Спосіб одержання гетерологічних білкових речовин з рослинного матеріалу

Даний винахід загалом відноситься до одержання білкових речовин з рослинного субстрату. Зокрема, даний винахід відноситься до нового способу одержання бажаних білкових речовин з мохів. Використання біотехнологічних методів у виробничих цілях дає людині можливість одержувати речовини, які не можуть бути одержані економічними або іншими шляхами, наприклад, хімічним синтезом, і які не доступні в природі в кількості, достатній для взаємодії як сировина. Хоч відомо більше за 10000 вторинних метаболітів рослин, за допомогою культур рослинних клітин на промисловому рівні одержують тільки декілька таких сполук. Ці сполуки є переважно фармацевтично активними вторинними метаболітами. Прикладами, які можуть бути приведені, є а) берберин (обсяг виробництва становить 4000л), який володіє бактеріостатичною і фунгіцидною дією [Y.Fujita і М.Tabata в: Plant tissue and cell culture, plant science; том 3, стор.169, C.E.Green et al. (Ed.), A.R. Liss Inc., Нью-Йорк (1987)], b) шиконін (обсяг виробництва 750л), який діє як антибіотик і володіє протизапалювальною активністю [М.Tabata і Y.Fujita в: Biotechnology in plant science; стор.207-218, P.Day et al. (Ed.), Academic Press, Орландо (1985)] і с) паклитаксел (обсяг виробництва 75000л), більш широко відомий під назвою таксол, який має протипухлинну активність [М.Jaziri et al., Taxus sp, cell, tissue and organ cultures as alternative sources for taxoids production: a literature survey, Plant Cell Tiss. Org. Cult., 46, стор.59-75 (1996)]. Більш важливим біотехнологічним методом, в якому використовуються культури рослинних клітин, є біотрансформація дигитоксину в дигоксин, серцевий і циркуляторний лікарського препарат. Таку стереоспецифічну реакцію гідроксилювання успішно проводять в біореакторній культурі Digitalis lanata [E.Reinhard і W.Kreis, Kultivierung von pflanzlichen Zellen im Bioreaktor (Plant cell culture in the bioreactor), Bio. Engin.,5, стор.135-136 (1989)] з високим виходом. Сучасні докладні огляди по використанню культур рослинних клітин в біотехнології можуть бути знайдені у [Н.-Р. Mühlbach, Use of plant cell cultures in biotechnology, Biotecnnol. Annu. Rev.,4, стор.113-176 (1998)]. Розробка, методів генетичної трансформації вищих рослин на початку вісімдесятих дозволила значно збільшити продуктивність рослин для специфічних вторинних конструкцій шляхом трансформації генів специфічних ключових ферментів метаболічних шляхів, що розглядаються. Використовувалися не тільки трансгенні інтактні рослини, але також культури рослинних клітин. Приклади, які можуть бути приведені, включають надмірну експресію бактерійної лізиндекарбоксилази в трансгенній культурі кореневих волосків Nicotiana tabacum, яка збільшує вихід біогенних амінів кадаверину і анабазину до 14 разів [J.Berlin et al., Genetic modification of plant secondary metabolism: Alteration of product levels by overexpression of amino acid decarboxylases, в: Advances in Plant Biology, Studies in Plant Science, том 4, стор.57-81, D.D.Y. Ryu і S.Furasaki (Ed.), Elsevier, Амстердам (1994)]. Однак можливість перенесення ДНК в рослини не тільки робить можливою кількісні і якісні зміни рослинних конструкцій; крім того, рослини і культури рослинних клітин стають більш цікавими для одержання гетерологічних білків [A.S.Moffat, High-Tech plants promise a bumper crop of new products, Science 256, стор.770771 (1992)], за основу були взяті два різних підходи. Перший підхід включає в себе одержання гетерологічних білків з трансгенних інтактних рослин. Крім одержання антитіл з трансгенних тютюнових рослин [J.K.-C.Ma et al., Generation and assembly of secretory antibodies in plants, Science 268, стор.716-719 (1995)], були описані експресія і точний процесінг альбуміну сироватки людини як в трансгенних рослинах тютюну, так і в трансгенних рослинах картоплі [Р.С.Sijmons et al., Production of correctly processed human serum albumin in transgenic plants, Bio/Techn.,8, стор.217-221 (1990)]. В трансгенних рослинах тютюну експресувався також епідермальний фактор зростання людини [(hEGF) (A.-H. Salmanian et al., Synthesis and expression of the gene for human epidermal growth factor in transgenic potato plants, Biotechnol, Lett.,18, стор.1095-1098 (1996)]. Проте, також використовували і інші рослини. Використовуючи Arabidopsis thaliana і Brassica napus, успішно одержували Leu-енцефалін, [Ε.Krebbers і J.Vandekerckhove, Production of peptides in plant seeds, Tibtech.,8, cтop.1-3. (1990)]. Крім того, для експресії химерних вірусних часток, які діють як вакцини, використали трансгенні рослини Vigna unguiculata [К. Palsgaard et al., Plant-derived vaccine protects target animals against a viral disease, Nat. Biotech.,15, стор.248-252 (1997)]. Основною незручністю при роботі з інтактними рослинами, у випадках, описаних вище як приклад, є необхідність їх вирощування, що віднімає багато часу і дорого коштує, а також великий об'єм культивування, необхідний для виробництва в промислових об'ємах. Крім того, для виділення бажаної цільової речовини з інтактних рослин звичайно потрібний складний багатостадійний процес, особливо, коли стабільність і якість продуктів повинні відповідати високим Вимогам, як у випадку з речовинами, що використовуються для фармацевтичних і харчових цілей. У другому підході для одержання антитіл використовуються культури трансгенних клітин тютюну. Описані, наприклад, експресія антитіл і їх секреція в середовище [N.S.Magnuson et al., Enhanced recovery of a secreted mammalian protein from suspension culture of genetically modified tobacco cells, Prot. Expr. Pur.,7, стор.220-228 (1996)]. Оскільки гетерологічні білки складно виділити з клітин, секреція цільового білка в середовище є значним удосконаленням. Крім того, продукція рекомбінантних фармацевтично важливих білків в культуру клітин також викликає інтерес з точки зору збереження, оскільки трансгенні рослинні клітини можна вирощувати виключно в біореакторах і їх не треба виділяти. Одержання необхідної масової культури можливе завдяки розробці біореакторів для культур гетеротрофних рослинних клітин у великих масштабах [наприклад, M.L. Shuler et al., Bioreactor engineering as an enabling technology to tap biodiversity: The case of taxol., Ann, N.У.Acad. Sci., 745, стор.455-461 (1994)]. Основною незручністю другого підходу, в якій використовуються рослинні суспензійні культури, є низька швидкість росту, відносна низьке утворення вторинних метаболітів, інгібування утворення продукту при високій щільності клітин і, як наслідок, низька продуктивність на об'єм, утворення агрегатів і компонентів клітинної стінки, і зростання чутливості клітин до поперечного зсуву. Також необхідно брати до уваги той факт, що при використанні гетеротрофних клітинних культур завжди повинне використовуватися складне середовище з різноманітними компонентами, деякі з яких є такими, що дорого коштують. Однак самою серйозною незручністю, про яку потрібно згадати, є наявність сoмаклональних варіацій в клітинних культурах рослин in vitro, які викликають кількісні і якісні зміни при одержанні гетерологічних білків [див., наприклад, M.G.K. Jones і К.Lindsey, Plant biotechnology, в: Molecular biology and biotechnology, J.M.Walker і E.W.Gingold (Eds.), 2nd Ed, Royal Soc. of Chem, Turlington House, Лондон (1988)]. Гетерогенність продуктів, що утворюються і їх функціональних властивостей недопустима, особливо, в зв'язку з виробництвом фармацевтичних препаратів і інших бажаних речовин, для офіційного схвалення яких потрібна надійна гарантія якості і стандартизація способу виробництва. Метою даного винаходу, таким чином, є спосіб для стандартизованого виробництва гетерологічних білкових речовин з рослинного субстрату, який істотним чином усуне не тільки описані вище труднощі використання інтактних рослин, але також труднощі використання клітинних культурних систем. Відповідно до винаходу мета досягається розробкою нового способу одержання гетерологічних білкових речовин з рослинного субстрату, згідно з яким повністю диференційовані мохи вирощують при стандартних умовах і одержані білкові речовини виділяють з культурального середовища по суті без руйнування продукуючих тканин або клітин. Як тут використовується, термін «білкові речовини» охоплює пептиди, поліпептиди і білки, а також їх фрагменти, які є відповідними, зокрема, для діагностичних, фармацевтичних і харчових цілей. Також він охоплює молекули, які містять пептидні зв'язки і які транслюються рослинним субстратом. У переважному здійсненні згідно з даним винаходом, бажані гетерологічні білкові речовини вивільняються в культуральне середовище в своїй біологічно активній формі. Як використовується в даному описі, термін «біологічно активні» означає, що цільові речовини з такою ознакою мають бажані або необхідні функціональні властивості для відповідної мети. Наприклад, якщо бажане одержання антитіл, то одержані білки або їх функціональні фрагменти є біологічно активними, якщо вони здатні здійснювати очікуване специфічне скріплення з антигеном. Фахівцеві в даній області очевидно, що для таких цілей не завжди потрібний нативний білок, а можна знайти епітопи або низькомолекулярні структури, які забезпечують бажану біологічну активність або дію. Наприклад, фермент є біологічно активним, якщо він здатний перетворювати свій цільовий субстрат. В іншому переважному втіленні винаходу, в культуральному середовищі, яке по суті не містить цукрів, вітамінів і фітогормонів або їх функціональних фрагментів, вирощують рослинний субстрат у вигляді інтактних мохів. Спосіб згідно з винаходом дозволяє вирощувати інтактні і повністю диференційовані рослини в фотоавтотрофних умовах, які можуть бути Стандартизовані, тобто не вимагають додавання цукрів, вітамінів, фітогормонів і тому подібне, як це потрібно для попередньої гетеротрофної суспензійної клітинної системи. Оскільки використовується недороге і просте поживне середовище, стадії одержання і очищення бажаних цільових речовин значно полегшені. У способі згідно з винаходом рослинним субстрат, що використовується переважно є інтактний мох, вибраний з групи мохів, включаючи печіночники, з видами родів Physcomitrellaf Funaria, Sphagnum і Ceratodon, а також Marchantia і Sphaerocarpos, які є особливо переважними для використання. Спосіб згідно з даним винаходом найбільш переважно проводити з використанням моху fhyscomitrella patens. У наступному переважному втіленні, конструкція нуклеїнової кислоти, що використовується для трансформації, кодує не тільки бажану білкову речовину, а і транспортний білок для секреції речовини з клітини-хазяїна в культуральне середовище. Відповідно до винаходу можна використати будь-яку аутологічну і гетерологічну послідовність нуклеїнової кислоти, відому фахівцеві в даній області, і її можна використати для одержання експресійної касети для трансформації Продукуючої тканини. Особливо переважним є використання сигнальних пептидів ендоплазматичного ретикулуму сітки або клітинного транспорту. Проведена згідно з даним винаходом робота показала, що вищезгадана проблема сомаклональних змін, з якою стикаються в клітинних культурах, в фотоавтотрофних рідких культурах мохів не виникає. Крім того, мохи, що використовуються відповідно до винаходу, мають перевагу над іншими системами своєю чіткою зміною суворо визначених стадій диференціювання (хлоронема, каулонема, бруньки, гаметофори), на які можна впливати доданням рослинних гормонів (індол-3-оцтова кислота стимулює розвиток каулонеми, ізопентеніладенін стимулює розвиток бруньок) [див., наприклад, N.W.Ashton et al., Analysis of qametophytic development in the moss, Physcomitrella patens, using auxin and cytokinin resistant mutants, Planta, 144, стор.427435 (1979)]. Таким чином, в біореакторних культурах можлива направлена експресія гетерологічних білків в визначеній стадії диференціювання, і особливо переважним відповідно до винаходу є синхронний розподіл чистої і, таким чином, гомогенної культури хлоронеми внаслідок продукції, що контролюється однакового білка в біореакторі і зручності використання гормоно-залежного промотору або промотору визначеної стадії диференціювання. У доповнення до такої експресійної системи, також відповідно до винаходу можна використати індуцибельну промоторну систему, зокрема, для одержання Ділків з коротким періодом напіврозпаду або які є цитотоксичними, особливо переважним є використання 1'-промотору Agrobacterium tumefaciens. Культивування мохів, запропонованих відповідно до винаходу для виробництва гетерологічних білків в економічних перспективах, може здійснюватися, наприклад, з використанням Physcomitrella в об'ємах з порядками величини від 20мл до 6л-10л і вище у культурах, що струшуються або в аерованих скляних ємностях [див., наприклад, R.Reski, Zell-und molekularbiologische Untersuchungen der cytokinin-induzierbaren Gewebedifferenzierung und Chloroplastenteilung bei Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G., (Cell- and molecularbiological studies of the cytokinin-inducible tissue differentiation and chloroplast division in Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G.), Ph.D. thesis, Університет Гамбурга (1990)]. Оскільки використовується культура диференційованих фотоаутотрофних рослин, середовище не потребує ні додання рослинних гормонів, ні вітамінів, ні цукрів. У порівнянні зі складним середовищем, яке потрібно, наприклад, для культур тваринних клітин, вартість знижується в 100 раз. Відповідно до винаходу було з'ясовано, що вихід біологічно активного гетерологічного білка в культуральному середовищі може бути збільшений в 35 раз в присутності ПВП, ось чому в способі згідно з винаходом переважне використання ПВП в культуральному середовищі. Докладна інформація по культивуванню в біореакторах інших мохів, які є придатними відповідно до винаходу, таких як, наприклад, Leptobryum pyriforme і Sphagnum magellanicum, описана в попередньому рівні техніки [див., наприклад, Е.Wilbert, Biotechnologische Studien zur Massenkultur von Moosen unter besonderer Berucksichtigung des Arachidonsaurestoffwechsels (Biotechnological studies concerning the mass culture of mosses with particular consideration of the arachidonic acid metabolism), Ph.D. thesis, Університет Майнца (1991); Η.Rudolph і S.Rasmussen, Studies on secondary metabolism of Sphagnum cultivated in bioreactors, Crypt. Bot,3, стор.67-73 (1992)]. Особливо переважно для цілей згідно з даним винаходом використання Physcomitrella, зокрема, оскільки всі стандартні молекулярно-біологічні методи створені для цього організму [див. огляд R.Reski, Development, genetics and molecular biology of mosses, Bot. Acta, 111, стор.1-15 (1998)]. Відповідні трансформуючі системи були розроблені для біотехнологічного використання Physcomitrella для одержання гетерологічних білків. Наприклад, проводилися успішні трансформації за допомогою прямого перенесення ДНК в протонемну тканину, використовуючи бомбардуючу частками гармату. Також може успішно застосовуватися перенесення ДНК в протопласти моху, зумовлене ПЕГ. Цей метод трансформації був неодноразово описаний для Physcomitrella і приводить як до тимчасових, так і до стабільних трансформантів [див., наприклад, К, Reutter and R. Reski, Production or a heterologous protein in bioreactor cultures of fully differentiated moss plants, PI. Tissue culture, @ Biotech.,2, стор.142-147 (1996)]. Хоча даний винахід головним чином підходить для одержання будь-якої білкової речовини, одержання фармацевтично важливого білка тут демонструється на прикладі людського фактора росту ендотелію судин (VEGF). VEGF був уперше виділений N.Ferrara і W.J. Henzel [Pituitary follicular cells secrete a novel heparin-binding growth factor specific for vascular endothelial cells, Biochem. Biophys. Res. Commun.,161, стор.851-858 (1989)] і описаний як регуляторний фактор, контролюючий ангіогенез і розподіл ендотеліальних клітин при нормальних фізіологічних умовах [N. Ferrara et al., The vascular endothelial growth factor family of polypeptides, J.Cell. Biochem.,47, стор.211-218 (1991)]. Автори також продемонстрували, що цей фактор росту володіє високою специфічністю до ендотеліальних клітин судин і неактивний по відношенню до інших типів клітин. VEGF являє собою гомодимерний глікопротеїн, пов'язаний дисульфідними містками. Відомі чотири різних форми людського VEGF. Чотири ізоформи мають протяжність в 121, 165, 189 і 206 амінокислот і утворюються альтернативним сплайсінгом PHKVEGF, VEGF206 виявлений тільки в кДНК печінці зародка, а транскрипти VEGF121, VEGF165 і VEGF165 виявлені в більшості пухлинних клітин і пухлинних тканинах. Хоча все ізоформи VEGF мають лідерну послідовність для секреції, ефективно секретується тільки дві найменші форми [див., наприклад, G.Martiny-Baron і D.Marme, VEGF-mediated tumor angiogenesis: A new target for cancer therapy, Curr. Opin. Biotechnol.,6, стор.675-680 (1995)]. Досі потрібні адекватні кількості VEGF як для розвитку і удосконалення існуючих підходів в терапії пухлин, так і для вивчення VEGF. На ранніх стадіях роботи, проведеної в контексті даного винаходу, єдиним описаним було рекомбінантне одержання VEGF в клітинах комах за допомогою бациловірусної експресійної системи [наприклад, B.L.Fiebich et al., Synthesis and assembly of functionally active human vascular endothelial growth factor homodimers in insect cells, Eur. J.Biochem., 211, стор.19-26 (1993)]. [Saccharomyces cerevisiae (S.Kondo et al., The shortest isoform of human vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor (VEGF/VPF 121) produced by Saccharomyces cerevisiae promotes both angiogenesis and vascular permeability, Biochira. Biophys. Acta, 1243, стор.195-202 (1995)], дріжджі Pichia pastoris [D.Mohanraj et al., Expression of biologically active human vascular endothelial growth factor in Yeast, Growth factors, 12, стор.17-27 (1995)] і [Escherichia coli (G. Siemeister et al., Expression of biologically active isoforms of the tumor angiogenesis factor VEGF in Escherichia coli, Biochem. Biophys. Res. Commun., 222, стор.249-255 (1996)] є додатковими продукуючими організмами. У всіх цих рекомбінантних системах був одержаний біологічно активний VEGF. Однак експресійна система Е.coli ускладнена у відношенні очищення і відновлення білка, оскільки останній упакований в тільця включення. Приклади Короткий виклад Розробка масових культур, що контролюються Physcomitrella patens [Reutter and Reski, loc. cit.) і способів перенесення ДНК в мох Physcomitrella patens (К.Reutter, Expression heterologer Gene in Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. (Expression of heterologous genes in Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G.), Ph.D. thesis, Університет Гамбурга (1994)] створює основні передумови для біотехнологічного використання цієї рослини. Робота, проведена спочатку, показала довготривалу стабільність інтеграції, використовуючи трансгенні лінії Physcomitrellaf одержані від Reutter (loc. cit., 1994). Експресія гетерологічних генів npt II і gus, які використовувалися як приклад для цієї мети, після чотирьох років досі виявляється. Була оптимізована біореакторна культура Physcomitrella. Була розроблена мішалка, яка здійснювала подрібнення протонем і, таким чином, забезпечувала необхідну гомогенність культури при постійних швидкостях 300-500об./хв. Таким чином, стало можливим стандартизувати взяття зразків. У той же час, поступаюче повітря розподілялося більш рівномірно в рідкій культурі. При цих умовах було показано, що утворення біомаси і білка без регуляції рН ззовні проходило так само, як при регуляції рН; несподівано виявилося, що регуляція, отже, не потрібна. Щотижневу продукцію біомаси, 500мг сухої ваги або 22мг загального білка на літр, одержували в напівсерійних умовах. Це означає збільшення продуктивності біомаси в п'ять разів в порівнянні із звичайними культурами в 5-літрових скляних колбах. Зниження концентрації солі середовища Кноп на одну десяту частину приводило до тих же даних і, таким чином, до зниження вартості. Додання 5мМ тартрату амонію прискорювало розвиток біомаси через скорочення лаг-періоду. Одночасно, додання тартрату амонію давало культури, які включали фактично тільки хлоронемні клітини. Було показано при допомозі проточної цитометрії, що фактично сто процентів клітин в цих культурах знаходилися в G2/M фазі клітинного циклу. Цей результат був підтверджений додатковими фізіологічними дослідженнями з ауксином і дослідженнями з мутантами визначеної стадії диференціювання call 12 і call 13, і були зроблені висновки, що каулонемні клітини велику частину часу знаходяться в G1/G0 фазі, в той час як хлоронемні клітини знаходяться переважно в G2/M фазі. Як можливий індуцибельний промотор моху розглядався 1'-промотор агробактерій. Як маркерний ген використовувався ген β-глюкоронідази (gus). У тимчасово трансформованих протопластах моху (рівень трансформації = 3´10-4), після індукції 5мкМ індол-3-оцтовою кислотою спостерігалася експресія гена gus. В жодному контролі експресії не спостерігалося. Ген 121 амінокислотної сплайсованої форми людського фактора росту ендотелію судин (VEGF121) трансформували в Physcomitrella з рівнем трансформації 0,5´10-5 і 3,3´10-6. Потім, ген клонували за конструктивним промотором 35S і в трансформуючий вектор pRT99, який придатний для рослин. У другому підході, додатково клонували послідовність, що кодує відповідний транспортний білок ER людини. Піддаючи одержані стабільні трансформанти Southern-аналізу, підтверджували інтеграцію гетерологічної ДНК і описували тип інтеграції. Nothern-аналіз підтвердив присутність nptll і двох транскриптів VEGF в цих трансформантах. Експресія VEGF121 в клітинах моху була показана опосередкованою імунофлуоресценцією. Білок однозначно локалізувався в клітинах, що було показано за допомогою конфокального лазерного скануючого мікроскопа. Для трансформантів без транспортного пептиду ці дослідження показали, що білок локалізований, зокрема, в цитоплазмі. У трансформантах, що містять транспортний пептид ER, білок може знаходитися в області ядра і в апікальних областях апікальних клітин, областях з дуже високим вмістом ER. Біологічну активність гетерологічного білка, одержаного відповідно до винаходу, перевіряли за допомогою аналізу ELISA і двох аналізів на функціональну активність, використовуючи білок VEGF, одержаний з поживного середовища. Матеріали і методи: Якщо інакше не указано в тексті, хімічні сполуки, що використовуються були чисті для аналізу і їх одержували від Fluka (Neu-Ulm), Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe), Serva (Heidelberg) і Sigma (Deisenhofen). Розчини готували на очищеній, апірогенній воді, тут позначеній як Н2О, з системи водного очищення MilliQ (Millipore, Eschborn). Рестрикційні ендонуклеази, ферменти, що модифікують ДНК, і біологічні набори одержували від AGS (Heidelberg), Amersham (Braunschweig), Applied Biosystems (Weiterstadt), Biometra (Gottingen), Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim), Genomed (Bad Oeynhausen), New England Biolabs (Schwalbach/Taunus), Novagen (Madison, Wisconsin, USA), Pharmacia (Freiburg), Qiagen (Hilden) і Stratagene (Heidelberg). Якщо не визначено інакше, їх використовували відповідно до інструкцій виробника. Вектори і конструкції Плазміда pCYTEXP-VEGF121 є похідною плазміди Pcytexp1 [T.N.Belev et al., A fully modular vector system for the optimization of gene expression in Escherichia coli, Plasmid, 26, стор.147-150 (1991)], в яку інтегрували кДНК людського VEGFm для експресії в Е. coli. Використовуючи рестрикційні ендонуклеази Nde І і Sal І з pCYTEXPVEGF121 вирізали кДНК VEGF121, очищали, робили їй тупі кінці і клонували в рестрикційний сайт Sma I pRT101 [R.Topfer et al., A set of plant expression vectors for transcriptional and translational fusions, Nucleic Acids Res., 15, стор.5890 (1987)] між промотором 35S і поліаденільованою послідовністю CaMV. Одержану таким чином касету знов розрізали Hin dlll, і клонували в сайт рестрикції Hin dlll трансформуючого вектора pRT99. pRT99 містить не тільки полілінкерний сайт рестрикції, але також ген фосфотрансферази неоміцину під регуляцією промотору 35S і відповідну поліаденільовану послідовність CaMV [R.Topfer et al., Versatile cloning vectors for transient gene expression and direct gene transfer in plant cells, Nucleic Acids Res., 16, стор.8725 (1988)]. Цей ген дає стійкість до антибіотика G418 стабільно трансформованим рослинам. Плазміди реплікувалися в штамі DH5a Escherichia coli [J.Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Нью-Йорк (1989)]. Використовуючи рестрикційні ферменти Bam HI і Bgl II, кДНК вирізали з вектора pVE-121, який був спочатку створений для експресії VEGF121 в клітинах комах і який крім послідовності VEGF121 включає ДНК, що кодує природний транспортний пептид, який, в свою чергу, в системі тваринних клітин опосередковує секрецію в середовище з ендоплазматичного ретикулуму [Fiebich et al., Synthesis and assembly of functionally active human vascular endothelial growth factor homodimers in insect cells, Eur. J.Biochem., 211, стор.19-26 (1993)] і, використовуючи pRT101, клонували в pRT99 і перевіряли. Плазміда pNA201 є похідним бінарного вектора рВl101 [A.R.Jefferson et al., Assaying chimeric genes in plants: The GUS gene fusion system, Plant Мої, Rep., 5, стор.387-405 (1987)]. Як селективний маркер рослин вона містить ген nptll під нопалінсинтазним промотором. Ген gus, який також присутній, регулюється 1'промотором Agrobacterium tumefaciens. pNA201 зручний для прямої трансформації Physcomitrella patens. Антитіла Використали два різних антитіла проти білка VEGF. Першим антитілом було кроляче анти-VEGF антитіло, направлене проти синтетичного пептиду, відповідного 1-20 амінокислотам нативного людського VEGF [Fiebich et al., loc. cit. (1993)]. Другим антитілом було моноклональне мишаче антитіло проти людського білка VEGF121 (R&D Systems, Wiesbaden). Рослинний субстрат Використовувався штам дикого типу моху Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G., який був взятий з колекції Genetics Group при Department of General Botany, Університет Гамбурга. Його джерелом є штам 16/14, який знаходиться в колекції H.L.K. Whitehouse в Gransden Wood, Huntingdonshire (Англія) і був субклонований з спори. Штам дикого типу вирощували або у вигляді рідкої культури із середовищем Knop [R.Reski і W.O.Abel, Induction of budding on chloronemata and caulonemata of the moss, Physcomitrella patens, using isopentenyladenine, Planta, 165, стор.354-358 (1985)], або на твердому середовищі з 1% агаром Oxoid [Unipath, Basingstoke, Англія). Рідкі середовища одержували, як описано у Reski (loc. cit., 1990)]. Біореакторна культура Для масової культивації, рослинний матеріал вміщували в 7-л круглодонні скляні колби біореактора, оснащеного подвійною обшивкою (Applikon Biotek, Knullwald). У системі біореактора зверху через отвір в кришці в об'єм культури вводили конденсатор з повітряним охолоджуванням для відведення газу, аераційну трубку, рН-електрод (Conducta, Gerlingen), температурний датчик, пристрій для перемішування, трубку для взяття проб і входу для кислоти, основи і середовища. Для культур встановлювали температуру 25°С і контролювали її за допомогою відповідно відрегульованої водяної бані, яка приєднувалася до подвійної обшивки. ВУ експерименті, який проводили з регулюванням рН, рН підтримували постійним при 5,8 за допомогою одиниці титрування. Температурні вимірювання і регулювання рН проводили за допомогою Biocontroller ADI 1030 (Applikon Biotek, Knullwald). Швидкість мішалки можна змінювати регулювальником частоти обертання ADI 1012 (Applikon Biotek, Knullwald). Поживне середовище постійно аерували 1 баром повітря через пористий вдуваючий елемент. Для забезпечення стерильності в колбі з культурою всі трубки, що відводять, і всі, що підводять були забезпечені пристроєм для стерилізації фільтрацією (Midisart, 0,2мкм; Sartorius, Gottingen). Біореакторну культуру вміщували в камеру з контролем клімату і бічним освітленням (біле світло; Osram L 40 W/20; максимально 100мкмоль -1м-2). Культуру інокулювали 0,5-1г сирого рослинного субстрату на літр культури біореактора в стерильних умовах. Трубка для взяття зразків знаходилася на одному рівні з мішалкою, таким чином, гарантуючи одноманітність відбору зразків під час перемішування. Невеликі по кількості зразки (