Цитотоксичний засіб, що включає похідні томайміцину, і його терапевтичне застосування

Реферат: Винахід стосується нових похідних томайміцину, що містять лінкер. Винахід також стосується кон'югатних молекул, які містять одне або більше зазначених похідних томайміцину, ковалентно зв'язаних з агентом, що зв'язується із клітиною, за допомогою зшивальної групи, присутньої на лінкері похідної сполуки томайміцину. Винахід також стосується одержання похідних сполук томайміцину й кон'югатних молекул. UA 98153 C2 (12) UA 98153 C2 UA 98153 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь винаходу Даний винахід стосується нових похідних томайміцину й їх терапевтичного застосування як цитотоксичних засобів. Терапевтичне застосування основане на спрямованій доставці похідних томайміцину до певної популяції клітин шляхом хімічного зв'язування похідного томайміцину з агентом, що зв'язується із клітиною. Винахід також стосується кон'югатних молекул, що містять одне або більше із зазначених похідних томайміцину, хімічно зв'язаних з агентом, що зв'язується із клітиною, необов'язково модифікованим. Попередній рівень техніки в даній галузі До теперішнього часу з'явилася множина повідомлень про початі спроби здійснення спрямованої доставки до пухлинних клітин кон'югата моноклональне антитіло-лікарський засіб (Sela et al., in Immuno-conjugates, 189-216 (С. Vogel, ed. 1987); Ghosе et al., in Targeted Drugs 122 (E. Goldberg, ed. 1983); Dienеr et al., in Antibody mediated delivery systems, 1-23 (J. Rodwell, ed. 1988); Pietersz et al., in Antibody mediated delivery systems, 25-53 (J. Rodwell, ed. 1988); Bumol et al., in Antibody mediated delivery systems, 55-79 (J. Rodwell, ed. 1988); G.A. Pietersz & K. Krauеr, 2, J. Drug Targeting, 183-215 (1994); R.V.J. Chari, 31 Adv. Drug Delivery Revs., 89-104 (1998); W.A. Blattler & R.V.J. Chari, in Anticancer Agents, Frontiers in Cancer Chemotherapy, 317-338, ACS Symposium Series 796; Ojima et al. eds, American Chemical Society 2001; J.M. Lambert, 5 Current Opinion in Pharmacology, 543-549 (2005); P.K. Hamann, 15 Expert Opinion on Therapeutics Patents, 1087-1103 (2005)). Всі посилання й патенти, цитовані в описі, включені в нього за допомогою посилання. Цитотоксичні лікарські засоби, такі як метотрексат, даунорубіцин, доксорубіцин, вінкристин, вінбластин, мелфалан, мітоміцин С і хлорамбуцил, були кон'юговані з рядом мишачих моноклональних антитіл. У деяких випадках молекули лікарських засобів з'єднували з молекулами антитіл через проміжну молекулу-носій, таку як сироватковий альбумін (Garnett et al., 46, Cancer Res. 2407-2412 (1986); Ohkawa et al. 23, Cancer Immunol. Imnumother, 81-86 (1986); Еndo et al., 47 Cancer Res. 1076-1080 (1980), дексгран (Нurwitz et al., 2 Appl. Biochem. 2535 (1980); Manabi еt al., 34 Biochem. Pharmacol. 289-291 (1985); Dillman еt al., 46 Cancer Res., 4886-4891 (1986); Shoval et al., 85, Proc. Natl. Aсad. Sci, 8276-8280 (1988)), або поліглутамінова кислота (Tsukada еt al., 73, J. Natl. Cane. lnst., 721-729 (1984); Kato et al., 27.J. Med. Chem., 16021607 (1984); Tsukada et al., 52, Br. J. Cancer, 111-116 (1985)). Широкий ряд лінкерних технологій використовували для одержання таких імунокон'югатів, при цьому досліджували як розщеплювані, так і не розщеплювані лінкери. У більшості випадків можна було спостерігати високий цитотоксичний потенціал лікарських засобів, однак, якщо молекули лікарських засобів могли бути вивільнені з кон'югатів у немодифіковапому вигляді біля цільової (таргетованої) ділянки, то використовували розщеплюваний лінкер. Тести цитотоксичності in vitro, однак, виявили, що кон'югати антитіло-лікарський засіб могли вбивати не тільки антиген-позитивні клітини, але також і інші сусідні клітини, незалежно від експресії антигену на їхній поверхні. Дане явище було названо ефектом "свідка". Такий ефект був виявлений у кон'югатах анти-CanAg антитіло, huC242, з мейтансиноїдами й з аналогом СС1065 (Еrickson et al., 66 Cancer Res., 4426-4433 (2006); Kovtun et al., 66 Cancer Res., 32143221 (2006)). Дотепер лише кон'югати, зв'язані за допомогою розщеплюваного зв'язку, такого як відновлюваний дисульфідний зв'язок, проявляли неспецифічну цитотоксичність, у той час як кон'югати, зв'язані через невідновлюваний тіоефірний зв'язок, не проявляли ефекту свідка. Сильнодіючі цитотоксичні ефекторні молекули, пов'язані з таргетуючими засобами, такими як антитіла, могли б утворювати ефективні похідні лікарських засобів після внутрішньоклітинного процесинга кон'югата. Це могло б відбутися, якщо утворені клітинні метаболіти проявляли б небажані або нелегко контрольовані побічні ефекти. Для того щоб контролювати токсичність кон'югатів антитіло-лікарський засіб, надзвичайно сприятливим може виявитися використання перозщеплюваних лінкерів. Іншим головним недоліком більшості кон'югатів антитіло-лікарський засіб є їхня нездатність забезпечувати достатню концентрацію лікарського засобу біля таргетованої ділянки через обмежене число гартованих антигенів і щодо помірної цитотоксичності канцеростатичних лікарських засобів, подібних метотрексату, даунорубіцину й вінкристину. Для досягнення істотної цитотоксичності стає необхідним зв'язування великої кількості молекул лікарського засобу, або прямо з антитілом, або через полімерну молекулу-носій. Однак такі сильно модифіковані антитіла часто гірше зв'язуються з антигеном-мішенню й швидко виводяться in vivo із кровотоку. Таким чином, альтернативою є використання найбільш ефективних молекул лікарських засобів, таких як молекули, представлені в описі нижче. Нерозщеплювані лінкери також використовували при кон’югуванні. Зокрема, ними цікавилися дослідники з метою застосування в радіоімунотерапії. Їх також використовували при 1 UA 98153 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 з'єднанні токсинів з моноклональними антитілами, наприклад, екзотоксину Pseudomonas з МАb 9.2.27 з використанням гетеробіфункціонального малeіміда сукцинімідил 4-(Nмалеімідометил)циклогексан-1-карбоксилату (SMCC) (EР 306943). Кон'югат МАb з токсином виявився більше специфічним in vitro стосовно позитивної клітинної лінії, ніж відповідний кон'югат, зв'язаний дисульфідним зв'язком, і, отже, менш токсичним, як перевірено на мишачій моделі. Неспецифічна токсичність знижується в значній мірі при використанні нерозщеплюваного лінкора. Такий нерозщеплюваний лінкер використовували у випадку трастузумабу (Герцептину), що таргетує HER 2-рецептор (ЕrbB), HЕRR2 є ключовою мішенню, і досліджували можливості максимального підвищення ефекту використання МАb для інгібування даного рецептора. Одним підходом є посилення ефективності трастузумабу (герцептину) шляхом з'єднання йото з хіміотерапевтичним засобом, у такий спосіб уможливлюючи здійснення цитотоксичної терапії на клітинному рівні (Ranson and Sliwkowski, 63 (Suppl. 1) Oncology, 17-24(2002)). Існують інші варіанти SMCC-Реагенту, наприклад, водорозчинний сульфосукцинімідил 4-(Nмалеімідометил) циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-SMCC), що використовували в реакціях кон'югування. Інші нерозщеплювані лінкери включають, зокрема, Сукцинімідил-SАцетилтіоацетат (SAТА), SATA-SMCC, 2-імінотіазол (2ІТ) і 2IT-SMCC (Foulon еt al., 10, Bioconjugate Chem., 867-876 (1999)). Поперечно-зв'язані реагенти, що містять фрагмент, оснований на галогенацетилі, також використовували, і вони включали N-Сукцинімідил-4(йодацетил)амінобензоат (SIAB), N-Сукцинімідилйодацетат (SIA), N-Сукцинімідилбромацетат (SBA) і N-Сукцинімідил 3-(бромацетамідо)пропіонат (SВAP). Зазначені поперечно-зв'язані реагенти утворюють нерозщеплювані лінкери, зроблені з галогенацетил-основаних фрагментів. Незважаючи на зазначені вище труднощі, були описані пов'язані з молекулами лікарських засобів, придатні цитотоксичні засоби, що включають фрагменти, які зв'язуються із клітиною, і групу цитотоксичних лікарських засобів, відомих як мейтансиноїди (патент США 5208020, патент США 5416064 і публікація R.V.J. Chari, 31 Advanced Drug Delivery Reviews 89-104 (1998)). Аналогічно були описані придатні цитотоксичні засоби, що включають фрагменти, які зв'язуються із клітиною, і аналоги й похідні ефективного протипухлинного антибіотика СС-1065 (патент США 5475092, патент США 5585499 і патент США 6756397). Похідні томайміцину являють собою піроло[1,4]бeнзодіазeпіни (PBD), відомий клас сполук, що проявляють їх біологічні властивості шляхом ковалентного зв'язування з N2 гуаніну в малій борозенці ДНК. Похідні PBD включають ряд речовин, що зв'язуються, у малій борозенці, таких як антраміцин, неотраміцин і DC-81. Протипухлинна активність томайміцину, однак, обмежена через його неспецифічну токсичність відносно нормальних клітин. Тому існує необхідність підвищення терапевтичної активності й зменшення неспецифічних токсичних ефектів сполук томайміцину. Автори даного винаходу показали, що цю проблему можна вирішити за допомогою спрямованої доставки сполук томайміцину шляхом зв'язування їх з агентами, що зв'язуються із клітиною. Крім того, існує необхідність розробки похідних томайміцину, які є розчинними й стійкими у водних розчинах. Крім того, томайміцин є недостатньо ефективним для використання його в кон'югатах, що містять агенти, які зв'язуються із клітинами. Недавно були описані декілька нових похідних PBD і їх протипухлинна активність у передклінічних моделях (WO 00/12508 і WO 2005/085260). Однак первісні клінічні випробування на людині вказують на те, що сполуки даного класу с надзвичайно токсичними з врахуванням дуже малої дози, що може бути введена людині (І. Puzanov, Proc. AACR-NCI-EORTC International Conference, Philadelphia, USA 2005, Abstract #B117). Тому бажано розробити альтернативні похідні, що проявляють менше побічних ефектів без порушення цитотоксичної активності. Попередній рівень техніки Міжнародні заявки WO 2007/085930 і WO 2008/010101 описують похідні томайміцину, які можуть зв'язуватися з агентом, що зв'язується із клітиною, через лінкер, але лінкер не є лінкором, визначеним для сполук відповідно до винаходу. Стаття "Tetrahedron Letters, vol.29, № 40, pp.5105-5108" описує похідні томайміцину, посилання (13)-(15), без якого-небудь лінкера. Міжнародна заявка WO 2005/085250 описує димери PBD загальної формули PBD-A-Y-X(Het)na-L-(Нet)nb-L-(Het)nc-Т-(Het')nd-L-(Нet')ne-L-(Неt')nf-X'-Y'-A'--PBD', де Het і Het' означають аміногетероариленові групи формули -J-G-J' або J'-G-J-, де G означає необов'язково заміщений гетероарилен, na-nf є цілими числами між 0 і 5, L може бути -аланіном, гліцином, 4аміномасляною кислотою або простим зв'язком. Обидва X і X' означають або -NH-, або –С(=О)-, і Y і Y' означають двовалентні групи, так що HY означає алкіл, гетероциклічну або арильну групу або простий зв'язок. Групи А і А' вибирають із О, S, NH або простого зв'язку. Т є двовалентним 2 UA 98153 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 лінкером формули -NН-Q-NH- або -С(=O)-Q-С(=О)-, де Q є двовалентною групою, так що QH означає алкіл, гетероциклічну або арильну групу (необов'язково заміщену). Сполуки відповідно до загальної формули, всі, містять -NH- або -С(=О)-, як X і X', і -NН-Q-NH- або –C(=O)-Q-С(=О)-, які не являють собою випадок для сполук відповідно до винаходу. Міжнародна заявка WO 2005/023814 описує димери PBD, в яких атом азоту N10 захищений за допомогою R10-COO-, що містить місток - X-R"-, де R" означає алкіленову групу, що необов'язково переривається одним або більше гетероатомами N, О або S і/або ароматичними кільцями, і X є О, S або NН. Згадування про лінкер на містку - X-R"-X- немає. Крім того, сполуки відповідно до винаходу не мають захисту біля азоту N10. Стаття "Еuropean Journal of Medicinal Chemistry vol.40, № 7, pp.641-654" описує димери PBD, посилання (38)-(40), які не містять якого-небудь лінкера, як сполуки відповідно до винаходу. Стаття "Expert opinion; Monoclonal antibody-drug conjugates", Ashley publications, vol.15, № 9, 2005, pp.1087-1103, ISSN: 1354-3774, не описує сполуки відповідно до винаходу, і стаття "Cancer Res. 2006, 66(8), pp.4426-4433" описує мейтансиноїд, з'єднаний з агентами, що зв'язуються із клітиною. Суть винаходу Винахід стосується нових похідних томайміцину, охарактеризованим у пп. 1-30 формули винаходу, що містять лінкер. Винахід також стосується кон'югатних молекул, які включають одне або більше із зазначених вище похідних томайміцину, ковалентно з'єднаних з агентом, що зв'язується із клітиною, через групу, що зшиває, яка присутня на лінкері похідного томайміцину. Винахід також стосується одержання похідних томайміцину й кон'югатних молекул. Докладний опис винаходу Визначення - "Алк" являє собою алкіл, алкен або алкіл; - "алкіл" означає аліфатичну вуглеводневу групу, що може бути прямою або розгалуженою, яка містить від 1 до 20 атомів вуглецю в ланцюзі, або циклічну групу, що містить від 3 до 10 атомів вуглецю. Переважні алкільні групи містять від 1 до 12 атомів вуглецю в ланцюзі. "Розгалужена" означає, що одна або більше нижчі алкільні групи, такі як метил, етил або пропіл, приєднані до лінійного алкільного ланцюга. Приклади алкільних груп включають метил, етил, нпропіл, ізопропил, н-бутил, трет-бутил, н-пентил, 3-пентил, октил, ноніл, децил, циклопентил і циклогексил; - "алкен" означає аліфатичну вуглеводневу групу, що містить вуглець-вуглецевий подвійний зв'язок, і яка може бути прямою або розгалуженою, що містить від 2 до 15 атомів вуглецю в ланцюзі. Переважні алкенільні групи містять від 2 до 12 атомів вуглецю в ланцюзі, і більш переважно приблизно від 2 до 4 атомів вуглецю в ланцюзі. Типові алкенільні групи включають етеніл, пропеніл, н-бутеніл, ізобутеніл, 2-еніл, н-пентеніл, гептеніл, октеніл, ноненіл, деценіл; - "алкін" означає аліфатичну вуглеводневу групу, що містить вуглець-вуглецевий потрійний зв'язок, і яка може бути прямою або розгалуженою, що містить від 2 до 15 атомів вуглецю в ланцюзі. Переважні алкинільні групи містять від 2 до 12 атомів вуглецю в ланцюзі, і більш переважно від 2 до 4 атомів вуглецю в ланцюзі. Типові алкинільні групи включають етиніл, пропініл, н-бутиніл, 2-бутиніл, 3-метилбутиніл, н-пентиніл, гептиніл, октиніл і дециніл; - "атом галогену" стосується атома фтору, хлору, брому або йоду: переважно атома фтору й хлору; "арил" означає ароматичну моноциклічну або мультициклічну вуглеводневу кільцеву систему, що містить від 6 до 14 атомів вуглецю, переважно від 6 до 10 атомів вуглецю. Типові арильні групи включають феніл або нафтил; - "Неt" означає гетероцикл або гетероарил; терміни "гетероцикл" або "гетероциклічна група" стосується насичених, частково ненасичених або ненасичених, неароматичних стабільних 3-14-, переважно 10-членних моно-, бі- або мультициклічних кілець, де, щонайменше, один член кільця є гетероатомом. Звичайно гетероатоми включають, але не обмежуються ними, атоми кисню, азоту, сірки, селену і фосфору. Придатні гетероцикли також описані в публікації The Handbook of Chemistry and Physics, 76th Edition, CRC Press, Inc., 1995-1996, pp.2-25 до 2-26, дані про які включені в опис за допомогою посилання. Переважні неароматичні гетероциклічні групи включають, але не обмежуються ними, піролідиніл, піразолідиніл, імідазолідиніл, оксираніл, тетрагідрофураніл, діоксоланіл, тетрагідропіраніл, діоксаніл, діоксоланіл, піперидил, піперазиніл, морфолініл, піраніл, імідазолініл, піролініл, піразолініл, тіазолідиніл, тетрагідротіопіраніл, дитіаніл, тіоморфолініл, дигідропіраніл, тетрагідропіраніл, дигідропіраніл, тетрагідропіридил, дигідропіридил, 3 UA 98153 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 тстрагідропіридиніл, дигідротіопіраніл, азепаніл, а також конденсовані системи, що утворюються в результаті конденсації з фенільною групою; - термін "гетероарил" або "ароматичні гетероцикли" стосується 5-14-, переважно 10членного ароматичного гетеро-, моно-, бі- або мультициклічного кільця. Приклади включають піроліл, піридил, піразоліл, тієніл, піримідиніл, піразиніл, тетразоліл, індоліл, хінолініл, пуриніл, імідазоліл, тієніл, тіазоліл, бензотіазоліл, фураніл, бензофураніл, 1,2, 4-тіадіазоліл, ізотіазоліл, триазоліл, тетразоліл, ізохіноліл, бензотієніл, ізобензофурил, піразоліл, карбазоліл, бензімідазоліл, ізоксазоліл, піридил-N-оксид, а також конденсовані системи, що утворюються в результаті конденсації з фенільною групою; - "алкіл", "циклоалкіл", "алкеніл", "алкініл", "арил", "гетероарил", "гетероцикл" тощо стосуються також відповідного "алкілену", "циклоалкілену", "алкенілену", "алкінілену", "арилену", "гетероарилену", "гетероциклену" і т.п. групам, які утворяться шляхом видалення двох атомів водню; - "нерозщеплювані лінкери" означає будь-яку групу, що підходить для з'єднання ковалентним зв'язком зазначеного вище похідного томайміцину з агентом, що зв'язується із клітиною, де зазначена вище група не містить дисульфідних груп, кислотолабільних груп, фотолабільних груп, нестійких до дії пептидаз груп і нестійких до дії естераз груп. Переважно, зазначені вище "нерозщеплювані лінкери" містять кінцеву карбоксигрупу або амідну групу або їх попередників. Лінкер не розщеплюється протягом внутрішньоклітинного процесінга після інтерналізації кон’югатної молекули всередину клітини й потенційного протеолізу з агентом, що зв'язується із клітиною; - вираз "зшиваються з агентом, що зв'язується із клітиною" стосується похідних томайміцину, що містять, щонайменше, один лінкер, який, у свою чергу, містить групу, що зшиває, або її попередник, що підходить для зв'язування зазначених вище похідних з агентом, що зв'язується із клітиною; переважними групами, що зшивають, є карбокси, амідні зв'язки або їхні попередники; - вираз "сполучений з агентом, що зв'язується із клітиною", стосується кон'югатної молекули, що включає, щонайменше, одне похідне томайміцину, зв'язане з агентом, який зв'язується із клітиною, через придатну групу, що зшиває, або її попередник; переважними групами, що зшивають, є нерозщеплювані зв'язки, або їхні попередники; - "попередник" даної групи стосується будь-якої групи, з якої може утворитися дана група шляхом якого-небудь зняття захисних груп, хімічної модифікації або реакції сполучення; - "пацієнт" стосується або тварини, такому як цінна тварина для селекції, компанії або для збереження, або переважно людини або дитини, що вражена або може бути уражена одним або більше захворюваннями й етапами, представленими в описі; - "терапевтично ефективна кількість" стосується кількості сполуки згідно із даним винаходом, що проявляє ефективність у запобіганні, ослабленні, виключенні, лікуванні або контролюванні симптомів представлених в описі захворювань і станів. Термін "контролювання'" передбачається як такий, що стосується всіх способів, де може бути досягнуте вповільнення, припинення, придушення або припинення розвитку захворювань і станів, представлених в описі, але необов'язково вказує на повне виключення всіх симптомів захворювання або стану, і призначений включити профілактичне лікування; - "фармацевтично прийнятні" стосується таких сполук, матеріалів, носіїв, композицій або дозованих форм, які є, у сфері ретельного медичного обстеження, придатних для контакту із тканинами людини й тварин без зайвої токсичності, подразнення, алергійної реакції або інших проблемних ускладнень, порівнянних із припустимим відношенням користь/ризик; - "фармацевтично прийнятні солі" стосуються похідних описаних сполук, де батьківська сполука модифікована шляхом утворення з неї солей з кислотою або основою. Фармацевтично прийнятні солі включають загальноприйняті нетоксичні солі або четвертинні амонієві солі батьківської сполуки, утворені, наприклад, з нетоксичних неорганічних або органічних кислот. Наприклад, такі звичайні нетоксичні солі включають солі, одержані з неорганічних кислот, таких як хлористоводнева, бромистоводнева, сірчана, сульфамінова, фосфорна, азотна тощо; і солі, одержані з органічних кислот, таких як оцтова, пропіонова, бурштинова, винна, лимонна, метансульфокислота, бензолсульфокислота, глюкуронова, глутамінова, бензойна, саліцилова, толуолсульфокислота, щавлева, фумарова, малеїнова, молочна кислота тощо. Крім того, додаткові солі включають амонієві солі, такі як трометамін, меглумін, еполамін, і т.д., солі металів, таких як натрій, калій, кальцій, цинк або магній. Фармацевтично прийнятні солі згідно з даним винаходом можуть бути синтезовані з батьківської сполуки, що містить основний або кислотний фрагмент, звичайними хімічними способами. Звичайно такі солі можуть бути одержані шляхом взаємодії вільних кислотних або основних форм зазначених сполук зі 4 UA 98153 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 стехіометричною кількістю відповідної основи або кислоти у воді або в органічному розчиннику або в суміші із двох компонентів. Звичайно неводні середовища, подібні до ефіру, етилацетату, етанолу, ізопропанолу або ацетонітрилу, є переважними. Перелік придатних солей знаходиться в Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1985, p.1418, розкритій яких включено в опис за допомогою посилання; - "лікування" або "терапія" означає зворотність, ослаблення, гальмування розвитку або запобігання порушенню або стану, до якого такий термін застосовний, або одного або більше симптомів такого порушення або стану; - "терапевтично ефективна кількість" означає кількість сполуки/лікарського засобу згідно з даним винаходом, ефективну в запобіганні або лікуванні згаданого вище патологічного стану; - "фармацевтично" або "фармацевтично прийнятні" стосуються молекулярних сутностей і композицій, які не проявляють несприятливу, алергійну або іншу небажану реакцію при введенні тварині або людині за необхідності; - "фармацевтично прийнятний наповнювач" включає носії, розріджувачі, ад'юванти або зв'язувальні речовини, такі як консерванти або антиоксиданти, наповнювачі, дезінтегруючі засоби, змочувальні засоби, емульгуючі засоби, суспендуючі засоби, розчинники, диспергуючі середовища, покриття, антибактеріальні й протигрибкові засоби, ізотонічні й затримуючі усмоктування засоби тощо. Використання таких середовищ і засобів для фармацевтично активних речовин добре відомо в даній галузі. За винятком випадків, коли будь-яке звичайне середовище або засіб не сполучається з активним інгредієнтом, його використання в терапевтичних композиціях розглядаються. Додаткові активні інгредієнти також можуть бути включені в композиції як придатні терапевтичні комбінації. Похідні томайміцину Винахід оснований на синтезі нових похідних томайміцину, які зберігають високу цитотоксичність і які можуть бути ефективно приєднані до агентів, що зв'язуються із клітиною, нерозщеплюваними лінкерами, такі кон’югати демонструють високу ефективність при знищенні пухлинних клітин. Попередньо було показано, що зв'язування високоцитотоксичних лікарських засобів з антитілами з використанням розщеплюваного зв'язку, такого як дисульфідний зв'язок, приводить до вивільнення повністю активних лікарських засобів усередині клітини, і такі кон'югати проявляють цитотоксичність у специфічному для антигену способі (патент США 6340701; патент США 6327738; патент США 6436931). Однак одержані в зазначеній галузі техніки дані показують, що вкрай важко модифікувати наявні лікарські засоби без зниження їх цитотоксичного потенціалу. Описаний винахід долає зазначені труднощі шляхом модифікації описаних похідних томайміцину хімічними фрагментами. У результаті, описані нові похідні томайміцину зберігають, і в деяких випадках навіть підсилюють, цитотоксичний ефект похідних томайміцину. Комплекси агент, що зв'язується із клітиною-похідне томайміцину повною мірою забезпечують цитотоксичну дію похідних томайміцину, що сприяє їхньому застосуванню в таргетуванні винятково небажаних клітин, отже, дозволяє уникнути побічних ефектів, обумовлених ушкодженням нетаргетованих здорових клітин. Таким чином, винахід стосується придатних засобів для видалення уражених хворобою або аномальних клітин, які передбачається знищити або лізувати, таких як пухлинні клітини (особливо клітини солідних пухлин). 45 50 Цитотоксичний засіб згідноз даним винаходом включає одне або більше похідних томайміцину, необов'язково з'єднуваних або пов'язаних з агентом, що зв'язується із клітиною, через нерозщеплювану групу, що зшиває. Зшиваюча група є частиною хімічного фрагмента, що ковалентно пов'язаний з похідним томайміцину за допомогою звичайних способів. Відповідно до одного аспекту винахід стосується похідних томайміцину формули (І): 5 UA 98153 C2 де являє собою необов'язковий простий зв'язок; 5 10 15 20 25 30 35 40 45 являє собою або простий зв'язок, або подвійний зв'язок; за умови, що коли являє собою простий зв'язок, U і U', однакові або різні, незалежно являють собою H, і W і W', однакові або різні, незалежно вибирають із групи, що складається з OH, простого ефіру, такого як -OR, складного ефіру (наприклад, ацетату), такого як -OCOR або COOR, карбонату, такого як -OCOOR, карбамату, такого як -OCONRR', циклічного карбамату, такого, що N10 і С11 є частиною циклу, сечовини, такої як –NRCONRR', тіокарбамату, такого як OCSNHR, циклічного тіокарбамату, такого, що N10 і С11 є частиною циклу, -SH, сульфіду, такого як -SR, сульфоксиду, такого як -SOR, сульфону, такого як -SOOR, сульфонату, такого як SO3-, сульфонаміду, такого як -NRSOOR', аміну, такого як -NRR', необов'язково циклічного аміну, такого, що N10 і С11 є частиною циклу, похідного гідроксил аміну, такого як -NROR', аміду, такого як -NRCOR', азидогрупи, такої як -N3, ціаногрупи -CN, галогеніду (Hal), триалкілу або триарилфосфонію; переважно W і W' є однаковими або різними й означають -ОН, -ОМе, OEt, -NHCONH2, -SMe; і коли являє собою подвійний зв'язок, U і U' відсутні, і W і W' являють собою Н. - R1, R2, R1', R2' є однаковими або різними й незалежно вибраними з H, галогеніду або алкілу, необов'язково заміщеного одним або більше Hal, CN, NRR', СF3, OR, арилом, Het, S(O)qR, або R1 і R2 і R1' і R2' разом утворюють подвійний зв'язок, що включає групу =В і =В', відповідно. Переважно R1 і R2 і R1' і R2' разом утворюють подвійний зв'язок, що включає групу =B і =В', відповідно. - В і В' є однаковими або різними й незалежно вибраними з алкенілу, необов'язково заміщеного одним або більше Hаl, CN, NRR', CF3, OR, SR, SOR, SO2R, арилом, Het, або В і В' являють собою атом кисню. Переважно, В=В'. Більш переважно В=В'= =СН2 або =СН-СН3, - X, X' є однаковими або різними й незалежно вибраними з одного або більше -О-, -S-, -NR-, -(С=О)-, -SO-, -SO2-; переважно. Х=Х'. Більш переважно, Х=Х'=О. - A, A' є однаковими або різними й незалежно вибраними з алкілу або алкенілу, кожна група необов'язково заміщена одним або більше Наl, CN, NRR', СF3, OR, SR, SOR, SO2R, арилом, Het, алкілом, алкенілом. Переважно, А=А'. Більш переважно, А=А'= лінійному незаміщеному алкілу. - Y, Y' с однаковими або різними й незалежно вибраними з Н, OR; переважно, Y=Y'. Більш переважно, Y=Y'=Оалкілу, більш переважно, Ометилу. - Т означає -NR- або 10-членний арил, циклоалкіл, гетероциклічну групу, гетероарил або лінійний або розгалужений алкіл, кожний заміщений одним або більше нерозщеплюваними лінкером(ами) і необов'язково заміщений одним або більше Hаl, CN, NRR', CF 3, R, OR, SOR або SO2R. - n, n', однакові або різні, дорівнюють 0 або 1; - q дорівнює 0, 1 або 2. Відповідно до іншого аспекту похідні томайміцину мають формулу (I’): 6 UA 98153 C2 5 де R1, R1' R2, R2', W, W', U, U', Y, Y', X, X', А, А' n, n' є такими, як описано вище, і Т означає NR- або 10-членний арил, циклоалкіл, гетероциклічну групу, гетероарил або лінійний або розгалужений алкіл, кожний заміщений одним або більше лінкером(ами) формули -G-D-(Z)рC(=O)-Z'R" і необов'язково заміщений одним або більше Нal CN, NRR', CF 3, R, OR, SOR, SO2R. Місточкова група -Х-Аn-Т-А'nХ'- не містить якої-небудь групи -NH-C(=O)-. Лінкер має формулу: 10 15 20 25 30 35 40 45 50 де - G означає простий, подвійний або потрійний зв'язок, -О-, -S- або -NR-; - D означає простий зв'язок або -Е-, -E-NR-, -E-NR-F-, -Е-О-, -E-O-F-, -E-NR-СО-, -E-CO-NR-, E-NR-CO-F-, -E-CO-NR-F-, -Е-СО-, -СО-Е-, -E-CO-F, -E-S-, -Е-S-F-, -E-NR-CS-, -E-CS-NR-, -E-NRCS-F-, -E-CS-NR-F-; - Е і F є однаковими або різними й незалежно вибраними з лінійних або розгалужених груп (ОСН2СН2)iалкіл(ОСН2СН2)j, -алкіл(ОСH2СН2)іалкіл-, -(ОСH2СН2)j, (ОСH2СН2)iциклоалкіл(ОСН2СН2)j, -(ОСН2СН2)ігетероциклічна група(ОСН2СН2)j, (ОСН2СН2)іарил(ОСН2СH2)j, (OCH2CH2)iгетepoapил(OCH2CН2)j-, -алкіл(ОСН2СН2)іалкіл(ОСН2СН2)j-, алкіл(ОСН2СH2)і-, -алкіл(ОСH2СН2)іциклоалкіл(ОСH2СH2)j-, алкіл(ОСН2СН2)ігетероциклічна група(ОСН2СН2)j, алкіл(ОСН2СН2)іарил(ОСH2СH2)j, алкіл(ОСH2СН2)ігетероарил(ОСH2СH2)j, -циклоалкілалкіл-, -алкілциклоалкіл-, -гетероциклічна група-алкіл-, -алкіл-гетероциклічна група-, -алкіларил-, -арилалкіл-, -алкілгетероарил-, гетероарил алкіл-; - і і j, ідентичн або різні, є цілими числами й незалежно вибраними з 0, 1-2000; - Z означає лінійний або розгалужений алкіл, циклоалкіл, арил, гетероарил, гетероциклил, аралкіл, циклоалкіл, гетероаралкіл або гетероциклилалкіл, необов'язково заміщені сприяючими солюбілізації функціональними групами, такими як аміно, простий ефір, сульфогрупа й карбоксильна група; - р дорівнює 0 або 1; - -C(=CO)-Z'R" являє собою карбоніл, що містить функцію, де - Z' являє собою простий зв'язок або -О-, -S-, -NR- і - R" являє собою Н, алкіл, циклоалкіл, арил, гетероарил або гетероциклічну групу, кожна група необов'язково заміщена одним або більше Hal, CN, NRR', СF3, R, OR, SOR, SO2R, арилом, Het; R, R' є рівними або різними й незалежно вибраними з H, алкілу, арилу, кожна група необов'язково заміщена Hаl, CN, СООН, COOR, CONHR, CONRR', NRR', CF3, R, OR, SOR, SO2R, арилом, Het. Лінкер являє собою ланцюг, що закінчується групою, що зшиває, що не містить якої-небудь розщеплюваної групи, такої як дисульфідна група, кислотолабільна група, фотолабільна група, нестійка до дії пептидаз група й нестійка до дії естераз група. Кінцева група, що зшиває, не містить S-V-групу, де V означає Н, групу, що захищає тіол (таку як COR), R20 або SR20, R20 означає Н, метил, алкіл, необов'язково заміщений циклоалкіл, арил, гетероарил або гетероциклічну групу. Лінкером не є який-небудь лінкер, описаний у міжнародній публікації WO 2007/085930, або в WO 2008/010101. Кінцевою групою, що зшиває, похідних томайміцину відповідно до винаходу переважно є карбоксигрупа або амідна група, біля кінцевої ділянки бічного ланцюга. Бічний ланцюг може бути лінійним або розгалуженим, ароматичним або гетероциклічним. Фахівець у даній галузі зможе легко ідентифікувати придатні бічні ланцюги. Переважні лінкери складаються з лінійних ланцюгів, що містять сприяючі солюбілізації функціональні групи, такі як аміно, гідрокси, простий ефір, сульфогрупи й карбоксильні групи. Т означає переважно 10-членний арил або гетероарил, більш переважно фенільну групу або піридильну групу, заміщені одним або більше зазначеним вище лінкером(ами) і необов'язково заміщені одним або більше Hal, CN, NRR', CF 3, R, OR, SOR або SO2R. 7 UA 98153 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Піридильна група сприяє більш високій розчинності похідної сполуки томайміцину у водних розчинах, ніж фенільна група. Більш висока розчинність може сприяти одержанню кон'югатної молекули з гідрофобним антитілом, оскільки в цьому випадку будуть утворюватися невеликі агрегати, які зможуть підвищити виходи кон'югатних молекул. Фармацевтично прийнятні солі, гідрати або гідратні солі або поліморфні кристалічні структури сполук поряд з оптичними ізомерами, рацематами, діастереомерами або енантіомерами також є частиною винаходу. Коли сполука представлена у вигляді іона + + (наприклад, сульфонату), то протилежний іон може бути присутнім (наприклад, Na або К ). Даний винахід стосується наступних варіантів здійснення винаходу або будь-якої комбінації кожного з них: - G означає простий зв'язок або -О-; - D означає простий зв'язок або -Е- або -Е-О-; - D означає -E-; - E означає лінійний або розгалужений -алкіл- або -алк(ОСН2СН2)і-; - Z означає лінійний або розгалужений -алкіл-; - р дорівнює 0; - Z' означає простий зв'язок або О; - Z' є О; - R" означає H або лінійний або розгалужений -алкіл- або необов'язково заміщену гетероциклічну групу; - R" означає H або алкіл або сукцинімідну групу ( ). Окремі приклади лінкерів включають наступні лінкери: -(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R", -(CR13R14)t(OCH2CH2)yO(CR15R16)uCOZ'R", -(CRI3R14)t(CR17=CR18)(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R", -(CRI3R14)t(NR19CO)(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R", -(CRI3R14)t(OCO)(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R", -(CR13R14)t(CO)(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R", -(CR13R14)t(CONR19)(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R". -(CR13R14)t-фeніл-CO(CR15R16)uCOZ'R", -(CR13R14)t-фypил-CO(CR15R16)uCOZ'R", -(CR13R14)t-oкcaзoліл-CO(CR15R16)uCOZ'R", -(CR13R14)t-тiaзоліл-CO(CR15R16)uCOZ'R", -(CR13R14)t-тієніл-CO(CR15R16)uCOZ'R", -(CR13R14)t-імідазоліл-CO(CR15R16)uCOZ'R", -(CR13R14)t-піперазино-CO(CR15R16)uCOZ'R", -(CR13R14)t-фeніл-QCОZ'R", -(CR13R14)t-фурил-QСOZ'R", -(CR13R14)t-oксазоліл-QCOZ'R", -(CR13R14)t-тіазоліл-QCOZ'R", -(CR13R14)t-тієніл-QCOZ'R", -(CR13R14)t-імідазоліл-QCOZ'R", -(CR13R14)t-пiпepaзинo-QCOZ'R", -(C≡C)-(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R", -O(CR13R14)t(CR15R16)u(OCН2CH2)yCOZ'R", -О(CR13R14)t(NR19CO)(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R", -O(CR13R14)t(CR17=CR18)(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R", - О-Феніл-QCOZ'R", -О-Фурил-QCOZ'R", - О-Оксазоліл-QCOZ'R", - О-Тіазоліл-QCOZ'R", - О-Тієніл-QCOZ'R", - О-Імідазоліл-QCOZ'R", -О-Морфоліно-QCOZ'R", -О-Піперазино-QCOZ'R", -OCO(CR13R14)t(NR19CO)(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R", -OCO(CR13R14)t(CR17=CR18)(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R", -OCONR12(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R", - ОСО-Феніл-QCOZ'R", - ОСО-Фурил-QCOZ'R", -ОСО-Оксазоліл-QCOZ'R", - ОСО-Тіазоліл-QCOZ'R", -ОСО-Тієніл-QCOZ'R", - ОСО-Імідазоліл-QCOZ'R", - OCO-Піперазино-QCOZ'R", або -C(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R", -CO(CR13R14)t(CR17=CR18)(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R", -CONR12(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R", -СО-Фeніл-QCOZ'R", -СО-Фурил-QCOZ'R", -СО-Оксазоліл-QCOZ'R", -СО-Тіазоліл-QCOZ'R", - СО-Тієніл-QCOZ'R", -СО-Імідазоліл-QCOZ'R", 8 UA 98153 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 -СО-Піперазино-QCOZ'R", - СО-Піперидино-QCOZ'R", -NR19(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R", -NR19CO(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R", -NR19(CR13R14)t(CR17=CR18)(CR15R16)u(OCH2CH2)vCOZ'R", -NR19CO(CR13R14)t(CR17=CR18)(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R", -NR19CONR12(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R", -NR19CONR12(CR13R14)t(CR17=CR18)(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R", -NR19СО-Феніл-QCOZ'R", -NR19СО-Фурил-QCOZ'R", -NR19СО-Оксазоліл-QCOZ'R", -NR19СО-Тіазоліл-QCOZ'R", -NR99СО-тієніл-QCOZ'R", -NR19СО-Імідазоліл-QCOZ'R", -NR19СО-Морфоліно-QCOZ'R", -NR19СО-Піперазино-QCOZ'R", -NR19CO-Піперидино-QCOZ'R", -NR феніл-QCOZ'R", -NR фурил-QCOZ'R", -NR оксазоліл-QCOZ'R", -NR тіазоліл-QCOZ'R", -NR тієніл-QCOZ'R", -NR імідазоліл-QCOZ'R", -NR піперазино-QCOZ'R", -NR піперидино-QCOZ'R", -NR19CO-NR феніл-QCOZ'R", -NR19CO-NR оксазоліл-QCOZ'R", -NR19CO-NR тіазоліл-QCOZ'R", -NR19CO-NR тієніл-QCOZ'R", -NR19CO-NR піперидино-QCOZ'R", -S(O)q(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R", -S(O)q(CR13R14)t(CR17=CR18)(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R", -SCONR12(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R", - SCO-Пiпepaзино-QCOZ'R" і -SCO-Піпepидино-QCOZ'R'', де - Q означає прямий зв'язок або лінійний або розгалужений алкіл, що містить 1-10 атомів вуглецю, або спейсер з поліетиленгліколю з 2-20 повторюваними одиницями оксіетилена; - R19 і R12 є однаковими або різними й означають лінійний алкіл, розгалужений алкіл або циклічний алкіл, що містить від 1 до 10 атомів вуглецю, або простий або заміщений арил або гетероциклічну групу, і R12 у додавання може означати Н; - R13, R14, R15 і R16 є однаковими або різними й означають Н або лінійний або розгалужений алкіл, що містить від 1 до 4 атомів вуглецю; - R17 і R18 означають Н або алкіл; - u є цілим числом від 1 до 10 і також може дорівнювати 0; -t є цілим числом від 1 до 10 і також може дорівнювати 0; - у с цілим числом від 1 до 20 і також може дорівнювати 0. Лінкером може бути більш переважно: - -(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R"; - -(CR13R14)t(OCH2CH2)yO(CR15R16)uCOZ'R", - -O(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R", - -O(CR13R14)t(NR19CO)(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R", - -(C≡C)-(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R", або один з наступних: - -O(CR13R14)tCOZ'R"; - -(OCH2CH2)yCOZ'R"; --(C≡C)-(CR13R14)tCOZ'R"; - -O(CR13R14)t(NR19CO)(CR15R16)uCOZ'R"; - -(CR13R14)t(OCH2CH2)yCOZ'R". -Z'R" більш переважно означає -ОН, -Оалкіл або 45 . Придатні лінкери й -Z'R" можна знайти в прикладах наведених в описі. Окрема група сприяє підвищенню реактивності складноефірної функції. Підгрупа сполук включає наступні сполуки: 9 UA 98153 C2 Або 5 де X, X', A, A', Y, Y', Т, n, n' є такими, як визначено вище. Інша підгрупа включає наступні сполуки: 10 Або 15 20 25 30 35 40 де Y, Y', G, D, Z, р, Z' і R" є такими, як визначено вище, і М являє собою СH або N. Як зазначено вище, розчинність похідної сполуки томайміцину поліпшується у водних розчинах, коли М означає N. Відповідно до іншого кращого аспекту, сполуки відповідно до винаходу вибирають із групи, що складається з 4-(3,5-6іс-[(S)-2-ет-(Е)-іліден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5он-8-ілоксиметил]фенокси)масляної кислоти; 4-(3,5-біс-[(S)-2-ет-(Е)-іліден-7-мeтокси-1,2,3,11а-тетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5он-8-ілоксиметил]фенокси)оцтової кислоти; -3-(2-{2-[2-(3,5-біс-[(S)-2-ет-(Е)-іліден-7-метокси-1,2,3,11атетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5-он-8ілоксиметил]феноксі)eтоксі]етокси}етокси)пропіонової кислоти; 6-(3,5-біс-[(S)-2-ет-(Е)-іліден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5он-8-ілоксиметил]феніл)гекс-5-инової кислоти; -3-(2-{2-[2-(2,6-бic-[(S)-2-eт-(Е)-іліден-7-метокси-1,2,3,11атетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5-он-8-ілоксиметил]піридин-4ілоксі)eтоксі]eтокси}етокси)пропіонової кислоти; 4-(2,6-біс-[(S)-2-ет-(E)-іліден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5он-8-ілоксиметил]піридип-4-ілокси)масляної кислоти; -N-[2-(3,5-біс-[(S)-2-ет-(Е)-іліден-7-метокси-1,2,3,11атетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5-он-8-ілоксиметил]феноксі)етил]-N-метилсукцинамової кислоти; -4-(3,5-біс-[(S)-2-метиліден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5он-8-ілоксиметил]феніл)пропанової кислоти; (2-{2-[2-(2-{3-[3,5-біс-(7-метокси-2-метилен-5-оксо-2,3,5,11а-тетрагідро-1Нбензо[е]піроло[1,2-а][1,4]діазепін-8ілоксиметил)феніл]пропокси}етокси)етоксі]етокси}етокси)оцтової кислоти; (3-{2-[2-(2-{3-[3,5-біс-(7-метокси-2-метилен-5-оксо-2,3,5,11а-тетрагідро-1Нбензо[е]піроло[1,2-а][1,4]діазепін-8-ілоксиметил)феніл]пропокси}етокси)етоксі]етокси}етокси) 10 UA 98153 C2 5 10 пропанової кислоти; а також відповідних складних ефірів або N-гідроксисукцинімідильних складних ефірів, або їх фармацевтично прийнятних солей, гідратів або гідратних солей, або поліморфних кристалічних структур зазначених сполук або їхніх оптичних ізомерів, рацематів, діастереомерів або енантіомерів. Геометричні ізомери й стереоізомери сполук загальної формули (I) або (I') також є частиною винаходу. Подвійний зв'язок N10, С11 похідних томайміцину, як відомо, легко перетворюється в зворотній реакції у відповідні імінові адукти в присутності води, спирту, тіолу, первинного або вторинного аміну, сечовини й інших нуклеофілів. Дана реакція є зворотною, і відповідні похідні томайміцину можна легко регенерувати в присутності дегідратуючого реагенту, у непроточному органічному розчиннику, у вакуумі або при високих температурах (Z. Tozuka, 36, J. Antibiotics, 276 (1983)). Таким чином, сьогодення винахід також падає зворотні похідні томайміцину загальної формули (II): 15 20 25 30 35 40 45 50 55 де A, X, Y, n, Т, A', X', Y', n', R1, R2, R1', R2' є такими, як визначено у формулі (І) або (I'), і W, W' є однаковими або різними й вибраними із групи, що складається з ОН, простого ефіру, такого як -OR, складного ефіру (наприклад, ацетату), такого як -OCOR, -COOR, карбонату, такого як OCOOR, карбамату, такого як -OCONRR', циклічного карбамату, такого, що N10 і С11 є частиною циклу, сечовини, такої як -NRCONRR', тіокарбамату, такого як -OCSNHR, циклічного тіокарбамату, такого, що N10 і С11 є частиною циклу, -SH, сульфіду, такого як -SR, сульфоксиду, такого як -SOR, сульфону, такого як -SOOR, сульфонату, такого як -SO3-, сульфонаміду, такого як -NRSOOR', аміну, такого як -NRR', необов'язково циклічного аміну, такого, що N10 і С11 є частиною циклу, похідного гідроксиламіну, такого як -NROR', аміду, такого як -NRCOR', -NRCONRR', азидо, такого як -N3, ціано, галогену, триалкілу або триарилфосфонію, групи амінокислот. Переважно, W і W' є однаковими або різними й означають ОН, ОМе, OEt, NHCONH2, SMe. Таким чином, сполуки формули (II) можуть розглядатися як сольвати, що включають воду, коли розчинником є вода; зазначені сольвати можуть бути особливо придатними. Щодо одержання сполук Сполуки можуть бути синтезовані шляхом використання або пристосування способів, описаних нижче, або варіантами способів, визначених фахівцем у даній галузі. Відповідні модифікації й заміщення будуть очевидні й добре відомі або легко одержувані на основі наукової літератури фахівцями в даній галузі. Зокрема, такі способи можна знайти в R.C. Larock, Comprehensive Organic Transformations, Wiley-VCH Publishers, 1999. Варто розуміти, що сполуки згідно з даним винаходом можуть містити один або більше асиметрично заміщених атомів вуглеців і можуть бути виділені в оптично активних або рацемічних формах. Таким чином, передбачаються всі хиральні, діастереомерні, рацемічні форми й всі геометричні ізомерні форми структури, якщо не зазначена особливо специфічна стереохімія або ізомерна форма. У даній галузі добре відомо, як одержати й виділити такі оптично активні форми. Наприклад, суміші стереоізомерів можуть бути відділені звичайними способами, що включають, але не обмежені ними, розділення рацемічних форм, стандартне, із зворотною фазою або хиральну хроматографію, переважне утворення солі, перекристалізацію тощо, або шляхом хирального синтезу або з хиральних вихідних матеріалів, або навмисним синтезом хиральних центрів-мішеней. У реакціях, представлених в описі нижче, може виявитися необхідним захистити активні функціональні групи, наприклад, гідрокси, аміно, іміно, тіо або карбоксигрупи, присутність яких є бажаною у кінцевому продукті, щоб уникнути небажаної участі в реакціях. Загальноприйняті захисні групи можуть бути використані відповідно до звичайної практики, наприклад, див. T.W. rd Greene and P.G.M. Wuts в Protective Groups in Organic Chemistry, 3 еd., John Wiley and Sons, 1999; J.F.W. McOmie в Protective Groups in Organic Synthesis, Plenum Press, 1973. Деякі реакції можуть бути здійснені в присутності основи. Особливого обмеження щодо природи основи, що призначена для використання в даній реакції, немає, і будь-яка основа, 11 UA 98153 C2 5 10 15 20 25 звичайно використовувана в реакціях даного типу, може бути використана рівною мірою, за умови, що вона не надає несприятливого впливу на інші частини молекули. Приклади придатних основ включають гідроксид натрію, карбонат калію, триетиламін, гідриди лужних металів, такі як гідрид натрію й гідрид калію; сполуки алкіллітію, такі як метиллітій і бутиллітій; і алкоголяти лужних металів, такі як метилат натрію й етилат натрію. Звичайно реакції здійснюють у придатному розчиннику. Ряд розчинників може бути використаний за умови, що вони не падають несприятливого впливу на реакцію або на використовувані реагенти. Приклади придатних розчинників включають вуглеводні, які можуть бути ароматичними, аліфатичними або циклоаліфатичними вуглеводнями, такими як гексан, циклогексан, бензол, толуол і ксилол; аміди, такі як диметилформамід; спирти, такі як етанол і метанол, і прості ефіри, такі як діетиловий ефір і тетрагідрофуран. Взаємодії можуть мати місце в широкому діапазоні температур. В основному, реакцію можна здійснювати при температурі від -20 °C до 150 °C (більш переважно приблизно від кімнатної температури до 100 °С). Час, необхідний для реакції, також може змінюватися в значній мірі, залежно від багатьох факторів, особливо від температури реакції й природи реагентів. Однак тільки якщо реакція протікає ефективно при переважних умовах, описаних вище, періоду часу від 3 годин до 20 годин звичайно буває достатньо. Одержані в такий спосіб сполуки можуть бути витягнуті з реакційної суміші звичайними способами. Наприклад, сполуки можуть бути витягнуті шляхом відгонки розчинника з реакційної суміші або, якщо необхідно, після дистиляції розчинника з реакційної суміші, вилити залишок у воду з наступною екстракцією органічним розчинником, що не змішується з водою, і дистиляцією розчинника з екстракту. Крім того, продукт, якщо бажано, можна також очистити різними добре відомими способами, такими як перекристалізація, переосадження або різні методи хроматографії, особливо колонкова хроматографія або препаративна тонкошарова хроматографія. Перший шлях синтезу Відповідно до першого шляху синтезу, спосіб одержання сполук, де Т містить кінцеву карбоксигрупу, включає стадію видалення захисту із сполук формули: 30 35 40 45 де Y, Y', X, А, А', X', n, n', W, W', U, U', , R1, R2, R1', R2' є такими, як визначено вище, і Т' відповідає Т, де кінцева карбоксигрупа захищена N-сукцинімідною групою або етерифікована. Типовою реакцією видалення захисної групи с гідроліз сполуки формули (І), де T' відповідає Т, де кінцева карбоксигрупа представлена у вигляді складного ефіру. Зазначену вище реакцію гідролізу звичайно проводять в основних умовах, у присутності органічної або мінеральної основи, такої як LiOH, з наступним додаванням органічної або мінеральної кислоти, такої як хлористоводнева кислота. Зазначені сполуки можуть бути одержані шляхом поєднання відповідних сполук формул (IV), (IV') і (V): де Lg є групою що видаляється, такою як галоген, -OMs (мезилат), -ОTs (тозилат) або – + OPPh3 (проміжна сполука, утворена в реакції Міцунобу). 12 UA 98153 C2 5 10 15 Сполуки формул (IV) і (IV') є добре відомими, описаними, наприклад, в WO 00/12508, WO 00/12507, WO 2005/040170, WO 2005/085260, або є комерційно доступними, і/або є доступними при використанні повного синтезу (М. Mori et al., 42 Tetrahedron, 3793-3806, 1986), або продукуються видом Streptomyces, зокрема, при використанні процедури, описаної у французькому патенті FR 1516743, або можуть бути одержані за допомогою застосування або пристосування ілюстративних процедур, описаних у прикладах. Сполуки формули (V) можуть бути одержані з відповідних сполук формули НО-Аn-Т'-А'n'-ОН (VI). Реакцію звичайно проводять у присутності PPh 3, і СНаl4 або шляхом взаємодії із сульфонілхлоридом (метансульфонілхлорид або мезилхлорид) у присутності основи, такої як триетиламін або гідроксид калію, переважно триетиламін. Сполуки формули (VI) можуть бути одержані з відповідних сполук формули НО-Аn-Т"-А'n'ОН (VII), де Т" є попередником групи Т. Попередник групи Т стосується будь-якої групи, що може привести до Т будь-яким способом видалення захисту, хімічної модифікації або зв'язування. Переважно, Т одержують шляхом зв'язування Т' з комплементарною частиною, де T' і комплементарна частина включають функції, які с реактивними одна до одної, наприклад, T' містить функціональну гідроксильну групу, і комплементарна частина являє собою бромисту сполуку. Типовий приклад зазначеної реакції описаний нижче: 20 Звичайно дану реакцію здійснюють у присутності карбонату калію. Сполуки формули (VII) можуть бути комерційно доступними або одержані шляхом пристосування або використання відомих способів або відповідно до прикладів. Приклад необмежуючої винахід схеми даного шляху синтезу представлений нижче: 25 30 35 Другий шлях синтезу Відповідно до другого шляху синтезу сполуки можуть бути одержані з відповідної сполуки формули (III): де Y, Y', X, А, А', X', n, n', W, W', U, U', , , R1, R2, R1', R2' є такими, як визначено вище, і Т" є необов'язково захищеним попередником групи Т. Попередник групи Т стосується будь-якої групи, що може привести до Т шляхом хімічної модифікації або зв'язування. 13 UA 98153 C2 5 10 15 Переважно, Т одержують шляхом зв'язування Т' з відповідною комплементарною частиною, де Т' і комплементарна частина включають функції, які є реактивними одна до одної, наприклад, Т' містить амінну функцію, і комплементарна частина містить кислотну функцію. Звичайно таку реакцію здійснюють у присутності N-гідроксисукциніміду й HOВТ (N-гідроксибензотриазол). Сполука формули (III) може бути одержана шляхом зв'язування відповідних сполук формул (IV), (IV') і (V): + де Lg є групою, що видаляється, такою як галоген або -OMs, -OTs або –OPPh3 (інтермедіат, утворений у реакції Міцунобу). Сполуки формули (V') можуть бути одержані з відповідних сполук формули HО-Аn-Т"-A'n'ОH (VII), де Т" є необов'язково захищеною попередньою групою Т'. Дану реакцію звичайно здійснюють у присутності PPh3 і СНаl4 або шляхом мезилування гідроксифункцій. Сполуки формули (VII) можуть бути комерційно доступними або одержані шляхом пристосування або використання відомих способів або відповідно до прикладів. Третій шлях синтезу Відповідно до третього шляху синтезу, сполуки, що мають симетричну структуру (R1=R 1', R2=R2' і Y=Y'), можуть бути одержані циклізацією відповідних сполук формули (VIII): 20 25 30 де Y, X, X', A, A', n, n', R1, R2, Т є такими, як визначено вище. Звичайно зазначену реакцію здійснюють у присутності реагенту, такого як гідросульфіт натрію (Na 2S2O4), у придатному розчиннику, такому як суміш TГФ/вода, з наступним додаванням МеОН і AсСІ. Сполуки формули (VIII) можуть бути одержані з відповідних сполук формули (IX): Дану реакцію здійснюють у присутності реагенту, такого як гідрид діізобутилалюмінію (DIBAL-H) у придатному розчиннику, такому як толуол. Сполуки формули (IX) можуть бути одержані шляхом зв'язування відповідних сполук формул (X) і (XI): 35 14 UA 98153 C2 Звичайно дану реакцію здійснюють шляхом додавання до (X) реагенту, такого як оксалілхлорид, у придатному розчиннику, такому як ДМФ, з наступним додаванням (XI) у придатному розчиннику, такому як ТГФ. Типова необмежуюча винахід схема для даного шляху представлена нижче: 5 10 15 20 25 30 35 40 Представлені вище реакції можуть бути здійснені фахівцем у даній галузі шляхом використання або пристосування способів, ілюстрованих у прикладах, наведених в описі. Крім того, способи, представлені в описі, можуть включати додаткову стадію(ї) виділення будь-яких кінцевих або проміжних продуктів. Зазначену стадію може здійснити фахівець у даній галузі будь-яким з відомих стандартних способів, таких як методи витягування, описані вище. Вихідні продукти є комерційно доступними або можуть бути одержані шляхом використання або пристосування будь-яких відомих способів або способами, описаними в прикладах. Синтез також можна здійснювати в одну стадію як багатокомпонентну реакцію. Відносно кон'югатної молекули Даний винахід також стосується кон'югатної молекули, що містить, щонайменше, одне похідне томайміцину, хімічно пов'язане з агентом, що зв'язується із клітиною, за допомогою зшиваючої групи лінкера. Хімічним зв'язком є переважно ковалентний зв'язок. Зазначений вище кон'югат містить одне або більше похідних томайміцину відповідно до винаходу, ковалентно пов'язаних з агентом, що зв'язується із клітиною, за допомогою зшиваючої групи лінкера похідного томайміцину. Як характерний приклад, зазначений вище кон'югат включає похідне томайміцину відповідно до винаходу, ковалентно пов'язане з агентом, що зв'язується із клітиною, через кінцеву групу -CO-Z'R" лінкера. Зазначена вище, зшиваюча група, ковалентно зв'язує агент, що зв'язується із клітиною, з лінкером похідною томайміцину. Переважно, лінкер зв'язується з агентом, що зв'язується із клітиною, за допомогою функції, активної по відношенню, наприклад, до полової функції й амінної функції агента, що зв'язується із клітиною, зробленим з відновлених дисульфідних зв'язків і залишків лізину, відповідно. Точніше, зазначене вище похідне зв'язується за допомогою групи -С- з амінофункцією залишку лізину зазначеного вище, що зв'язується із клітиною агента, з утворенням амідного зв'язку. Агенти, що Зв'язуються із клітиною, можуть бути будь-якого типу й включають пептиди й непептиди. Звичайно вони можуть бути антитілами (особливо моноклональними антитілами) або фрагментом антитіла, що містить, щонайменше, один зв'язуючий сайт, лімфокінами, гормонами, факторами росту, молекулами, що переносять біогенні речовини (такі як трансферин), або будь-якою іншою молекулою, що зв'язується із клітиною, або речовиною. Більш специфічні приклади агентів, що зв'язуються із клітиною, які можуть бути використані, включають моноклональні антитіла; химерні антитіла; гуманізовані антитіла; цілком людські антитіла; одноланцюжкові антитіла; фрагменти антитіл, такі як Fab, Fab', F(ab')2 and Fv {Parham, 131 J. Immunol. 2895-2902 (1983); Spring et al., 113 J. Immunol. 470-478 (1974); Nisonoff et al., 89 Arch. Biochem. Biophys. 230-244 (1960)}; інтерферони; пептиди; лімфокіни, такі як IL,-2, IL-3, IL-4, 15 UA 98153 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 IL-6; гормони, такі як інсулін, TRH (гормони, що звільняють тиреотропін), MSH (МСГ) (меланоцитстимулюючий гормон), стероїдні гормони, такі як андрогени й естрогени; фактори росту й колонієстимулюючі фактори, такі як EGF, TGF, інсулінподібний фактор росту (IGF-I, IGF-II) G-CSF, M-CSF і GM-CSF {Burgess, 5 Immunology Today 155-158 (1984)}; вітаміни, такі як фолат і трансферин (O'Keefe et al., 260 J. Biol. Chem. 932-937 (1985)}. Вираз "агент, що зв'язується із клітиною", також включає, агенти, що зв'язуються із клітиною, де зазначений, що зв'язується із клітиною агент модифікований за допомогою засобу, що модифікує, для поліпшення активності зазначеного агента, що зв'язується із клітиною, стосовно зшиваючої групи лінкера похідного томайміцину. Технологія моноклональних антитіл дозволяє одержувати надзвичайно виборчі агенти, що зв'язуються із клітиною, у вигляді специфічних моноклональних антитіл. Особливо, добре відомими в даній галузі є способи створення моноклональних антитіл, продукованих імунізованими мишами, щурами, хом'ячками або будь-якими іншими ссавцями, з антигеном, що цікавить, таким як інтактна клітина-мішень, антигени, виділені із клітини-мішені, цільний вірус, ослаблений цільний вірус і вірусні білки, такі як білки вірусної оболонки. Відбір придатного агента, що зв'язується із клітиною, є завданням вибору, що залежить від окремої клітинної популяції, що призначена для таргетування, але, взагалі, моноклональні антитіла є переважними, якщо придатне антитіло є доступним. Наприклад, моноклональне антитіло MY9 є мишачим IgG1 антитілом, що зв'язується специфічно з антигеном CD33 (J.D. Griffin et al. 8 Leukemia Res., 521 (1984)} і може бути використано, якщо клітини-мішені експресують CD33, що експресується клітинами при гострому мієлоїдному лейкозі (AML). Аналогічно, моноклональне антитіло анти-В4 є мишачим IgG1, що зв'язується з антигеном CD19 на В-клітинах {Nadler et al., 131 J. Immunol. 244-250 (1983)}, і може бути використано, якщо клітини-мішені є В-клітинами або ушкодженими клітинами, експресуючими даний антиген, що експресується клітинами при неходжкінській лімфомі або хронічному лімфолейкозі. Як зазначено вище, антитіла MY9 і анти-В4 можуть бути мишачими, химерними, гуманізованими або повністю людськими антитілами. Крім того, фактор GM-CSF, що зв'язується з мієлоїдними клітинами, може бути використаний у якості агента, що зв'язується із клітиною, для уражених клітин при гострому мієлоїдному лейкозі. IL-2, що зв'язується з активованими Т-клітинами, може бути використаний для запобігання відторгнення трансплантату, для терапії й запобігання реакції "трансплантатпроти-хазяїиа" і для лікування гострого Т-клітинного лейкозу. MSН, що зв'язується з меланоцитами, може бути використаний для лікування меланоми. Прикладами придатних моноклональних антитіл, які можуть бути використані для одержання кон'югатної молекули, можуть бути антитіла hu2Н11 (зареєстровано під РТА-7662 в АТСС), huMy9-6, описане в WO 2004/043344, huDS6, описане в WO 2005/009369, або антитіло, описане в WO 2008/047242, WO 2005/061541 або WO 02/16101. Похідні томайміцину можуть бути пов'язані з антитілом або іншим агентом, що зв'язується із клітиною, через функцію амідного типу. Переважно, синтезовані похідні містять карбоксильну функцію, і потім одне або більше похідні, що містять карбонові кислоти, кожне ковалентно зв'язується з агентом, що зв'язується із клітиною, за допомогою амідного зв'язку. Характерними кон'югатами відповідно до винаходу є антитіло-похідне томайміцину, фрагмент антитіла-похідне томайміцину, епідермальний фактор росту (EGF)-пoxiднe томайміцину, меланоцитстимулюючий гормон (MSН)-похідне томайміцину, тиреотропний гормон (TSН)-пoxідне томайміцину, естроген-похідне томайміцину, аналог естрогену-похідне томайміцину, андроген-похідне томайміцину, аналог андрогену-похідне томайміцину й фолатпохідне томайміцину. Кон'югати можуть бути очищені ВЕРХ або гель-фільтрацією. Переважно, кон'югати моноклональне антитіло- або агент, що зв'язується із клітиною, похідне томайміцину являють собою кон'югати молекул, зв'язаних амідним зв'язком, як описано вище, які проявляють здатність доставляти похідні томайміцину. Кон'югати можуть бути одержані з використанням N-гідроксисукцинімідних похідних карбоксильної функції на кінці лінкера димерного томайміцину. Кон'югати, що містять від 1 до 10 одиниць лікарського засобу похідного томайміцину, зв'язаних амідним зв'язком, легко одержують зазначеним способом. Точніше, розчин антитіла при концентрації 8 мг/мл у водному буфері, що містить 0,05 М фосфату калію, 0,05 М хлориду натрію й 2 мМ етилендіамінтетраоцтової кислоти (ЕДТА), при рН 8, обробляють 5-кратним молярним надлишком розчину N-гідроксисукцинімідного похідного димера томайміцину в диметилацетаміді (DMA) таким чином, що кінцева концентрація DMA у буфері становить 20 %. Реакційну суміш перемішують протягом 70 хв. при кімнатній температурі (кт). Кон'югат антитіло-похідне томайміцину очищають і відокремлюють від лікарського засобу, що не прореагував, й іншого низькомолекулярного матеріалу гель 16 UA 98153 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 фільтрацією за допомогою колонки з Sеphadеx G-25 або Sephacryl S300 або Supеrdеx 200. Зразок також може бути діалізований протягом ночі в буфері при рН 6,5 для очищення продукту. Число фрагментів похідного томайміцину, пов'язаних з молекулою антитіла, можна визначити шляхом вимірювання відносини абсорбції при 320 нм і 280 нм. У середньому, 1-10 молекул похідного томайміцину/молекулу антитіла можна з'єднати амідним зв'язком даним способом. Вплив кон'югування на спорідненість до зв'язування з антиген-експресуючими клітинами можна визначити за допомогою способів, раніше описаних Liu et al., 93 Proc. Natl. Acad. Sci. 8618-8623 (1996). Цитотоксичність похідних томайміцину і їх кон'югатів з антитілом щодо клітинних ліній можна виміряти методом зворотної екстраполяції кривих клітинної проліферації, як описано в публікації Goldmacher et al., 135 J. Immunol. 3648-3651 (1985). Цитотоксичність зазначених сполук відносно адгезивних клітинних ліній можна визначити за допомогою клоногенного аналізу, як описано Goldmacher еt al., 102 J. Cell Вiol. 1312-1319 (1986). Характерними кон’югатами відповідно до винаходу є кон'югати похідних томайміцину з антитілами, фрагментами антитіл, епідермальним фактором росту (EGF), меланоцитстимулюючим гормоном (MSH), тиреотропним гормоном (TSH), естрогеном, аналогами естрогену, андрогеном і аналогами андрогену. Характерні приклади одержання різних кон'югатів похідних і агентів, що зв'язуються із клітиною, описані нижче. Амідні лінкери: наприклад, моноклональним антитілом MY9 с мишаче IgG 1 антитіло, що специфічно зв'язується з антигеном CD33 (J.D. Griffin et al. 8 Leukemia Res., 521 (1984)} і може бути використано, якщо клітини-мішені експресують CD33, що експресується клітинами при гострому мієлоїдному лейкозі (AML). Аналогічно, моноклональне антитіло анти-В4 є мишачим імуноглобуліном IgG1, що зв'язується з антигеном CD19 на В-клітинах (Nadler et al., 131 J. Immunol., 244-250 (1983)} і може бути використано, якщо клітини-мішені є В-клітинами або ураженими клітинами, які екепресують даний антиген, такими як при неходжкінській лімфомі або хронічному лімфобластному лейкозі. Крім того, фактор GM-CSF, що зв'язується з мієлоїдними клітинами, може бути використаний як агент, що зв'язується із клітиною, для клітин при гострому мієлоїдному лейкозі. IL-2, що зв'язується з активованими Т-клітинами, може бути використаний для запобігання відторгнення трансплантату, для терапії й запобігання реакції "трансплантат-проти-хазяїна" і для лікування гострого Т-клітинного лейкозу. MSH, що зв'язується з меланоцитами, може бути використаний для лікування меланоми. Антитіло або інший агент, що зв'язується із клітиною, взаємодіє з N-гідроксисукцинімідним похідним карбонової кислоти з одержанням амід-зв'язаного кон'югата. Кон’югати, одержані описаними вище способами, можуть бути очищені стандартними способами хроматографії, такими як гель-фільтрація, адсорбційна хроматографія, що включає, але не обмежена ними, іонобмінну хроматографію, хроматографію з гідрофобною взаємодією, афінну хроматографію, хроматографію на керамічному гідроксіапатиті або на Porapak, або ВЕРХ. Очищення діалізом або діафільтрацією також можуть бути використані. Переважно, кон'югати між моноклональними антитілами або агентами, що зв'язуються із клітиною, і похідними згідно з даним винаходом являють собою такі кон'югати, які зв'язуються через амідний зв'язок, як описано вище. Такі кон’югати, що зв'язуються із клітиною, одержують відомими способами, такими як модифікація молекул лікарських засобів, що зв'язуються, які володіють карбоксильною функцією, з одержанням N-гідроксисукцинімідного похідного карбонової кислоти. Потім активовані карбоксильні групи ацилують залишки лізину, ідо втримуються в молекулі антитіла, з одержанням кон'югатів, зв'язаних амідним зв'язком. Кон'югати, що містять від 1 до 10 похідних, зв'язаних через амідний місток, легко одержують зазначеним способом. Відповідно до переважного аспекту агентом, що зв'язується із клітиною, є антитіло, зокрема, моноклональне антитіло. Відповідно до іншого переважного аспекту, агентом, що зв'язується із клітиною, є антиген-специфічний фрагмент антитіла, такий як sFV, Fab, Fab' F(ab')2. Щодо використання кон'югатної молекули Даний винахід також стосується фармацевтичних композицій, що містять кон'югатну молекулу відповідно до винаходу або похідне томайміцину, як визначено вище, разом з фармацевтично прийнятним носієм. Даний винахід також стосується способу знищення клітин або інгібування росту клітин, переважно вибраних із клітинних популяцій, що включає контакт клітин-мішеней або тканини, що містить клітини-мішені, з ефективною кількістю фармацевтичної композиції. Вибраними клітинними популяціями є ракові й/або проліферуючі клітини. Даний винахід також стосується способу лікування, переважно виборчого лікування раку, що включає введення ефективної 17 UA 98153 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кількості фармацевтичної композиції хворому при необхідності такого лікування. "Виборче лікування раку" стосується загибелі ракових і/або проліферуючих клітин, в основному, без знищення нормальних і/або непроліферуючих клітин. Даний винахід також стосується використання кон'югатної молекули або похідного томайміцину, як визначено вище, для одержання лікарського засобу з метою лікування раку. Спосіб інгібування росту вибраних клітинних полуляцій може бути здійснений на практиці in vitro, in vivo або ex vivo. Приклади використання in vitro включають обробки клітинних культур з метою знищення всіх клітин за винятком бажаних варіантів, які не експресують антиген-мішень; або з метою знищення варіантів, які експресують небажаний антиген. Умови неклінічного використання in vitro легко визначає фахівець у даній галузі. Приклади використання ex vivo включають обробки аутологічного кісткового мозку до його пересадження тому ж хворому, щоб знищити вражені або злоякісні клітини, обробки кісткового мозку до його пересадження, щоб знищити компетентні Т-клітини й запобігти реакції трансплантат-проти-хазяїна (GVНD). Клінічна обробка ex vivo з метою видалення пухлинних клітин або лімфоїдних клітин з кісткового мозку до аутологічної трансплантації при лікуванні раку або при лікуванні аутоімунного захворювання, або з метою видалення Т-клітин і інших лімфоїдних клітин з алогенного кісткового мозку або тканини до пересадження, щоб запобігти GVНD, може бути здійснена в такий спосіб. Кістковий мозок беруть у хворого або іншого індивідуума й потім інкубують у середовищі, що містить сироватку, до якої додають цитотоксичний засіб відповідно до винаходу, концентрації коливаються приблизно від 10 мкМ до 1 нМ, протягом приблизно від 30 хвилин до 48 годин приблизно при 37 °C. Точні умови концентрації й часу інкубації (=доза) легко визначає фахівець у даній галузі. Після інкубації клітини кісткового мозку промивають середовищем, що містить сироватку, і повертають хворому шляхом внутрішньовенної (i.v.) інфузії відомими способами. У випадках, коли хворий одержує інше лікування, такс як курс абляційної хіміотерапії або тотальне опромінення всього організму, між часом забору кісткового мозку й реінфузією оброблених клітин, оброблені клітини кісткового мозку зберігають замороженими в рідкому азоті, використовуючи стандартне медичне устаткування. Для клінічного використання in vivo цитотоксичний засіб відповідно до винаходу буде подаватися у вигляді розчинів, які перевіряють на стерильність і рівні ендотоксинів, або у вигляді ліофілізованої твердої речовини, що може бути розчинена в стерилізованій воді для ін'єкції. Прикладами придатних протоколів введення кон'югатів є наступні приклади. Кон'югати дають щотижня протягом 6 тижнів у вигляді i.v. болюсу. Дози болюсу дають в 50-400 мл звичайного фізіологічного розчину, до якого можна додати сироватковий альбумін людини (наприклад, від 0,5 до 1 мл концентрованого розчину сироваткового альбуміну людини, 100 мг/мл). Дозування будуть становити приблизно від 50 мкг до 100 мг/кг маси тіла на тиждень, i.v. (діапазон від 10 мкг до 100 мг/кг на ін'єкцію). Через шість тижнів після лікування хворий може одержати другий курс лікування. Окремі клінічні протоколи щодо способу введення, наповнювачів, розріджувачів, дозувань, часу й т.д. може скласти фахівець у даній галузі на підставі клінічного стану. Приклади медичних станів, які можна піддавати лікуванню згідно з in vivo або ex vivo способами знищення вибраних клітинних популяцій, включають злоякісні пухлини будь-якого типу, що включають, наприклад, рак легені, молочної залози, товстої кишки, простати, нирки, підшлункової залози, яєчника й органів лімфатичної системи; меланоми; аутоімунні захворювання, такі як системний червоний вовчак, ревматоїдний артрит і розсіяний склероз; відторгнення трансплантату, такі як відторгнення ниркового трансплантату, відторгнення трансплантату печінки, відторгнення трансплантату легені, відторгнення трансплантату серця й відторгнення трансплантату кісткового мозку; реакція трансплантат-проти-хазяїна; вірусні інфекції, такі як інфекція CMV, інфекція HIV, AIDS, і т.п.; бактеріальна інфекція й паразитарні інфекції, такі як гіардіоз, амебіаз, шистосомоз і інших, обумовлених фахівцем у даній галузі. Терапевтично ефективну кількість може легко визначити лікар, як фахівець у даній галузі, шляхом використання звичайних методів і спостереження результатів, одержаних в аналогічних ситуаціях. При визначенні терапевтично ефективної кількості ряд факторів розглядається лікарем, що включають, але не обмежених ними, вид суб'єкта, його розмір, вік і загальний стан здоров'я; окреме захворювання; ступінь поразки хворобою або тяжкість захворювання; відповідь індивідуального суб'єкта; окрема введена сполука; спосіб введення; характеристику біодоступності введеного препарату; вибраний дозовий режим; використання супутнього лікарського препарату й інші істотні обставини. Кількість, необхідна для досягнення бажаного біологічного ефекту, буде змінюватися залежно від ряду факторів, що включають хімічні характеристики (наприклад, гідрофобність) використовуваних сполук, ефективність сполук, тин захворювання, вид, до якого хворий належить, стадію захворювання, спосіб введення, біодоступність сполуки при вибраному 18 UA 98153 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 способі введення, всі фактори, що обумовлюють необхідні дозові кількості, доставку й режим введення. Загалом, сполуки відповідно до даного винаходу можуть бути надані у водному фізіологічному буферному розчині, що містить від 0,1 до 10 % мас./об. сполуки для парентерального введення. Типові діапазони доз становлять від 1 мкг/кг до 0,1 г/кг маси тіла на день; переважна область доз становить від 0,01 мг/кг до 10 мг/кг маси тіла на день або еквівалентну дозу для дитини. Переважне дозування лікарського засобу, призначеного для введення, імовірно, залежить від таких змінних параметрів, як тип захворювання й ступінь розвитку захворювання або порушення, загальний статус здоров'я окремого хворого, відносна біологічна ефективність вибраної сполуки, композиція сполуки, спосіб введення (внутрішньовенний, внутрішньом'язовий, внутрішньочеревні ший, підшкірний або інший), фармакокінетичні властивості сполуки, обумовлені вибраним способом доставки, і швидкість (болюс або безперервна інфузія) і режим введень, (число повторень в даний період часу). Звичайно композиції можуть бути введені в стандартній лікарській формі й можуть бути одержані будь-яким із способів, добре відомих у фармацевтичній галузі, наприклад, як описано th в публікації Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20 ed.; Gennaro, A.R., Ed.; Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2000. Рідкі препарати для парентерального введення включають стерилізовані водні або неводні розчини, суспензії й емульсії. Рідкі композиції також можуть включати зв'язувальні речовини, буфери, консерванти, хелатуючі засоби, підсолоджувачі, ароматичні й барвні засоби тощо. Неводні розчинники включають спирти, пропіленгліколь, поліетиленгліколь, рослинні олії, такі як оливкова олія, і органічні складні ефіри, такі як етилолеат. Водні носії включають суміші спиртів і води, забуферені середовища й фізіологічний розчин. Зокрема, біосумісний, біодеградований полімер лактиду, співполімер лактид/гліколід або співполімери поліоксіетилен-поліоксипропілен можуть бути придатними наповнювачами для контролювання вивільнення активних сполук. Внутрішньовенні наповнювачі можуть включати рідкі й поживні добавки, добавки електролітів, такі як добавки, основані на розчині Рінгера-декстрози, тощо. Інші потенційно придатні парентеральні системи доставки для зазначених активних сполук включають частинки співполімера етилен-вінілацетат, осмотичні насоси, імплантовані інфузійні системи й ліпосоми. Фігури Фіг. 1: in vitro цитотоксичність метилового ефіру 4-(3,5-бic-[(S)-2-eт-(E)-іліден-7метокси-1,2,3,11а-тетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5-он-8ілоксиметил]фенокси)масляної кислоти прикладу 1; Фіг. 2: in vitro цитотоксичність метилового ефіру 4-(3,5-бic-[(S)-2-eт-(E)-іліден-7-метокси1,2,3,11а-тетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5-он-8-ілоксиметил]фенокси)оцтової кислоти прикладу 2; Фіг. 3: in vitro цитотоксична активність сполук 8 (IGP08) і 9 (IGР08-ОМе) прикладу 8; Фіг. 4: являє собою дані мас-спектрального аналізу деглікозилованого huMy9-6 -4-(3,5-біс[(S)-2-ет-(Е)-іліден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагідропіроло [2,1с][1,4]бензодіазепін-5-он-8ілоксиметил]фенокси)бутирильного кон'югату (що має відношення 2,1 лікарський засіб/антитіло за допомогою УФ, тобто 2,1 одиниць похідного томайміцину на 1 одиницю антитіла, як визначено за допомогою УФ) прикладу 11; Фіг. 5: являє собою дані мас-спектрального аналізу деглікозилованого huB4 -4-(3,5-біс-[(S)-2ет-(Е)-іліден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5-он-8ілоксиметил]фенокси)бутирильного кон'югату (4,48 лікарський засіб/антитіло за допомогою УФ) прикладу 12; Фіг. 6: дані МС-аналізу деглікозилованого hu2H11 -4-(3,5-бic-[(S)-2-eт-(E)-іліден-7-метокси1,2,3,11а-тетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5-он-8-ілоксиметил]фенокси)бутирильного кон'югату (3,74 лікарський засіб/антитіло за допомогою УФ) прикладу 13; Фіг. 7: дані МС-аналізу huMy9 -6-3-(2-{2-[2-(3,5-біс-[(S)-2-ет-(Е)-іліден-7-метокси-1,2,3,11атетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5-он-8ілоксиметил]феноксі)етоксі]етокси}етокси)пропіонільного кон'югату (4,8 лікарський засіб/антитіло за допомогою УФ) прикладу 14; Фіг. 8: дані МС-аналізу hu2H11 -3-(2-{2-[2-(3,5-біс-[(S)-2-eт-(Е)-іліден-7-метокси-1,2,3,11атетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5-он-8ілоксиметил]феноксі)етоксі]етокси}етокси)пропіонільного кон'югату (4,08 лікарський засіб/антитіло за допомогою УФ) прикладу 15; Фіг. 9: дані МС-аналізу деглікозилованого huB4-IGP08 (сполука прикладу 18); Фіг. 10: порівняльні властивості зв'язування оголених антитіл huMy9-6 і huMy9-6-IGP08 (сполука прикладу 18) з антигеном CD33; 19 UA 98153 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Фіг. 11: in vitro цитотоксична активність huB4-IGP08 (сполука прикладу 18) проти клітин Ramos (Ag-) і HL60/QC (Ag+); Фіг. 12: дані МС-аналізу деглікозилованого huB4-IGP08 (3,1 лікарський засіб/антитіло за допомогою УФ) прикладу 19; Фіг. 13: цитотоксичні властивості huB4-lGP08 (сполука прикладу 19) проти клітин ВJАВ (Ag+), Ramos (Ag+) і MOLT-4 (Ag-); Фіг. 14: порівняльні властивості зв'язування оголених антитіл huB4 і huB4-IGP08 (сполука прикладу 19); Фіг.15: дані МС-аналізу деглікозилованого hu2H11-IGP13 (4,7 лікарський засіб/антитіло за допомогою УФ) прикладу 21; Фіг. 16: цитотоксичні властивості hu2H11-IGP13 (сполука прикладу 21) проти клітин РС3 (Ag+), MDA-MB-231 (Ag+) і SK-MEL-28 (Ag-); Фіг. 17: цитотоксичні властивості метилового ефіру 3-(2-{2-|2-(2,6-бic-[(S)-2-ет-(Е)-іліден-7метокси-1,2,3,11а-тетрагідропіроло[2,1с][1,4]бeнзодіазeпін-5-он-8-ілоксиметил]піридин-4ілоксі)етоксі]етокси}етокси)пропіонової кислоти прикладу 5; Фіг. 18: цитотоксичні властивості 4-(2,6-біс-[(S)-2-ет-(Е)-іліден-7-мeтокси-1,2,3,11атетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5-он-8-ілоксиметил]піридин-4-ілокси)масляної кислоти прикладу 6; Фіг. 19: цитотоксичні властивості метилового ефіру N-[2-(3,5-бic-[(S)-2-eт-(Е)-іліден-7метокси-1,2,3,11а-тетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5-он-8-ілоксиметил]феноксі)етил]-Nметилсукцинамової кислоти прикладу 7; Фіг. 20: in vitro дані цитотоксичності huMy9-6 -4-(3,5-біс-[(S)-2-ет-(Е)іліден-7-метокси1,2,3,11а-тетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5-он-8-ілоксиметил]фенокси)бутирильного кон'югату із прикладу 11; Фіг. 21: in vitro дані цитотоксичності huB4 -4-(3,5-біс-[(S)-2-ет-(Е)-іліден-7-метокси-1,2,3,11атетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5-он-8-ілоксиметил]фенокси)бутирильного кон'югату із прикладу 12; Фіг. 22: in vitro дані цитотоксичності hu2Н11 1-4-(3,5-біс-[(S)-2-ет-(Е)-іліден-7-метокси1,2,3,11а-тетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5-он-8-ілоксиметил]фенокси)бутирильного кон'югату із прикладу 13; Фіг. 23: in vitro дані цитотоксичності huMy9-6 -3-(2-{2-[2-(3,5-бic-[(S)-2-eт-(Е)-іліден-7-метокси1,2,3,11а-тетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5-он-8ілоксиметил]феноксі)етоксі]етокси}етокси)пропіонільного кон'югату із прикладу 14; Фіг. 24: in vitro дані цитотоксичності hu2H11 -3-(2-{2-|2-(3,5-бic-[(S)-2-ет-(Е)-іліден-7-метокси1,2,3,11а-тетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5-он-8ілоксиметил]феноксі)етоксі]етокси}етокси)пропіонільпого кон'югату із прикладу 15. Експериментальна частина Метод А1: Високоефективна рідинна хроматографія - Мас-спектромстрія (PXMC)(LCMS) Програму Micromass MassLynx використовували, і аналіз здійснювали на приладі ВЕРХ Waters Alliance з колонкою WATERS XBridge С18 3,5 мкм (100×3 мм), використовуючи градієнтну елюцію сумішшю (А) метанолу й (В) води/0,1 % мурашиної кислоти (градієнт: від 5 % А : 95 % В аж до 95 % А : 5 % протягом 10 хв., від 95 % А : 5 % В аж до 5 % А : 95 % В протягом 1 хв., 5 % А : 95 % В протягом 2 хв.), зі швидкістю потоку 1,1 мл/хв; спектрометр WatersMicromass Platform ІІ з електророзпиленням (позитивна й негативна іонізація); приєднана в ланцюг діодна матриця (190-500 нм); додатковий детектор Sedere (France) модель SEDEX 85 випарний детектор світлорозсіювання (ELS). Метод А2: Високоефективна рідинна хроматографія - Мас-спектромстрія (РХМС) Програму Micromass MassLynx використовували, і аналіз здійснювали на приладі Agilent 1100 серії ВЕРХ з колонкою XBridge C18 2,5 мкм (50×3 мм), використовуючи градієнтну елюцію сумішшю (А) ацетонітрилу й (В) води/0,1 % мурашиної кислоти (градієнт: від 5 % А : 95 % В аж до 100 % А протягом 5 хв., 100 % A протягом 0,5 хв., від 100 % А аж до 5 % А : 95 % В протягом 1 хв. 5 % А : 95 % В протягом 0,5 хв.), зі швидкістю потоку 1,1 мл/хв; спектрометр WatersMicromass ZQ з електророзпиленням (позитивна й негативна іонізація); приєднана в ланцюг діодна матриця (210-254 нм). Метод A3: Високоефективна рідинна хроматографія - Мас-спектрометрія (РХМС) Аналіз здійснювали на приладі Waters UPLC-SQD з колонкою ACQUITY ВЕН С18 1,7 мкм 2,1×50 мм при 50 °C, використовуючи градієнтну елюцію сумішшю (А) Н2О/0,1 % мурашиної кислоти й (В) CH3CN/0,1 % мурашиної кислоти (градієнт: від 95 % А : 5 % В аж до 50 % А : 50 % В протягом 0,8 хв., від 50 % А : 50 % В аж до 100 % В протягом 1,2 хв., 100 % В протягом 1,85 20 UA 98153 C2 5 10 15 хв., від 100 % В аж до 95 % А : 5 % В протягом 1,95 хв.), зі швидкістю потоку 1 мл/хв; електророзпилення (позитивна й/або негативна іонізація). Метод А4: Високоефективна рідинна хроматографія - Мас-спектрометрія (РХМС) Аналіз здійснювали на спектрометрі Waters ZQ з колонкою XBridge C18 2,5 мкм (50×3 мм) при 70 °C, використовуючи градієнтну елюцію сумішшю (А) ацетонітрилу й (В) води/0,1 % мурашиної кислоти (градієнт: від 5 % А : 95 % В аж до 100 % А протягом 5,3 хв., 100 % А протягом 5,5 хв., 5 % А : 95 % В протягом 6,3 хв.), зі швидкістю потоку 0,9 мл/хв.; електророзпилення (позитивна й/або негативна іонізація). 1 Метод В: Спектри Н ядерного магнітного резонансу (ЯМР) (NMR) 1 Спектри Н ЯМР записували або на спектрометрі BRUKЕR AVANCE DRX-500, BRUKER 13 AVANCЕ DRX-400 або на спектрометрі BRUKER AVANCE DRX-300. Спектри С ЯМР записували на спектрометрі BRUKER AVANCE DRX-300. Метод С: Мас-спектрометрія з хімічною іонізацією (СІ). Мас-спектри СІ записували, використовуючи мас-спектрометр WATERS GCT (аміак). Метод D: Mac-спектрометрія з хімічною іонізацією (СІ). Мас-спектри СІ записували, використовуючи мас-спектрометр FINNIGAN SSQ 7000 (аміак). Приклад 1 N-гідроксисукцинімідильний складний ефір 4-(3,5-біс-[(S)-2-eт-(E)-іліден-7метокси-1,2,3,11а-тетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5-он-8ілоксиметил]фенокси)масляної кислоти може бути одержаний у такий спосіб: 20 25 30 35 40 45 До суспензії 4-(3,5-біс-[(S)-2-ет-(Е)-іліден-7-метокси-1,2,3,11aтетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5-он-8-ілоксиметил]фенокси)масляної кислоти (11,3 мг) у тетрагідрофурані (0,4 мл) додавали N,N'-дисукцинімідилкарбонат (7,7 мг) і N,Nдіїзопропілетиламін (15,8 мкл). Після 2,5 год. при кімнатній температурі до реакційної суміші додавали етилацетат (6 мл), і органічний розчин промивали двічі водою (4 мл), потім насиченим водним розчином хлориду натрію (5 мл), сушили над сульфатом магнію й концентрували у вакуумі до одержання залишку. Залишок очищали хроматографією на силікагелі (Merck MiniVarioFlash колонка 2,5 г, Si60 15-40 мкм), використовуючи градієнтну елюцію сумішшю МеОН (метанол) (А)/ДХМ (дихлорметан) (В), (градієнт: від 2 % А : 98 % В аж до 4 % А : 96 % В) з одержанням 4-(3,5-6ic-[(S)-2-eт-(Е)-іліден-7-метокси-1,2,3,11атетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5-он-8-ілоксиметил]фенокси)масляної кислоти N+ гідроксисукцинімідильного ефіру (17,6 мг): РХ/МС (метод А4): ES: m/z 846 (М+Н) ; час 1 утримання (RT)=3,89 хв; Н ЯМР (400 МГц, CDCl3-d1,  м.ч.): = 1,75 (д, J-6,8 Гц, 6Н); 2,23 (м, 2Н); 2,73-2,87 (м, 6Н); 2,97 (м, 4Н); 3,84-3,95 (м, 2Н); 3,97 (с, 6Н); 4,06 (м, 2Н); 4,26 (м, 4Н); 5,14 (д, J=12,4 Гц, 2Н); 5,21 (д, J=12,4 Гц, 2Н); 5,62 (м, 2Н); 6,84 (с, 2Н); 6,96 (с, 2Н); 7,09 (с, 1Н); 7,53 (с, 2Н); 7,63 (м, 2Н). 4-(3,5-Біс-[(S)-2-ет-(Е)-іліден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5он-8-ілоксиметил]фенокси)масляну кислоту одержували в такий спосіб До розчину метилового ефіру 4-(3,5-біс-[(S)-2-ет-(Е)-іліден-7-метокси-1,2,3,11атетрагідропіроло[2,1с|[1,4]бензодіазепін-5-он-8-ілоксиметил]фенокси) масляної кислоти (60 мг) в тетрагідрофурані (0,9 мл) додавали МеОН (0,3 мл), воду (0,3 мл) і водний розчин гідроксиду літію (1М, 87 мкл). Після 3 годин реакційну суміш розбавляли водою (10 мл) і рН доводили до 2 шляхом додавання 1н водного розчину хлористоводневої кислоти. Водну фазу екстрагували гри рази ДХМ (10 мл) і об'єднані органічні розчини сушили над сульфатом натрію й концентрували у 21 UA 98153 C2 5 10 15 20 25 30 35 вакуумі до одержання залишку. Залишок очищали хроматографією на силікагелі (Merck SuperVarioFlash колонка 10 г, SiOН 15-40 мкм), елюювали сумішшю ДХМ/МеОН/оцтова кислота (100:4:0,5) з одержанням 4-(3,5-біс-[(S)-2-ет-(Е)-іліден-7-метокси-1,2,3,11атетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5-он-8-ілоксиметил]фенокси)масляної кислоти: РХ/МС + 2+ 1 (метод А2): ES: m/z=749 MH ; m/z=375 (М+2Н) /2; RT=3,7 хв; H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6,  у м.ч.): =1,69 (д, .1=6,5 Гц, 6H); 1,95 (м, 2Н); 2,39 (т, J=6,5 Гц, 2H); 2,91 (м. 2H); 3,05 (м, 2H); 3,83 (с, 6Н); 3,98 (м, 2Н); 4,01 (т, J=6,5 Гц, 2H); 4,10 (м, 4H); 5,11 (д, J=12,5 Гц, 2H); 5,20 (д, J=12,5 Гц, 2Н); 5,55 (м, 2Н); від 6,90 до 7,15 (м, 5H); 7,34 (с, 2H); 7,77 (м, 2H); 12,1 (ушир.м, 1Н). Метиловий ефір 4-(3,5-біс-[(S)-2-ет-(Е)-іліден-7-метокси-1,2,3,11атетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5-он-8-ілоксиметил]фенокси)масляної кислоти одержували в такий спосіб: До охолодженого (0 °C) розчину метилового ефіру 4-(3,5-бісгідроксиметилфенокси)масляної кислоти (50 мг) і триетиламіну (110 мкл) у ТГФ (тетрагідрофуран) (1,4 мл) додавали метансульфонілхлорид (46 мкл). Після 1 год. реакційну суміш розбавляли ДХМ (10 мл) і промивали двічі водою (5 мл). Органічний розчин сушили над сульфатом натрію й концентрували у вакуумі до одержання залишку. Залишок очищали хроматографією на силікагелі (Merck SuperVarioFlash колонка 10 г, SiOH 15-40 мкм), використовуючи градієнтну елюцію сумішшю МеОН (А)/ДХМ (В), (градієнт: від 100 % В аж до 5 % А : 95 % В) з одержанням 71,8 мг сполуки у вигляді димезилату. До суміші томайміцину (80 мг), йодиду калію (49 мг), карбонату калію (122 мг) у ДМФА (диметилформамід) (1 мл) додавали розчин димезилату сполуки (71,8 мг) у ДМФА (1,6 мл). Реакційну суміш перемішували протягом 16 год. при 30 °C. Воду (12 мл) додавали й тверду речовину, що випала в осад, фільтрували, промивали водою й сушили у вакуумі з одержанням залишку. Залишок очищали хроматографією на силікагелі (Merck SuperVarioFlash колонка 30 г, SiOH 15-40 мкм), використовуючи градієнтну елюцію сумішшю МеОН (А)/ДХМ (В), (градієнт: від 100 % В аж до 5 % А : 95 % В), з одержанням метилового ефіру 4-(3,5-бic-[(S)-2-eт-(Е)-іліден-7-метокси1,2,3,11а-тетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5-он-8-ілоксиметил]фенокси)масляної кислоти + 2+ 1 (65,4 мг): РХ/МС (метод А2): ES: m/z=763 МН ; m/z=382 (М+2Н) /2; RT=4,0 хв; Н ЯМР (500 МГц, CDCl3-d1,  у м.ч.): 1,75 (д, J-6,5 Гц, 6Н); 2,1 1 (м, 2Н); 2,53 (т, J-6,5 Гц, 2Н); 2,98 (м, 4Н); 3.69 (с, 3Н); 3,89 (м, 2Н); 3,97 (с, 6Н); 4,00 (т, J=6,5 Гц, 2Н); 4,28 (ушир.с, 4Н); 5,12 (д, J 12,5 Гц, 2Н); 5,19 (д, J=12,5 Гц, 2Н); 5,61 (м, 2Н); 6,82 (с, 2Н); 6,92 (с, 2H); 7,06 (с, 1H); 7,52 (с, 2H); 7,64 (д, J=4,5 Гц, 2Н). Метиловий ефір 4-(3,5-біс-гїдроксиметилфенокси)масляної кислоти одержували в такий спосіб: 40 45 До розчину 3,5-біс-гідроксиметилфенолу (Felder, D.; Gutiérrez Nava, M.; del Pilar Carreon, M.; Eckert, J.F.; Luccisano, M.; Schall, C; Masson, P.; Gallani, J.L.; Heinrich, В.; Guillon, D.; Nierengarten, J.F. Helv. Chimica Acta 2002, 85, 288) (200 мг), йодиду калію (50 мг) і карбонату калію (540 мг) у ТГФ (2,5 мл) додавали метиловий ефір 4-броммасляної кислоти (400 мкл). Реакційну суміш перемішували протягом 20 год. при кімнатній температурі, частину що не розчинилася, потім відфільтровували. Фільтрат концентрували у вакуумі й залишок очищали хроматографією па силікагелі (Merck SuperVarioFlash колонка 30 г, Si60 15-40 мкм), використовуючи градієнтну елюцію сумішшю МеОН (A)/ДХМ (В), (градієнт: від 100 % В аж до 22 UA 98153 C2 5 5 % А : 95 % В), з одержанням метилового ефіру 4-(3,5-біс-гідроксиметилфенокси)масляної + + 1 кислоти (53,5 мг): РХ/МС (метод А2): ES: m/z=255 МН ; m/z=237 (М+Н - Н2О) ; RT=2,5 хв; Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6,  у м.ч.) =1,96 (м, 2H); 2,47 (т, J=6,5 Гц, 2Н); 3,61 (с, 3Н); 3,96 (т, J=6,5 Гц, 2H); 4,43 (д, J=6,0 Гц, 4H); 5,11 (т, J=6,0 Гц, 2H); 6,71 (с, 2H); 6,82 (с, 1H). Приклад 2 4-(3,5-біс-[(S)-2-ет-(Е)-іліден-7-мeтокси-1,2,3,11a-тетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5он-8-ілоксимeтил]фенокси)оцтова кислота 10 15 4-(3,5-Біс-[(S)-2-ет-(Е)-іліден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5он-8-ілоксиметил]фенокси)оцтова кислота може бути одержана відповідно до одержання 4-(3,5біс-[(S)-2-ет-(Е)-іліден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагідро[2,1с][1,4]бензодіазепін-5-он-8ілоксиметил]фенокси)масляної кислоти, використовуючи як вихідну сполуку метиловий ефір 4(3,5-біс-[(S)-2-ет-(Е)-іліден-7-метокси-1,2,3,11а-тeтрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5-он-8+ 2+ ілоксиметил]фенокси)оцтової кислоти: РХ/МС (метод А2): ES: m/z=721 МН ; m/z=361 (M+2H) /2; RT=3,5 хв. Метиловий ефір 4-(3,5-біс-[(S)-2-ет-(Е)-іліден-7-метокси-1,2,3,11атетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5-он-8-ілоксиметил]фенокси)оптової кислоти 20 25 30 Метиловий ефір 4-(3,5-біс-[(S)-2-ет-(Е)-іліден-7-метокси-1,2,3,11атетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5-он-8-ілоксиметил]фенокси)оцтової кислоти може бути одержаний відповідно до одержання метилового ефіру 4-(3,5-біс-[(S)-2-ет-(Е)-іліден-7-метокси1,2,3,11а-тетрагідротроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5-он-8-ілоксиметил]фенокси)масляної кислоти, використовуючи як вихідну сполуку метиловий ефір 4-(3,5-біс-гідроксиметилфенокси)оцтової + 2+ 1 кислоти: РХ/МС (метод А2): ES: m/z=735 МH ; mZ=368 (M+2H) /2; RT=3,8 хв; H ЯМР (500 МГц, CDCl3-d1,  у м.ч.): =1,76 (д, J=6,5 Гц, 6H); 2,96 (м, 4H); 3,78 (с, 3Н); 3,88 (м, 2H); 3,97 (с, 6Н); 4,27 (ушир.с, 4H); 4,64 (с, 2Н); 5,13 (д, J=12,5 Гц, 2H); 5,19 (д, J=12,5 Гц, 2Н); 5,60 (м, 2H); 6,80 (с, 2H); 6,96 (с, 2H); 7,11 (с, 1H); 7,53 (с, 2H); 7,63 (д, J=4,5 Гц, 2Н). Метиловий ефір 4-(3,5-біс-гідроксиметилфeнокси)оцтової кислоти 35 40 Метиловий ефір 4-(3,5-біс-гідроксиметилфенокси)оцтової кислоти одержували відповідно до способу одержання метилового ефіру 4-(3,5-бісгідроксиметилфенокси)масляної кислоти, використовуючи як вихідну сполуку метиловий ефір 4-бромоцтової кислоти: РХ/МС (метод А2): + + 1 ES: m/z 227 MН ; m/z=209 (М+Н - Н2О) ; RT=1,9 хв; Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6,  у м.ч.) =3,70 (с, 3Н); 4,43 (д, J=6,0 Гц, 4H); 4,74 (с, 2Н); 5,14 (т, J=6,0 Гц, 2Н); 6,72 (с, 2H); 6,88 (с, 1Н). Приклад 3 23 UA 98153 C2 N-гідроксисукциінімідильний ефір 3-(2-{2-[2-(3,5-біс-[(S)-2-ет-(E)-іліден-7-метокси-1,2,3,11атетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5-он-8Ілоксиметил]феноксі)етоксі]eтокси}етокси)пропіонової кислоти 5 10 15 20 25 30 35 40 N-гідроксисукцинімідильний ефір 3-(2-{2-[2-(3,5-біс-[(S)-2-ет-(Е)-іліден-7-метокси-1,2,3,11атетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5-он-8ілоксиметил]феноксі)eтоксі]eтокси)eтокси)пропіонової кислоти може бути одержаний відповідно до одержання N-гідроксисукцинімідильного ефіру 4-(3,5-бic-[(S)-2-ет-(Е)-іліден-7-метокси1,2,3,11а-тетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазeпін-5-он-8-ілоксиметил]фенокси)масляної кислоти, використовуючи як вихідну сполуку З-(2-{2-[2-(3,5-біс-[(S)-2-ет-(Е)-іліден-7-метокси1,2,3,11а-тeтрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепіп-5-он-8ілоксиметил]феноксі)етоксі]етокси}етокси)пропіонову кислоту: РХ/МС (метод A3): ES: m/z 964 + 1 (М+Н) ; RT=0,90 хв; Н ЯМР (500 МГц, CDCl3-d1,  м.ч.): =1,75 (дд, J=6,7 Гц, 6H); 2,82 (м, 4Н); 2,89 (т, J=6,6 Гц, 2H); 2,97 (м, 4Н); 3,57-4,23 (м, 16Н); 3,97 (с, 6Н); 4,27 (м, 4Н); 5,13 (д, J=12,7 Гц, 2Н); 5,20 (д, J=12,2 Гц, 2H); 5,61 (м, 2H); 6,82 (с, 2H); 6,96 (с, 2Н); 7,07 (с, 1H): 7,53 (с, 2Н); 7,64 (д, J=4,4 Гц, 2Н). 3-(2-{2-[2-(3,5-біс-[(S)-2-ет-(Е)-ілідeн-7-мeтокси-1,2,3,11атетрагідропіроло[2,1с][1,4]бeнзодіазепін-5-он-8ілоксиметил]феноксі)eтокси]етокси}етокси)пропіонова кислота: 3-(2-{2-[2-(3,5-біс-[(S)-2-ет-(Е)-іліден-7-метокси-1,2,3,11атетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5-он-8ілоксиметил]феноксі)етоксі]eтокси}етокси)пропіонову кислоту можна одержувати відповідно до одержання 4-(3,5-бic-[(S)-2-eт-(Е)-іліден-7-метокси-1,2,3,11атетрагідропіроло[2,1c][1,4]бензодіазепін-5-он-8-ілоксиметил]фенокси)масляної кислоти, використовуючи як вихідну сполуку метиловий ефір 3-(2-{2-[2-(3,5-біс-[(S)-2-ет-(Е)-іліден-7метокси-1,2,3,11а-тетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5-он-8ілоксиметил]феноксі)eтокси]етокси}етокси)пропіонової кислоти: РХ/МС (метод A3): ES: m/z 867 + 2+ 1 (М+Н) ; m/z 434 (МН+2Н) /2; RT=0,84 хв; Н ЯМР (400 МГц, CDCl3-d1,  м.ч.): =1,76 (дд, J=8,6, 1,5 Гц, 6Н); 2,61 (т, 2Н); 2,94-3,00 (м, 4H); 3,63-3,75 (м, 8H); 3,80 (т, J 6,5 Гц, 2H); 3,85-3,95 (м, 4H); 3,98 (с, 6H); 4,17 (т, J=4,9 Гц, 2H); 4,27 (ушир.с, 4Н); 5,14-5,21 (м, 2H); 5,18 (д, J=12,7 Гц, 2H); 5,23 (д, 2Н); 5,23 (д, J=12,7 Гц, 2Н) 5,62 (тд, J=4,5, 2,2 Гц, 2Н); 6,88 (д, J=0,5 Гц, 2Н); 6,977,02 (м, 2Н); 7,09 (с, 1Н); 7,54 (с, 2Н); 7,68 (д, J=4,9 Гц, 2Н). Метиловий ефір 3-(2-{2-[2-(3,5-біс-[(S)-2-ет-(Е)-іліден-7-мeтокси-1,2,3,11атетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5-он-8ілоксиметил]феноксі)етокси]етокси}етокси)пропіонової кислоти: 24 UA 98153 C2 5 10 15 20 25 30 Метиловий ефір 3-(2-{2-[2-(3,5-біс-[(S)-2-ет-(Е)-іліден-7-метокси-1,2,3,11атетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5-он-8ілоксиметил]феноксі)eтокси]етокси}етокси)пропіонової кислоти одержували відповідно до одержання метилового ефіру 4-(3,5-біс-[(S)-2-ет-(Е)-іліден-7-мeтокси-1,2,3,11атетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5-он-8-ілоксиметил]фенокси)масляної кислоти, використовуючи як вихідну сполуку метиловий ефір 3-(2-{2-[2-(3,5-бісгідроксиметил]феноксі)етоксі]етокси}етокси)пропіонової кислоти: РХ/МС (метод A3): ES: m/z 881 + 2+ 1 (М+Н) ; m/z 441 (М+2Н) /2; RT=0,91 хв; H ЯМР (400 МГц, CDCl3-d1,  м.ч.): =1,75 (ушир.д, .16,7 Гц, 6H); 2,60 (т, J=6,7 Гц, 2H); 2,97 (м, 4H); 3,54-4,21 (м, 16Н); 3,68 (c, 3H); 3,97 (с, 6H); 4,27 (м, 4Н); 5,13 (д, J=12,2 Гц, 2H); 5,21 (д, J=12,2 Гц, 2Н); 5,61 (м, 2Н); 6,83 (с, 2Н); 6,96 (с, 2H); 7,08 (с, 1H); 7,53 (c, 2Н); 7,64 (д, J=4,2 Гц, 2Н). Метиловий ефір 3-(2-{2-[2-(3,5-біс-гідроксиметил]феноксі)eтокси]етокси}етокси)пропіонової кислоти може бути одержаний у такий спосіб: До розчину трет-бутилового ефіру 3-(2-{2-[2-(3,5-бісгідроксиметил]феноксі)етоксі]етокси}етокси)пропіонової кислоти (607 мг) у ДХМ (8,7 мл) додавали трифтороцтову кислоту (2,2 мл). Реакційну суміш перемішували протягом 3 днів при кімнатній температурі, потім концентрували у вакуумі, і одержаний залишок розчиняли в метанолі (5 мл). До охолодженого (0 °C) метанольного розчину додавали 2М розчин (триметилсиліл)діазометану в гексанах (3,6 мл) до збереження жовтого фарбування. Потім додавали оцтову кислоту (10 мкл) і одержаний розчин концентрували у вакуумі з утворенням залишку. Залишок очищали хроматографією на силікагелі (Analogix Super Flash SiO2 SF25-40г), використовуючи градієнтну елюцію сумішшю ДХМ (А) і МеОН (В) (градієнт: від 99 % А : 1 % В аж до 90 % А : 10 % В), з одержанням метилового ефіру 3-(2-{2-[2-(3,5-бісгідроксиметил]феноксі)етоксі]етокси}етокси)пропіонової кислоти (232 мг). РХ/МС (метод A3): ES: + + m/z 373 (M+Н) ; m/z 395 (M+Na) ; RT=0,50 хв. трет-бутиловий ефір 3-(2-{2-[2-(3,5-бісгідроксиметил]феноксі)етокси]етокси}етокси)пропіонової кислоти: 35 40 трет-бутиловий ефір 3-(2-{2-[2-(3,5-бісгідроксиметил]фенокси)етоксі]етокси}етокси)пропіонової кислоти може бути одержаний відповідно до способу одержання метилового ефіру 4-(3,5-біс-гідроксиметилфенокси)масляної кислоти, використовуючи як вихідну сполуку трет-бутиловий ефір 3-{2-[2-(2брометоксі)етоксі]етокси}пропіонової кислоти (WO 2004/091542): РХ/МС (метод A3): ES: m/z 415 + + (М+Н) ; m/z 432 (M+NH4) ; RT=0,75 хв. Приклад 4 25 UA 98153 C2 N-гідроксисукцинімідильний ефір 6-(3,5-біс-[(S)-2-ет-(Е)-ілідeн-7-метокси-1,2,3,11атетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5-он-8-ілоксиметил]феніл)гекс-5-инової кислоти 5 10 N-Гідроксисукцинімідильний ефір 6-(3,5-біс-[(S)-2-ет-(Е)-іліден-7-метокси-1,2,3,11атетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5-он-8-ілоксиметил]феніл)гекс-5-инової кислоти може бути одержаний відповідно до одержання N-гідроксисукцинімідильного ефіру 4-(3,5-біс-[(S)-2-ет(Е)-іліден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5-он-8ілоксиметил]фенокси)масляної кислоти, використовуючи як вихідну сполуку 6-(3,5-бic-[(S)-2-eт(E)-іліден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5-он-8+ ілоксиметил]феніл)гекс-инову кислоту: РХ/МС (метод A3): ES: m/z 854 (М+Н) ; RT=1,25 хв. 6-(3,5-Біс-[(S)-2-ет-(Е)-ілідeн-7-мeтокси-1,2,3,11а-тетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5он-8-ілоксиметил]феніл)гекс-5-инова кислота 15 20 25 6-(3,5-Біс-[(S)-2-ет-(Е)-іліден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5он-8-ілоксиметил]феніл)гекс-5-инову кислоту можна одержати відповідно до одержання 4-(3,5біс-[(S)-2-ет-(Е)-іліден-7-мeтокси-1,2,3,11а-тетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5-он-8ілоксиметил]фенокси)масляної кислоти, використовуючи як вихідну сполуку метиловий ефір 6(3,5-біс-[(S)-2-ет-(Е)-іліден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагідропіроло[2,1с][1,4] бензодіазепін-5-он-8+ 1 ілоксиметил]феніл)гекс-инової кислоти: РХ/МС (метод A3): ES: m/z 757 (М+М) ; RT=0,89 хв; Н ЯМР (400 МГц, CDCl3-d1,  м.ч.): =1,76 (д, J=6,8 Гц, 6Н); 1,98 (м, 2Н); 2,55 (м, 4Н); 2,97 (м, 4Н); 3,91 (м, 2Н); 3,97 (с, 6Н); 4,27 (м, 4Н); 5,15 (д, J=12,8 Гц, 2H); 5,21 (д, J=12,8 Гц, 2Н); 5,61 (м, 2H); 6,88 (с, 2Н); 7,48 (с, 3Н); 7,53 (с, 2Н); 7,67 (м, 2H). Метиловий ефір 6-(3,5-біс-[(S)-2-ет-(Е)-іліден-7-метокси-1,2,3,11атетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5-он-8-ілоксиметил]феніл)гекс-5-инової кислоти 30 Метиловий ефір 6-(3,5-біс-[(S)-2-ет-(E)-іліден-7-метокси-1,2,3,11атетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5-он-8-ілоксиметил]феніл)гекс-5-инової кислоти може бути одержаний відповідно до одержання метилового ефіру 4-(3,5-біс-[(S)-2-ет-(E)-іліден-7 26 UA 98153 C2 5 метокси-1,2,3,11а-тетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5-он-8ілоксиметил]фенокси)масляної кислоти, використовуючи як вихідну сполуку метиловий ефір 6+ (3,5-біс-гідроксиметилфеніл)гекс-5-инової кислоти: РХ/МС (метод A3): ES: m/z 771 (М+Н) ; 1 RT=1,00 хв; Н ЯМР (500 МГц. CDCl3-d1,  м.ч.): =1,75 (д, J=6,6 Гц, 6Н); 1,93 (м, 2Н); 2,50 (м, 4Н); 2,96 (м, 4Н); 3,69 (с, 3Н); 3,90 (м, 2Н); 3,97 (с, 6Н); 4,27 (м, 4Н); 5,12 (д, J=12,3 Гц, 2Н); 5,19 (д, J=12,3 Гц, 2Н); 5,61 (м, 2H); 6,81 (с, 2H); 7,43 (c, 3H); 7,54 (с, 2H); 7,64 (д, J=4,4 Гц, 2Н). Метиловий ефір 6-(3,5-біс-гідроксиметилфеніл) гекс-5-инової кислоти одержували в такий спосіб: 10 15 20 До охолодженого (0 °C) розчину метилового ефіру 6-[3,5-біс(третбутилдиметилсилілоксиметил)феніл] гекс-5-инової кислоти (140 мг) у безводному тетрагідрофурані (0,3 мл) обережно додавали 1М розчин тетрабутиламонійфториду в ТГФ (716 мкл). Після 75 хв. при кімнатній температурі, етилацетат (20 мл) додавали, і органічну фазу промивали три рази водою (5 мл) і один раз насиченим водним розчином хлориду натрію (5 мл), сушили над сульфатом натрію й концентрували у вакуумі з одержанням залишку. Залишок очищали хроматографією на силікагелі (Merck SuperVarioFlash колонка 15 г, Si60 15-40 мкм), використовуючи градієнтну елюцію сумішшю гептан (А)/етилацетат (В), (градієнт: від 50 % А : 50 % В аж до 10 % А : 90 % В, з одержанням метилового ефіру 6-(3,5-біс-гідроксиметилфеніл) гекс-5-инової кислоти (64,3 мг) у вигляді масла блідо-жовтого кольору. РХ/МС (метод A3): BS: + m/z 263 (М+Н) ; RT=0,62 хв. Метиловий ефір 6-[3,5-біс(трет-бутилдиметилсилілоксиметил)феніл] гекс-5-инової кислоти одержували в такий спосіб: 25 30 35 40 До розчину 1,3-біс-гідроксиметил-5-йодбензолу (Zeng, F., Zimmerman, S.C. J. Am. Chem. Soc. 1996, 118 (22), 5326-5327) (1,7 г) у дихлорметані (10 мл) додавали триетиламін (3,59 мл), третбутилдиметилсилілхлорид (2,91 г) і ДМФА (2 мл). Після 1 год. етилацетат (200 мл) додавали й органічну фазу промивали три рази водою (50 мл) і один раз насиченим водним розчином хлориду натрію (50 мл), сушили над сульфатом магнію й концентрували у вакуумі з одержанням залишку (3,65 г). До розчину одержаного залишку (200 мг) у ДМФА (0,90 мл) додавали йодид міді(І) (7,7 мг), дихлоробіс(трифенілфосфін)паладій(ІІ) (28,5 мг), метиловий ефір 5-гексинової кислоти (102,4 мг) і триетиламін (113 мкл). Після 45 хв. етилацетат (40 мл) додавали й органічну фазу промивали три рази водою (10 мл) і один раз насиченим водним розчином хлориду натрію (10 мл), сушили над сульфатом магнію й концентрували у вакуумі з одержанням залишку. Залишок очищали хроматографією на силікагелі (Merck SupеrVarioFlash колонка 30 г, Si60 15-40 мкм), використовуючи градієнтну елюцію сумішшю гептан (А)/етилацетат (В), (градієнт: від 100 % А аж до 90 % А : 10 % В), з одержанням метилового ефіру 6-[3,5-біс(трeтбутилдиметилсилілоксиметил)феніл] гекс-5-инової кислоти (145,3 мг) у вигляді жовтого масла. + 1 МС (метод С): СІ: m/z 494 (M+NH4) ; Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6,  у м.ч.) =0,07 (с, 12H); 0,89 (с, 18H); 2,55-2,69 (м, 2H): 3,63 (с, 3Н); 4,67 (с, 4H); 7,15 (великий с, 2H); 7,28 (ушир.с, 1Н). Приклад 5 27 UA 98153 C2 Метиловий ефір 3-(2-{2-[2-(2,6-біс-[(S)-2-ет-(Е)-іліден-7-мeтокси-1,2,3,11атетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5-он-8-ілоксиметил]піридин-4ілоксі)етоксі]етокси}етокси)пропіонової кислоти: 5 10 15 Метиловий ефір 3-(2-{2-[2-(2,6-біс-[(S)-2-ет-(Е)-іліден-7-метокси-1,2,3,11атетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5-он-8-ілоксиметил]піридин-4ілоксі)етоксі]етокси}етокси)пропіонової кислоти може бути одержаний відповідно до одержання метилового ефіру 4-(3,5-бic-[(S)-2-(E)-іліден-7-метокси-1,2,3,11атетрагідропіроло[2,1с][1,4]бензодіазепін-5-он-8-ілоксиметил]фенокси)масляної кислоти, використовуючи як вихідну сполуку метиловий ефір 3-(2-{2-[2-(2,6-біс-гідроксиметилпіридин-4+ ілоксі)етоксі]етокси}етокси)пропіонової кислоти: РХ/МС (метод A3): ES: m/z 882 (М+Н) ; m/z 2+ 1 441,5 (М+2Н) /2; RT=0,82 хв; Н ЯМР (400 МГц, CDCl3-d1,  м.ч.): =1,76 (д, J-6,8 Гц, 6Н); 2,59 (т, J=6,5 Гц, 2Н); 2,97 (м, 4Н); 3,58-3,72 (м, 9H); 3,75 (т, J=6,5 Гц, 2H); 3,80-3,97 (м, 4Н); 4,00 (с, 6Н); 4,20 (ушир.м, 2Н); 4,27 (м, 4H); 5,31-5,42 (м, 4Н); 5,61 (ушир.м, 2Н); 6,87 (с, 2H); 7,02-7,15 (ушир.м, 2Н); 7,56 (с, 2H); 7,65 (д. J=4,4 Гц, 2Н). Метиловий ефір 3-(2-{2-[2-(2,6-біс-гідроксиметилпіридин-4ілоксі)eтокси]етокси}етокси)пропіонової кислоти: 20 25 30 35 40 Метиловий ефір 3-(2-{2-[2-(2,6-біс-гідроксиметилпіридин-4ілоксі)стокси]етокси}етокси)пропіонової кислоти може бути одержаний відповідно до способу одержання метилового ефіру 3-(2-{2-[2-(3,5-бісгідроксиметил]фенокси)eтоксі]етокси}етокси)пропіонової кислоти, використовуючи як вихідну сполуку трет-бутиловий ефір 3-(2-{2-[2-(2,6-біс-гідроксиметилпіридин-4+ ілоксі)етоксі)етокси}етокси)пропіонової кислоти: РХ/МС (метод A3): KS: m/z 374 (М+Н) ; m/z 418 (М+НСО2Н-Н) ; RT=0,31 хв. трет-бутиловий ефір 3-(2-{2-[2-(2,6-біс-гідроксиметилпіридин-4ілоксі)eтоксі]етокси}етокси)пропіонової кислоти: До розчину діетилового ефіру 4-(2-{2-[2-(2-третбутоксикарбонілетоксі)етоксі]етокси}етокси)піридин-2,6-дикарбонової кислоти (1,36 г) в абсолютному етанолі (72 мл) додавали боргідрид нагрію (309 мг) і хлорид кальцію (921 мг). Після перемішування протягом 30 хв. виділення водню припинялося й реакцію гасили водою. Після концентрування при зниженому тиску хлорид амонію додавали й водну фазу екстрагували три рази етилацетатом. Об'єднані органічні розчини сушили над сульфатом магнію й концентрували у вакуумі з одержанням залишку. Залишок очищали хроматографією на 28