Спосіб виробництва поліпептиду, підданого протеолітичному процесингу

Реферат: Винахід належить до застосування протеолітично активного поліпептиду для протеолітичного процесингу одноланцюгового ботулінічного нейротоксину серотипу А (BoNT/А) шляхом гідролізу з отриманням дволанцюгового ботулінічного нейротоксину серотипу А (BoNT/А), способів виробництва поліпептиду, підданого протеолітичному процесингу, композиції, молекули нуклеїнової кислоти, вектора, клітини-хазяїна, що включають поліпептид, підданий протеолітичному процесингу. UA 111795 C2 (12) UA 111795 C2 UA 111795 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [0001] Даний винахід стосується нового протеолітично активного поліпептиду та різноманітних шляхів застосування поліпептиду в способах скринінгу та виробництва. [0002] Clostridium botulinum та Clostridium tetani виробляють високоактивні нейротоксини, тобто ботулінічні нейротоксини (BoNT) та правцевий нейротоксин (TeNT), відповідно. Ці клостридіальні нейротоксини (CNT) специфічно зв’язуються з нейронами та порушують вивільнення нейромедіаторів. Clostridium botulinum секретує сім антигенно відмінних серотипів ботулінічного нейротоксину (BoNT), позначуваних A-G. Всі серотипи разом зі спорідненим 2+ правцевим нейротоксином (TeNT), секретованим Clostridium tetani, являють собою Zn -залежні ендопротеази, що блокують екзоцитоз синаптичних везикул шляхом розщеплення білків, залучених в утворення комплексу SNARE, який контролює злиття з клітинною мембраною. CNT спричиняють атонічний параліч м’язів, який спостерігається при ботулізмі та правці. На додаток, було продемонстровано, що активність CNT впливає на секрецію залоз. Ці фізіологічні ефекти CNT стосовно активності м'язів та залоз все частіше застосовують у різних шляхах терапевтичного та косметичного застосування. Ботулінічний нейротоксин серотипу A (BoNT/A) було схвалено для застосування в медицині у Сполучених Штатах Америки у 1989 році для лікування косоокості, блефароспазму та інших порушень. Він є комерційно доступним як білковий препарат ботулінічного нейротоксину A, наприклад, під торговельною назвою BOTOX (Allergan Inc.) та під торговельною назвою DYSPORT (Ipsen Ltd). Для терапевтичного застосування комплекс, що містить нейротоксин та додаткові бактеріальні білки, вводять ін'єкцією безпосередньо у м'яз, що підлягає обробці. Токсин вивільняється з білкового комплексу за фізіологічного значення pH (Eisele et al. 2011, Toxicon 57(4):555-65), і має місце бажаний фармакологічний ефект. Поліпшений препарат BoNT/A, який не містить комплексоутворювальних білків, доступний під торговельними назвами XEOMIN або Bocouture (Merz Pharmaceuticals GmbH, Франкфурт/Німеччина). Ефект BoNT є лише тимчасовим, що є причиною того, що для підтримки терапевтичного впливу часто потрібним є повторне введення BoNT. [0003] Кожний CNT спочатку синтезується як неактивний одноланцюговий поліпептид. У випадку BoNT поліпептидний нейротоксин має молекулярну вагу, яка становить приблизно 150 кДа. Посттрансляційний процесинг цього одноланцюгового поліпептиду включає обмежений протеоліз у доступній ділянці, яка має назву петлі (див. таблицю 1), та утворення близькорозташованого дисульфідного містка. Активний дволанцюговий нейротоксин складається з двох продуктів розщеплення, одержаних у результаті протеолітичного гідролізу одноланцюгового поліпептиду-попередника: N-кінцевого легкого ланцюга розміром приблизно 50 кДа та важкого ланцюга розміром приблизно 100 кДа, приєднаного дисульфідним зв'язком. За своєю структурою CNT містить три домени, тобто каталітичний легкий ланцюг, транслокаційний домен (N-кінцева половина) та рецептор-зв'язувальний домен (C-кінцева половина), що містяться у важкому ланцюзі (див. Krieglstein 1990, Eur J Biochem 188: 39; Krieglstein 1991, Eur J Biochem 202: 41; Krieglstein 1994, J Protein Chem 13: 49; Lacy et al., 1998, Nat. Struct. Biol. 5(10):898-902). Залежно від кількості сайтів розщеплення, присутніх в одному ланцюзі між амінокислотними залишками, які утворюють каталітичний домен, та амінокислотними залишками, які утворюють транслокаційний домен, ендопептидазна активність може зумовлювати утворення двох великих продуктів розщеплення, тобто легкого та важкого ланцюгів, та, на додаток, характерних коротких пептидів, що представляють колишню петльову ділянку, які утворюють містки в одному ланцюзі нейротоксину, якому належить стати легким та важким ланцюгами (див. таблицю 1 нижче). [0004] Очищення CNT з розчину ферменту є особливо складною проблемою, оскільки нейротоксини містяться там як суміш непроцесованих, частково процесованих та повністю процесованих поліпептидів, всі з яких мають дуже подібні біохімічні та фізичні властивості. Частково процесовані нейротоксини зазвичай утворюються, якщо під впливом ендопротеолітичної активності відбувся гідроліз пептидного зв'язку між легким ланцюгом та петлею, у той час як пептидний зв'язок між петлею та N-кінцем важкого ланцюга залишається в незмінному стані. Крім того, частково процесований нейротоксин також може утворюватися, якщо під впливом ендопротеолітичної активності відбулося вивільнення петльового пептиду з важкого ланцюга, у той час як пептидний зв'язок між петльовим пептидом та C-кінцем легкого ланцюга ще не був гідролізований. Залежно від умов ферментативного розщеплення та типу нейротоксину повністю процесований поліпептид, позбавлений петльового пептиду, може бути значною мірою забрудненим частково процесованим або непроцесованим поліпептидом у кількості від 5% до 90%. Ще у декількох випадках нейротоксин є головним чином непроцесованим та перед терапевтичним застосуванням потребує обробки ендопептидазою для того, щоб стати біологічно активним. 1 UA 111795 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [0005] У попередньому рівні техніки описано різні спроби обробки клостридіальних нейротоксинів гетерологічними протеазами з метою зменшення кількості непроцесованого або частково процесованого білка-попередника. Протеаза трипсин, яка найширше застосовується для активації клостридіальних нейротоксинів та при цьому є застосовною для активації клостридіальних нейротоксинів серотипів B (BoNT/B) та E (BoNT/E) (DasGupta & Sugiyama 1972, Biochem. Biophys. Res. Commun. 48: 108-112; Kozaki et al., 1974, Infect. Immun. 10: 750-756), як виявляється, зумовлює утворення вторинних продуктів, імовірно шляхом протеолітичної дії біля C-кінця важкої субодиниці BoNT/A, і, таким чином, як виявляється, порушує зв'язування токсину з його клітинним рецептором (Shone et al., 1985, Eur. J. Bioch. 151: 75-82). Утворення більш специфічних продуктів розщеплення теоретично очікується в результаті дії ендогенних протеаз, виділених з нативного хазяїна, такого як C. botulinum, що виробляє BoNT/A. Відповідно, було зроблено багато спроб виділення з нативної клітини-хазяїна ендогенної протеази, залученої в протеолітичну активацію клостридіальних нейротоксинів. Dekleva та DasGupta (Dekleva & DasGupta, 1989, Biochem. Biophys. Res. Commun. 162: 767-772) очистили з культур C. botulinum, які виробляють BoNT/A, фракцію, здатну до протеолітичного розщеплення BoNT/A на важку та легку субодиниці. У пізніших дослідженнях тих же авторів було додатково охарактеризовано ендогенну протеазу, виділену з C. botulinum (Dekleva & DasGupta, 1990, J. Bact. 172: 2498-2503), та виявлено білок розміром 62 кДа, який складався з поліпептиду розміром 15,5 кДа та поліпептиду розміром 48 кДа. Однак, спостереження значної фрагментації CNT після обмеженого впливу білка Dekleva та DasGupta розміром 62 кДа дозволяє припустити, що виділена протеаза не може бути неідентифікованим протеолітичним ферментом, який відповідає за активацію CNT в культурах клітин клостридій та під час інфекції. Відомо, що інші нещодавно зробили припущення, що клострипаїн, також позначуваний як клостридіопептидаза B (Mitchel & Harrington, 1968, JBC 243: 4683-4692), може бути залучений у специфічну активацію CNT (Sebaihia et al., 2007, Genome Res. 17(7):1082-1092; WO2009/014854). Цікаво, що структура та субстратна специфічність цього ферменту нагадують такі альфа-клострипаїну, секретованого Clostridium histolyticum (Dargatz et al. 1993), гомолог (ідентичність амінокислот 74%) якого присутній у C. botulinum (CBO1920). Альфа-клострипаїн C. histolyticum являє собою цистеїнову ендопептидазу із суворою специфічністю стосовно аргінілового зв’язку. Він синтезується як неактивний препрофермент, який піддається автокаталітичному розщепленню з утворенням поліпептидів розміром 15,4 та 43 кДа, які асоціюють, утворюючи гетеродимерний активний фермент (Dargatz et al. 1993). Як альфа-клострипаїн C. histolyticum, так і протеаза C. botulinum розміром 62 кДа потребують відновника та кальцію для повної активності та є сприйнятливими до одних і тих самих інгібіторів протеаз. Ці дані дають вагомі підстави припускати, що ортолог альфа-клострипаїну (CBO1920) з C. botulinum являє собою ендогенну протеазу, яка відповідає за протеолітичне внесення одноланцюгових розривів у нейротоксин C. botulinum. Ген, що кодує клострипаїн (CPE0846), також є присутнім у C. perfringens, і було виявлено, що його позитивна регуляція здійснюється двокомпонентною системою VirR/VirS (Shimizu et al. 2002b). [0006] До сьогодні, однак, додаткові переконливі експериментальні підтвердження відсутні, і протеаза, здатна до ефективного перетворення одноланцюгових попередників CNT на автентичні зрілі продукти розщеплення, тобто дволанцюговий нейротоксин, все ще не є доступною з рівня техніки. Даний винахід вирішує одну або декілька з описаних вище проблем. [0007] Засоби та способи зменшення кількості непроцесованих та/або частково процесованих поліпептидних нейротоксинів та поліпшення, таким чином, якості препаратів нейротоксинів є дуже бажаними, але ще не є доступними. Таким чином, технічну проблему, яка лежить в основі даного винаходу, можна розглядати як забезпечення засобів та способів для поліпшення виробництва поліпептидних нейротоксинів із задоволенням зазначених вище потреб. Технічна проблема вирішується за допомогою варіантів здійснення, охарактеризованих у формулі винаходу та в даному документі нижче. [0008] Відповідно, даний винахід в одному аспекті стосується протеолітично активного поліпептиду, який містить поліпептидну послідовність, що характеризується щонайменше 50% ідентичністю послідовності з послідовністю SEQ ID NO: 1. В іншому аспекті даний винахід стосується протеолітично активного поліпептиду, який складається з поліпептидної послідовності, що характеризується щонайменше 50% ідентичністю послідовності з послідовністю SEQ ID NO: 1. В іншому аспекті даний винахід стосується протеолітично активного поліпептиду, який складається з поліпептидної послідовності, наведеної у SEQ ID NO: 1. [0009] Вираз "протеолітично активний поліпептид", застосовуваний у даному документі, стосується каталітичної функції поліпептиду за даним винаходом і означає, що поліпептид за 2 UA 111795 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 даним винаходом є здатним до гідролізу пептидного зв'язку. В одному аспекті "протеолітично активний поліпептид" стосується поліпептиду, здатного до гідролізу поліпептиду, який містить амінокислотну послідовність, вибрану з будь-якої з SEQ ID NO: 4-25. Вираз "протеолітично неактивний поліпептид", застосовуваний у даному документі, стосується каталітичної функції поліпептиду за даним винаходом і означає, що поліпептид за даним винаходом є нездатним до гідролізу пептидного зв’язку. [0010] Фахівець у даній галузі може визначити, чи є поліпептид згідно з визначенням послідовності, згаданим у даному документі, поліпептидом згідно з даним винаходом, шляхом тестування протеолітичної активності зазначеного поліпептиду. Система аналізу або тестування для визначення протеолітичної активності передбачає приведення поліпептиду, який містить поліпептидну послідовність, що характеризується щонайменше 50% ідентичністю послідовності з послідовністю SEQ ID NO: 1, у контакт із тестовим субстратом. Тестовий субстрат, як правило, є поліпептидом, який, як відомо, є розщеплюваним під дією поліпептиду за даним винаходом. Тестовий субстрат переважно являє собою CNT, такий як BoNT, або його фрагмент. Тестовий субстрат може являти собою, наприклад, нерозщеплений/непроцесований BoNT, позначуваний у даному документі як "scBoNT", і може належати, наприклад, до серотипу A, B, C1, D, E, F або G (наприклад, "scBoNT/A", "scBoNT/B" тощо), або тестовий субстрат може являти собою правцевий нейротоксин. Альтернативно, тестовий субстрат може являти собою фрагмент клостридіального нейротоксину, при цьому зазначений фрагмент містить амінокислотну послідовність, вибрану з будь-якої з SEQ ID NO: 4-25. Фрагмент може являти собою поліпептид, який містить 50 або більше амінокислотних залишків, або пептид, який містить до 49 амінокислотних залишків. Як застосовується у всьому даному описі, вираз "поліпептид" стосується молекул з 50 або більше амінокислотними залишками, тоді як вираз "пептид" стосується молекул з 2-49 амінокислотними залишками. В одному аспекті тестовий субстрат являє собою розчинний фрагмент нейротоксину, що має назву LH N, який містить легкий ланцюг поліпептиду, доступну петльову пептидну ділянку та N-кінцеву половину важкого ланцюга поліпептиду, транслокаційний домен HN. В іншому аспекті тестовий субстрат являє собою або містить пептид, вибраний з будь-якого з SEQ ID NO: 4-25 (див. таблицю 1). У ще одному аспекті тестовий субстрат являє собою химерний нейротоксин, який містить амінокислотні залишки, що походять з двох або більше серотипів. [0011] Аналіз для визначення протеолітичної активності, як правило, включатиме етап визначення ступеня перетворення тестового субстрату на його продукт(продукти) розщеплення. Спостереження утворення одного або декількох продуктів розщеплення після приведення поліпептиду в контакт із тестовим субстратом або спостереження збільшення кількості продукту(продуктів) розщеплення свідчить про протеолітичну активність поліпептиду. Зазначений етап визначення може включати порівняння субстрату та продукту(продуктів) розщеплення. Зазначене порівняння може включати визначення кількості субстрату та/або кількості одного або декількох продуктів розщеплення й також може включати обчислення співвідношення кількостей субстрату та продукту(продуктів) розщеплення. На додаток, аналіз для визначення протеолітичної активності може включати етап порівняння тестового зразка з еталонним зразком, де еталонний зразок, як правило, містить (a) поліпептид, який містить поліпептидну послідовність, що характеризується щонайменше 50% ідентичністю послідовності з послідовністю SEQ ID NO: 1, і який, як відомо, є протеолітично активним, та (b) тестовий субстрат, який, як відомо, є розщеплюваним під дією поліпептиду (a). В одному аспекті аналіз для визначення протеолітичної активності включає розділення субстрату та продукту(продуктів) розщеплення за допомогою електрофорезу або за допомогою колонкової хроматографії та, необов'язково, спектрометричний аналіз. Може бути зручним маркування тестового субстрату однією або декількома мітками задля легшого виявлення зменшення кількості тестового субстрату та/або збільшення кількості продукту(продуктів). Вираз "мітка", застосовуваний у даному документі, означає маркер, що детектується, та включає, наприклад, радіоактивну мітку, антитіло, флуоресцентну мітку. Кількість тестового субстрату та/або продукту розщеплення можна визначити, наприклад, за допомогою способів радіоавтографії або спектрометрії включно зі способами, які базуються на резонансному перенесенні енергії щонайменше між двома мітками. Альтернативно, для виявлення можна застосовувати імунологічні способи, такі як вестерн-блотинг або ELISA. Переважний аналіз для визначення протеолітичної активності поліпептиду за даним винаходом описаний у даному документі нижче у прикладах, які ілюструють даний винахід. В особливо переважному варіанті здійснення даного винаходу поліпептид є протеолітично активним, якщо більше 20%, переважно більше 95% тестового субстрату перетворюється на продукти розщеплення, такі як легкий ланцюг та важкий ланцюг, за 120 хв. при 37°C із застосуванням буфера, вибраного із 100 мМ Tris-HCl, pH 8,0, або PBS (50 3 UA 111795 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 мМ Na2HPO4, 150 мМ NaCl, pH 7,4). Ті самі умови застосовують, якщо тестовий субстрат являє собою не нейротоксин повної довжини, а замість цього, наприклад, фрагмент нейротоксину повної довжини або похідну нейротоксину. Очевидно, що в цьому випадку продукти розщеплення будуть іншими. Однак, фахівець у даній галузі може визначити кількість відповідних продуктів розщеплення. В іншому аспекті, як правило, в аналізі застосовують 100 нг протеолітично активного поліпептиду та молярне співвідношення 1:100 стосовно субстрату. У ще одному аспекті зразок можна відбирати через певні інтервали з метою відстеження каталітичної активності із часом. Аналіз можна модифікувати, наприклад, шляхом застосування декількох кількостей протеолітично активного поліпептиду. [0012] У SEQ ID NO: 2 наведено поліпептидну послідовність протеолітично неактивного поліпептиду, отриманого з Clostridium botulinum штаму ATCC 3502, № доступу в GenBank "CAL82988.1", яка має довжину 581 амінокислотний залишок. У SEQ ID NO: 1 наведено протеолітично активну похідну SEQ ID NO: 2, в якої відсутні амінокислотні залишки 1-248 з SEQ ID NO: 2. [0013] Вираз "поліпептид, який містить поліпептидну послідовність, що характеризується щонайменше 50% ідентичністю послідовності з послідовністю SEQ ID NO: 1", стосується поліпептиду, який характеризується щонайменше 50% ідентичністю послідовності з послідовністю SEQ ID NO: 1. На додаток, вираз стосується поліпептиду, який містить поліпептидну послідовність, що характеризується щонайменше 50% ідентичністю послідовності з послідовністю SEQ ID NO: 1. Зазначений поліпептид може містити додаткові амінокислоти, наприклад, у внутрішньому положенні чи на N- або C-кінці послідовності, наведеної у SEQ ID NO: 1, або у внутрішньому положенні чи на N- або C-кінці амінокислотної послідовності, щонайменше на 50% ідентичної послідовності SEQ ID NO: 1, де метіонін може бути присутнім на N-кінці поліпептиду. На додаток, вираз стосується поліпептиду, в якому відсутні один або декілька амінокислотних залишків, наприклад, у внутрішньому положенні чи на N- або C-кінці послідовності, наведеної у SEQ ID NO: 1, або у внутрішньому положенні чи на N- або C-кінці послідовності, щонайменше на 50% ідентичної послідовності SEQ ID NO: 1. [0014] Вираз "ідентичність послідовності", застосовуваний у даному документі, стосується визначення ідентичності між еталонною амінокислотною послідовністю та шуканою послідовністю, де послідовності вирівнюють таким чином, що отримують збіг найвищого порядку, яку можна обчислити із застосуванням опублікованих методик або способів, кодифікованих у комп’ютерних програмах, таких як, наприклад, BLASTP, BLASTN, FASTA (Altschul 1990, J MoI Biol 215: 403). Значення відсоткової ідентичності в одному аспекті обчислюють упродовж усієї амінокислотної послідовності. В іншому аспекті ідентичність послідовності обчислюють упродовж довжини послідовності, що становить до 50 амінокислотних залишків, до 100 амінокислотних залишків, до 150 амінокислотних залишків, до 250 амінокислотних залишків, 300 амінокислотних залишків, 350 амінокислотних залишків, 400 амінокислотних залишків, 450 амінокислотних залишків, 500 амінокислотних залишків або 550 амінокислотних залишків. В іншому аспекті ідентичність послідовності обчислюють упродовж щонайменше 50 амінокислотних залишків, щонайменше 100 амінокислотних залишків, щонайменше 150 амінокислотних залишків або щонайменше 250 амінокислотних залишків. У переважних варіантах здійснення ідентичність послідовності визначають упродовж усієї довжини SEQ ID NO: 1 або 2, тобто впродовж довжини, яка становить 333 амінокислотні залишки або 581 амінокислотний залишок, відповідно. Для фахівця в даній галузі доступною є низка програм, що базуються на різноманітних алгоритмах, для порівняння різних послідовностей. У цьому контексті алгоритми Нідлмана-Вунша або Сміта-Вотермана дають особливо достовірні результати. Для здійснення вирівнювань послідовностей та обчислення значень ідентичності послідовностей, перелічених у даному документі, застосовували комерційно доступну програму DNASTAR Lasergene MegAlign версії 7.1.0, яка базується на алгоритмі Clustal W, упродовж усієї ділянки послідовності з наступними налаштуваннями: параметри попарного вирівнювання: штраф за відкриття гепу: 10,00, штраф за продовження гепу: 0,10, матриця ваг амінокислот Gonnet 250, які, якщо не зазначене інше, завжди слід застосовувати як стандартні налаштування для вирівнювань послідовностей. [0015] Вираз "щонайменше 50% ідентичність послідовності", застосовуваний у даному документі, означає щонайменше 50%, щонайменше 55%, щонайменше 60%, щонайменше 65%, щонайменше 70%, щонайменше 75%, щонайменше 80%, щонайменше 85%, щонайменше 90%, щонайменше 95% або 100%. [0016] Протеолітично активний поліпептид за даним винаходом може мати ту саму кількість амінокислот, що й еталонна поліпептидна послідовність, наведена у SEQ ID NO: 1. Даний винахід також охоплює поліпептиди, які мають додаткові амінокислотні залишки або меншу їх 4 UA 111795 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 кількість. В одному аспекті протеолітично активний поліпептид за даним винаходом являє собою або містить усічений мутантний варіант SEQ ID NO:1 або 2 або поліпептиду, який характеризується щонайменше 50% ідентичністю послідовності з послідовністю SEQ ID NO: 1 або 2. В усіченому мутантному варіанті SEQ ID NO: 2 може, наприклад, бути відсутніми один або декілька амінокислотних залишків, розташованих у N-кінцевій частині відносно положення амінокислоти 249. Усічений мутантний варіант може бути мутантним варіантом з N- або Cкінцевим усіченням та/або мутантним варіантом із внутрішнім усіченням, який є протеолітично активним. В одному аспекті у зазначеному усіченому мутантному варіанті SEQ ID NO:2 відсутні положення амінокислот 1-248 з SEQ ID NO: 2. В іншому аспекті усічений мутант SEQ ID NO: 2 являє собою мутанта з C-кінцевим усіченням. В одному аспекті в усіченому мутанті відсутні до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 50, 100, 150 або до 170 послідовних амінокислотних залишків. В іншому аспекті протеолітично активний поліпептид за даним винаходом має довжину амінокислотної послідовності, яка становить щонайменше 200 амінокислотних залишків, щонайменше 250 амінокислотних залишків, щонайменше 300 амінокислотних залишків або щонайменше 333 амінокислотні залишки. В іншому аспекті протеолітично активний поліпептид за даним винаходом має до 333 амінокислотних залишків, до 350 амінокислотних залишків, до 573 залишків, до 581 амінокислотного залишку, до 592 амінокислотних залишків, до 600 амінокислотних залишків або до 617 амінокислотних залишків. [0017] В іншому аспекті протеолітично активний поліпептид за даним винаходом охоплює поліпептид, який містить додаткові амінокислотні залишки на N- або C-кінці та/або у внутрішньому положенні поліпептидного ланцюга SEQ ID NO: 1 або поліпептидної послідовності, що характеризується щонайменше 50% ідентичністю послідовності з послідовністю SEQ ID NO: 1. Ці додаткові амінокислотні залишки можуть включати в себе до 5, до 10 або навіть до 200, 300 або до 400 послідовних амінокислотних залишків. В одному аспекті функцією додаткових амінокислотних залишків є інгібування протеолітичної активності. В іншому аспекті додаткові амінокислотні залишки можнавидалити за допомогою протеази. В іншому аспекті додаткові залишки, які інгібують протеолітичну активність поліпептиду за даним винаходом, виключені зі складу. Додаткові амінокислотні залишки можуть бути фланкованими одним або декількома сайтами розщеплення протеазою. В іншому аспекті додаткова амінокислотна послідовність функціонує як мітка, що детектується, та/або дозволяє здійснювати зв’язування з твердою основою. [0018] В іншому аспекті поліпептидний ланцюг SEQ ID NO: 1 або поліпептидної послідовності, що характеризується щонайменше 50% ідентичністю послідовності з послідовністю SEQ ID NO: 1, модифікують шляхом заміни одного або декількох амінокислотних залишків. Вираз "заміна", застосовуваний у даному документі, означає заміщення амінокислоти іншою амінокислотою. Наприклад, у поліпептидній послідовності можуть бути заміщеними до 1 амінокислоти, 2 амінокислот, 3 амінокислот, 4 амінокислот, 5 амінокислот, 6 амінокислот, 7 амінокислот, 8 амінокислот, 9 амінокислот, 10 амінокислот, 15 амінокислот, 20 амінокислот або до 50 амінокислот. Заміни можуть включати у себе консервативні або неконсервативні амінокислотні заміни, призначені, наприклад, для посилення або послаблення зв’язування із субстратом або протеолітичної активності поліпептиду за даним винаходом. [0019] В одному аспекті протеолітично активний поліпептид за даним винаходом охоплює поліпептид, здатний гідролізувати субстрат з отриманням двох або більше нативних продуктів розщеплення. В іншому аспекті поліпептид за даним винаходом гідролізує субстрат з отриманням двох або більше продуктів розщеплення, які відрізняються від нативних продуктів розщеплення. Вираз "нативні продукти розщеплення" або "нативні продукти", застосовуваний у даному документі, стосується продуктів, ідентичних за амінокислотними послідовностями порівняно з продуктами, утвореними з того самого субстрату в культурах клітин дикого типу, з яких походить субстрат. В одному аспекті продукт розщеплення являє собою дволанцюговий нейротоксин з ботулінічного нейротоксину або правцевого нейротоксину, в іншому аспекті дволанцюговий нейротоксин являє собою нейротоксин, виділений з C. botulinum серотипу A, B, C1, D, E, F або G. У ще одному аспекті зазначений дволанцюговий нейротоксин являє собою нативний дволанцюговий нейротоксин. [0020] У таблиці 1 показано нативний дволанцюговий нейротоксин-попередник TeNT та BoNT/A-G та ідентифіковано доступну петлю, яка містить амінокислотну послідовність, розщеплювану під дією поліпептиду за даним винаходом. 5 UA 111795 C2 Таблиця 1 Токсин Доступна петля LC HN HCN HCC BoNT/A1 SEQ ID NO: 4 M1-K438 A449-N872 I873-S1092 N1093-L1296 BoNT/A2 SEQ ID NO: 5 M1-K438 A449-N872 I873-S1092 N1093-L1296 BoNT/A3 SEQ ID NO: 6 M1-K434 A445-N868 I869-S1088 N1089-L1292 BoNT/A3 SEQ ID NO: 7 M1-K434 A445-N868 I869-S1088 N1089-L1292 BoNT/A4 SEQ ID NO: 8 M1-K438 A449-N872 I873-S1092 N1093-L1296 BoNT/A5 SEQ ID NO: 9 M1-K438 A449-N872 I873-S1092 N1093-L1296 BoNT/A6 SEQ ID NO: 5 M1-K438 A449-N872 I873-S1093 N1094-L1297 BoNT/A7 SEQ ID NO: 10 M1-K438 A449-N872 I873-S1092 N1093-L1296 BoNT/B1 SEQ ID NO: 11 M1-K441 A442-I860 L861-S1079 Y1080-E1291 BoNT/B2 SEQ ID NO: 12 M1-R441 A442-I860 L861-S1079 Y1080-E1291 BoNT/B3 SEQ ID NO: 12 M1-R441 A442-I860 L861-S1079 Y1080-E1291 BoNT/B4bv SEQ ID NO: 11 M1-K441 A442-I860 L861-S1079 Y1080-E1291 BoNT/B5nP SEQ ID NO: 13 M1-K441 V442-I860 L861-S1079 Y1080-E1291 BoNT/B6 SEQ ID NO: 11 M1-K441 A442-I860 L861-S1079 Y1080-E1291 BoNT/C1 SEQ ID NO: 14 M1-R444 T450-I868 N869-L1092 Q1093-E1291 BoNT/CD SEQ ID NO: 14 M1-R444 T450-I868 N869-Q1083 I1084-E1280 BoNT/D SEQ ID NO: 15 M1-K442 D446-I864 N865-Q1079 I1080-E1276 BoNT/DC SEQ ID NO: 16 M1-R442 D446-I864 N865-L1088 Q1089-E1285 BoNT/E1E5 SEQ ID NO: 17 M1-K419 S424-I847 K848-P1067 N1068-K1252 BoNT/E6 SEQ ID NO: 18 M1-K419 S424-I847 K848-P1067 N1068-K1252 BoNT/F1 SEQ ID NO: 19 M1-R435 A440-I866 K867-P1085 D1086-N1278 BoNT/F2 SEQ ID NO: 20 M1-R435 Q440-I866 K867-P1088 D1089-E1280 BoNT/F3 SEQ ID NO: 20 M1-R435 Q440-I866 K867-P1088 D1089-E1279 BoNT/F4 SEQ ID NO: 21 M1-R435 A440-I866 K867-P1085 D1086-E1277 6 UA 111795 C2 Таблиця 1 Токсин Доступна петля BoNT/F5 SEQ ID NO: 22 M1-K434 BoNT/F6 SEQ ID NO: 19 BoNT/F7 15 20 25 30 35 40 HCC P440-I863 K864-P1085 D1086-E1277 M1-R435 A440-I866 K867-P1088 D1089-E1275 SEQ ID NO: 23 M1-K427 N432-I857 I858-P1076 D1077-E1268 SEQ ID NO: 24 M1-K442 S447-I865 S866-S1086 S1087-E1297 TeNT 10 HCN BoNT/G 5 LC HN SEQ ID NO: 25 M1-R449 T456-K883 S884-L1109 S1110-D1315 [0021] Слід розуміти, що визначення та пояснення виразів, наведені вище та нижче, застосовуються з урахуванням необхідних змін для всіх аспектів, викладених у даному описі, якщо не зазначене інше. [0022] Протеолітично активний поліпептид за даним винаходом є придатним для різних шляхів застосування. Комерційно значущим застосуванням є його застосування в отриманні терапевтичних нейротоксинів, таких як виділені з C. botulinum. На сьогодні культури клітин C. botulinum, застосовувані для отримання комерційно доступних препаратів ботулінічного нейротоксину, забруднюються значними кількостями частково процесованого та/або непроцесованого нейротоксину, обидва з яких негативно впливають на ці фармацевтичні композиції, тобто знижують їх специфічну активність. Застосовуючи протеолітично активний або активований поліпептид за даним винаходом, наприклад, після лізису C. botulinum, тепер буде можливо проводити обробку композицій, які містять непроцесований та/або частково процесований нейротоксин, і, таким чином, перетворювати ці забруднювачі на повністю процесований нейротоксин. Внаслідок цього можна забезпечувати комерційні продукти з підвищеною специфічною активністю нейротоксину, де загальну кількість бактеріального білка можна зменшити, додатково зменшуючи ризик утворення антитіл у пацієнтів. [0023] В іншому аспекті даний винахід стосується молекули нуклеїнової кислоти, яка містить послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид за даним винаходом, та, необов'язково, регуляторні елементи. Вираз "регуляторні елементи", застосовуваний у даному документі, стосується елементів, які регулюють експресію генів, у тому числі транскрипцію та трансляцію, і включають такі елементи, як TATA-бокс, промотор, енхансер, сайт зв'язування рибосоми, послідовність Шайна-Дальгарно, IRES-ділянка, сигнал поліаденілювання, кінцева кеп-структура тощо. Зазначений регуляторний елемент може включати в себе один або декілька гетерологічних регуляторних елементів або один або декілька гомологічних регуляторних елементів. "Гомологічний регуляторний елемент" являє собою регуляторний елемент клітини дикого типу, з якої отримана молекула нуклеїнової кислоти за даним винаходом, який залучено в регуляцію експресії генів молекули нуклеїнової кислоти або поліпептиду в зазначеній клітині дикого типу. Даний винахід також охоплює молекули нуклеїнових кислот, які містять гетерологічні регуляторні елементи. Вираз "гетерологічний регуляторний елемент" означає регуляторний елемент, який не залучено в регуляцію експресії генів молекули нуклеїнової кислоти або поліпептиду в зазначеній клітині дикого типу. Також охоплюються регуляторні елементи для індукованої експресії, такі як індуковані промотори. Молекула нуклеїнової кислоти може, наприклад, являти собою гяРНК, мРНК, РНК, ДНК, PNA, LNA та/або модифіковані молекули нуклеїнових кислот. Молекула нуклеїнової кислоти може бути кільцевою, лінійною, інтегрованою в геном або епісомною. Також охоплюються конкатемери, які кодують білки злиття, що містять три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять або десять поліпептидів за даним винаходом. Більше того, молекула нуклеїнової кислоти може містити послідовності, що кодують сигнальні послідовності для внутрішньоклітинного транспорту, такі як сигнали для транспорту у внутрішньоклітинний компартмент або для транспорту крізь клітинну мембрану. [0024] В іншому аспекті даний винахід стосується вектора, який містить молекулу нуклеїнової кислоти, яка відповідає молекулі нуклеїнової кислоти за даним винаходом. Вектор 7 UA 111795 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 може бути придатним для in vitro та/або in vivo експресії поліпептиду за даним винаходом. Вектор може являти собою вектор для транзієнтної та/або стабільної експресії генів. В одному варіанті здійснення вектор додатково містить регуляторні елементи та/або селективні маркери. Зазначений вектор в одному варіанті здійснення має вірусне походження, в іншому варіанті здійснення має фагове походження, у ще одному варіанті здійснення має бактеріальне походження. [0025] В іншому аспекті даний винахід стосується клітини, яка містить молекулу нуклеїнової кислоти або вектор за даним винаходом. Вираз "клітина", застосовуваний у даному документі, охоплює прокаріотичні та/або еукаріотичні клітини, придатні для експресії зазначеної молекули нуклеїнової кислоти або зазначеного вектора та, зокрема, поліпептиду за даним винаходом. Зазначена клітина може являти собою клітину-хазяїна, яка не експресує поліпептид за даним винаходом або його гомолог. Вираз "гомолог", застосовуваний у даному документі, стосується поліпептиду, який містить поліпептидну послідовність, що характеризується щонайменше 50% ідентичністю послідовності з послідовністю SEQ ID NO: 1. Однак, даний винахід також охоплює клітини, зокрема, клітини дикого типу, які експресують поліпептид за даним винаходом або його гомолог. У конкретному аспекті клітина за даним винаходом вибрана з C. botulinum, C. butyricum, C. baratii та C. tetani. У переважному аспекті клітина являє собою клітину C. botulinum серотипу A, B або F. В іншому аспекті зазначена клітина являє собою клітину C. botulinum штаму Hall (ATCC 3502). В іншому аспекті зазначена клітина являє собою клітину C. botulinum штаму ATCC 19397, також відомого як NCTC 4587 та NCTC 7272, який виробляє BoNT/A. В іншому аспекті зазначена клітина являє собою клітину C. botulinum штаму NCTC 2916, який виробляє BoNT/A. В іншому аспекті зазначена клітина являє собою клітину C. botulinum штамів Kyoto-F та Mauritius/NCTC 9837, які виробляють BoNT/A2. В іншому аспекті зазначена клітина являє собою клітину C. botulinum штаму A254 Loch Maree/NCTC 2012, який виробляє BoNT/A3. В іншому аспекті зазначена клітина являє собою клітину C. botulinum штаму CDC657, який виробляє BoNT/A4 та B. В іншому аспекті зазначена клітина являє собою клітину C. botulinum штаму H04402 065, який виробляє BoNT/A5 та B3'. В іншому аспекті зазначена клітина являє собою клітину C. botulinum штаму Okra/NCTC 7273, який виробляє BoNT/B1. В іншому аспекті зазначена клітина являє собою клітину C. botulinum штаму CDC4013/NCTC 12265, який виробляє BoNT/B та F. В іншому аспекті зазначена клітина являє собою клітину C. botulinum штаму Langeland/NCTC 10281, який виробляє BoNT/F1. В іншому аспекті зазначена клітина являє собою клітину Clostridium sporogenes, Clostridium perfringens, Clostridium acetobutylicum, B. cereus, B. thuringiensis, B. mycoidis, B. thermoproteolyticus, B. anthracis, B. megaterium, B. subtilis, E. coli або клітину дріжджів. В одному аспекті поліпептид за даним винаходом є модифікованим всередині клітини (тобто глікозильованим, фосфорильованим, процесованим під дією протеаз тощо). Модифікація також включає додавання небілкових кофакторів, які включають іони металів. Даний винахід охоплює клітини, які містять протеолітично неактивний поліпептид, описаний вище, будь-який проміжний поліпептидний продукт, а також кінцевий протеолітично активний поліпептид, розкритий у даному документі. Даний винахід також охоплює клітини, які містять індуктор експресії поліпептиду за даним винаходом. Такий індуктор експресії може являти собою молекулу нуклеїнової кислоти, або поліпептид, або хімічну структурну одиницю, в тому числі малу хімічну структурну одиницю, яка має ефект збільшення кількості або активності протеолітично активного поліпептиду за даним винаходом у культурах клітин або їх лізатах. Індуктор експресії може, наприклад, посилювати транскрипцію або трансляцію молекули нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид за даним винаходом. Альтернативно, індуктор експресії може являти собою сполуку, здатну до активації протеолітично неактивного поліпептиду SEQ ID NO:2 або поліпептиду, який містить поліпептидну послідовність, що характеризується щонайменше 50% ідентичністю послідовності з послідовністю SEQ ID NO: 2. В одному аспекті зазначена клітина містить індуктор, який являє собою протеолітично активний поліпептид, здатний до видалення інгібіторних амінокислотних залишків з N-кінця зазначеного поліпептиду. Індуктор може, наприклад, експресуватися рекомбінантним шляхом, що відомо фахівцеві в даній галузі. Альтернативно, індуктор можна виділяти з клітини, наприклад, клітини клостридії. [0026] Даний винахід також стосується застосування молекули нуклеїнової кислоти за даним винаходом для виробництва протеолітично активного поліпептиду за даним винаходом. [0027] У пов'язаному аспекті даний винахід стосується способу виробництва протеолітично активного поліпептиду, який включає етапи (a) хімічного синтезу або трансляції з нуклеотидної послідовності поліпептиду, який містить поліпептидну послідовність, що характеризується щонайменше 50% ідентичністю послідовності з послідовністю SEQ ID NO: 1; та (b) очищення поліпептиду з етапу (a). 8 UA 111795 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [0028] Вираз "хімічний синтез" означає синтез поліпептидів хімічним шляхом. Такі способи розглядаються, наприклад, у Nilsson et al., Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 2005. 34:91-118. Вираз "очищення поліпептиду" означає видалення із суміші, яка містить поліпептид за даним винаходом, сполук, відмінних від зазначеного поліпептиду. Вираз також означає видалення поліпептиду за даним винаходом із суміші, яка містить сполуки, відмінні від зазначеного поліпептиду. У конкретному аспекті вираз означає відділення протеолітично активного поліпептиду від його протеолітично неактивного попередника. [0029] Трансляція нуклеїнової кислоти може відбуватися в клітині або в безклітинній системі. Фахівцеві в даній галузі доступні різні безклітинні системи трансляції. Даний винахід охоплює, наприклад, трансляцію у безклітинній системі трансляції білка, яка включає лізат ретикулоцитів кроля, лізат зародків пшениці, лізат E. coli або інші клітинні лізати, наприклад, лізати, утворені з C. botulinum тощо. Також охоплюється трансляція поліпептиду за даним винаходом з нуклеотидної послідовності за даним винаходом або вектора за даним винаходом. Транскрипцію можна регулювати або контролювати за допомогою одного або декількох гетерологічних регуляторних елементів або за допомогою гомологічних регуляторних елементів. Також цей аспект даного винаходу охоплює трансляцію в клітині дикого типу, тобто в клітині, виділеній з природного джерела, такій як будь-який відомий ізолят C. botulinum, C. butyricum, C. baratii та C. tetani. У конкретному аспекті зазначена клітина являє собою клітину C. botulinum штаму Hall (ATCC 3502). Фахівцеві в даній галузі доступні різні стандартні засоби та способи для введення молекули нуклеїнової кислоти або вектора у клітину та для експресії поліпептиду за даним винаходом як рекомбінантного білка у клітині. Більше того, фахівець у даній галузі знає багато стандартних методик виділення поліпептидів з клітин чи клітинних лізатів або з безклітинних систем експресії (наприклад, описаних у Recombinant DNA Principles and Methodologies, J. Green, Marcel Dekker Inc., 1998; The Condensed Protocols: From Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al, Cold Spring Harbor Laboratory, 2006; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 2000). Будь-який з цих засобів та способів можна застосовувати у способах за даним винаходом. [0030] Перший поліпептид за даним винаходом може транслюватися з молекули нуклеїнової кислоти, що кодує протеолітично активний поліпептид. SEQ ID NO: 26 являє собою приклад такої молекули нуклеїнової кислоти. Альтернативно, зазначена молекула нуклеїнової кислоти може кодувати поліпептид-попередник, який є протеолітично неактивним, але який можна перетворити на протеолітично активний поліпептид за даним винаходом. SEQ ID NO: 27 являє собою приклад такої молекули нуклеїнової кислоти. Протеолітично неактивний попередник також позначують як "неактивна BoNT-гідролаза", скорочено iBH. Цей протеолітично неактивний поліпептид можна, наприклад, активувати під час або після трансляції або шляхом уведення, наприклад, зазначеного протеолітично неактивного поліпептиду в контакт із протеазою, здатною до видалення інактивувальних амінокислотних залишків з N-кінця протеолітично неактивного поліпептиду. Прикладом протеолітично неактивного поліпептиду є поліпептид, представлений у SEQ ID NO: 2. Іншим прикладом є поліпептид, який містить поліпептидну послідовність, що характеризується щонайменше 50% ідентичністю послідовності з послідовністю SEQ ID NO: 2. Вираз "інактивація амінокислотних залишків на N-кінці" в одному аспекті стосується перших 248 амінокислотних залишків зазначеного поліпептиду. В іншому аспекті цей вираз стосується фрагмента, який містить до 10 амінокислотних залишків, 50 амінокислотних залишків, 100 амінокислотних залишків, 150 амінокислотних залишків, 200 амінокислотних залишків, 250 амінокислотних залишків зазначеного поліпептиду. Будь-який з цих поліпептидів є застосовним у способі за даним винаходом для виробництва протеолітично активного поліпептиду. В одному аспекті протеазу, здатну до видалення інактивувальних амінокислотних залишків з N-кінця цього поліпептиду, виділяють, наприклад, з Clostridium botulinum, Clostridium butyricum, Clostridium baratii та Clostridium tetani. В іншому аспекті протеазу, здатну до видалення зазначених інактивувальних амінокислот, забезпечують шляхом отримання фракціонованого або нефракціонованого лізату зазначених клітин. Інактивувальні амінокислотні залишки можна видалити шляхом приведення протеолітично неактивного поліпептиду в контакт із зазначеним лізатом та інкубування до перетворення протеолітично неактивного поліпептиду на протеолітично активний поліпептид. [0031] В іншому аспекті способу за даним винаходом трансляція поліпептиду відбувається в клітині. Клітина може бути прокаріотичною або еукаріотичною клітиною. В одному аспекті клітину вибирають з клітини E. coli, B. subtilis або дріжджів. Даний винахід також охоплює трансляцію поліпептиду за даним винаходом у клітині дикого типу, тобто у клітині, виділеній з природного джерела, такій як будь-який відомий ізолят Clostridium botulinum, Clostridium butyricum, Clostridium baratii та Clostridium tetani. У конкретному аспекті зазначена клітина являє 9 UA 111795 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 собою клітину C. botulinum штаму Hall (ATCC 3502). В іншому конкретному аспекті зазначена клітина являє собою клітину за даним винаходом, описану в даному документі вище. [0032] Продукти трансляції, отримувані за допомогою способу за даним винаходом, можна очищувати в різні способи, всі з яких відомі фахівцеві в даній галузі (наприклад, описані у Recombinant DNA Principles and Methodologies, J. Green, Marcel Dekker Inc., 1998; The Condensed Protocols: From Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al, Cold Spring Harbor Laboratory, 2006; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 2000). Типові способи очищення поліпептиду за даним винаходом можуть включати центрифугування клітинного лізату, осадження білків сульфатом амонію, ресуспендування білків, центрифугування ресуспендованих білків, іонообмінну хроматографію, ексклюзійну хроматографію, хроматографію гідрофобних взаємодій тощо. Деякі комбінації таких етапів у іншому порядку можуть бути застосовними для очищення поліпептиду за даним винаходом. Переважний спосіб очищення поліпептиду за даним винаходом описано у прикладах, які ілюструють даний винахід. [0033] В одному аспекті етап очищення включає зв’язування поліпептиду за даним винаходом з твердою основою. Вираз "тверда основа" стосується матриці, яка включає, наприклад, діоксид кремнію, зшитий декстран, зшитий поліакриламід або зшиту агарозу тощо. Також включено, зокрема, поліпептиди, скло, полістирол, поліпропілен, поліетилен, поліетиленгліколь (PEG), декстран, нейлон, амілази, природні та модифіковані форми целюлози, поліакриламіди, форми габро та магнетит. Тверда основа в одному з аспектів даного винаходу являє собою полісахаридну матрицю, вибрану з групи, яка включає сефарозу, сефадекс, агарозу, сефацель, мікроцелюлозу та гранули альгінату. В іншому аспекті зазначена тверда основа може включати скляне намисто та/або поліпептидні матриці. [0034] В одному аспекті тверда основа з'єднана з антитілом за даним винаходом. Вираз "з'єднаний" означає в одному аспекті стабільно з'єднаний або стабільно асоційований. В іншому аспекті "з'єднаний" включає такі види взаємодії, як непрямі або прямі, необоротні або оборотні, фізичні та хімічні, електростатичні та/або ковалентні зв’язки. В одному з аспектів антитіло з'єднане ковалентним зв'язком, безпосередньо або за допомогою лінкерної молекули, з твердою основою. Антитіло може бути зв’язаним із зазначеною твердою основою за допомогою лінкера, у тому числі низькомолекулярних сполук та пептидних (або поліпептидних) лінкерних молекул. Тверда основа може по суті мати будь-яку можливу структурну конфігурацію або просторове розташування, якщо тільки іммобілізоване антитіло здатне до зв'язування з його антигеном. Таким чином, матриця або тверда основа може бути сферичною, як у випадку гранули, або циліндричною, як у випадку внутрішньої поверхні тестової пробірки або зовнішньої поверхні стрижня. Альтернативно, поверхня може мати неправильну форму або бути пласкою, такою як аркуш або тест-смужка. [0035] Зазначене антитіло, з'єднане з твердою основою, можна застосовувати, наприклад, у способі виробництва за даним винаходом або у способі діагностики. В одному аспекті зазначений спосіб виробництва може включати етап афінної хроматографії, де зазначена афінна хроматографія базується на антитілі, з'єднаному з твердою основою. В одному варіанті здійснення зазначене антитіло являє собою антитіло, яке специфічно зв'язується з протеолітично активним поліпептидом за даним винаходом. В іншому варіанті здійснення зазначене антитіло являє собою антитіло, яке специфічно зв'язується з протеолітично неактивним поліпептидом за даним винаходом. [0036] В іншому аспекті спосіб виробництва протеолітично активного поліпептиду за даним винаходом включає очищення поліпептиду за даним винаходом із суміші, яка містить додаткові компоненти. Очищення може базуватися, наприклад, на полярності, електричному заряді та розмірі. Таким чином, спосіб може в одному аспекті включати один або декілька етапів розділення, вибраних з групи, яка включає ВЕРХ з нормальними фазами, обернено-фазову ВЕРХ, хроматографію гідрофільних взаємодій (HILIC), хроматографію гідрофобних взаємодій (HIC), іонообмінну хроматографію (IEC), у тому числі аніонообмінну хроматографію та катіонообмінну хроматографію, ексклюзійну хроматографію (SEC), гель-проникну хроматографію (GPC). [0037] В іншому аспекті зазначене очищення включає етапи: (a) розділення за допомогою аніонообмінної хроматографії; (b) розділення за допомогою ексклюзійної хроматографії; (c) розділення за допомогою хроматографії гідрофобних взаємодій та (d) розділення за допомогою ексклюзійної хроматографії. [0038] Одну або декілька фракцій, зібраних з хроматографічної колонки, можна концентрувати, наприклад, шляхом осадження або ультрафільтрації. 10 UA 111795 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [0039] В одному аспекті даний винахід стосується композиції, яка містить протеолітично активний поліпептид за даним винаходом. Застосовуючи спосіб, розкритий у даному документі, можливо здійснювати виробництво протеолітично активного поліпептиду за даним винаходом, який практично не включає в себе протеолітично неактивний поліпептид. Іншими словами, спосіб за даним винаходом забезпечує протеолітично активний поліпептид та композицію, яка не має значного забруднення неактивним білком-попередником поліпептиду за даним винаходом. Вважається, що композиція не має значного забруднення протеолітично неактивним поліпептидом-попередником або практично не містить останній, якщо, застосовуючи спосіб виявлення на основі вестерн-блоту, можна виявити менше 5% протеолітично неактивного попередника, де зазначені 5% стосуються кількості протеолітично неактивного попередника відносно суми кількостей протеолітично активного та неактивного поліпептиду. В іншому аспекті зазначена композиція є практично чистою та містить щонайменше 50% протеолітично активного поліпептиду за даним винаходом, де зазначені 50% стосуються кількості протеолітично активного попередника відносно загальної кількості білка, що міститься у композиції. В іншому аспекті зазначена практично чиста композиція містить щонайменше 75%, 80%, 90% або щонайменше 98% протеолітично активного поліпептиду. [0040] В іншому аспекті даний винахід також стосується поліпептиду, отримуваного у способі виробництва протеолітично активного поліпептиду, як описано в даному документі вище та як проілюстровано в прикладах. Зазначений протеолітично активний поліпептид в одному аспекті являє собою протеолітично активний поліпептид з поліпептидною послідовністю SEQ ID NO: 1. В іншому аспекті протеолітично активний поліпептид являє собою поліпептид, який характеризується щонайменше 50% ідентичністю послідовності з послідовністю SEQ ID NO: 1. У ще одному аспекті протеолітично активний поліпептид являє собою поліпептид, який містить поліпептидну послідовність, що характеризується щонайменше 50% ідентичністю послідовності з послідовністю SEQ ID NO: 1. Вираз "отримуваний поліпептид", застосовуваний у даному документі, в одному аспекті стосується поліпептиду, який транслюється з нуклеїнової кислоти за даним винаходом. Поліпептид можна згодом піддавати посттрансляційній модифікації, такій як ацилювання, алкілування, амідування, додавання амінокислот, делеція амінокислот, глікозилювання, окиснення, S-глутатіонілювання, фосфорилювання, сульфатування, протеолітичний процесинг тощо. Більше того, поліпептид може зв’язуватися з іоном металу, + + + + + 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ таким як Li , Na , K , Ag , Cs , Mg , Ca , Co , Ni , Mn , Cu або Zn . Переважно, зазначений 2+ 2+ 2+ іон металу являє собою Zn , Mn або Co . [0041] Даний винахід в одному аспекті також стосується антитіла, яке специфічно зв'язується з поліпептидом за даним винаходом. Вираз "антитіло", застосовуваний у даному документі, охоплює моноклональне антитіло, поліклональне антитіло, одноланцюгове антитіло, людське, гуманізоване, приматизоване або химеризоване антитіло, біспецифічне антитіло, синтетичне антитіло, хімічно або ферментативно модифіковані похідні, фрагмент будь-якого із зазначених антитіл або аптамери, які містять такі, що зустрічаються в природі, та/або хімічно модифіковані нуклеїнові кислоти. Фрагменти зазначених антитіл включають F(ab')2-, F(ab)-, Fvчи scFv-фрагменти або хімічно, або ферментативно модифіковані похідні будь-якого з цих фрагментів. [0042] В одному аспекті антитіло за даним винаходом буде специфічно зв’язуватися з протеолітично активним поліпептидом за даним винаходом або його протеолітично неактивним попередником. В одному аспекті антитіло, специфічне щодо протеолітично активного поліпептиду за даним винаходом, перехресно реагує з протеолітично неактивним поліпептидом, описаним у даному документі. В іншому аспекті антитіло здатне відрізняти протеолітично активний поліпептид за даним винаходом від його неактивного попередника. В іншому аспекті епітоп, щодо якого зазначене антитіло є специфічним, розташований в амінокислотній ділянці, присутній у протеолітично неактивному поліпептиді, але не у протеолітично активному поліпептиді. Наприклад, зазначений епітоп може являти собою епітоп у ділянці поліпептиду, яка містить амінокислотні залишки 1-248 поліпептиду, який містить поліпептидну послідовність, що характеризується щонайменше 50% ідентичністю послідовності з послідовністю SEQ ID NO: 2. [0043] В іншому аспекті епітоп утворений амінокислотними залишками, розташованими в Nкінцевій частині відносно амінокислоти 249 поліпептиду, який містить поліпептидну послідовність, що характеризується щонайменше 50% ідентичністю послідовності з послідовністю SEQ ID NO: 2. В іншому аспекті зазначений епітоп видалено з протеолітично неактивного поліпептиду, описаного в даному документі, шляхом протеолітичного процесингу. [0044] В іншому аспекті епітоп, щодо якого антитіло за даним винаходом є специфічним, являє собою епітоп, розташований на N-кінці поліпептиду, який містить поліпептидну послідовність, що характеризується щонайменше 50% ідентичністю послідовності з 11 UA 111795 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 послідовністю SEQ ID NO: 1. Вираз "N-кінець", застосовуваний у цьому аспекті даного винаходу, стосується ділянки поліпептиду, яка містить 50 N-кінцевих амінокислотних залишків зазначеної поліпептидної послідовності, переважно 25 N-кінцевих амінокислотних залишків зазначеної поліпептидної послідовності. У конкретному аспекті вираз стосується 14 N-кінцевих амінокислотних залишків. Вираз "епітоп", застосовуваний у даному документі, стосується антигенної детермінанти, яку розпізнає антитіло за даним винаходом. В одному аспекті епітоп являє собою лінійний епітоп, в іншому аспекті епітоп являє собою конформаційний епітоп. У конкретному аспекті антигенна детермінанта містить пептид, який має амінокислотну послідовність N-кінця протеолітично активного поліпептиду за даним винаходом, де зазначений пептид може мати довжину амінокислотної послідовності, що становить від 7 до 14, переважно 8, 9, 10, 11, 12, 13 або 14 амінокислотних залишків. [0045] Вирази "специфічно зв'язується" або "специфічне зв’язування з" в одному аспекті означають, що антитіло за даним винаходом значною мірою не реагує перехресно з іншими епітопами у поліпептиді за даним винаходом або в інших поліпептидах в цілому. Епітопна специфічність є важливою характеристикою антитіла за даним винаходом. Специфічність антитіла щодо протеолітично активного поліпептиду порівняно з протеолітично неактивним в одному з аспектів буде становити щонайменше 95%, щонайменше 96%, щонайменше 97%, щонайменше 98%, щонайменше 99%. Специфічне зв'язування можна тестувати за допомогою різних добре відомих методик, у тому числі, наприклад, конкурентних досліджень. Іншою важливою характеристикою є чутливість антитіла. Чутливість в одному аспекті за даним винаходом може бути такою, що зв'язується щонайменше 70%, щонайменше 80%, щонайменше 90%, щонайменше 95% епітопу, який міститься у зразку. Чутливість можна тестувати за допомогою добре відомих методик. Фахівці в даній галузі будуть у змозі визначити експлуатаційні та оптимальні умови аналізу для кожного визначення, вдаючись до звичайного проведення експериментів. Традиційні методики досліджень зв'язування включають радіоімунологічний аналіз, ELISA, рівноважний діаліз, ізотермічну мікрокалориметрію, аналізи BIACORE® (на основі поверхневого плазмонного резонансу, SPR) або інші способи на основі поверхневої адсорбції. У системі BIACORE® на основі SPR вимірюють взаємодію антитілоантиген. SPR-відповідь відображає зміну масової концентрації на поверхні детектора в міру зв'язування або дисоціації аналітів. Під час вимірювань у BIACORE® у режимі реального часу на основі SPR відстежують взаємодії безпосередньо з їх появою, див. BIAapplications Handbook, версія AB (перевидання 1998 р.), № коду BIACORE® BR-1001-86; BIAtechnology Handbook, версія AB (перевидання 1998 р.), № коду BIACORE® BR-1001-84. Властивості зв'язування, такі як чутливість антитіла за даним винаходом, можна в цілому визначити за допомогою досліджень зв'язування із застосуванням іммобілізованого антигену (ліганду), присутнього на сенсорній поверхні. Антитіло, яке підлягає тестуванню (аналіт), буде представлене у рухомій фазі, тобто у розчині. У деяких випадках антиген непрямо прикріплюють до поверхні шляхом зв'язування з іншою іммобілізованою молекулою, яка має назву молекули захоплення. Якщо антитіло вводять шляхом поширення дискретного імпульсу поверхнею з іммобілізованими антигенами, це можна фактично підрозділити на три наступні фази: (i) асоціація антитіла з антигеном під час уведення зразка; (ii) рівноважний або стаціонарний стан під час уведення зразка, де швидкість зв'язування антитіла врівноважується дисоціацією з комплексу антитілоантиген; (iii) дисоціація антитіла з поверхні з потоком буфера. Буде зрозуміло, що такий аналіз можна альтернативно проводити з іммобілізованими антитілами, які належить досліджувати, та розчином, який містить антиген, як рухомою фазою. Фази асоціації та дисоціації забезпечують інформацію щодо кінетики взаємодії аналіт-ліганд (ka та kd, швидкості утворення та дисоціації комплексу, kd/ka=KD). Рівноважна фаза забезпечує інформацію про афінність взаємодії аналітліганд (KD). В одному з аспектів даного винаходу антитіло за даним винаходом має K D менше 0,5 мкМ, в іншому аспекті менше 0,05 мкМ та в іншому аспекті менше 0,02 мкМ. [0046] Антитіло, згадуване в даному винаході, можна виробляти шляхом застосування способів, описаних, наприклад, у Harlow and Lane, 1988 (Harlow and Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988). Моноклональні антитіла можна отримати за допомогою методик, вперше описаних у Kohler & Milstein, 1975 (Kohler & Milstein 1975, Nature 256: 495) та Galfre & Milstein, 1981 (Galfre & Milstein 1981, Meth Enzymol 73: 3). Зазначені методики включають злиття мієломних клітин мишей з клітинами селезінки, отриманими від імунізованих ссавців. Антитіла можна додатково поліпшити за допомогою методик, добре відомих в даній галузі. Наприклад, поверхневий плазмонний резонанс, використовуваний у системі BIACORE®, можна застосовувати для підвищення ефективності фагових антитіл, які зв’язуються зі згаданим вище епітопом у поліпептиді за даним винаходом 12 UA 111795 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (див. Schier et al., 1996, Human Antibodies Hybridomas 7: 97; Malmborg et al., 1995, J. Immunol Methods 183: 7). [0047] В одному з аспектів даного винаходу антитіло отримують шляхом застосування пептиду, який містить згаданий вище епітоп або складається з нього. Пептид можна отримувати, наприклад, синтетично або шляхом рекомбінантної експресії. Альтернативно, антитіло за даним винаходом можна отримати шляхом застосування протеолітично активного або неактивного поліпептиду за даним винаходом, який зустрічається у природі. В останньому випадку слід розуміти, що отримувані в результаті антитіла слід додатково тестувати стосовно специфічності щодо поліпептиду за даним винаходом. У додатковому аспекті даного винаходу моноклональне антитіло за даним винаходом отримують шляхом застосування поліпептиду за даним винаходом, який можна обробляти детергентом, щоб зробити епітоп імунологічно доступним. Однак, буде зрозуміло, що у випадку, якщо антитіло слід спрямовувати проти конформаційного епітопу, не слід проводити таку обробку детергентом. У додатковому аспекті в такому способі також можна застосовувати імуностимулятори, такі як гемоціанін лімфи равлика (KLH), особливо у разі застосування синтетичного пептиду. [0048] Антитіло за даним винаходом можна застосовувати, наприклад, для афінної хроматографії, імунопреципітації та імунолокалізації поліпептиду за даним винаходом, а також для відстежування наявності зазначеного поліпептиду в зразках або в рекомбінантних організмах. Більше того, антитіло за даним винаходом можна застосовувати у способі виявлення або у способі діагностики. У конкретному аспекті антитіло за даним винаходом застосовують у вестерн-блотингу або ELISA. На додаток, антитіло за даним винаходом можна застосовувати у шляхах терапевтичного застосування. Зокрема, антитіло можна застосовувати для інгібування активності протеолітично активного поліпептиду за даним винаходом. Таким чином, антитіло за даним винаходом також має різні шляхи терапевтичного застосування, описані в даному документі нижче. [0049] Даний винахід також стосується застосування протеолітично активного поліпептиду за даним винаходом у способі протеолітичного процесингу поліпептиду. В одному аспекті даний винахід стосується способу виробництва поліпептиду, підданого протеолітичному процесингу, який включає етап приведення в контакт (a) першого поліпептиду, при цьому зазначений перший поліпептид являє собою поліпептид за даним винаходом, та (b) другого поліпептиду, при цьому зазначений другий поліпептид є сприйнятливим до протеолізу під дією зазначеного першого поліпептиду, де зазначене приведення в контакт зумовлює протеолітичний процесинг зазначеного другого поліпептиду з отриманням щонайменше двох продуктів розщеплення. [0050] Даний винахід також стосується застосування Lys-N, та/або Lys-C, та/або аргінілендопептидази (ендопротеїнази Arg-C, LeR) з Lysobacter enzymogenes (ATCC 29487) (Wright DS, Graham LD, Jennings PA. Biochim Biophys Acta. 1998 Dec 22;1443(3):369-74). Більше того, також охоплено застосування плазміну та/або омптину (OmpT), мембранозв'язаної серинової протеази, яка здійснює розщеплення в мотивах (Arg/Lys)-(Arg/Lys) (K. Sugimura and T. Nishihara. J. Bacteriol. 170 (1988), pp. 5625–5632), у способі протеолітичного процесингу CNT, такого як BoNT/A. В одному аспекті даний винахід стосується способу виробництва поліпептиду, підданого протеолітичному процесингу, який включає етап приведення в контакт (a) першого поліпептиду, при цьому зазначений перший поліпептид являє собою Lys-C або Lys-N, та (b) другого поліпептиду, при цьому зазначений другий поліпептид є сприйнятливим до протеолізу під дією зазначеного першого поліпептиду, де зазначене приведення в контакт зумовлює протеолітичний процесинг зазначеного другого поліпептиду з отриманням щонайменше двох продуктів розщеплення, і де другий поліпептид являє собою одноланцюговий BoNT/A. Вираз "Lys-C" стосується серинової ендопротеїназиLys-C розміром 33 кДа з Lysobacter enzymogenes (лізилендопептидази, LeK, № доступу в GenBank Q7M135), яка специфічно розщеплює пептидні зв'язки в C-кінцевій частині відносно лізину, або її гомолога, який характеризується щонайменше 60% ідентичністю послідовності. Вираз "Lys-N" стосується металоендопептидази Lys-N, виділеної з Grifola frondosa та Pleurotus ostreatus (Nonaka T et al., 1997, J Biol Chem. 272:30032-30039; Nonaka T et al., 1998, J Biochem. 1998 124:157-162; Hori T et al., 2001, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 57:361-368). Вираз також охоплює гомологи зазначеної протеази, які характеризуються щонайменше 60% ідентичністю послідовності. [0051] Цей спосіб можна застосовувати, наприклад, для виробництва нейротоксину (CNT) або ботулінічного нейротоксину (BoNT), підданих протеолітичному процесингу. Вираз "BoNT", застосовуваний у всьому даному винаході, означає ботулінічний нейротоксин та стосується нейротоксину, отримуваного з C. botulinum, такого як BoNT серотипу A, B, C1, D, E, F або G. Вирази "CNT" та "BoNT" також охоплюють рекомбінантний та модифікований нейротоксин, який містить одну або декілька модифікацій, у тому числі хімічну модифікацію або генетичну 13 UA 111795 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 модифікацію. Вираз "генетична модифікація" означає делецію, заміну або додавання одного або декількох амінокислотних залишків. Застосовуючи спосіб за даним винаходом, тепер можливо отримувати композиції нейротоксинів із значно меншим забрудненням непроцесованим або частково процесованим нейротоксином, оскільки такі забруднювачі ефективно процесуються у дволанцюговий нейротоксин. В одному аспекті дволанцюговий нейротоксин являє собою нативний дволанцюговий нейротоксин, де C-кінець легкого ланцюга та N-кінець важкого ланцюга є ідентичними відповідному повністю процесованому дволанцюговому нейротоксину, виділеному з клостридій дикого типу. [0052] Вираз "приведення в контакт", застосовуваний у даному документі, стосується розміщення щонайменше двох різних сполук у фізичній близькості для того, щоб забезпечити фізичну та/або хімічну взаємодію зазначених сполук. Відповідно до способу за даним винаходом зазначені дві різні сполуки в одному з аспектів являють собою перший та другий поліпептиди, які містяться у розчині. Приведення в контакт проводиться за таких умов та протягом такого часу, що є достатніми для забезпечення взаємодії першого та другого поліпептидів. Вираз "поліпептид, підданий протеолітичному процесингу", застосовуваний у даному документі, в одному аспекті стосується поліпептиду, один або декілька пептидних зв'язків у поліпептидному ланцюзі якого були гідролізовані або розщеплені. В іншому аспекті вираз стосується поліпептиду, який був підданий протеолітичному розщепленню під дією ендопротеїнази або ендопептидази. В іншому аспекті вираз стосується поліпептиду, який був розщеплений до ступеня в щонайменше 50%. В іншому аспекті зазначений поліпептид, підданий протеолітичному процесингу, являє собою другий поліпептид. В іншому аспекті щонайменше 60%, 70%, 80%, 90% або 95% піддані протеолітичному процесингу. [0053] Вираз "перший поліпептид", застосовуваний у даному документі, стосується поліпептиду за даним винаходом, тобто протеолітично активного або активованого поліпептиду, також позначуваного як "активна BoNT-гідролаза". Оскільки активну BoNT-гідролазу можна отримати з надосадової рідини C. botulinum, її спочатку назвали нативною BoNT-гідролазою, скорочено "nBH". Однак, вирази "перший поліпептид" та "nBH" також стосуються BoNT-гідролаз, отримуваних з інших джерел. Вираз "другий поліпептид", застосовуваний у даному документі, стосується субстрату для зазначеного першого поліпептиду. Вираз "сприйнятливий до протеолізу" стосується ознаки або вимоги до другого поліпептиду та застосовується в даному документі, означаючи, що другий поліпептид є протеолітично розщеплюваним під дією зазначеного першого поліпептиду. Іншими словами, вираз "сприйнятливий до протеолізу" означає, що другий поліпептид містить сайт розпізнавання та розщеплення протеазою, який дозволяє йому функціонувати як субстрат для першого поліпептиду. "Другий поліпептид" являє собою субстрат для першого поліпептиду та піддається протеолітичному процесингу з отриманням двох або більше продуктів розщеплення. Застосовуючи аналіз, описаний у даному документі вище, фахівець у даній галузі може визначити, чи є даний поліпептид субстратом для першого поліпептиду і, таким чином, "другим поліпептидом" згідно з визначенням у даному винаході. Вираз "щонайменше два продукти розщеплення" включає, наприклад, до двох, трьох, чотирьох, п’яти та до шести продуктів розщеплення. [0054] Цей спосіб можна застосовувати, наприклад, для отримання фармацевтичної композиції, яка містить клостридіальний нейротоксин, або для утворення фрагментів поліпептидів, застосовуваних у способі мас-спектрометрії. Перший поліпептид та другий поліпептид можна приводити в контакт на різних етапах способу виробництва поліпептиду, підданого протеолітичному процесингу. В одному аспекті етап приведення першого поліпептиду в контакт з другим поліпептидом відбувається в клітині. У конкретному аспекті цього варіанту здійснення перший та другий поліпептиди експресуються у зазначеній клітині. [0055] В іншому аспекті зазначений етап приведення в контакт відбувається в клітинному лізаті або в очищеному клітинному лізаті. Цей аспект охоплює додавання першого поліпептиду до лізату або очищеного лізату. Перший поліпептид можна додавати на різних етапах у ході очищення другого поліпептиду з клітинного лізату. Наприклад, перший поліпептид можна додавати до або після: осадження білка, іонообмінної хроматографії, хроматографії гідрофобних взаємодій та/або ексклюзійної хроматографії. Більше того, також охоплюється додавання першого поліпептиду у фармацевтичну композицію. У цьому аспекті поліпептид за даним винаходом застосовують, наприклад, для протеолітичного розщеплення другого поліпептиду, наприклад, для активації другого поліпептиду, який являє собою терапевтичний засіб, що міститься у фармацевтичній композиції. Також передбачається введення першого поліпептиду суб'єктові з метою протеолітичного процесингу другого поліпептиду в суб'єкта. Введення також включає спільне введення першого та другого поліпептидів. Цей спосіб також включає етап інкубування за таких умов та протягом такого часу, що є достатніми для 14 UA 111795 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 розщеплення другого поліпептиду. В одному аспекті умови можуть включати додавання буфера, вибраного з групи, яка включає 100 мМ Tris-HCl, pH 8,0, або PBS (50 мМ Na2HPO4, 150 мМ NaCl, pH 7,4). Переважні умови в буфері включають 100 мМ Tris-HCl, pH 8,0. "Час, достатній для розщеплення" можна визначити із застосуванням аналізу, описаного в даному документі вище. В одному аспекті зазначений "час, достатній для розщеплення" залежить від ступеня розщеплення, який повинні мати поліпептид, підданий протеолітичному процесингу, або композиція, яка його містить. В одному аспекті спосіб включає етап інкубування першого та другого поліпептидів протягом щонайменше 30 хв., 60 хв., 120 хв. або щонайменше 240 хв. В іншому аспекті перший та другий поліпептиди інкубують протягом до 30 хв., 60 хв., 120 хв., 240 хв., 480 хв. або до 600 хв. В іншому аспекті спосіб включає етап інкубування першого та другого поліпептидів при 4°C або при 37°C. В іншому аспекті спосіб включає етап інкубування протягом до 1 год., до 2 год., 4 год., 6 год., 10 год. або до 16 год. [0056] В одному аспекті поліпептидний ланцюг зазначеного другого поліпептиду містить послідовність, вибрану з будь-якої з SEQ ID NO: 4-25. У конкретнішому аспекті поліпептидний ланцюг зазначеного другого поліпептиду містить послідовність, вибрану з будь-якої з SEQ ID NO: 4-25, і при цьому другий поліпептид розщеплюється у C-кінцевій частині відносно основного амінокислотного залишку в зазначеній послідовності з будь-якої з SEQ ID NO: 4-25. Зазначені послідовності представляють амінокислотні послідовності відомих субстратів для протеолітично активного поліпептиду за даним винаходом. Як показано в даному документі, зазначені субстрати розщеплюються в C-кінцевій частині відносно основного амінокислотного залишку, який міститься в послідовності, порівн. стовпчики LC та HN у таблиці 1.У переважному аспекті зазначений другий поліпептид містить послідовність, вибрану з SEQ ID NO: 4-10. В іншому переважному аспекті зазначений другий поліпептид являє собою BoNT/A або його похідну, у тому числі, наприклад, поліпептид SEQ ID NO: 3 та його похідні. Вираз "похідна", застосовуваний стосовно цього та інших аспектів даного винаходу, включає амінокислотні мутації, такі як додавання, заміна, делеція або усічення одного або декількох амінокислотних залишків. [0057] В одному аспекті другий поліпептид містить похідну будь-якої з SEQ ID NO: 4-25 або SEQ ID NO: 3, де зазначена похідна містить одну або декілька точкових мутацій та/або один або декілька додаткових амінокислотних залишків. В іншому аспекті зазначена похідна має до 1, до 2, до 3, до 4, до 5, до 6, до 7, до 8, до 9, до 10, до 15 точкових мутацій. Застосовуючи аналіз активності для визначення протеазної активності, як описано в даному документі, фахівець у даній галузі може визначити, чи є дана похідна процесованою під дією протеолітично активного поліпептиду за даним винаходом. В іншому аспекті похідна має точкову мутацію, яка міняє основний амінокислотний залишок на неосновний амінокислотний залишок. В іншому аспекті похідна характеризується щонайменше 50% ідентичністю послідовності з будь-якою з SEQ ID NO: 4-25. В іншому аспекті зазначена похідна або поліпептид, який містить похідну, являють собою субстрат для першого поліпептиду та є протеолітично розщеплюваними під дією першого поліпептиду. Типовим прикладом є похідна SEQ ID NO: 3, яка містить, наприклад, одну або декілька точкових мутацій у легкому або важкому ланцюзі. [0058] В іншому аспекті зазначений другий поліпептид містить (a) поліпептидну послідовність, що характеризується щонайменше 30% ідентичністю послідовності з послідовністю SEQ ID NO: 3 [(BoNT/A з ATCC 3502, № доступу в GenBank AAA23262)]; або (b) поліпептидну послідовність, вибрану з групи, яка включає правцевий нейротоксин, білок системи згортання крові фактор X або протромбін (фактор II), травні ферменти підшлункової залози, такі як трипсин, хімотрипсин, пепсин, папаїн. Щонайменше 30% означає щонайменше 30%, щонайменше 40%, щонайменше 50%, щонайменше 85%. У конкретному аспекті ідентичність послідовності зазначеної другої поліпептидної послідовності, що характеризується щонайменше 50% ідентичністю послідовності з послідовністю SEQ ID NO: 3, визначають на основі положень амінокислот 420-466 SEQ ID NO: 3, в іншому аспекті зазначену ідентичність послідовності визначають на основі будь-якої з SEQ ID NO: 4-25. Іншими словами, зазначений аспект стосується другого поліпептиду, який містить поліпептидну послідовність, що характеризується, наприклад, щонайменше 30% ідентичністю послідовності з поліпептидною послідовністю, розташованою між положеннями амінокислот 420 та 466 SEQ ID NO: 3, або щонайменше 30% ідентичністю послідовності з поліпептидною послідовністю з будь-якої з SEQ ID NO: 4-25. Поліпептид згідно з цим визначенням є, наприклад, отримуваним з C. botulinum, C. tetani або C. sporogenes. Зазначений другий поліпептид може бути, наприклад, нейротоксином, що зустрічається у природі, таким як BoNT/A, B, C1, D, E, F або G, або його похідною, яка містить одну або декілька амінокислотних мутацій, таких як додавання, заміна, делеція або усічення одного або декількох амінокислотних залишків. Охоплено, наприклад, похідні, в яких 15 UA 111795 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 відсутні, наприклад, нативний домен HC нейротоксину або його частини, або похідні з іншими амінокислотними залишками, які заміщають домен HC нейротоксину, а також похідні з додатковим легким ланцюгом або іншою білковою молекулою-карго, злитою з N-кінцем легкого ланцюга BoNT. [0059] В іншому аспекті другий поліпептид може містити додаткові амінокислотні залишки на N- або C-кінці або у внутрішньому положенні. Додаткові амінокислотні залишки можуть бути фланкованими одним або декількома сайтами розщеплення протеазою. В іншому аспекті додаткова амінокислотна послідовність функціонує як мітка, що детектується, та/або дозволяє здійснювати зв’язування з твердою основою. Прикладом є His-мітка або GST-мітка. Іншим прикладом є амінокислотна послідовність VPPTPGSAWSHPQFEK, яка містить Strep-мітку, переважно додану до C-кінця. [0060] У конкретному аспекті зазначений другий поліпептид являє собою поліпептид, який містить поліпептидну послідовність, наведену у GenBank під №№ CBZ04958.1, YP_002805603.1, ZP_02994746.1, YP_001788403.1, YP_001782718.1, ZP_02616437.1, ZP_02614241.1, YP_001392361.1, YP_001255575.1, або її гомолог, що характеризується щонайменше 50% ідентичністю послідовності. [0061] В іншому аспекті біологічну активність зазначеного другого поліпептиду модулюють шляхом протеолітичного розщеплення. Фахівцеві в даній галузі добре відомо, що функцію багатьох поліпептидів можна модулювати шляхом протеолітичного процесингу. Вираз "модульований", застосовуваний у даному документі, означає підвищений або знижений, активований або інактивований. Наприклад, біологічна активність багатьох клостридіальних нейротоксинів підвищується або викликається шляхом протеолітичного процесингу одноланцюгового нейротоксину з отриманням дволанцюгового нейротоксину, де дволанцюговий нейротоксин містить легкий та важкий поліпептидні ланцюги, з’єднані ковалентним зв’язком за допомогою дисульфідного містка. Біологічна активність нейротоксину охоплює щонайменше три окремі види активності: першим видом активності є "протеолітична активність", властива легкому ланцюгу нейротоксину та відповідальна за гідроліз пептидного зв'язку в одному або декількох поліпептидах, залучених у регуляцію злиття з клітинною мембраною. Другим видом активності є "транслокаційна активність", властива N-кінцю важкого ланцюга процесованого нейротоксину та залучена в транспорт легкого ланцюга крізь мембрану лізосоми та в цитоплазму. Третім видом активності є "рецептор-зв'язувальна активність", властива C-кінцю важкого ланцюга процесованого нейротоксину та залучена у зв'язування та поглинання нейротоксину цільовою клітиною. У переважному аспекті вираз "біологічна активність", застосовуваний у даному документі, означає протеолітичну активність. У переважнішому аспекті вираз означає підвищену протеолітичну активність. [0062] Біологічну активність клостридіального нейротоксину можна вимірювати за допомогою різних тестів, всі з яких відомі фахівцеві в даній галузі. Ці тести дозволяють здійснювати визначення одного або декількох видів активності, згаданих вище. Наприклад, аналіз LD50 мишей або ex vivo аналіз діафрагмального нерву та куполу діафрагми мишей (MPN), описаний Pearce та співавт. у 1994 р. (Pearce LB, Borodic GE, First ER, MacCallum RD (1994), Toxicol Appl Pharmacol 128: 69-77) та Habermann та співавт. у 1980 р.(Habermann E, Dreyer F, Bigalke H. (1980), Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 311:33-40) дозволяють здійснювати визначення токсичного ефекту даного препарату нейротоксину стосовно живого організму або виділеного нервово-м'язового препарату. Для встановлення токсичного ефекту в аналізі LD50 нейротоксин має бути біологічно активним за кожним із зазначених трьох видів активності, згаданих вище. Більше того, доступними є різні інші аналізи, які дозволяють, наприклад, визначати, чи є нейротоксин або легкий ланцюг нейротоксину протеолітично активним. Такі аналізи базуються, наприклад, на приведенні BoNT/A в контакт із SNAP-25. Альтернативно, можна застосовувати пептид, який представляє сайт розщеплення для SNAP25, де пептид може бути міченим задля легкості виявлення. У переважному аспекті біологічну активність визначають шляхом застосування аналізу MPN, описаного в даному документі вище. [0063] В іншому аспекті зазначений перший поліпептид активується шляхом протеолітичного процесингу неактивного поліпептиду-попередника, при цьому зазначений неактивний поліпептид-попередник містить поліпептидну послідовність, що характеризується щонайменше 60% ідентичністю послідовності з послідовністю SEQ ID NO: 2. Цей аспект базується на спостереженні, що поліпептид, який має поліпептидну послідовність SEQ ID NO: 2, є протеолітично неактивним, тоді як його варіанти з N-кінцевим усіченням є протеолітично активними. Даний винахід також передбачає застосування протеолітично неактивного поліпептиду у способах, описаних у даному документі. Протеолітично неактивний поліпептид, описаний у даному документі, можна активувати, наприклад, шляхом видалення фрагмента з N 16 UA 111795 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кінця або всього N-кінця, що містить амінокислотні залишки 1-248 SEQ ID NO: 2. В одному аспекті N-кінець видаляють за допомогою протеази, в іншому аспекті N-кінець видаляють шляхом автопротеолізу SEQ ID NO: 2. 60% ідентичність послідовностей стосується вирівнювання послідовностей з NT02CB1447 повної довжини. [0064] В іншому аспекті спосіб за даним винаходом для виробництва підданого протеолітичному процесингу поліпептиду включає етап очищення другого поліпептиду, підданого протеолітичному процесингу, або щонайменше одного, або двох, або більше його продуктів розщеплення. Очищення BoNT/A, який експресується C. botulinum, можна здійснювати, наприклад, як загалом описано в попередньому рівні техніки (DasGupta 1984, Toxicon 22, 415; Sathyamoorthy 1985, J Biol Chemistry 260, 10461). Зокрема, очищення нейротоксину може включати один або декілька етапів осадження та екстракції, один або декілька етапів концентрування і додаткові окремі етапи хроматографії. Рекомбінантний одноланцюговий BoNT/A та його очищення описані в попередньому рівні техніки (Rummel et al., 2004, Mol Microbiol. 51:631-43). [0065] У переважному варіанті здійснення штам Clostridium являє собою C. botulinum, який, наприклад, виробляє BoNT/A або його похідну. Для ферментативного розщеплення можна застосовувати спосіб, описаний DasGupta B. R. та співавт. у Toxicon, vol. 22, No.3, p. 414-424, 1984. Таким чином, 0,5% екстракт дріжджів та 0,6% автоклавовану дріжджову пасту додають до 2% середовища N-Z-Amine типу A, і pH доводять до 7,2 за допомогою 4 н. NaOH, і середовище, отримане в такий спосіб, після цього автоклавують. До цього середовища можна додавати окремо автоклавовану глюкозу (20% за вагою на одиницю об’єму) для досягнення в середовищі кінцевої концентрації глюкози 0,5%. Інкубування може відбуватися, наприклад, при 37°C без перемішування, де ферментативне розщеплення припиняють, наприклад, через 96 годин. В межах обсягу даного винаходу перебуває те, що окрім періодичного ферментативного розщеплення, описуваного раніше, також можна здійснювати напівперіодичне ферментативне розщеплення, повторне періодичне ферментативне розщеплення або безперервне ферментативне розщеплення. [0066] Після фактичного ферментативного розщеплення та відділення середовища ферментативного розщеплення від клітин середовище ферментативного розщеплення можна піддавати першому осадженню з метою видалення великих білків. Осадження переважно являє собою кислотне осадження. Умови реакції такого кислотного осадження відомі фахівцям у даній галузі. Як правило, можна застосовувати 1,5 M H2SO4 для підкислення надосадової рідини до pH 3,5. Центрифугування зазвичай відбувається протягом 20 хвилин при 2400 x g та при 4°C. Осад, отриманий у процесі центрифугування, можна промивати водою, переважно декілька разів. Згодом осад можна екстрагувати 0,1 M буфером, що містить лимонну кислоту та цитрат тринатрію, pH 5,5, наприклад, протягом години. Згодом можна здійснювати додатковий етап центрифугування, наприклад, при 9800 x g протягом 20 хвилин при 4°C. Отриманий таким чином осад можна, необов'язково, в подальшому знову екстрагувати, як описано раніше. Надосадову рідину після екстракції або обидві надосадові рідини у разі повторення екстракції можна в подальшому піддавати осадженню сульфатом протаміну. Осадження може тривати протягом ночі, наприклад, при 8°C. Згодом осад можна центрифугувати, наприклад, протягом 20 хвилин при 4°C та при 12000 x g. Надосадову рідину після центрифугування можна піддавати осадженню, такому як осадження сульфатом амонію, за допомогою чого можна видаляти інші більші білки. Після етапу осадження сульфатом амонію можна додавати інший етап центрифугування, і отриманий таким чином осад можна в подальшому повторно розчиняти та, необов'язково, піддавати діалізу. Екстракт, який переважно піддають діалізу та знову центрифугують, можна піддавати послідовним етапам хроматографії з метою очищення нейротоксину. Кожен з етапів хроматографії слугує для видалення забруднювачів, таких як сульфат протаміну, решти ДНК, частин менших білків та білків середнього розміру, а також гемаглютинінів з білкового комплексу ботулінічного нейротоксину. З цією метою в переважному варіанті здійснення можна застосовувати один або декілька етапів хроматографії. Елюат, наприклад, після останнього етапу хроматографії, необов'язково, можна фільтрувати з метою зменшення кількості мікробів. Необов'язково, елюат можна розводити перед фільтрацією, і можна додавати придатні допоміжні засоби. Протягом додаткових етапів можна проводити іншу стерилізаційну фільтрацію після додавання допоміжних засобів. В одному аспекті фільтрацію проводять у реакційних ємностях, які можна в подальшому піддавати етапу ліофілізації. [0067] Даний винахід також стосується композиції, отримуваної за допомогою способу за даним винаходом для виробництва поліпептиду, підданого протеолітичному процесингу. В одному аспекті зазначена композиція містить суміш процесованого та непроцесованого другого поліпептиду, де зазначена суміш може містити менше 5%, 4%, 3%, 2% або менше 1% 17 UA 111795 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 непроцесованого другого поліпептиду. В одному з аспектів зазначеної композиції зазначений другий поліпептид являє собою BoNT або його похідну. BoNT може, наприклад, бути вибраним з групи, яка включає BoNT серотипів A, B, C, D, E, F та G, у тому числі його похідну. Композиція може бути, наприклад, рідкою або твердою композицією та може містити один або декілька носіїв, допоміжних засобів та/або наповнювачів. [0068] В іншому аспекті даний винахід також стосується способу виробництва лікарського препарату, тобто фармацевтичної композиції, який включає етапи згаданого вище способу та додатковий етап складання очищеного дволанцюгового нейротоксину у формі лікарського препарату. В одному аспекті зазначений лікарський препарат містить суміш процесованого та непроцесованого другого поліпептиду, де зазначена суміш містить менше 5% непроцесованого другого поліпептиду. У переважних варіантах здійснення суміш містить менше 4%, 3%, 2% або менше 1% непроцесованого другого поліпептиду. [0069] Даний винахід також стосується різних шляхів медичного застосування сполук, розкритих у даному документі. [0070] В одному аспекті даний винахід стосується протеолітично активного поліпептиду згідно з даним винаходом для застосування у формі лікарського препарату або у фармацевтичній композиції. [0071] В іншому аспекті даний винахід стосується композиції згідно з даним винаходом для застосування у формі лікарського препарату або у фармацевтичній композиції. [0072] У ще одному аспекті даний винахід стосується антитіла згідно з даним винаходом для застосування у формі лікарського препарату або у фармацевтичній композиції. [0073] У ще одному аспекті даний винахід стосується інгібітора згідно з даним винаходом для застосування у формі лікарського препарату або у фармацевтичній композиції. Зокрема, даний винахід стосується фармацевтичної композиції, яка містить поліпептид за даним винаходом, антитіло за даним винаходом, композицію за даним винаходом або інгібітор за даним винаходом. [0074] Вираз "композиція", застосовуваний у даному документі, стосується будь-якої композиції, складеної у твердій, рідкій, аерозольній (або газоподібній) формі тощо. Зазначена композиція містить, наприклад, терапевтично активну сполуку за даним винаходом, необов'язково, разом з придатними допоміжними сполуками, такими як розріджувачі або носії, або додатковими інгредієнтами. В одному аспекті терапевтично активна сполука являє собою протеолітично активний поліпептид за даним винаходом. В іншому аспекті терапевтична сполука являє собою другий поліпептид, підданий протеолітичному процесингу, описаний у даному документі вище, такий як дволанцюговий нейротоксин. В іншому аспекті терапевтично активна сполука являє собою антитіло за даним винаходом. В іншому аспекті терапевтично активна сполука являє собою інгібітор протеолітично активного поліпептиду за даним винаходом. [0075] У цьому контексті в даному винаході розрізняють допоміжні сполуки, тобто сполуки, які не сприяють ефектам, котрі викликає сполука за даним винаходом після застосування композиції для досягнення бажаної для неї мети, і додаткові інгредієнти, тобто сполуки, які сприяють додатковому ефекту або модулюють ефект сполуки за даним винаходом. Придатні розріджувачі та/або носії залежать від мети, з якою композицію належить застосовувати, та інших інгредієнтів. Фахівець у даній галузі може визначити такі придатні розріджувачі та/або носії без додаткових зусиль. [0076] Носій(носії) має бути прийнятним у сенсі сумісності з іншими інгредієнтами складу та нешкідливості для того, хто його приймає. Використовуваний фармацевтичний носій може включати тверду речовину, гель або рідину. Ілюстративними твердими носіями є лактоза, фарфорова глина, сахароза, тальк, желатин, агар, пектин, аравійська камедь, стеарат магнію, стеаринова кислота тощо. Ілюстративними рідкими носіями є фосфатно-сольовий буфер, сироп, олія, вода, емульсії, різні типи змочувальних засобів тощо. Аналогічно, носій або розріджувач може включати матеріал-уповільнювач, добре відомий з рівня техніки, такий як гліцерилмоностеарат або гліцерилдистеарат окремо або з воском. Зазначені придатні носії включають згадані вище та інші, добре відомі з рівня техніки, див., наприклад, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania. [0077] Розріджувач(розріджувачі) вибирають так, щоб не впливати на біологічну активність комбінації. Прикладами таких розріджувачів є дистильована вода, фізіологічний розчин, розчини Рінгера, розчин декстрози та розчин Хенкса, на додаток, фармацевтична композиція або склад також можуть містити інші носії, допоміжні засоби або нетоксичні, нетерапевтичні, неімуногенні стабілізатори тощо. 18 UA 111795 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [0078] В одному аспекті фармацевтична композиція, застосовувана в даному документі, містить біологічно активний нейротоксин, отриманий за допомогою способу за даним винаходом, та, необов'язково, один або декілька фармацевтично прийнятних носіїв. Активний нейротоксин може бути присутнім у рідкий або ліофілізованій формі. В одному з аспектів зазначена сполука може бути присутньою разом з гліцерином, білковими стабілізаторами (наприклад, сироватковим альбуміном людини (HSA)) або небілковими стабілізаторами, такими як полівінілпіролідон або гіалуронова кислота. Фармацевтичну композицію в одному аспекті вводять місцево. Традиційно застосовуваним введенням лікарського засобу є внутрішньом’язове, підшкірне (біля залоз) введення. Однак, залежно від природи та механізму дії сполуки фармацевтичну композицію також можна вводити іншими шляхами. Дволанцюговий поліпептидний нейротоксин являє собою активний інгредієнт композиції, і в одному аспекті його вводять у традиційних лікарських формах, отриманих шляхом об'єднання лікарського засобу зі стандартними фармацевтичними носіями згідно з традиційними процедурами. Ці процедури можуть включати змішування, грануляцію та пресування або розчинення інгредієнтів, необхідних для бажаного препарату. Буде зрозуміло, що форма та характерні особливості фармацевтично прийнятного носія або розріджувача визначаються кількістю активного інгредієнта, з яким його слід об’єднати, шляхом введення та іншими добре відомими змінними характеристиками. [0079] Терапевтично ефективна доза стосується кількості сполуки, нейротоксину, яку слід застосовувати у фармацевтичній композиції за даним винаходом, що попереджає, зменшує інтенсивність або лікує симптоми, які супроводжують захворювання або стан, згадувані в даному описі. Терапевтичну ефективність та токсичність сполуки, наприклад, ED 50 (доза, терапевтично ефективна для 50% популяції) та LD50 (доза, летальна для 50% популяції), можна визначити за допомогою стандартних фармацевтичних процедур з культурами клітин або піддослідними тваринами. Співвідношення доз між терапевтичним та токсичним ефектами являє собою терапевтичний індекс, і його можна виразити співвідношенням LD 50/ED50. [0080] Режим дозування визначатиметься лікарем-куратором та іншими клінічними чинниками. Як добре відомо в галузі медицини, дозування для будь-якого пацієнта залежать від багатьох чинників, у тому числі від габаритів, площі поверхні тіла, віку пацієнта, конкретної сполуки, яку належить вводити, статі, часу та шляху введення, загального стану здоров'я та інших лікарських засобів, які вводять паралельно. Прогрес можна відстежувати шляхом періодичного оцінювання. Фармацевтичні композиції та склади, згадувані в даному документі, вводять щонайменше один раз з метою лікування, або зменшення інтенсивності, або попередження захворювання або стану, наведених у даному описі. Однак, зазначені фармацевтичні композиції можна вводити більше ніж один раз. [0081] У додатковому аспекті даного винаходу згадана вище композиція являє собою лікарський препарат або косметичну композицію. В одному аспекті зазначений лікарський препарат, який містить біологічно активний нейротоксин, можна застосовувати для попередження та/або лікування щонайменше одного з наступних захворювань та порушень: довільного напруження м'язів, фокальної дистонії, у тому числі цервікальної, краніальної дистонії та доброякісного есенціального блефароспазму, геміфаціального спазму та фокальної спастичності, порушень роботи шлунково-кишкового тракту, гіпергідрозу та косметичної корекції зморшок, у додатковому аспекті також блефароспазму, оромандибулярної дистонії за типом порушення відкривання рота, за типом порушення закривання рота, бруксизму, синдрому Мейге, лінгвальної дистонії, апраксії відкривання повік, цервікальної дистонії, антеколіса, ретроколіса, латероколіса, кривошиї, фарингеальної дистонії, ларингеальної дистонії, спастичної дисфонії аддукторного типу, спастичної дисфонії абдукторного типу, спастичної задишки, дистонії м'язів кінцівок, дистонії м'язів рук, задачеспецифічної дистонії, писального спазму, спазму музикантів, спазму гравців у гольф, дистонії м'язів ніг, приведення стегна, відведення стегна, згинання в колінному суглобі, розгинання в колінному суглобі, згинання в гомілковостопному суглобі, розгинання в гомілковостопному суглобі, еквіноварусної деформації стопи, деформувальної дистонії стопи, стріарного пальця ноги, згинання пальців ніг, розгинання пальців ніг, аксіальної дистонії, синдрому "Пізанської вежі", дистонії "танець живота", сегментарної дистонії, гемідистонії, генералізованої дистонії, дистонії при синдромі Любаг, дистонії при кортикобазальній дегенерації, дистонії при синдромі Любаг, тардивної дистонії, дистонії при спінально-церебелярній атаксії, дистонії при хворобі Паркінсона, дистонії при хворобі Гантінгтона, дистонії при хворобі Галлервордена-Шпатца, форм дофамін-індукованої дискінезії/дофамін-індукованої дистонії, форм тардивної дискінезії/тардивної дистонії, форм пароксизмальної дискінезії/дистонії, кінезіогенної, некінезіогенної, індукованої рухом велопалатинної міоклонії, міоклонічної міокімії, ригідності м'язів, доброякісних судом м'язів, 19 UA 111795 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 спадкового тремору підборіддя, парадоксальної активності жувальних м’язів, гемімастикаторних спазмів, гіпертрофічної бранхіогенної міопатії, гіпертрофії жувального м'яза, гіпертрофії переднього великого гомілкового м'яза, ністагму, осцилопсії, над'ядерного паралічу погляду, парціальної безперервної епілепсії, підготовки до операції з корекції спастичної кривошиї, паралічу абдуктора голосових зв'язок, мутаційної дисфонії, яка не підлягає лікуванню, дисфункції верхнього стравохідного сфінктера, гранульоми голосових зв'язок, заїкання, синдрому Жиля де ля Туретта, міоклонії м'язів середнього вуха, захисного закривання гортані, стану після ларингектомії, розладу мовлення, захисного птозу, ентропіону, дисфункції сфінктера Одді, псевдоахалазії, порушень моторики стравоходу, відмінних від ахалазії, вагінізму, післяопераційного тремору, обумовленого іммобілізацією, дисфункції сечового міхура, детрузорно-сфінктерної диссинергії, спазму сфінктера сечового міхура, геміфаціального спазму, форм дискінезії внаслідок реіннервації, "гусячих лапок" у випадку косметичного застосування, форм асиметрії обличчя при нахмурюванні, ямочок на підборідді, синдрому скутої людини, правця, гіперплазії простати, ожиріння, лікування дитячого церебрального паралічу, змішаної, паралітичної, співдружної косоокості, стану після оперативного лікування відшарування сітківки, після оперативного лікування катаракти, за наявності афакії, косоокості внаслідок міозиту, косоокості внаслідок міопатії, дисоційованої вертикальної девіації, як додатковий засіб до оперативного лікування косоокості, за наявності езотропії, екзотропії, ахалазії, тріщин заднього проходу, гіперактивності екзокринних залоз, синдрому Фрей, синдрому "крокодилячих сліз", гіпергідрозу пахв, долонь, підошов, ринореї, відносної гіперсалівації при інсульті, при хворобі Паркінсона, при спастичних станах при бічному аміотрофічному склерозі, за наявності аутоімунних процесів при енцефаліті та мієліті, розсіяного склерозу, поперечного мієліту, синдрому Девіка, вірусних інфекцій, бактеріальних інфекцій, паразитарних інфекцій, грибкових інфекцій, за наявності спадкового спастичного парапарезу, постапоплексичного синдрому, півкульного інфаркту, інфаркту стовбура головного мозку, інфаркту спинного мозку, мігрені, за наявності травми центральної нервової системи, уражень півкуль головного мозку, уражень стовбура головного мозку, ураження спинного мозку, за наявності крововиливу в центральній нервовій системі, внутрішньомозкового крововиливу, субарахноїдального крововиливу, субдурального крововиливу, інтраспінального крововиливу, за наявності неоплазій, пухлин півкуль головного мозку, пухлин стовбура головного мозку, пухлин спинного мозку, хропіння (WO 2000/033863). Стосовно деталей та симптомів див., наприклад, Jost 2007, Drugs 67(5), 669 або Dressler 2000 у Botulinum Toxin Therapy, Thieme Verlag, Stuttgart, New York. [0082] В іншому аспекті даного винаходу композиція являє собою косметичну композицію, яку можна складати, як описано вище для фармацевтичної композиції. Для косметичної композиції аналогічно передбачається, що сполуку за даним винаходом у певному аспекті застосовують у практично чистій формі. Косметичні композиції у додатковому аспекті слід застосовувати внутрішньом’язово. У ще одному додатковому аспекті даного винаходу косметичні композиції, які містять нейротоксин, можна складати у формі розчину проти зморшок. [0083] В іншому аспекті фармацевтична композиція містить антитіло або інгібітор за даним винаходом. Оскільки поліпептид за даним винаходом відповідає за активацію клостридіальних нейротоксинів, антитіло буде застосовним для послаблення токсичного ефекту, спостережуваного під час інфекції, спричинюваної клостридіями. Таким чином, антитіло за даним винаходом в одному аспекті можна застосовувати для лікування інфекції, спричинюваної клостридіями, у тому числі Clostridium perfringens, Clostridium difficile, Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Clostridium baratii, Clostridium butyricum, Clostridium sporogenes, Clostridium acetobutylicum, Clostridium haemolyticum, Clostridium novyi та Clostridium oedematiens. Додатково, антитіло за даним винаходом в іншому аспекті можна застосовувати для лікування симптомів, асоційованих із зазначеною інфекцією. Більше того, зазначене антитіло можна застосовувати в лікуванні стану або симптому, асоційованого зі станом, де стан вибрано з ботулізму, правця, псевдомембранозного коліту, гангрени, харчового отруєння тощо. [0084] В іншому аспекті фармацевтична композиція містить протеолітично активний поліпептид за даним винаходом. Зазначену фармацевтичну композицію в одному аспекті можна застосовувати для протеолітичного розщеплення поліпептидів, залучених у коаглютинацію, зокрема, для лікування пацієнтів з гіпокоаглютинацією. В іншому аспекті фармацевтичну композицію можна застосовувати як фібрінолітичний засіб, зокрема, для лікування пацієнтів з інфарктом міокарду, емболією легеневої артерії, тромбоемболією глибоких вен, тобто для видалення тромбів. Також передбачається застосування фармацевтичної композиції в лікуванні інсульту. Більше того, в інших аспектах фармацевтичну композицію можна застосовувати в лікуванні екзокринної недостатності підшлункової залози для заміщення будь-якого з трипсину, 20 UA 111795 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 хімотрипсину, пепсину. Більше того, в інших аспектах фармацевтичну композицію можна застосовувати в лікуванні пацієнтів, які страждають від запальних реакцій, у лікуванні пацієнтів з раком, зокрема, для протеолітичного розщеплення доступних на поверхні пухлинних антигенів. Більше того, в іншому аспекті фармацевтичну композицію можна застосовувати в лікуванні папіломи. [0085] Даний винахід також стосується способу скринінгу щодо інгібітора, який включає етап (a) приведення протеолітично активного поліпептиду за даним винаходом в контакт з відомим субстратом і, необов’язково, з передбачуваним інгібітором та (b) визначення ефекту передбачуваного інгібітора щодо перетворення субстрату на продукт розщеплення, де зменшення кількості продукту розщеплення свідчить про інгібіторний ефект передбачуваного інгібітора. В одному аспекті передбачуваний інгібітор являє собою пептид, який містить амінокислотну послідовність, вибрану з будь-якої з SEQ ID NO: 4-25, де щонайменше одна основна амінокислота в зазначеній амінокислотній послідовності заміщена неосновною амінокислотою. У додатковому аспекті зазначений пептид містить одну або декілька хімічних модифікацій. В іншому аспекті інгібітор являє собою пептидоміметик зазначеного пептиду. В іншому аспекті передбачуваний інгібітор являє собою частину мікроматриці з хімічними сполуками, тобто набору органічних хімічних сполук. У ще одному аспекті інгібітор являє собою антитіло за даним винаходом. Цей спосіб є застосовним для ідентифікації сполук, здатних до інгібування протеолітично активного поліпептиду за даним винаходом. Початковий етап скринінгу може відбуватися, наприклад, на основі пептиду, який містить амінокислотну послідовність, вибрану з будь-якої з SEQ ID NO: 4-25. Пептиди, здатні до інгібування поліпептиду за даним винаходом, можна модифікувати з метою посилення інгібування. Модифікації включають заміни або хімічні модифікації амінокислот. Як правило, цей спосіб здійснюють шляхом приведення поліпептиду за даним винаходом в контакт з відомим субстратом за присутності та за відсутності передбачуваного інгібітора (етап (a) способу) та шляхом порівняння ефекту передбачуваного інгібітора щодо перетворення субстрату на продукт розщеплення. Зменшення швидкості перетворення за присутності передбачуваного інгібітора свідчить про інгібіторний ефект. [0086] Даний винахід також стосується інгібітора протеолітично активного поліпептиду за даним винаходом, де зазначений інгібітор являє собою (a) інгібітор, який містить амінокислотну послідовність, наведену у будь-якій з SEQ ID NO: 4-25, де основна амінокислота, яка міститься в ньому, заміщена неосновною амінокислотою; або (b) антитіло за даним винаходом. [0087] Всі літературні джерела, перелічені в даному описі, таким чином, включені в даний документ за допомогою посилання стосовно їх повного змісту розкриття та змісту розкриття, конкретно згаданого в даному описі. На фігурах показано наступне. Фігура 1. Тестування активності фракцій, зібраних з HiPrep 16/10 Q FF Аналізували 5 мкл фракцій, зібраних після прогону на HiPrep 16/10 Q FF, щодо ферментативної активності шляхом інкубування 2 мкг scBoNTA (доріжка 2) протягом 1 год. при 37°C та наступного SDS-PAGE у 10% гелі. Доріжка 1: маркер низьких молекулярних ваг (LMW): 116 кДа, 66 кДа, 45 кДа, 35 кДа. Фігура 2. Аналіз фракцій, зібраних після SEC (HiLoad 16/60 Superdex 75), щодо вмісту nBH з молекулярною вагою ~37,3 кДа за допомогою SDS-PAGE у 12,5% гелі Фракції 9-11 містять більшу частину nBH. (Доріжка 1: LMW: 116 кДа, 66 кДа, 45 кДа, 35 кДа, 25 кДа, 18,4 кДа, 14,4 кДа). Фігура 3. Аналіз за допомогою SDS-PAGE у 12,5% гелі для визначення чистоти та концентрації білка у трьох очищуваних порціях nBH Доріжка 1, LMW (116 кДа, 66 кДа, 45 кДа, 35 кДа, 25 кДа, 18,4 кДа, 14,4 кДа); доріжка 2, nBH партії TE311206 (192 нг/мкл зрілого NT02CB1446/CBO1444, амінокислоти 254-594 послідовності з № доступу в GenBank CAL82987.1, MW: 38,6 кДа); доріжка 3, nBH партії TIK301009 (130 нг/мкл зрілого NT02CB1447/CBO1445, SEQ ID NO: 1, амінокислоти 249-581 послідовності з № доступу в GenBank CAL82988.1, MW: 37,3 кДа); доріжка 4, nBH партії TIK280509 (114 нг/мкл зрілого NT02CB1447/CBO1445, SEQ ID NO: 1, амінокислоти 249-581 послідовності з № доступу в GenBank CAL82988.1, MW: 37,3 кДа). Фігура 4. Звіт за спектральним аналізом за методом ESI-MS/MS Білкову смугу nBH партії TE311206 розміром 38,6 кДа ідентифікували як NT02CB1446/CBO1444 з кількісним показником у Mascot, що дорівнює 725, та отриманим на основі MS/MS 29,6% охопленням послідовностей пептидів у всій відкритій рамці зчитування (ORF). Не було ідентифіковано пептидів (сірий прямокутник - пептид, ідентифікований на основі MS; червоні квадрати - ідентифіковані амінокислоти y-/b-іона пептиду після виявленого шляхом MS/MS 21 UA 111795 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 розпаду), які походили від 253 N-кінцевих амінокислот. Аналіз партії TE311206 за методом MS/MS виявив 52% охоплення послідовностей відповідно до C-кінцевих амінокислот 254-594, які утворюють nBH. Фігура 5. Звіт за спектральним аналізом за методом ESI-MS/MS Білкову смугу nBH партії TIK301009 розміром 37,3 кДа ідентифікували як NT02CB1447/CBO1445 з кількісним показником у Mascot, що дорівнює 555, та отриманим на основі MS/MS 28,4% охопленням послідовностей пептидів у всій відкритій рамці зчитування (ORF). Всі ідентифіковані пептиди, за винятком одного (сірий прямокутник - пептид, ідентифікований на основі MS; червоні квадрати - ідентифіковані амінокислоти y-/b-іона пептиду після виявленого шляхом MS/MS розпаду), походили від 333 C-кінцевих амінокислот. Аналіз партії TIK301009 за методом MS/MS виявив 49,5% охоплення послідовностей відповідно до C-кінцевих амінокислот 249-581, які утворюють nBH. Фігура 6. Порівняння залежної від концентрації протеолітичної активності nBH, отриманої з трьох очищуваних порцій A. Тестування активності за допомогою SDS-PAGE у 12,5% гелі, в якому аналізували nBH, отриману з порцій TIK301009, TIK280509 та TE311206, із застосуванням наступних розведень концентрованої nBH: 1:10, 1:30, 1:100, 1:300, 1:1000. Аналіз здійснювали шляхом інкубування 1 мкг scBoNT/A, і 2 мкл dH2O, і 1 мкл відповідним чином розведеної nBH протягом 60 хв. при 37°C. Для аналізу за методом SDS-PAGE додавали 3 мкл 4x відновного буфера Laemmli з SDS до кінцевого об'єму 10 мкл. scBoNT/A розміром 150 кДа розщеплювався з отриманням важкого ланцюга розміром 100 кДа та легкого ланцюга розміром 50 кДа. B. Оптичну густину білкових смуг важкого ланцюга, легкого ланцюга та scBoNT/A оцінювали кількісно, і суму цих показників для смуг продуктів у формі легкого та важкого ланцюгів ділили на суму для білкових смуг LC, HC та scBoNT/A. Сильніше розведення першого поліпептиду знижує швидкість розщеплення. Специфічна протеолітична активність трьох різних порцій є практично ідентичною. Фігура 7. Залежне від часу розщеплення scBoNT/A дикого типу та мутантних варіантів, які містять модифіковану петлю, за допомогою nBH A. Модифікація послідовності петлі. У scBoNTAS Throm видалені всі лізинові залишки та вставлена послідовність розпізнавання тромбіном LVPRGS, тоді як у петлі scBoNT Res немає жодної основної амінокислоти. Скорочуючи петлю до восьми невеликих залишків або п'яти амінокислот з об'ємними бічними ланцюгами, отримують scBoNTAS (GGSG)2 та scBoNTAS FQWYI, відповідно. У scBoNTAS CGS-C видалено всю петлю, а цистеїнові залишки, які утворюють дисульфідний місток, заміщено гліцином та серином. B. Аналіз залежного від часу розщеплення scBoNT/A дикого типу та мутантних варіантів за методом SDS-PAGE. C. scBoNTAS дикого типу активується за допомогою nBH із часовою залежністю, розщеплюючись з отриманням легкого ланцюга та важкого ланцюга протягом 120 хв. Відсутність лізинових залишків та вставка одного аргінінового залишку збільшує час розщеплення петлі (scBoNTAS Throm). Петля, в якій немає жодного основного залишку, залишається розщеплюваною (scBoNTAS Res). Скорочуючи петлю до 8-мерного пептиду, уводячи п'ять амінокислот з об'ємними бічними ланцюгами або видаляючи всю петлю, отримують нерозщеплюваний scBoNT/A. Фігура 8. Аналіз продуктів розщеплення розміром 50 кДа та 100 кДа, утворених після розкладання scBoNT/A за допомогою nBH, за методом MS/MS A. Аналіз продукту розщеплення розміром 50 кДа, який був ідентифікований як легкий ланцюг BoNT/A з кількісним показником у Mascot, що дорівнює 1460. Пептид, який вважається найближчим до C-кінця, охоплює амінокислоти G433-K438, що відповідають фізіологічно спостережуваному C--кінцю LC BoNT/A. B. Аналіз продукту розщеплення розміром 100 кДа, який був ідентифікований як важкий ланцюг BoNT/A з кількісним показником у Mascot, що дорівнює 96. Пептид, який вважається найближчим до N-кінця, охоплює амінокислоти A449-K456, що відповідають фізіологічно спостережуваному N--кінцю HC BoNT/A. Фігура 9. A. Вміст білка (мг/мл), який являє собою антитіло IgY до nBH, у трьох послідовних пулах аналізували за допомогою SDS-PAGE у 12,5% гелі. B. ELISA. Титраційні мікропланшети Nunc Maxisorp F96 вкривали за допомогою nBH з різних партій (500 нг/мл) у PBS протягом ночі при 4°C та потім блокували протягом 1 год. за допомогою блокувального буфера PBS, який містив 0,1% Tween-20 та 2% знежирене сепароване молоко. Після промивання додавали розведений IgY з кожного пулу (10 мкг/мл у блокувальному буфері) на 1 год. і проводили його виявлення за допомогою міченого біотином антитіла віслюка до IgY курки, пероксидази хріну, 22 UA 111795 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кон'югованої зі стрептавідином (обидва від Dianova, Гамбург, Німеччина), та 3,3',5,5'тетраметилбензидину (Sigma). Фігура 10. A. Рекомбінантна експресія та виділення неактивної BH 1-581 (63 кДа) за допомогою IMAC з Talon Аналіз фракцій після IMAC з Talon за методом SDS-PAGE у 10% гелі (LMW: 116 кДа, 66 кДа, 45 кДа, 35 кДа, 25 кДа; SS34 - освітлений лізат; TD - проточна фракція; W - фракція після промивання; E1-E7 - елюйовані імідазолом фракції 1-7). B. Не спостерігали ендопротеолізу scBoNT/A з отриманням LC (50 кДа) та HC (100 кДа) за допомогою рекомбінантної iBH (SEQ ID NO: 2; "E"; 63 кДа) при 37°C через 1 год. (доріжка 6) (LMW: 116 кДа, 66 кДа, 45 кДа, 35 кДа, 25 кДа). Фігура 11. Застосування очищеної активної BoNT-гідролази (nBH) для отримання поліпептиду, підданого протеолітичному процесингу A. Інкубували 200 мкг рекомбінантного очищеного scBoNT/A з 350 нг очищеної активної BoNTгідролази протягом 12 хв. при 37°C. Для припинення реакції nBH видаляли за допомогою SEC (колонка Superdex 200 10/300 GL, буфер: 50 мМ NaP, pH 7,5, 150 мМ NaCl, об'єм проби = 0,3 мл, швидкість потоку = 0,25 мл/хв.), і ступінь розщеплення аналізували за допомогою SDSPAGE у 10% гелі. B. Фракцію 1 (1800 мкл), яка містила BoNT/A, процесований на ~40%, інкубували з 350 нг очищеної активної BoNT-гідролази протягом 15 хв. при 37°C та концентрували до 300 мкл шляхом ультрафільтрації. Для остаточного припинення реакції nBH видаляли за допомогою SEC (колонка Superdex 200 10/300 GL, буфер: 50 мМ NaP, pH 7,5, 150 мМ NaCl, об'єм проби = 0,3 мл, швидкість потоку = 0,25 мл/хв.), і ступінь розщеплення аналізували за допомогою SDS-PAGE у 10% гелі. C. Фракції 1 та 2 (1800 мкл), які містили BoNT/A, процесований на ~80%, об'єднували та інкубували зі 120 нг очищеної активної BoNTгідролази протягом 25 хв. при 37°C та концентрували до 300 мкл шляхом ультрафільтрації. Для остаточного припинення реакції nBH видаляли за допомогою SEC (колонка Superdex 200 10/300 GL, буфер: 50 мМ NaP, pH 7,5, 150 мМ NaCl, об'єм проби = 0,3 мл, швидкість потоку = 0,25 мл/хв.), і ступінь розщеплення аналізували за допомогою SDS-PAGE у 10% гелі. Отримували BoNT/A, процесований на >95% (SEQ ID NO: 3). У переліку послідовностей наведено наступне. SEQ ID NO: 1: протеолітично активний поліпептид, отриманий з Clostridium botulinum штаму ATCC 3502, № доступу в GenBank "CAL82988.1", у якому відсутні 248 N-кінцевих амінокислотних залишків. SEQ ID NO: 2: протеолітично неактивний поліпептид, отриманий з Clostridium botulinum штаму ATCC 3502, № доступу в GenBank "CAL82988.1". SEQ ID NO: 3: BoNT/A з ATCC 3502, № доступу в GenBank "AAA23262". SEQ ID NO: 4: петля BoNT/A1. SEQ ID NO: 5: петля BoNT/A2/A6. SEQ ID NO: 6: петля BoNT/A3. SEQ ID NO: 7: петля BoNT/A3. SEQ ID NO: 8: петля BoNT/A4. SEQ ID NO: 9: петля BoNT/A5. SEQ ID NO: 10: петля BoNT/A7. SEQ ID NO: 11: петля BoNT/B1/B4bv/B6. SEQ ID NO: 12: петля BoNT/B2/B3. SEQ ID NO: 13: петля BoNT/B5np. SEQ ID NO: 14: петля BoNT/C/CD. SEQ ID NO: 15: петля BoNT/D. SEQ ID NO: 16: петля BoNT/DC. SEQ ID NO: 17: петля BoNT/E1-E5. SEQ ID NO: 18: петля BoNT/E6. SEQ ID NO: 19: петля BoNT/F1/F6. SEQ ID NO: 20: петля BoNT/F2/F3. SEQ ID NO: 21: петля BoNT/F4. SEQ ID NO: 22: петля BoNT/F5. SEQ ID NO: 23: петля BoNT/F7. SEQ ID NO: 24: петля BoNT/G. SEQ ID NO: 25: петля TeNT. SEQ ID NO: 26: послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 27: послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує SEQ ID NO: 2. Наступні приклади ілюструють даний винахід, і їх в жодному випадку не слід тлумачити як такі, що обмежують його обсяг. 23 UA 111795 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ПРИКЛАДИ Приклад 1. Очищення та характеристика нативної BoNT-гідролази (nBH), яка специфічно розщеплює одноланцюговий BoNT/A з отриманням його активної дволанцюгової форми (1) Система зчитування результатів/тестування активності. Для специфічного виявлення та очищення ферменту з активністю, яка забезпечує гідроліз ботулінічного нейротоксину A (BoNT/A) з отриманням легкого ланцюга (LC) розміром 50 кДа та важкого ланцюга (HC) розміром 100 кДа, в надосадових рідинах культур C. botulinum та в період між етапами хроматографії в E. coli експресували BoNT/A розміром 150 кДа як одноланцюговий (sc) поліпептид. Під час інкубування рекомбінантного scBoNT/A з ферментом з відповідною активністю (nBH) мають отримувати LC розміром 50 кДа та HC розміром 100 кДа, які візуалізуються за допомогою SDS-PAGE у 10-13% гелі у відновних умовах. (2) Експресія клостридіальних протеаз. Одну колонію C. botulinum штаму ATCC 3502 інокулювали в 100 мл середовища із серцево-мозковим екстрактом (BHI), і культуру інкубували протягом ночі при 37°C в анаеробних умовах. 10 мл O/N-культури інокулювали в 1 л середовища з BHI та інкубували в анаеробних умовах протягом 48-72 год. (3) Осадження сульфатом амонію. Надосадову рідину культури на 1 л збирали шляхом центрифугування (4°C, 6500 x g, 25 хв.). Додавали сульфат амонію до кінцевої концентрації 85% (тут 575 г), суспензію перемішували протягом 6 годин при 4°C та після цього центрифугували (4°C, 6500 x g, 30 хв.). Осаджений сульфатом амонію осад розчиняли в невеликому об'ємі (тут 5 мл) 50 мМ NaP, pH 7,5, та діалізували проти 50 мМ NaP, 150 мМ NaCl, pH 7,5. Зрештою діалізат центрифугували (4°C, 40000 x g, 60 хв.) і надосадову рідину застосовували для IEC. (4) Іонообмінна хроматографія (IEC, колонка HiPrep 16/10 Q FF). Надосадову рідину (3) (фігура 1, доріжка 3) вносили в аніонообмінну колонку HiPrep 16/10 Q FF, яку врівноважували та через яку здійснювали прогін буфером, який містив 50 мМ NaP, pH 7,5, 150 мМ NaCl. Прогін здійснювали зі швидкістю потоку 1 мл/хв. Тестування активності здійснювали шляхом інкубування 5 мкл кожної другої фракції з 2 мкг scBoNTA протягом 1 год. при 37°C та наступного аналізу за методом SDS-PAGE (фігура 1). Фракції 6-24 об'єднували і концентрували до об'єму 3,5 мл шляхом застосування ультрафільтрації (Amicon-Ultra MWCO 10000). (5) Ексклюзійна хроматографія (SEC, HiLoad 16/60 Superdex 200). Згодом концентрований розчин білка (4) завантажували в колонку HiLoad 16/60 Superdex 200, врівноважували за допомогою 50 мМ NaP, pH 7,5, 150 мМ NaCl. Розділення здійснювали зі швидкістю потоку 1 мл/хв. Фракції з утримуваним об'ємом, що становив від 80 мл до 100 мл, аналізували за допомогою тестування активності (1), і відповідні фракції, які характеризувалися ферментативною активністю (nBH), об'єднували (~10 мл) та концентрували до 3 мл шляхом ультрафільтрації. Згодом додавали сульфат амонію до кінцевої концентрації 12,5% = 500 мМ (+ 0,2 г). (6) Хроматографія гідрофобних взаємодій (HIC, фенілсефароза HiTrap). nBH зв'язувалась з фенілсефарозою в буфері A (50 мМ NaP, pH 7,5, 500 мМ сульфат амонію). Зв'язану nBH елюювали шляхом зменшення кількості сульфату амонію внаслідок лінійного збільшення градієнта у бік буферу B (50 мМ NaP, pH 7,5) зі швидкістю потоку 1 мл/хв. Всі фракції, які містили білок, аналізували за допомогою тестування активності (1), і відповідні фракції об’єднували та концентрували шляхом ультрафільтрації до 3,5 мл. Буфер з розчину доводили до 50 мМ NaP, pH 7,5; 150 мМ NaCl. (7) SEC (HiLoad 16/60 Superdex 75). Зрештою nBH очищували за допомогою SEC із застосуванням колонки HiLoad 16/60 Superdex 75 з 50 мМ NaP, pH 7,5, 150 мМ NaCl та зі швидкістю потоку 1 мл/хв. Фракції з утримуваним об’ємом, що становив від 70 мл до 80 мл, аналізували за допомогою SDS-PAGE у 12,5% гелі (фігура 2), і фракції 8-12, які містили nBH, що мігрувала при ~37,3 кДа, об’єднували (~10 мл) та концентрували до 1 мл шляхом ультрафільтрації. (8) Чітко виражений білок, що мігрував при приблизно 37,3 кДа (nBH), аналізували шляхом секвенування N--кінцевого пептиду згідно з протоколом деградації Едмана. Послідовність ідентифікованого пептиду являє собою V Q G Q S V K G V G та відповідає першим десяти залишкам SEQ ID NO: 1. (9) Дві партії nBH (NT02CB1447, 37,3 кДа, фігура 3, доріжка 3: TIK301009, доріжка 4: TIK280509) виділяли відтворюваним чином згідно з процедурою, описаною вище. Ізоформу nBH NT02CB1446 (38,6 кДа, фігура 3, доріжка 2, партія TE311206) отримували після наступних модифікацій процедури виділення: (i) ріст культури C. botulinum: 18 год. замість 48-72 год.; (ii) зміна етапів хроматографії: IEC -> SEC на Superdex 75 -> HIC із фенілсефарозою замість IEC-> SEC на Superdex 200 -> HIC із фенілсефарозою -> SEC на Superdex 75. 24 UA 111795 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Приклад 2. Ідентифікація послідовності nBH з C. botulinum за допомогою мас-спектрометрії (MS) (1) Розкладання під дією трипсину. Білкові смуги, що мігрували при приблизно 38 кДа (nBH) у SDS-PAGE, вилучали для розкладання під дією трипсину та знебарвлювали шляхом обережного струшування у 50 мМ NH 4HCO3, 50% ацетонітрилі протягом 30 хв. при 37°C. Знебарвлення повторювали, допоки плями в гелі не ставали світлими. Додавали ацетонітрил (100%) і видаляли його через 3 хв. Згодом плями висушували у швидкісній вакуумній системі (Eppendorf, Німеччина). Додавали трипсин (10 нг/мкл) у 50 мМ NH4HCO3 і здійснювали інкубування на льоду протягом 1 год. Згодом решту розчину трипсину видаляли, додавали невеликий об’єм 50 мМ NH4HCO3 і проводили розкладання при 37°C протягом ночі. Надосадову рідину збирали і екстрагували шматки гелю двічі із застосуванням 5% TFA, 10% ацетонітрилу. Всі рідини об'єднували, висушували у швидкісній вакуумній системі, і екстраговані пептиди зберігали при 4°C. (2) Часопролітна MS з лазерною іонізацією та десорбцією з рідкої матриці (MALDITOF/TOF). Зразки аналізували на мас-спектрометрі для MALDI-TOF/TOF (Ultraflex1 Bruker Daltonik GmbH) у лінійному режимі з прискорювальною напругою 25 кВ. Маси визначали від 700 маса/заряд до 4500 маса/заряд. Зразки (2 мкл) піддавали спільній кристалізації з 2 мкл розчину синапінової кислоти, який містив 50% ацетонітрил та 0,2% трифтороцтову кислоту (TFA), безпосередньо на основі-мішені для MALDI з неіржавкої сталі. Кожний зразок отримав 500 лазерних імпульсів. (3) Розділення пептидів за допомогою обернено-фазової хроматографії. Розділення пептидів здійснювали за допомогою обернено-фазової хроматографії із застосуванням нанопотокової системи ВЕРХ (Agilent Technologies, Вальдбронн, Німеччина), яка включає в себе автодозатор та градієнтний насос. Зразок розчиняли в буфері A (5% ацетонітрил, 0,1% мурашина кислота) і аліквоту об'ємом до 10 мкл вводили в колонку C18 (Zorbax SB-C18, 5 мкм, 300 A, внутрішній діаметр 0,5 мм, довжина 15 см) зі швидкістю потоку 5 мкл/хв. Після завантаження колонку промивали протягом 15 хв. буфером A, і пептиди елюювали за допомогою градієнта елюенту A та елюенту B (70% (об./об.) ацетонітрил у 0,1% (об./об.) мурашиній кислоті) від 0% до 100% елюенту B протягом 75 хв. (4) Інтерфейс для іонізації шляхом електророзпилення (ESI) та мас-спектрометрія на основі захоплення іонів. Вихідний отвір системи ВЕРХ безпосередньо з’єднували з нанопотоковим джерелом ESI мас-спектрометричної іонної пастки, і застосовували коаксіальний розпилювач обволікальної рідини Agilent (Agilent Technologies). Випускний капіляр утримувався прилеглою сталевою голкою та видавався вперед від неї на 0,1-0,2 мм. Розпилювану рідину стабілізували за допомогою N2 як розпилювального газу (5 л/хв.). Напругу іонізації встановлювали на 4500 В і сухий газ подавали при 5 фунтів/кв. дюйм та 250°C. Спектри збирали за допомогою масспектрометричної іонної пастки Esquire3000+ (Bruker Daltonik) зі швидкістю сканування 13000 маса/заряд на секунду. Застосовуючи ESI у позитивному режимі, мас-спектри отримували від 50 до 1600 маса/заряд у режимі сканування та із залежним від даних перемиканням між режимами аналізу MS та MS/MS. Для підвищення якості MS/MS-спектрів лише два іони-попередники з одного спектра вибирали для аналізу за методом MS/MS і активне виключення встановлювали на 2 хв. для виключення іонів-попередників, з якими вже були проведені вимірювання. (4) Обробка даних. Обробку даних здійснювали за допомогою пакетів програмного забезпечення Data Analysis (версія 3.0) та BioTools (версія 3.0) (Bruker Daltonik). Ідентифікацію білків виконували за допомогою програмного забезпечення MASCOT (версія 2.1) та бази даних MSDB (Matrix Science, Лондон, Великобританія). (5) Результати. Таблиця 2 nBH, ідентифіковані за допомогою MS Доріжка Партія nBH Концентрація білка 2 TE311206 192 нг/мкл 3 TIK301009 130 нг/мкл 4 TIK280509 114 нг/мкл Назва ORF № доступу в GenBank NT02CB1446 CAL82987.1 CBO1444 NT02CB1447 CAL82988.1 CBO1445 NT02CB1447 CAL82988.1 CBO1445 25 Амінокислоти ORF MW [кДа] Кількісний показник у Mascot 254-594 38,6 725 249-581 37,3 555 249-581 37,3 609 UA 111795 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Білкову смугу розміром 38,6 кДа з доріжки 2 (nBH партії TE311206) ідентифікували як NT02CB1446/CBO1444 з кількісним показником у Mascot, що дорівнює 725, та отриманим на основі MS/MS 29,6% охопленням послідовностей пептидів у всій відкритій рамці зчитування (ORF). Не було ідентифіковано пептидів, які походили від 253 N-кінцевих амінокислот (фігура 4). Аналіз партії TE311206 за методом MS/MS виявив 52% охоплення послідовностей відповідно до C-кінцевих амінокислот 254-594, які утворюють nBH. Білкові смуги розміром 37,3 кДа з доріжки 3 (nBH партії TIK301009) та доріжки 4 (nBH партії TIK280509) ідентифікували як NT02CB1447/CBO1445 з кількісними показниками у Mascot, що дорівнюють 555 та 609, відповідно. Всі ідентифіковані пептиди, за винятком одного, походили від 333 C-кінцевих амінокислот (фігура 5). Аналіз партії TIK301009 за методом MS/MS виявив 49,5% охоплення послідовностей відповідно до C-кінцевих амінокислот 249-581, які утворюють nBH. Приклад 3. Характеристика специфічності ферменту nBH (1) Порівнювали залежну від концентрації протеолітичну активність nBH, отриманої з трьох очищуваних порцій (фігура 6). Тестування активності, в якому аналізували nBH, отриману з порцій TIK301009, TIK280509 та TE311206, за допомогою різних розведень nBH, демонструє, що сильніші розведення знижують швидкість розщеплення. Протеолітична активність трьох різних порцій є практично ідентичною, що вказує на те, що зріла ізоформа NT02CB1446 (TE311206) проявляє специфічну активність, подібну до такої у зрілої NT02CB1447 (SEQ ID NO: 1). (2) Залежне від часу розщеплення scBoNT/A дикого типу та мутантних варіантів під дією nBH аналізували з використанням тестування активності (фігура 7). scBoNTAS дикого типу активується за допомогою nBH із часовою залежністю, розщеплюючись з отриманням легкого ланцюга та важкого ланцюга протягом 120 хв. більше ніж на 95%. Послідовність петлі модифікували для характеристики сайту розщеплення. У scBoNTAS Throm видалені всі лізинові залишки та вставлена послідовність розпізнавання тромбіном LVPRGS, що знижувало швидкість розщеплення. У scBoNT Res у петлі немає жодної основної амінокислоти, що істотно затримує повний гідроліз, вказуючи на сувору перевагу nBH у розпізнаванні до основних залишків, таких як лізин та аргінін, у сайті розщеплення. Додатково, доступність петлі для nBH погіршується через скорочення петлі до восьми невеликих залишків або п'яти амінокислот з об'ємними бічними ланцюгами (scBoNTAS (GGSG)2 та scBoNTAS FQWYI). (3) Аналіз продукту розщеплення розміром 50 кДа після розкладання scBoNT/A під дією nBH за методом MS/MS виявив, що пептид, який вважається найближчим до C-кінця, охоплює амінокислоти G433-K438, що відповідають фізіологічно спостережуваному C--кінцю LC BoNT/A (фігура 8A). Аналіз продукту розщеплення розміром 100 кДа, який був ідентифікований як важкий ланцюг BoNT/A, продемонстрував, що пептид, який вважається найближчим до N-кінця, охоплює амінокислоти A449-K456, що відповідають фізіологічно спостережуваному N--кінцю HC BoNT/A (фігура 8B). Таким чином, виділена nBH забезпечує отримання фізіологічно процесованого BoNT/A та переважно гідролізує пептидні зв’язки в C-кінцевій частині відносно лізинових та аргінінових залишків. Приклад 4. Еволюційна консервативність BoNT-гідролази та її ізоформ Аналіз білкової послідовності SEQ ID NO: 2 (№ доступу в GenBank CAL82988.1/YP_001253958.1) виявив три консервативні домени. Залишки 18-573 відповідають цинковій металoпротеазі (еластазі) або LasB, залученій у транспорт та метаболізм амінокислот, з кількісним показником у Blast, що дорівнює 738. Залишки 148-212 відповідають домену пропептиду пептидази та YPEB або PepSY (кількісний показник у Blast дорівнює 97). Залишки 336-573 є частиною пептидази з родини M4, яка включає термолізин, протеалізин, ауреолізин та нейтральні протеази (кількісний показник у Blast дорівнює 803). Секвенування генома C. botulinum ATCC 3502 виявило наявність шести ORF, що кодують ізоформи iBH (Sebaihia et al., 2007, Genome Res. 17(7):1082-1092). Додаткові дані стосовно генома доступні для 10 штамів C. botulinum групи I, а також C. sporogenes, що не секретує BoNT, всі з яких містять п’ять-сім ORF, що кодують iBH. Мінімальна ідентичність амінокислотної послідовності, якою характеризується nBH (SEQ ID NO:1) щодо інших 63 ізоформ, становить 64%. Приклад 5. Утворення антитіл, специфічних щодо BoNT-гідролази (1) Утворення IgY. Курей у віці шістнадцяти тижнів [ІСА-Браун та ломанн-легорн (LSL), Spreenhagener Vermehrungsbetrieb für Legehennen GmbH, Бестензе, Німеччина] тримали в окремих клітках, сконструйованих спеціально для утримання курей (Ebeco, Кастроп-Рауксель, Німеччина). Їжа (ssniff Legehühner-Zucht 1 та 2; ssniff Spezialitäten GmbH, Зост, Німеччина) та 26 UA 111795 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вода були доступними ad libitum, і кури починали відкладати яйця у віці 23-25 тижнів. Яйця збирали щодня, маркували та зберігали при 4°C до їх подальшої обробки. Всі експерименти та утримання тварин здійснювали відповідно до директив місцевих органів влади у Берліні (№ H0069/03). Курям проводили імунізацію та бустер-ін'єкцію за допомогою внутрішньом'язового шляху (пекторальний м'яз, лівий та правий бік) загалом 10 разів протягом періоду 1 року з інтервалами від 4 до 8 тижнів. Застосовуваний інтервал базувався на попередній роботі, в якій не було показано спостережуваних клітин пам'яті щонайменше до закінчення 3 тижнів після імунізації (Pei and Collisson, 2005). Застосовувана концентрація антигену становила приблизно 20 мкг в розрахунку на одну ін'єкцію (nBH). Ін'єктували не більше 500 мкл розчину антигену за одну процедуру імунізації. Для першої імунізації застосовували повний ад’ювант Фрейнда, а для наступних бустер-ін'єкцій застосовували FIA. Спосіб очищення IgY базувався на роботі Polson та співавт. (1980). Коротко, яєчний жовток розводили 1:2 за допомогою стерильного PBS (pH 7,4, Roche, Мангейм, Німеччина). Для усунення ліпідів та ліпопротеїну додавали 3,5% (вага/об'єм) поліетиленгліколю (PEG) 6000 (Roth, Карлсруе, Німеччина). Після обережного струшування з наступним центрифугуванням (10000 × g протягом 20 хв. при 4°C) надосадову рідину зливали, і додавали твердий PEG 6000 до кінцевої концентрації 12% (вага/об'єм). Цю суміш згодом центрифугували, як описано вище. Осад розчиняли в 10 мл PBS, додавали PEG до 12% (вага/об'єм) і розчин центрифугували. Зрештою осад розчиняли в 1,2 мл PBS, переносили у пристрій для мікродіалізу (QuixSep, Рот, Німеччина) та діалізували проти PBS при 4°C. Вміст білка (мг/мл) аналізували за допомогою SDS-PAGE у 12,5% гелі (фігура 9A), і вимірювали фотометрично при 280 нм, і обчислювали згідно із законом Ламберта-Бера з коефіцієнтом поглинання 1,33 для IgY. (2) ELISA. Титраційні мікропланшети Nunc Maxisorp F96 (VWR International GmbH, Дармштадт, Німеччина) вкривали за допомогою nBH з різних партій (500 нг/мл) у PBS протягом ночі при 4°C та згодом блокували протягом 1 год. за допомогою блокувального буфера PBS, який містив 0,1% Tween-20 та 2% знежирене сепароване молоко (Merck, Дармштадт, Німеччина). Після промивання додавали розведений IgY (10 мкг/мл у блокувальному буфері) на 1 год. і проводили його виявлення за допомогою міченого біотином антитіла віслюка до IgY курки, пероксидази хріну, кон'югованої зі стрептавідином (обидва від Dianova, Гамбург, Німеччина), та 3,3',5,5'-тетраметилбензидину (Sigma). Виявлену nBH проілюстровано на фігурі 9B. (3) Вестерн-блотинг. nBH розділяли за допомогою SDS-PAGE у 12,5% гелі та переносили на мембрану з полівініліденфториду (Invitrogen GmbH, Карлсруе, Німеччина) за допомогою стандартних методик імуноблотингу. Мембрану блокували протягом ночі при 4°C та інкубували з IgY (1:5000 у блокувальному буфері) протягом 1 год. Після промивання мембрану зондували за допомогою міченого біотином антитіла віслюка до IgY курки протягом 30 хв. і проявляли за допомогою лужної фосфатази та CDP-Star (Perkin Elmer, Волтгем, Массачусетс). Приклад 6. Рекомбінантна експресія BoNT-гідролази (1) Плазмідні конструкції. Частини гена, що кодують нативну BH (SEQ ID NO: 1) та її пропептид (SEQ ID NO: 2), ампліфікували шляхом ПЛР із застосуванням придатних олігонуклеотидів та геномної ДНК C. botulinum ATCC 3502, зливали з олігонуклеотидом, що кодує His6-мітку, та вставляли в pQE3 (Qiagen) з отриманням експресійних плазмід pQBH1445H6-249-581 та pQ-BH1445H6-1-581, відповідно. Нуклеотидні послідовності підтверджували шляхом секвенування ДНК. (2) Очищення рекомбінантних білків. nBH та iBH, злиті з карбокси-кінцевою His6-міткою, отримували з використанням E. coli штаму M15pREP4 (Qiagen) протягом десяти годин інкубування за кімнатної температури і очищували їх на гранулах Talon-сефарози (Clontech Inc.) згідно з інструкціями виробника. Фракції, які містили бажані білки, об’єднували, заморожували в рідкому азоті та витримували при -70°C. Виділяли iBH як рекомбінантний білок з MW 63 кДа (фігура 10A). Неактивність iBH демонстрували за допомогою тестування активності: через 1 год. при 37°C не відбувався гідроліз scBoNT/A дикого типу з отриманням LC та HC (фігура 10B). Приклад 7. Інгібування BoNT-гідролази (1) Скринінг щодо пептидних інгібіторів BH. На основі SEQ ID NO: 4-25 синтезують пептиди, в яких відсутні один або декілька основних залишків. Кожен пептид додають до суміші відповідно до тестування активності. Пептид, здатний зменшувати кількість процесованого scBoNT/A, збільшувати необхідну тривалість повного процесингу scBoNT/A або блокувати процесинг scBoNT/A, вважається інгібітором nBH. (2) Скринінг щодо інгібіторів на основі антитіл. Антитіла, утворювані до епітопів, які походять з nBH, такі як IgY з прикладу 5, інкубують з nBH та згодом піддають тестуванню активності. Антитіло, здатне зменшувати кількість процесованого scBoNT/A, збільшувати необхідну 27 UA 111795 C2 5 10 15 20 25 тривалість повного процесингу scBoNT/A або блокувати процесинг scBoNT/A, вважається інгібітором nBH. Приклад 8. Застосування очищеної активної BoNT-гідролази (nBH) для отримання поліпептиду, підданого протеолітичному процесингу (1) Інкубували 200 мкг рекомбінантного очищеного scBoNT/A з 350 нг очищеної активної BoNT-гідролази протягом 12 хв. при 37°C. Для припинення реакції nBH видаляли за допомогою SEC (колонка Superdex 200 10/300 GL, буфер: 50 мМ NaP, pH 7,5, 150 мМ NaCl, об'єм проби = 0,3 мл, швидкість потоку = 0,25 мл/хв.) і ступінь розщеплення аналізували за допомогою SDSPAGE у 10% гелі (фігура 11A). (2) Фракцію 1 (1800 мкл), яка містила BoNT/A, процесований на ~40%, інкубували з 350 нг очищеної активної BoNT-гідролази протягом 15 хв. при 37°C та концентрували до 300 мкл шляхом ультрафільтрації. Для остаточного припинення реакції nBH видаляли за допомогою SEC (колонка Superdex 200 10/300 GL, буфер: 50 мМ NaP, pH 7,5, 150 мМ NaCl, об’єм проби = 0,3 мл, швидкість потоку = 0,25 мл/хв.) і ступінь розщеплення аналізували за допомогою SDSPAGE у 10% гелі (фігура 11B). (2) Фракції 1 та 2 (1800 мкл), які містили BoNT/A, процесований на ~80%, об'єднували та інкубували зі 120 нг очищеної активної BoNT-гідролази протягом 25 хв. при 37°C та концентрували до 300 мкл шляхом ультрафільтрації. Для остаточного припинення реакції nBH видаляли за допомогою SEC (колонка Superdex 200 10/300 GL, буфер: 50 мМ NaP, pH 7,5, 150 мМ NaCl, об'єм проби = 0,3 мл, швидкість потоку = 0,25 мл/хв.) і ступінь розщеплення аналізували за допомогою SDS-PAGE у 10% гелі (фігура 11C). Отримували BoNT/A, процесований на >95% (SEQ ID NO: 3). Ідентичний повністю процесований другий поліпептид (BoNT/A, процесований на >95%) отримували, якщо другий поліпептид піддавали процесингу за один етап протягом 50 хв. при 37°C (200 мкг scBoNT/A, інкубованого з 350 нг nBH). Після періоду інкубування 1 год. при 37°C BoNT/A був процесований більше ніж на 97%. 28