відповідних компонентів ДНК, уводять пацієнтові таким чином, що ланцюги антитіла експресуються із послідовностей ДНК і збираються in situ. Даний винахід також передбачає злиту молекулу антитіла (або композиції, що містять її) для застосування при контролі запальних захворювань, наприклад, гострого або хронічного запального захворювання. Відповідно, молекула антитіла (або композиції, що містять її) може бути використана для полегшення запального процесу або для профілактики запального процесу. В одному варіанті здійснення передбачається зменшення кількості in vivo активованих Т-клітин, зокрема тих, які приймають участь у нетипових запальних імунних відповідях, наприклад, залучених у зону/місце розташування такої відповіді. Зменшення кількості активованих Т-клітин, як використовується в даному документі, може являти собою зменшення кількості на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 або більше відсотків у порівнянні з кількістю до лікування або за відсутності лікування. Переважно, лікування з використанням антитіла, фрагмента або композиції згідно із даним винаходом може забезпечити зниження рівня активованих Т-клітин без зниження загального рівня Т-клітин (неактивованих Т-клітин) у пацієнта. Це може привести до зменшення побічних ефектів і, можливо, до запобігання виснаження T-клітин у пацієнта. Даний винахід також передбачає злиту молекулу антитіла за даним винаходом для застосування в лікуванні або профілактиці патологічного порушення, яке опосередковане OX40 або пов'язане з підвищеним рівнем OX40. Патологічний стан може бути вибраний, наприклад, із групи, що складається з інфекцій (вірусних, бактеріальних, грибкових і паразитарних), ендотоксичного шоку, пов'язаного з інфекцією, артриту, ревматоїдного артриту, астми, COPD, запалення органів тазу, хвороби Альцгеймера, запального захворювання кишечнику, хвороби Крона, виразкового коліту, хвороби Пейроні, целіакії, захворювання жовчного міхура, пілонідальної хвороби, перитоніту, псоріазу, васкуліту, хірургічних спайок, інсульту, цукрового діабету I типу, хвороби Лайма, артриту, менінгоенцефаліту, автоімунного увеїту, імунноопосередкованих запальних порушень центральної та периферичної нервової системи, таких як розсіяний склероз, вовчаку (наприклад, системного червоного вовчаку та вовчакового нефриту) і синдрому Гієна-Барра, атопічного дерматиту, автоімунного гепатиту, фіброзуючого альвеоліту, хвороби Грейвса, IgA-нефропатії, ідіопатичної тромбоцитопенічної пурпури, хвороби Меньєра, пухирниці, первинного біліарного цирозу, саркоїдозу, склеродермії, гранулематозу Вегенера, інших автоімунних захворювань, панкреатиту, травми (хірургічної операції), реакції "трансплантат проти хазяїна", відторгнення трансплантата, хвороби серця, включаючи ішемічні захворювання, такі як інфаркт міокарда, а також атеросклероз, внутрішньосудинного згортання, резорбції кістки, остеопорозу, остеоартриту, періодонтиту та гіпохлоргідрії. В одному варіанті здійснення злитий білок антитіла згідно із даним винаходом використовують при лікуванні алергії, COPD, автоімунного захворювання, ревматоїдного артриту, астми, реакції "трансплантат проти хазяїна", хвороби Крона, виразкового коліту, цукрового діабету 1 типу, розсіяного склерозу, системного червоного вовчаку, вовчакового нефриту, міастенії, хвороби Грейвса, відторгнення трансплантата, гранулематозу Вегенера, пурпури Шенлейна-Геноха, системної склеродермії або спричиненого вірусом запалення легенів. В одному варіанті здійснення злитий білок антитіла згідно із даним винаходом використовують при лікуванні захворювання, вибраного із групи, що складається з алергії, COPD, автоімунного захворювання, ревматоїдного артриту, астми, реакції "трансплантат проти хазяїна", хвороби Крона, виразкового коліту, цукрового діабету 1 типу, розсіяного склерозу, системного червоного вовчаку, вовчакового нефриту, міастенії, хвороби Грейвса, відторгнення трансплантата, гранулематозу Вегенера, пурпури Шенлейна-Геноха, системної склеродермії або спричиненого вірусом запалення легенів. 15 UA 112203 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Даний винахід також передбачає злиту молекулу антитіла згідно із даним винаходом для застосування в лікуванні або профілактиці болю, особливо болю, пов'язаного із запаленням. В одному варіанті здійснення механізм, за допомогою якого функціонують злиті молекули за даним розкриттям, включає одне або декілька з інгібування проліферації або виживання Тклітин, підвищення вироблення TReg, погіршення диференціювання В-клітин і/або зменшення продукування цитокінів. Даний винахід додатково передбачає застосування злитої молекули антитіла або композиції згідно із даним винаходом при виготовленні лікарського препарату для лікування або профілактики патологічного порушення, яке опосередковане OX40 або пов'язане з підвищеним рівнем OX40, зокрема, патологічного порушення, яке являє собою ревматоїдний артрит, астму або COPD. Даний винахід додатково передбачає застосування молекули антитіла, фрагмента або композиції згідно із даним винаходом при виготовленні лікарського препарату для лікування або профілактики одного або декількох медичних показань, описаних у даному документі. Злита молекула антитіла або композиція за даним винаходом може бути використана в будь-якій терапії, де бажано зменшити вплив OX40 на організм людини або тварини. OX40 може циркулювати в організмі або ж може бути представлений на небажано високому рівні, локалізуючись у певному місці в організмі, наприклад, у місці запалення. В одному варіанті здійснення злиту молекулу антитіла за даним винаходом або композицію, що містить її, використовують для контролю запального захворювання, наприклад, описаного в даному документі. Даний винахід також передбачає спосіб лікування людей або тварин, що страждають від опосередкованого OX40 порушення або піддані ризику його виникнення, причому спосіб включає введення суб'єктові ефективної кількості злитої молекули антитіла за даним винаходом або композиції, що містить таку. В одному варіанті здійснення передбачається очищений злитий білок біспецифічного антитіла, що зв'язується з OX40 людини та сироватковим альбуміном людини, в практично очищеній формі, а саме, без або практично без ендотоксину та/або білка або ДНК клітинихазяїна. Передбачається, що термін "очищена форма", який використано вище, стосується щонайменше 90 % чистоти, такої як 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % вага/вага або більша чистота. Передбачається, що термін "практично без ендотоксину" у цілому стосується вмісту ендотоксину, що складає 1 EU на мг продукту антитіла або менше, наприклад, 0,5 або 0,1 EU на мг продукту. Передбачається, що термін "практично без білка або ДНК клітини-хазяїна" у цілому стосується вмісту білка та/або ДНК клітини-хазяїна, що складає 400 мкг на мг продукту антитіла або менше, наприклад, 100 мкг на мг або менше, зокрема 20 мкг на мг, в залежності від конкретного випадку. Злита молекула антитіла за даним винаходом також може бути використана у діагностиці, наприклад, у діагностиці in vivo, та при візуалізації хворобливих станів за участю OX40. Переважно дані злиті молекули у належній терапевтичній дозі вважаються безпечними для введення людям, зокрема через те, що вони не є суперагоністами і навряд можуть викликати цитокіновий шторм. Термін "суперагоніст", використаний у даному документі, стосується антитіла, яке приводить до розмноження Т-клітин без залучення TCR. В одному варіанті здійснення А26 Fab-Fv знижує індекс поділу, вказуючи на те, що менша кількість клітин у популяції піддається поділу; цей ефект, імовірно, опосередкований NKклітинами, які експресують OX40. Індекс поділу представляє середню кількість клітинних поділів, яких зазнала клітина у вихідній популяції, і включає клітини, що не зазнали поділу. Індекс проліферації відображає лише проліферацію тієї популяції, що відреагувала, і в одному варіанті здійснення інгібіторний ефект A26 Fab-Fv при використанні цієї величини є відносно зниженим. Передбачається, що термін "який містить" у контексті даного опису припускає значення "який включає". Технічно придатні варіанти здійснення даного винаходу можуть бути об'єднані. Варіанти здійснення описані в даному документі як такі, що включають певні ознаки/елементи. Розкриття також поширюється на окремі варіанти здійснення, які складаються або по суті складаються із зазначених ознак/елементів. 16 UA 112203 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід додатково описується лише за допомогою ілюстрації в нижченаведених прикладах, які посилаються на супровідні графічні матеріали, де продемонстровано наступне. ПРИКЛАДИ Докладний опис графічних матеріалів Фігура 1: злитий білок біспецифічного антитіла за даним винаходом, названий Fab-dsFv. Фігура 2: a) V-ділянка легкого ланцюга антитіла A26 (SEQ ID NO:7), b) V-ділянка важкого ланцюга антитіла A26 (SEQ ID NO:8), c) CDRH1 (SEQ ID NO:1), CDRH2 (SEQ ID NO:2), CDRH3 (SEQ ID NO:3), CDRL1 (SEQ ID NO:4), CDRL2 (SEQ ID NO:5) і CDRL3 (SEQ ID NO:6) антитіла A26, d) легкий ланцюг Fab-компонента антитіла A26 (SEQ ID NO:9), e) важкий ланцюг Fab-компонента антитіла A26(SEQ ID NO:10). Фігура 3: a) важкий ланцюг Fv-компонента 645gH5 до альбуміну (SEQ ID NO:11), b) легкий ланцюг Fv-компонента 645gL4 до альбуміну (SEQ ID NO:12), c) лінкер 1 (SEQ ID NO:13), d) лінкер 2 (SEQ ID NO:14), e) важкий ланцюг Fab-dsFv (SEQ ID NO:15), f) легкий ланцюг Fab-dsFv (SEQ ID NO:16). Фігура 4: a) варіабельний домен важкого ланцюга 645g1 (SEQ ID NO:17), b) варіабельний домен легкого ланцюга 645g1 (SEQ ID NO:18), c) 645gH1 А26 Fab-dsFv (SEQ ID NO:19), d) 645gL1 А26 Fab-dsFv (SEQ ID NO:20). Фігура 5: a) ДНК, що кодує важкий ланцюг Fab-dsFv, включаючи лідерну послідовність OmpA (SEQ ID NO:21), b) ДНК, що кодує важкий ланцюг Fab-dsFv, без лідерної послідовності OmpA (SEQ ID NO:22). Фігура 6: a) ДНК, що кодує легкий ланцюг Fab-dsFv, включаючи лідерну послідовність OmpA (SEQ ID NO:23), b) ДНК, що кодує легкий ланцюг Fab-dsFv, без лідерної послідовності OmpA (SEQ ID NO:24). Фігура 7: a) ДНК, що кодує важкий ланцюг Fab-dsFv, включаючи лідерну послідовність B72.3 (SEQ ID NO:25), b) ДНК, що кодує важкий ланцюг Fab-dsFv, без лідерної послідовності B72.3 (SEQ ID NO:26). Фігура 8: a) ДНК, що кодує легкий ланцюг Fab-dsFv, включаючи лідерну послідовність B72.3 (SEQ ID NO:27), b) ДНК, що кодує легкий ланцюг Fab-dsFv, без лідерної послідовності B72.3 (SEQ ID NO:28). На Фігурі 9a показане зв'язування А26 Fab-dsFv, міченого AlexaFluor 488, з активованими + + CD4 OX40 Т-клітинами людини. На Фігурі 9b показане зв'язування A26Fab", A26 Fab-Fv і A26 Fab'-PEG при наявності 5 % HSA на активованих CD4+, OX40+T-клітинах людини. На Фігурі 10a показаний вплив А26 Fab-dsFv на продукування цитокінів в PBMC, підданих дії алергенного екстракту Dermatophagoides pteronyssinus. На Фігурі 10b показана здатність А26 Fab-dsFv інгібувати проліферацію CD4+ і CD8+T-клітин у моделі мишей Hu-NSG. На Фігурі 11a показане інгібування зв'язування OX40L з активованими CD4+OX40+Tклітинами людини за допомогою А26 Fab-dsFv. На Фігурі 11b показане інгібування зв'язування OX40L з активованими CD4+OX40+Tклітинами людини за допомогою A26Fab", А26 Fab-dsFv, A26 Fab'-PEG і двох контролів. На Фігурі 12a показане інгібування A26 Fab-Fv реакції змішаних лімфоцитів (MLR) людини. На Фігурі 12b показане інгібування A26 Fab-Fv продукування IFN-гама в ході MLR людини. На Фігурі 13 показане зниження A26 Fab-Fv відсотка активованих (CD25+) CD4+T-клітин після вторинної рестимуляції антигеном за допомогою алергенного екстракту Dermatophagoides pteronyssinus. На Фігурі 14 показане інгібування проліферації CD4+ і CD8+T-клітин у моделі Hu-NSG за допомогою Fab-Fv і Fab-PEG, уведених до клітинного переносу залежним від дози способом. 17 UA 112203 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Обробка ДНК і загальні способи Для трансформацій і рутинного культивування використовували компетентні штами E. coli. Ферменти для рестрикції та модифікації ДНК одержали від Roche Diagnostics Ltd. та New England Biolabs. Плазмідні препарати одержували, використовуючи набори Maxi Plasmid purification (QIAGEN, номер за каталогом 12165). Реакції секвенування ДНК проводили із використанням набору ABI Prism Big Dye terminator sequencing (номер за каталогом 4304149) і проганяли на автоматичному секвінаторі ABI 3100 (Applied Biosystems). Дані аналізували за допомогою програми Sequencher (Genecodes). Олігонуклеотиди одержали від Simga або Invitrogen. Гени, що кодують початкові послідовності V-ділянки, конструювали способом автоматизованого синтезу за допомогою DNA2.0 і модифікували з метою створення привитих версій шляхом олігонуклеотид-направленого мутагенезу. Концентрацію Fab-Fv визначили способом HPLC на основі білка G. ПРИКЛАД 1 Створення та аналіз різних гуманізованих трансплантатів 645 в A26Fab-645dsFv Раніше в WO2010/035012 був описаний формат антитіла Fab-dsFv (Фігура 1) (іноді називаний у даному документі просто як Fab-Fv) і гуманізоване антитіло до альбуміну, відоме як '645gH1gL1'. Також раніше в WO2010/096418 було описане створення гуманізованого антагоністичного антитіла до ОХ40, відомого як "A26", і його пегільованого Fab'-фрагмента. В даному документі описується створення нового покращеного гуманізованого трансплантата антитіла '645', відомого як 645dsgH5gL4, і створення молекули антитіла Fab-dsFv, що містить цей трансплантат в Fv-компоненті та варіабельні ділянки 'A26' в Fab-компоненті. Варіабельні ділянки А26 наведені на Фігурах 2a і b (SEQ ID NO: 7 і 8). Послідовності варіабельної та константної ділянки A26 спільно наведені на Фігурах 2d і е (SEQ ID 9 і 10). Послідовності 645gH1 і gL1 наведені на Фігурах 4 (а) і (b), SEQ ID NO 17 і 18. Якщо використовується термін Fab'-PEG або А26 Fab'-PEG, то мова йде про A26 Fab-40К PEG', описаний в WO2010/096418. 1.1 Конструювання лінкерних плазмід A26Fab-645dsFv(gH1gL1) і A26Fab645dsFv(gH5gL4)G4S Усю ділянку кодування легкого ланцюга A26Fab-645dsFv(gL1) (SEQ ID NO:20) клонували у вектор експресії ссавців UCB під контролем промотору HCMV-MIE і послідовності поліаденілювання SV40E. Варіабельну ділянку легкого ланцюга з 645dsFv (gL1) (SEQ ID NO:18) мутували в 645dsFv (gL4) (SEQ ID NO:12) способом ПЛР, що перекривається. Усю ділянку кодування важкого ланцюга A26Fab-645dsFv(gH1) (SEQ ID NO:19) клонували у вектор експресії ссавців UCB під контролем промотору HCMV-MIE і послідовності поліаденілюванняSV40E. Варіабельну ділянку важкого ланцюга з 645dsFv(gH1) (SEQ ID NO:17) мутували в 645dsFv(gH5) (SEQ ID NO:11) способом ПЛР, що перекривається. Конструкції підтверджували секвенуванням. Обидві конструкції містили лінкер 3xG4S, наведений в SEQ ID NO:14 Фігури 3(d). 1.2 Експресія A26Fab-645dsFv(gH1gL1) і A26Fab-645dsFv(gH5gL4) у ссавців Клітини НЕК293 трансфікували плазмідами з важким та легким ланцюгами із використанням реагенту для трансфекції 293fectin від Invitrogen відповідно до інструкцій виробника. Коротко, 25 мкг плазміди з важким ланцюгом і 25 мкг плазміди з легким ланцюгом інкубували зі 100 мкл 293fectin і 1700 мкл середовища Optipro протягом 20 хвилин при кімнатній температурі. Потім 6 суміш додали до 50 × 10 клітин НЕК293 в 50 мл суспензії та інкубували протягом 6 днів зі струшуванням при 37 °C. Через 6 днів супернатант зібрали центрифугуванням при 1500 xg протягом 10 хвилин для видалення клітин, а потім простерилізували через 0,22 мкм фільтр. 1.3 Очищення A26Fab-645dsFv(gH1gL1) і A26Fab-645dsFv(gH5gL4) білком G ~ 50 мл пропущених через 0,22 мкм фільтр супернатантів концентрували до ~ 2 мл за допомогою концентраторів Amicon Ultra-15 з мембраною відсічення молекулярної ваги 10 кДа та центрифугування при 4000 xg у поворотному роторі. 1,8 мл концентрованого супернатанта застосували при 1 мл/хв у 1 мл колонці Gammabind Plus Sepharose (GE Healthcare), урівноваженій 20 мМ фосфату, 40 мМ NaCl, рН 7,4. Колонку промивали 20 мМ фосфату, 40 мМ NaCl, рН 7,4, а зв'язаний матеріал елюювали 0,1 М гліцином/HCl, pH 2,7. Отримували пік елюювання та доводили рН до ~ рН 7 за допомогою 2 М Tris/HCl, рН 8,5. Елюат з доведеним рН концентрували та піддавали діафільтрації в 20 мМ фосфату, 150 мМ NaCl, рН 7,4, за допомогою концентраторів Amicon Ultra-15 з мембраною відсічення молекулярної ваги 10 кДа та центрифугування при 4000 xg у поворотному роторі до кінцевого об'єму ~ 0,3 мл. 1.4 Аналіз A26Fab-645dsFv(gH1gL1) і A26Fab-645dsFv(gH5gL4) за допомогою ексклюзійної хроматографії Очищені білком G зразки аналізували за допомогою ексклюзійної HPLC. Зразки розділяли на 18 UA 112203 C2 5 10 15 20 25 колонці 10/300 GL Tricorn Superdex 200 (GE Healthcare), спроектованій з ізократичним градієнтом PBS, рН 7,4, при швидкості 1 мл/хв. Виявлення піків проводили при 280 нМ і розраховували істинну молекулярну вагу шляхом порівняння зі стандартною кривою білків з відомою молекулярною вагою проти об'єму елюювання. Зміна гуманізованого трансплантата 645dsFv з gH1gL1 на gH5gL4 привела до збільшення відсоткового вмісту мономера експресованого A26Fab-645dsFv з 59 % до 71 %, тобто на 12 %, без будь-якої зміни термічної стабільності dsFv (дані не показані) або афінності зв'язування dsFv з HSA (дані не показані). Приклад 2 2.1 Кінетики зв'язування A26 Fab-dsFv (645gH5gL4) з ОХ40 по BIAcore У цьому та всіх наступних прикладах А26 Fab-dsFv 645gH5gL4 мало послідовність важкого ланцюга, наведену в SEQ ID NO:15 (Фігура 3(е)), і послідовність легкого ланцюга, наведену в SEQ ID NO:16 (Фігура 3(f)), тобто важкий ланцюг містив лінкер G4S, G4T, G4S, наведений в SEQ ID NO:13, Фігура 3(с). BIA (аналіз біомолекулярної взаємодії) виконували з використанням BIAcore T200 (GE Healthcare). F(ab')2-фрагмент антитіла кози до IgG людини від Affinipure, специфічний F(ab') 2фрагмент (Jackson ImmunoResearch), імобілізували на сенсорний чіп СМ5 за допомогою хімії зв'язування амінів до рівня захоплення ≈5000 одиниць відповіді (RU). Буфер HBS-EP (10 мМ HEPES, рН 7,4, 0,15 М NaCl, 3 мМ EDTA, 0,05 % сурфактант Р20, GE Healthcare) використовували в якості рухливого буфера зі швидкістю потоку 10 мкл/хв. Ін'єкцію 10 мкл A26 Fab' при 0,5 мкг/мл або A26Fab-dsFv при 1 мкг/мл використовували для захоплення іммобілізованим F(ab')2 до IgG людини. OX40 людини титрували захоплене A26 у різних концентраціях (від 25 нМ до 1,5625 нМ) при швидкості потоку 30 мкл/хв. Поверхню регенерували за допомогою ін'єкції 2 × 10 мкл 50 мМ HCl з наступною ін'єкцією 5 мкл 5 мМ NaOH при швидкості потоку 10 мкл/хв. Криві зв'язування з відніманням фону аналізували за допомогою програмного забезпечення T200 evaluation (версія 1.0), дотримуючись стандартних процедур. Кінетичні параметри визначили, виходячи з алгоритму підганяння. Таблиця 1 Зразок Fab’ Fab-Fv Fab" PEG 30 35 40 ka (1/Мс) kd (1/с) KD (M) KD (пM) 2,18+0,38 E+05 2,55+0,35 E+05 2,33+0,46 E+05 1,00 E-05 1,04 E-05 1,12 E-05 4,68E-11 4,12E-11 4,84E-11 46,8 41,2 48,4 Середнє 4 визначень 2.2. Кінетика зв'язування A26 Fab-dsFv (645gH5gL4) з альбуміном по BIAcore BIA (аналіз біомолекулярної взаємодії) виконували з використанням BIAcore T200 (GE Healthcare). F(ab')2-фрагмент антитіла кози до IgG людини від Affinipure, специфічний F(ab')2фрагмент (Jackson Immunoresearch), імобілізували на сенсорний чіп СМ5 за допомогою хімії зв'язування амінів до рівня захоплення ≈5000 одиниць відповіді (RU). Буфер HBS-EP (10 мМ HEPES, рН 7,4, 0,15 М NaCl, 3 мМ EDTA, 0,05 % сурфактант Р20, GE Healthcare) використовували в якості рухливого буфера зі швидкістю потоку 10 мкл/хв. Ін'єкцію 10 мкл FabFv при 0,75 мкг/мл використовували для захоплення іммобілізованим F(ab') 2 до IgG людини. Сироватковим альбуміном людини (HSA), сироватковим альбуміном миші (MSA) і сироватковим альбуміном яванського макака (CSA) титрували захоплене Fab-Fv при різних концентраціях (від 50 нМ до 6,25 нМ) при швидкості потоку 30 мкл/хв. Поверхню регенерували за допомогою ін'єкції 2 × 10 мкл 50 мМ HСl з наступною ін'єкцією 5 мкл 5 мМ NaOH при швидкості потоку 10 мкл/хв. Криві зв'язування з відніманням фону аналізували за допомогою програмного забезпечення T200 evaluation (версія 1.0), дотримуючись стандартних процедур. Кінетичні параметри визначили, виходячи з алгоритму підганяння. 45 Таблиця 2 Зразок HSA MSA CSA ka (1/Mс) 5,84 E+04 8,86 E+04 7,1 E+04 kd (1/с) 1,63 E-04 3,68 E-04 1,89 E-04 Середнє 3 визначень 19 KD (M) 2,93E-09 4,16E-09 2,66E-09 KD (нM) 2,93 4,16 2,66 UA 112203 C2 5 2.3. Демонстрація одночасного зв'язування A26 Fab-dsFv (645gH5gL4) з ОХ40 і альбуміном Оцінювали одночасне зв'язування ОХ40 людини та сироваткового альбуміну людини з А26 Fab-dsFv. Конструкцію А26 Fab-dsFv захоплювали на поверхні сенсорного чіпа, як зазначено в способі для кінетики зв'язування A26 Fab-dsFv з альбуміном по BIAcore. 50 нМ HAS, 25 нМ OX40 або змішаним розчином з кінцевою концентрацією 50 нМ HSA і 25 нМ OX40 окремо титрували захоплене А26 Fab-dsFv. Відповідь зв'язування для комбінованого розчину HSA/OX40 була еквівалентна сумі відповідей незалежних ін'єкцій. Це підтверджує, що Fab-dsFv здатний до одночасного зв'язування як ОХ40 людини, так і HSA. Таблиця 3 Зразок A26 Fab-Fv Аналіт hOX40 HSA hOX40+HSA Зв'язування(RU) 25 9 35 (34) 10 15 20 25 30 35 2.4 Аналіз афінності A26 Fab-dsFv (645gH5gL4) за допомогою клітин Способи + + Зв'язування А26 Fab-Fv з активованими CD4 OX40 Т-клітинами людини РВМС виділяли шляхом розділення в градієнті Ficoll і активували 4 мкг/мл PHA-L протягом 3 + днів при 37 °C, 5 % CO2, 100 % вологості. CD4 Т-клітини виділяли шляхом негативної селекції + за допомогою магнітних гранул (CD4 T cell Isolation Kit II for Human; Miltenyi Biotec). Приблизно 1 5 × 10 клітин інкубували при наявності антитіла або в буфері Facs (PBS/0,2 % BSA/0,09 % NaN3) або в буфері Facs з додаванням 5 % HSA при 4 °C. Кінцева концентрація антитіла коливалася в межах від 48 нM до 0,0005 нM. Клітини промили в PBS перед аналізом методом проточної цитометрії з використанням FACScalibur (Becton Dickinson). В умовах обох буферів одержували два набори даних титрування, один з A26 Fab-dsFv, а другий з невідповідним контрольним FabFv, щоб визначити неспецифічне зв'язування. Число молів зв'язаного антитіла розрахували з використанням інтерпольованих значень зі стандартної кривої, отриманої з використанням гранул, що містять різні, але відомі кількості флуоресцентного барвника. Геометричні середні значення флуоресценції визначали в аналізі проточної цитометрії клітин і гранул. Неспецифічне зв'язування віднімали від значень для A26 Fab-dsFv, а отримані таким чином криві специфічного зв'язування аналізували за допомогою нелінійної регресії, використовуючи рівняння зв'язування з одним центром (Graphpad Prism®) для визначення KD. Для визначення афінності A26 Fab-dsFv до антигену, експресованого на клітинній поверхні, + + проводили експерименти щодо насичення зв'язування з використанням активованих CD4 OX40 Т-клітин і A26 Fab-dsFv, міченого Alexa Fluor 488. Специфічне зв'язування антитіла з рецептором при рівновазі в діапазоні концентрацій антитіла використовували для визначення KD за умови, що тільки дуже незначна фракція антитіла була зв'язана з рецептором у будь-якій точці на кривій зв'язування. Рівноважне зв'язування описується за допомогою наступного рівняння: k Рецептор вільний + Антитіло вільне on    Рецептор-Антитіло    k off 40 45 50 Швидкість асоціації антитіла з рецептором = k on  [Рецептор вільний]  [Антитіло вільне] Швидкість дисоціації комплексу рецептор-антитіло = koff  [Рецептор-Антитіло]. При рівновазі швидкості асоціації та дисоціації рівні, при цьому можна одержати рівняння, яке описує ізотерму зв'язування; на напівлогарифмічному графіку зв'язування є сигмоїдальним. KD визначається як koff / kon і може бути розрахована із кривої зв'язування як концентрація, при якій відбувається половина від максимального зв'язування. + + Зв'язування А26 Fab-Fv, міченого AlexaFluor488, з активованими CD4 OX40 Т-клітинами людини виміряли за допомогою проточної цитометрії в 5-log діапазоні концентрацій. Репрезентативна крива зв'язування для A26 Fab-Fv показана на Фігурі 9А. Середнє значення KD, отримане на активованих клітинах від 5 різних донорів, становить 145 пM. Компаратор кривої зв'язування для A26 Fab, А26 Fab-Fv і А26 Fab-PEG показано на Фігурі 9В. Графіки представляють середнє 4 або 5 експериментів, де у кожному експерименті використовували різних донорів. РВМС виділили шляхом розділення в градієнті Ficoll і активували з 4 мкг/мл PHA-L протягом 20 UA 112203 C2 + 5 10 3 днів при 37 °C, 5 % CO2, 100 % вологості. Потім ці CD4 Т-клітини виділили шляхом негативної + селекції за допомогою магнітних гранул (CD4 T cell Isolation Kit II for Human; Miltenyi Biotec). 5 Приблизно 1 × 10 клітин інкубували при наявності антитіла або в буфері Facs (PBS/0,2 % BSA/0,09 % NaN3), або в буфері Facs з додаванням 5 % HSA при 4 °C. Кінцева концентрація антитіла коливалася в межах від 48 нM до 0,0005 нM. Клітини промили в PBS перед аналізом методом проточної цитометрії з використанням FACScalibur (Becton Dickinson). Також були отримані набори даних титрування для ізотопних контрольних антитіл до кожного формату А26, щоб визначити неспецифічне зв'язування. Число молів зв'язаного антитіла розрахували з використанням інтерпольованих значень зі стандартної кривої, отриманої з використанням гранул, що містять різні, але відомі кількості флуоресцентного барвника. Геометричні середні значення флуоресценції визначали в аналізі проточної цитометрії клітин і гранул. Неспецифічне зв'язування віднімали від значень для A26 Fab-dsFv, а отриману таким чином криву специфічного зв'язування аналізували за допомогою нелінійної регресії, використовуючи рівняння зв'язування з одним центром (Graphpad Prism®) для визначення KD. 15 Таблиця 4 Середні значення KD для антитіл A26 в аналізах афінності на клітинах людини Формат антитіла A26 Fab-Fv (n=5) A26 Fab'PEG (n=4) A26 Fab' (n=4) 20 25 Клітинна афінність HSA KD (нM) ± S.E.M 0,145±0,019 0,230±0,057 0,068±0,011 Клітинна афінність NO HSA KD (нM) ± S.E.M 0,096±0,017 0,322±0,089 0,085±0,031 Приклад 3: Модулювання A26 Fab-Fv продукування цитокінів у РВМС, підданих впливу алергенного екстракту Dermatophagoides pteronyssinus РВМС виділяли у добровольців з алергією шляхом розділення у градієнті Ficoll. Очищені РВМС піддавали впливу 25 мкг/мл алергенного екстракту Dermatophagoides pteronyssinus при наявності випробовуваного антитіла (діапазон концентрацій від 50 мкг до 0,0005 мкг/мл) у кінцевому об'ємі 200 мкл на лунку в 96-лунковому круглодонному планшеті. Через 6 днів інкубації при 37 °C, 5 % CO2, 100 % вологості, супернатанти збирали та аналізували на вміст IL13 за допомогою MSD. Графік на Фігурі 10 (а) показує репрезентативні дані 1-го репрезентативного донора з 4, де середнє значення EC50 для інгібування продукування IL-13 складало 0,87 нМ (діапазон від 0,6 нМ до 1,07 нМ). Таблиця 5 Cередні значення EC50 для антитіл A26 в аналізах in vitro на HDM людини Значення EC50 розрахували із кривих інгібування від окремих донорів за допомогою нелінійної регресії з використанням програмного забезпечення Graphpad Prism® Формат антитіла A26 Fab-Fv (n=4) A26 Fab'PEG (n=4) A26 Fab' (n=4) Інгібування продукування IL-13 Інгібування продукування IL-5 EC50 (нM) EC50 (нM) ± S.E.M ± S.E.M 0,865±0,112 0,785±0,216 0,928±0,282 1,310±0,425 0,335±0,040 0,680±0,223 + 30 35 40 + А26 Fab-Fv знижує відсоток активованих (CD25 ) CD4 Т-клітин після вторинної антигенної рестимуляції алергенним екстрактом Dermatophagoides pteronyssinus + CD4 Т-клітини від донорів з алергією стимулювали in vitro протягом 7 днів з 25 мкг/мл алергенного екстракту Dermatophagoides pteronyssinus (Greer) і аутологічними APC за відсутності антитіла або при наявності 10 мкг/мл A26 Fab'PEG, A26 Fab-Fv або контрольного Fab '(A33 Fab'). Клітини промивали та залишили на 3 дні, а потім рестимулювали екстрактом Dermatophagoides pteronyssinus як раніше (Фігура 13). Через 3 дні клітини промивали та флуоресцентно фарбували для виявлення поверхневих CD3, CD4 і CD25. Потім клітини аналізували методом проточної цитометрії на проточному цитометрі FACS Canto (BD). Клітини + + запускали на виявлення живих лімфоцитів і експресію CD3 CD4 до аналізу. Дані представляють n=3 донора, включаючи середнє. n.s, А26 Fab-Fv у порівнянні з контрольним Fab' (значимість вимірювали з використанням парного двостороннього T-критерію). 21 UA 112203 C2 + 5 10 15 20 25 30 35 40 45 + Приклад 4: Інгібування А26 Fab-Fv проліферації CD4 і CD8 Т-клітин у моделі мишей HuNSG Мишам уводили підшкірно 0,03, 0,3, 3 або 30 мг/кг A26 Fab-Fv за один день до переносу 1 × 7 10 PBMC людини в черевну порожнину. Через 14 днів у мишей брали кров шляхом серцевої пункції під термінальною анестезією, а потім умертвляли зсувом шийних хребців. Після цього в + + крові визначали число CD4 і CD8 клітин людини за допомогою аналізу FACS (Фігура 10 (b)). Дані (n=10) виражені як середнє ± SEM, а статистичний аналіз виконували однобічним ANOVA з наступним тестом Бонфероні. Значення представляють % інгібування ± SEM. Результати показані на Фігурі 14. Модель Hu-NSG демонструє, що A26 Fab-Fv повністю інгібує проліферацію Т-клітин людини in vivo і підтверджує A26 Fab-Fv у якості життєздатного терапевтичного кандидата на інгібування опосередкованих Т-клітинами патологій. Крім того, формат Fab-Fv надає більшу ефективність при нижчих дозах, ніж формат Fab'-PEG. Зменшення даної ксено-проліферативної відповіді донорних Т-клітин може надати докази, які підтверджують, що А26 Fab-Fv може бути доцільним терапевтичним засобом при GVHD. Приклад 5: Ліганд-блокувальна здатність Здатність А26 Fab-dsFv блокувати взаємодію між експресованим на клітинній поверхні OX40 і рекомбінантним OX40L виміряли з використанням аналізу блокування ліганда на основі + + методу проточної цитометрії. Коротко, активовані CD4 OX40 Т-клітини людини попередньо інкубували з титруванням А26 Fab-Fv. Потім рекомбінантний OX40L поступово додавали до клітин і залишали для зв'язування при наявності А26 Fab-dsFv. Після цього визначали долю зв'язаного OX40L за допомогою методу проточної цитометрії з використанням міченого вторинного реагенту. На Фігурі 11 показана крива інгібування, що представляє об'єднані дані від 3 незалежних донорів і демонструє, що А26 Fab-dsFv здатне повністю блокувати зв'язування OX40L. Середнє значення IC50 для інгібування зв'язування рекомбінантного OX40L складає 0,44 нМ (n=3 донора). + + Способи: Інгібування зв'язування OX40L з активованими CD4 OX40 Т-клітинами людини за допомогою А26 Fab-Fv РВМС виділяли шляхом розділення у градієнті Ficoll і активували з 4 мкг/мл PHA-L (Sigma) + протягом 3 днів при 37 °C, 5 % CO2, 100 % вологості. Потім CD4 Т-клітини очищали від + культури шляхом негативної селекції з використанням колонок MACS (Miltenyi Biotech, CD4 T 5 + cell isolation kit II). 2 × 10 CD4 Т-клітин інкубували при наявності А26 Fab-dsFv (діапазон кінцевої концентрації 10 мкг/мл - 0,000056 мкг/мл (136,6 нМ - 0,000765 нМ)) протягом 30 хвилин при 4 °C. OX40L (біотинілований CD252-muCD8, Ancell) додавали при кінцевій концентрації 2 мкг/мл та інкубували ще протягом 30 хвилин при 4 °C. Клітини промивали, а зв'язування OX40L виявляли за допомогою інкубації з РЕ-міченим стрептавідином (Jackson Immunoresearch) до аналізу шляхом методу проточної цитометрії з використанням FACS Canto (Becton Dickinson). В якості контролю використовували відповідне Fab-dsFv, що не зв'язує OX40. Криву інгібування аналізували за допомогою нелінійної регресії (Graphpad Prism®), щоб визначити IC 50. Крива інгібування, що представляє об'єднані дані від 3 незалежних донорів, показана на Фігурі 11, де точки даних представляють середнє значення, а планки погрішностей представляють SEM. Середнє значення ЕС50 для інгібування зв'язування рекомбінантного OX40L з ОХ40 за допомогою А26 Fab-Fv складає 0,445 нМ. Для порівняння, A26 Fab'PEG було дещо менш активним при блокуванні ліганда (EC50=0,739 нМ), тоді як A26 Fab' було ненабагато активнішим (EC50=0,242 нМ) за Fab-Fv, як показано нижче. Таблиця 6 Значення EC50 для інгібування зв'язування OX40L з + + активованими CD4 OX40 Т-клітинами людини за допомогою антитіл A26 EC50 блокування ліганда (нM) Середнє значення ± S.E.M. 0,445±0,110 0,739±0,166 0,242±0,069 Формат антитіла A26 Fab-Fv (n=3) A26 Fab'PEG (n=3) A26 Fab' (n=3) 50 Значення EC50 розраховували із кривих інгібування окремих донорів за допомогою нелінійної регресії з використанням програмного забезпечення Graphpad Prism®. Приклад 6. Вплив A26 Fab-Fv у функціональних аналізах in vitro на клітинах людини 22 UA 112203 C2 5 10 15 20 25 30 35 Вплив А26 Fab-Fv на залежні від OX40-OX40L клітинні взаємодії оцінювали в ряді аналізів на стимульованих антигеном лімфоцитах людини. Ці аналізи проводили при наявності 5 % сироватки людини, щоб забезпечити насичення альбумін-зв'язувального центру Fv-ділянки, яке, як можна передбачити, відбувається in vivo. Інгібування А26 Fab-Fv реакції змішаних лімфоцитів Однонаправлена реакція алогенних змішаних лімфоцитів (MLR) є моделлю in vitro активації та проліферації алореактивних Т-клітин (Bach et al., 1964, O'Flaherty et al., 2000). Донорні Тклітини активують за допомогою розпізнавання алогенних антигенів МНС на неспоріднених донорних стимулюючих РВМС, приводячи до клітинної проліферації та продукування цитокінів (Lukacs et al., 1993). Алореакція Т-лімфоцитів, як було показано, викликана одночасно алогенним антигеном МНС і зв'язаним пептидом (Sherman et al., 1993). Величина відповіді MLR корелює зі ступенем неправильного добору МНС між парою респондер-стимулятор (Forrester et al., 2004). Відповідь MLR приводить до проліферації клітин відповідаючого донора і продукування як Th1 (IL-2, IFN-γ і TNF-α), так і Th2 (IL-4, IL-5, IL-10 і IL-13) T-клітинних цитокінів. Точний цитокіновий профіль в MLR вважають специфічним при утворенні пари респондерстимулятор (Jordan et al., 2002). Аналізи MLR широко використовують у дослідженнях з вивчення шляхів активації T-клітин, при скринінгу імунодепресантних лікарських засобів і для прогнозування можливого відторгнення донорного органа у реципієнтів із трансплантацією (Bromelow et al., 2001). Вплив А26 Fab-Fv на активацію та проліферацію алореактивних Т-клітин людини in vitro досліджували з використанням аналізу MLR, по суті, як описано O'Flaherty et al., 2000. РВМС від двох неспоріднених донорів спільно культивували при наявності або за відсутності А26 Fab-Fv, 3 А26 Fab' або А26 Fab'PEG і виміряли клітинну проліферацію по включенню Н-тимідину. Як показано на Фігурі 12, A26 Fab-Fv інгібувало клітинну проліферацію залежним від концентрації способом при значенні ЕС50 0,56 нМ (40,9 нг/мл) і максимальному інгібуванню на 55 % (n=3 донорних пар). A26 Fab-Fv було дещо активнішим за А26 Fab'PEG, яке мало значення ЕС50 0,88 нМ, тоді як A26 Fab' мало значення ЕС50 0,25 нМ, як показано в Таблиці 7. РВМС людини від двох неспоріднених донорів виділяли із цільної крові. Клітини від одного донора інактивували γ-опроміненням з одержанням популяції стимулятора. Клітини від донора, що залишився, утворювали популяцію респондера. Популяції стимулятора та респондера 5 змішували у співвідношенні 1:1 (1 × 10 клітин/донор) і культивували за наявності А26 Fab', А26 Fab-Fv або А26 Fab'PEG (0,4 нг-25 мкг/мл) протягом 6 днів. Реагент власного виробництва CA162-01297.1 Fab-Fv використовували в якості підібраного за ізотипом контролю. Клітинну 3 проліферацію виміряли в день 6 по включенню Н-тимідину (0,5 μCi/лунка). Дані показані як відсоток інгібування відносно відповіді респондера плюс стимулятора за відсутності біологічного реагенту, і є об'єднаними даними трьох донорних пар. Значення ЕС 50 розраховували з використанням програмного забезпечення Graphpad Prism ®. Таблиця 7 Значення EC50 для інгібування проліферативної відповіді MLR людини за допомогою антитіл A26 Формат антитіла A26 Fab-Fv (n=3) A26 Fab'PEG (n=3) A26 Fab' (n=3) 40 45 EC50 (нM) середнє значення ± S.E.M. 0,56±0,12 0,88±0,44 0,25±0,06 Супернатанти від MLR людини також аналізували для дослідження впливу A26 Fab-Fv на продукування цитокінів. Як показано на Фігурі 5.4, А26 Fab-Fv суттєво інгібувало продукування IFN-γ при MLR у середньому на 81 % (n=3 донорні пари). РВМС людини від двох неспоріднених донорів виділяли із цільної крові. Клітини від одного донора інактивували γ-опроміненням з одержанням популяції стимулятора. Клітини від донора, що залишився, утворювали популяцію респондера. Популяції стимулятора та респондера 5 змішували у співвідношенні 1:1 (1 × 10 клітин/донор) і культивували при наявності 25 мкг/мл А26 Fab', А26 Fab-Fv, А26 Fab'PEG або контролів (A33 Fab' або CA162.01297.1) протягом 6 днів. Супернатанти збирали та аналізували на вміст IFN-γ з використанням аналізу MSD. Відсоток інгібування розраховували щодо клітин, культивованих без антитіла. Графіки представляють 23 UA 112203 C2 5 10 15 об'єднані дані від трьох донорів (середнє значення ± SEM). ** = Р