Спосіб одержання тимосапоніну вii

1. Спосіб одержання Тимосапоніну ВІІ: а) одержання відварених шматочків Китайського традиційного лікарського засобу Кореневища Anemarrhenae або свіжовикопаного кореневища, або мочкуватого кореня Anemarrhena asphodeloides Bunge як сировини і екстракція розчинником, який вибирають з групи, яка складається з води, ацетону, етанолу, пропанолу і суміші щонайменше двох з них; б) виділення екстракту, одержаного з а) за допомогою одного або декількох способів, що вибирають з групи, яка складається з адсорбції полімерною смолою, поліамідної хроматографії, колонкової хроматографії з оберненою фазою і колонкової хроматографії з Sephadex LH-20, і елюювання за допомогою елюенту, вибраного з групи, яка складається з води, ацетону, ацетоніт 2 (19) 1 3 85710 4 який вибирають з групи, яка складається з води, ацетону, ацетонітрилу, етанолу і пропанолу, і елюювання може бути ізократичним елююванням або градієнтним елююванням. 8. Спосіб за п. 1, в якому поліамідна хроматографія у б) включає завантаження водного розчину Тимосапоніну ВІІ у поліамідну колонку і потім елюювання водою або 0-15 % розчином ацетону, етанолу або пропанолу у воді у кількості, 2-5кратній об'єму колонки. 9. Спосіб за п. 1, в якому колонковою хроматографією з оберненою фазою є колонкова хроматографія з оберненою фазою при нормальному тиску або при підвищеному тиску, наповнювачем колон ки є силікагель RP-18 (ODS) або RP-8, елюент вибирають з групи, яка складається з ацетонітрилу-води, ацетону-води, етанолу-води і пропанолуводи, і елюювання може бути ізократичним елююванням або градієнтним елююванням. 10. Спосіб одержання Тимосапоніну ВІІ за п. 1, в якому колонковою хроматографією з Sephadex-20 є колонкова хроматографія при нормальному тиску або при підвищеному тиску, елюент вибирають з групи, яка складається з ацетонітрилу-води, ацетону-води, етанолу-води і пропанолу-води, і елюювання може бути ізократичним елююванням або градієнтним елююванням. Винахід стосується способу одержання Тимосапоніну ВII. Китайський традиційний лікарський засіб Кореневище Anemarrhenae є кореневищем Anemarrhena asphodeloides Bge.(Liliaceae), що широко поширене в Hebei, Neimenggu, провінція Шанхай, північно-східний Китай, і у деяких інших областях. Внаслідок функції очищення шляхом підвищення температури і очищення внаслідок пропасниці, і дії, що стимулює продукування рідини тіла і живлення легені, воно часто застосовується у клініці традиційної китайської медицини. Головними компонентами Anemarrhena asphodeloides Bge. є стероїдні сапоніни поряд з флавонами, олігосахаридами, полісахаридами і жирними кислотами, і т.п. Фармакологічні дослідження показали, що воно має антибіозний, антивірусний, піретолітичний, антидіабетичний, седативний по відношенню до свідомості, інгібуючий агрегацію тромбоцитів, протираковий і протипроменевий ефекти, і т.п. Тимосапонін ВII, також названий як Прототимосапонін АIII, є головним компонентом кореневища Anemarrhena asphodeloides Bge. Він має структур у (25S)-26-О-b-D-глюкопіранозил-22гідрокси-5b-фуростан-3b, 26-діол-3-О-b-D-глюкопіранозил-(1®2)-b-D-галактопіранозид. Він має наступну формулу: 350), Bai-ping Ma (Bai-ping Ma зі співр., Acta. Pharm. Sin. 1996; 31 (4): 271-277), Masayasu Kimura (Masayasu KIMURA зі співр., Biol. Pharm. Bull, 1996; 19 (7): 926-931) і Jian-ying Zhang (Jianying ZHANG зі співр., Clinica Chimica Acta, 1999; 289: 79-88) повідомили про виділення і активність Тимосапоніну ВII. Дослідники вказали, що Тимосапонін ВII має активності антидіабетичну, інгібуючу агрегацію тромбоцитів, захоплення вільних радикалів і протидії деменції. У майже всіх попередніх посиланнях у даній галузі Тимосапонін ВII одержували за допомогою екстракції н-бутанолом, колонкової хроматографії з силікагелем з нормальною фазою, колонкової хроматографії з макропористою полімерною смолою і високоефективної рідинної хроматографії (HPLC). Але він легко емульгується при екстракції н-бутанолом, кількість зразка обмежена для колонкової хроматографії з силікагелем, є труднощі у регенерації силікагелю, існують труднощі у виділенні елюенту хлороформметанол-вода. Тому описані способи звичайно мають важкий технологічний процес, низький вихід, низьку чистоту і не піддаються промисловому одержанню. Навіть з використанням макропористої полімерної смоли і рідинної хроматографії з оберненою фазою елюент метанол-вода буде приводити до метоксилювання по С-22 гідроксилу Тимосапоніну ВII з формуванням визначеної фракції Тимосапоніну ВІ (Seiji NAGUMO зі співр., YAKUGAKU ZASSHI, 1991; 111 (1): 306-310). Так ці способи приводять до непродуктивної витрати деякої кількості зразків і можуть тільки генерувати суміш Тимосапоніну ВII і Тимосапоніну ВІ, а також є важкими до Тимосапонін ВII був вперше виділений Toshio KAWAZAKI в 1963, але він не представив його структур у. У 1991 Seiji NAGUMO перший визначив структур у Тимосапоніну ВII (Seiji NAGUMO зі співр, YAKUGAKI ZASSHI, 1991; 111 (1): 306-310). Після цього Noboru Nakashima (NOBORU NAKASHIMA зі співр., Journal of Natural Products, 1993; 56(3): 345 З цих причин існує необхідність поліпшення способу одержання Meтою даного винаходу є поліпшений спосіб одержання Тимосапоніну ВІІ. У способі уникають 5 85710 застосування н-бутанолу і колонкової хроматографії з силікагелем при екстракції і очищенні, уникають застосування метанолу для елюювання і, тому, забезпечують високу чистоту і вихід Тимосапоніну ВII. Таким чином, даний винахід стосується поліпшеного способу одержання Тимосапоніну ВІІ, що включає: а) забезпечення як сировини відварених шматочків Китайського традиційного лікарського засобу кореневища Anemarrhenae або свіжовикопаного кореневища або кореня Anemarrhena asphodeloides Bge. і екстракцію розчинником, вибраним з групи, яка складається з води, ацетону, етанолу, пропанолу і суміші щонайменше двох з них; б) виділення екстракту з а) за допомогою одного або декількох способів, вибраних з групи, яка складається з адсорбції полімерною смолою, поліамідної хроматографії, колонкової хроматографії з оберненою фазою і колонкової хроматографії з Sephadex LH-20, і елюювання елюентом, вибраним з групи, що містить воду, ацетон, ацетонітрил, етанол, пропанол і суміш щонайменше двох з них; в) об'єднання елюентів б), сушіння і одержання Тимосапоніну ВІІ. Відповідно до даного винаходу на етапі а) використаним розчинником може бути будь-який один з води, ацетону, етанолу і пропанолу або суміш, що містить два або декілька з них у будьякій пропорції. Екстракт може бути одержаний шляхом імерсійної екстракції або ультразвукової екстракції в ультразвуковому екстракторі при кімнатній температурі, або імерсійної екстракції або екстракцією при кип'ятінні в умовах нагрівання, і екстракція може бути проведена один або декілька разів. На етапі а) переважними способами екстракції є наступні: відварювання у воді; або кип'ятіння, діафільтрація або ультразвукова екстракція 10-90% розчином етанолу у воді; або кип'ятіння, діафільтрація або ультразвукова екстракція 10-80% розчином ацетону у воді. Відповідно до даного винаходу на етапі б) відносно адсорбції полімерною смолою використаними полімерними смолами можуть бути тип D-101 адсорбуючих полімерних смол, тип АВ-8 адсорбуючих полімерних смол, тип XAD-2 адсорбуючих полімерних смол, тип НР20 адсорбуючих полімерних смол, тип SP825 адсорбуючих полімерних смол, тип SP700 адсорбуючих полімерних смол, тип СНР-20Р адсорбуючих полімерних смол або тип SP70 адсорбуючих полімерних смол, або інші типи полістиренових (PS) макропористих адсорбуючи х полімерних смол. Використовуваним елюентом може бути один або декілька, вибраних з води, ацетону, етанолу і пропанолу. Елююючим способом може бути ізократичне елюювання або градієнтне елюювання. У конкретному варіанті здійснення супернатант після центрифугування або фільтрат екстракту адсорбували на макропористій полімерній смолі і домішки могли бути видалені шляхом елюювання водою або низькою концентрацією ацетону, або нижчим спиртом (наприклад, етанолом або пропа 6 нолом) у воді, де концентрація може бути 5-30% і об'єм може бути 2-7-кратним об'єму колонки (2-7 BV). Потім колонку елюювали найвищою концентрацією ацетону або нижчого спирту (наприклад, етанолом або пропанолом) у воді, де концентрація може бути 20-70% і об'єм може бути 2-7-кратним об'єму колонки (2-7 BV). В залежності від результатів детектування весь або частину елюату збирали, розчинник регенерували і залишок концентрували до одержання неочищенного Тимосапоніну ВІІ. Відповідно до даного винаходу як альтернативний спосіб, який може бути використаний на етапі б), поліамідною хроматографією може бути колонкова хроматографія або статичний спосіб адсорбуючої фільтрації і елюентом може бути один або декілька, вибраних з води, ацетону, ацетонітрилу, етанолу і пропанолу. Елююючим способом може бути ізократичне елюювання або градієнтне елюювання. У конкретному варіанті здійснення водний розчин Тимосапоніну ВІІ завантажували у поліамідну колонку та елюювали водою або низькою концентрацією ацетону, або нижчим спиртом (наприклад, етанолом або пропанолом) у воді, де концентрація може бути 0-15% і об'єм може бути 2-5-кратним об'єму колонки (2-5 BV). В залежності від результатів детектування весь або частину елюату збирали, розчинник регенерували і залишок концентрували до одержання Тимосапоніну ВІІ. Як альтернатива, поліамід додавали у водний розчин, що містить Тимосапонін ВІІ, перемішували досить, відстоювали, фільтрували через фільтр Бюхнера та елюювали водою або низькою концентрацією ацетону, або нижчим спиртом у воді. В залежності від результатів детектування весь або частину елюату об'єдн ували, розчинник регенерували і залишок концентрували до одержання Тимосапоніну ВІІ. Поліамід можна було регенерувати високою концентрацією ацетону, етанолу або пропанолу у воді або кислотою, або лугом. Як альтернативний спосіб, який може бути використаний на етапі б) способу відповідно до даного винаходу, колонкова хроматографія з оберненою фазою може бути колонковою хроматографією з оберненою фазою при нормальному тиску або при підвищеному тиску. Наповнювачем колонки може бути Силікагель з оберненою фазою 18 (Силікагель RP-18) або Силікагель з оберненою фазою 8 (Силікагель RP-8). Елюентом може бути один або декілька, вибраних з ацетонітрилу-води, ацетону-води, етанолу-води і пропанолу-вод. Елююючим способом може бути ізократичне елюювання або градієнтне елюювання. У конкретному варіанті здійснення зразок, який містить Тимосапонін ВІІ, розчиняли в елюенті, розчин хроматографували на колонці з оберненою фазою та елюювали одним або декількома, вибраними з ацетонітрилу-води, ацеіону-води, еганолу-води і пропанолу-води, де концентрація органічного розчинника може бути 15-60% і елюат збирали фракційно. В залежності від результатів детектування частину елюату об'єднували, розчинник регенерували і залишок концентрували до одержання Тимосапоніну ВІІ. 7 85710 Як альтернативний спосіб, який може бути використаний на етапі б) способу відповідно до даного винаходу, колонковою хроматографією з Sephadex LH-20 може бути колонкова хроматографія при нормальному тиску або при підвищеному тиску. Елюентом може бути один або декілька, вибраних з ацетонітрилу-води, ацетону-води, етанолу-води і пропанолу-води, і елююючим способом може бути ізократичне елюювання або градієнтне елюювання. У конкретному варіанті здійснення зразок, який містить Тимосапонін ВІІ, розчиняли в елюенті, хроматографували на Sephadex LH-20 та елюювали одним або декількома, вибраними з ацетонітрилу-води, ацетону-води, С2-С5 спирту (наприклад, етанолу і пропанолу)-води, де концентрація органічного розчинника може бути 5-60% і елюат збирали фракційно. В залежності від результатів детектування частину елюату об'єднували, розчинник регенерували і залишок концентрували до одержання Тимосапоніну ВІІ. Відповідно до даного винаходу на етапі в) способом сушіння, відомим у даній галузі, могло бути використане, наприклад, сушіння при зниженому тиску, сушіння виморожуванням і розпилювальне сушіння. Винахід вирішив проблеми труднощів попередніх способів з даної галузі техніки, особливо відносно низької чистоти і низького виходу Тимосапоніну ВІІ внаслідок застосування н-бутанолу, метанолу і колонкової хроматографії з силікагелем. Відповідно до способу за даним винаходом чистота одержаного Тимосапоніну була ви щою 90%; і цей спосіб є простим, практичним і здійсненним для промисловості. Приклади Наступні приклади детально ілюструють винахід, але не обмежують винахід будь-якими засобами. Приклад 1 Одержання Тимосапоніну ВІІ Відварені шматочки Китайського традиційного лікарського засобу Кореневища Anemarrhenae (8 кг) подрібнювали, до них додавали 48 л 50% етанолу. Ліки занурювали на одну годину і потім при кип'ятінні екстрагували одну годину до фільтрування. Залишок також при кип'ятінні екстрагували більше двох разів. Етанольний екстракт об'єднували, етанол регенерували і залишок концентрували при зниженому тиску до 40 л. Заздалегідь оброблену макропористу адсорбуючу полімерну смолу SP825 (Mitsubishi Co., Japan) завантажували у колонку (18 л), яку зрівноважували водою. Концентрований екстракт фільтрували і фільтрат хроматографували на колонці, і промивали водою для видалення домішок. Потім колонку елюювали послідовно 3-кратним об'ємом колонки (3BV) 35% етанолом, 3BV 50% етанолом і 3BV 95% етанолом. Результати детектування показали, що Тимосапонін ВІІ був, в основному, зібраний у фракції 50% етанолу. Цю фракцію концентрували для видалення етанолу до невеликого об'єму і потім етанол додавали до 35% кінцевої концентрації для подальшого застосування. Колонку з регенерованою макропористою полімерною смолою SP825 8 (18 л) зрівноважували 35% етанолом. Зазначений вище зразок хроматографували на колонці та елюювали 6BV 45% етанолом. Елюат збирали у фракції по 2000 мл на фракцію і чистоту кожної фракції детектували за допомогою HPLC. Фракції 18-30 об'єднували і концентрували для видалення етанолу до невеликого об'єму. Одержаний розчин хроматографували на заздалегідь обробленій поліамідній колонці (6 л, 30-60 меш, Linjiang Reagent Chemical Plant) та елюювали 5BV води. Спочатку фракцію, що містить забарвлений матеріал, відкидали і елюат збирали у фракції по 600 мл на фракцію і детектували за допомогою HPLC. Фракції 623 об'єднували, концентрували і сушили розпилювальним сушінням до одержання Тимосапоніну ВИ (56,5 г). Вихід продукту становив 0,71% сирого медичного матеріалу і чистота, детектована за допомогою HPLC, була 90,8%. Приклад 2 Одержання Тимосапоніну ВІІ Відварені шматочки Китайського традиційного лікарського засобу Кореневища Anemarrhenae (5 кг) подрібнювали, до них додавали 30 л 30% ацетону. Ліки занурювали на дві години і потім екстрагували 0,5 години генератором ультразвукових хвиль до фільтрування. Залишок також екстрагували ультразвуком більше двох разів. Ацетоновий екстракт об'єднували, ацетон регенерували і залишок концентрували при зниженому тиску до 30 л. Заздалегідь оброблену макропористу полімерну смолу АВ-8 (Tianjin Nankai Chemical Plant) завантажували у колонку (18 л), яку зрівноважували водою. Концентрований екстракт фільтрували і фільтрат хроматографували на колонці та елюювали водою для видалення домішок. Потім колонку елюювали послідовно 3-кратним об'ємом колонки (3BV) 20% етанолом, 3BV 50% етанолом і 3BV 95% етанолом. Результати детектування показали, що Тимосапонін ВІІ був, в основному, зібраний у фракції 50% етанолу. Цю фракцію концентрували для видалення етанолу до невеликого об'єму і потім сушили у вакуумі до одержання неочищеного зразка Тимосапоніну ВІІ (286 г). 80 г неочищеного зразка розчиняли у 1000 мл 25% ацетону і завантажували у колонку з силікагелем RP-18 (6,5 л), яку заздалегідь зрівноважували 25% ацетоном. Колонку елюювали послідовно 28% ацетоном (20000 мл) і 30% ацетоном (20000 мл) і потім регенерували 80% ацетоном (13000 мл). Елюати 28% ацетону і 30% ацетону збирали у фракції по 600 мл на фракцію і чистоту кожної фракції детектували за допомогою HPLC. Фракції 6-21 об'єднували і концентрували для видалення ацетону до невеликого об'єму і потім ліофілізували до одержання Тимосапоніну ВІІ (12,9 г). Вихід продукту становив 0,92% неочищеного медичного матеріалу і чистота, детектована за допомогою HPLC, була 94,3%.· Приклад 3 Одержання Тимосапоніну ВII Відварені шматочки Китайського традиційного лікарського засобу Кореневища Anemarrhenae (5 кг) подрібнювали, до них додавали 30 л 30% ацетону. Ліки занурювали на дві години і потім екстрагували 0,5 години генератором ультразвукових хвиль до фільтрування. Залишок також екстрагу 9 85710 вали ультразвуком більше двох разів Ацетоновий екстракт об'єднували, ацетон регенерували і залишок концентрували при зниженому тиску до 30 л. Заздалегідь оброблену макропористу полімерну смолу АВ-8 (Tianjin Nankai Chemical Plant) завантажували у колонку (18 л), яку зрівноважували водою. Концентрований екстракт фільтрували і фільтрат хроматографували на колонці, і елюювали водою для видалення домішок. Потім колонку елюювали послідовно 3BV 20% етанолом, 3BV 50% етанолом і 3BV 95% етанолом. Результати детектування показали, що Тимосапонін ВІІ був, в основному, зібраний у фракції 50% етанолу. Цю фракцію концентрували для видалення етанолу до невеликого об'єму і потім сушили у вакуумі до одержання неочищеного зразка Тимосапоніну ВІІ (290 г). 80 г неочищеного зразка розчиняли у 1000 мл 25% розчину ацетону і хроматографували на колонці з СИЛІКАГЕЛЕМ RP-18 (6,5 л), яку заздалегідь зрівноважували 32% метанолом Колонку елюювали послідовно 32% метанолом (20000 мл) і 34% метанолом (20000 мл) і потім регенерували 90% метанолом (15000 мл). Елюати 32% метанолу і 34% метанолу збирали у фракції по 600 мл на фракцію і чистоту кожної фракції детектували за допомогою HPLC. Фракції 8-19 об'єднували і концентрували для видалення метанолу до невеликого об'єму і потім ліофілізували до одержання Тимосапоніну ВІІ (9,79 г). Чистота, детектована за допомогою HPLC, була 73,1%. Зразок розчиняли у 30% ацетоні, кип'ятили при 95°С протягом 5 годин і концентрували для видалення ацетону до одержання невеликого об'єму і потім ліофілізували до одержання Тимосапоніну ВІІ (9,7 г). Вихід продукту становив 0,70% неочищеного медичного матеріалу і чистота, детектована за допомогою HPLC, була 93,9%. Приклад 4 Одержання Тимосапоніну ВII Свіжовикопані кореневища Anemarrhena asphodeloides Bunge (4 кг) з'єднували і відварювали з 10 л води 1 годину до фільтрування. 8 л води додавали до залишку і відварювали 1 годину до фільтрування. Фільтрати об'єднували і концентрували при зниженому тиску до 10 л, до них додавали етанол до 25% кінцевої концентрації до одержання екстракту для подальшого застосування. Заздалегідь оброблену макропористу полімерну смолу D101 (Tianjin Agrochemical Plant) завантажували у колонку (6 л), яку зрівноважували 25% етанолом. Екстрагований розчин фільтрували і фільтрат хроматографували на колонці. Потім колонку eлюювали послідовно 3BV 25% етанолом, 3BV 35% етанолом і 3BV 90% етанолом. Результати детектування показали, що Тимосапонін ВІІ був, в основному, зібраний у фракції 35% етанолу. Цю фракцію концентрували для видалення етанолу до невеликого об'єму. Концентрований елюат хроматографували на заздалегідь обробленій поліамідній колонці (6 л, 30-60 меш, Linjiang Reagent Chemical Plant) та елюювали 5BV води. Спочатку фракцію, що містить забарвлений матеріал, відкидали і елюат збирали у фракції по 600 мл на фракцію та детектували за допомогою HPLC. Фракції 8-24 об'єднували, концентрували і сушили за до 10 помогою розпилювального сушіння до одержання неочищеного зразка Тимосапоніну ВІІ (51 г). Близько 40 г неочищеного зразка розчиняли у 200 мл 35% етанолу і хроматографували на колонці з Sephadex LH-20 (8,5 л), яку заздалегідь зрівноважували 35% етанолом. Колонку елюювали 35% етанолом (50000 мл) і потім регенерували 95% етанолом (20000 мл). Елюат 35% етанолу збирали у фракції по 800 мл на фракцію і чистоту кожної фракції детектували за допомогою HPLC. Фракції 16-35 об'єднували і концентрували для видалення етанолу до невеликого об'єму і потім ліофілізували до одержання Тимосапоніну ВІІ (11,2 г). Вихід продукту становив 0,36% свіжовиділених кореневищ (відповідає виходу 1,07% сухого медичного матеріалу) і чистота, де тектована за допомогою HPLC, була 92,3%. Приклад 5 Одержання Тимосапоніну ВІІ Мочкуваті корені Anemarrhena asphodeloides Bunge (2 кг) нарізали і відварювали з 16 л води 1 годину до фільтрування. 12 л води додавали до залишку і відварювали 1 годину до фільтрування. Фільтрати об'єднували і концентрували при зниженому тиску до 12 л, до ни х додавали ацетон до одержання 15% кінцевої концентрації для подальшого застосування. Заздалегідь оброблену макропористу полімерну смолу SP700 (Mitsubishi Co., Japan) завантажували у колонку (6 л), яку зрівноважували 15% ацетоном. Екстракт фільтрували і фільтрат хроматографували на колонці. Потім колонку елюювали послідовно 3BV 25% ацетоном, 3BV 35% ацетоном і 3BV 80% ацетоном. Результати детектування показали, що Тимосапонін ВІІ був, в основному, зібраний у фракції 35% ацетону. Цю фракцію концентрували для видалення ацетону і сушили розпилювальним сушінням до одержання неочищеного зразка Тимосапоніну ВІІ (45,0 г). Близько 40 г неочищеного зразка розчиняли у 200 мл 10% ацетону і хроматографували на колонці з Sephadex LH-20 (8,5 л), яку заздалегідь зрівноважували 10% ацетоном. Колонку елюювали 10% ацетоном (40000 мл) і потім регенерували 80% ацетоном (20000 мл). Елюат 10% ацетону збирали у фракції по 800 мл на фракцію і чистоту кожної фракції детектували за допомогою HPLC. Фракції 20-36 об'єднували і концентрували для видалення ацетону до невеликого об'єму і потім ліофілізували до одержання Тимосапоніну ВІІ (9,2 г). Вихід продукту становив 0,52% кореневого матеріалу і чистота, детектована за допомогою HPLC, була 91,7%. Приклад 6 Одержання Тимосапоніну ВII Свіжовикопані кореневища Anemarrhena asphodeloides Bunge (4 кг) з'єднували, до них додавали 8 л 50% етанолу. Ліки занурювали на 2 години і потім екстрагували 0,5 години генератором ультразвукових хвиль до фільтрування. Залишок також екстрагували ультразвуком більше двох разів. Етанольні екстракти об'єднували і концентрували при зниженому тиску для видалення етанолу до 10 л. Заздалегідь оброблену макропористу полімерну смолу АВ-8 (Tianjin Nankai Chemical Plant) завантажували у колонку (6 л), яку 11 85710 зрівноважували водою. Концентрований екстракт фільтрували і фільтрат хроматографували на колонці, і елюювали водою для видалення домішок. Потім колонку елюювали послідовно 3BV 20% етанолом, 3BV 50% етанолом і 3BV 95% етанолом. Результати детектування показали, що Тимосапонін ВІІ був, в основному, зібраний у фракції 50% етанолу. Цю фракцію концентрували для видалення етанолу до невеликого об'єму і потім сушили у вакуумі до одержання неочищеного зразка Тимосапоніну ВІІ (59,3 г). 50 і неочищеного зразка розчиняли у 200 мл 35% ацетону і хроматографували на колонці з силікагелем RP-18 (6,5 л), яку заздалегідь зрівноважували 25% етанолом. Колонку елюювали послідовно 28% ацетоном (20000 мл) і 30% ацетоном (20000 мл) і потім регенерували 80% ацетоном (15000 мл). Елюати 28% ацетону і 30% ацетону збирали у фракції по 600 мл на фракцію і чистоту кожної фракції детектували за допомогою HPLC. Фракції 6-25 об'єднували і концентрували для видалення ацетону до невеликого об'єму і потім ліофілізували до одержання Тимосапоніну ВІІ (15,6 г). 14,1 г зразка розчиняли у 70 мл 25% розчину ацетону і хроматографували на колонці з силікагелем RP-18 (6,5 л), яку заздалегідь зрівноважували 25% ацетоном. Колонку елюювали 28% ацетоном (40000 мл) і потім регенерували 80% ацетоном (1200 мл). Елюат збирали у фракції по 600 мл на фракцію і чистоту кожної фракції детектували за допомогою HPLC. Фракції 8-19 об'єднували і концентрували для видалення ацетону до невеликого об'єму і потім ліофілізували до одержання Тимосапоніну ВII (4,5 г). Вихід продукту становив 0,15% свіжовикопаних кореневищ (відповідає виходу 0 ,44% у перерахунку на сухий медичний матеріал) і чистота, детектована за допомогою HPLC, була 98,6%. Продукт був у вигляді білого аморфного порошку з т.пл. 243°С (розкл.) і був позитивний як у реакції Лібермана-Бурхарда, так і у реакції Моліша, а також позитивний з реагентом Ерліха. Структуру одержаного Тимосапоніну ВІІ ідентифікували за допомогою інфрачервоної спектроскопії (ІЧ), мас-спектрометрії (МС) і ядерного магнітного резонансу (ЯМР) наступним чином: ІЧ (дифузне відбиття)см-1: 3348(ОН), 2930, 2850, 1075, 1044 (глікозидний зв'язок С-О). FAB-MC (m/z): 943(M+Na)+, 903(M+H-H 2O)+, 741(M+H-H 2O-Glc)+, 579(M+H-H 2O-Glcx2)+, 417(M+H-H 2O-Glcx2-Gal)+, 399(аглікон+Н-Н2Ох2)+, 255, 185, 145. ЕІ-МС (m/z): 740(M-H 2O-Glc)+, 578(M-H2OGlcx2)+, 416(аглікон-Н2О)+, 415(аглікон-Н-Н 2О)+, 357, 273, 217, 181. 139. 1 Н-ЯМР (C5D5N)d: 0,85(3Н, с, 18-СН3), 0,96(3Н, с, 19-СН3), 1,00(3Н, д, J =6,4 Гц, 27-СН3), 1,30(3Н, д, J=6,8 Гц, 21-СН3), 4,79(1Н, д, J=7,8 Гц, Glc 1-H), 4,901(1Н, д, J=7,8 Гц, Glc 1-H), 5,27(1Н, д, J=7,8 Гц, Glc 1-H). Дані 13С-ЯМР наведені у Таблиці 1. Сполукою був (25S)-26-Ο-b-D-глюкопіранозил-22-гідрокси-5bфуростан-3b, 26-діол-3-O-b-D-глюкопіранозил-(1 2)-b-D-галактопіранозид. 12 Порівняльний приклад 1 Одержання Тимосапоніну ВII Відварені шматочки Китайського традиційного лікарського засобу Кореневища Anemarrhenae (1 кг) подрібнювали, до них додавали 6 л 60% етанолу. Ліки занурювали на одну годину і потім при кип'ятінні екстрагували нагріванням одну годину до фільтрування. Залишок також при кип'ятінні екстрагували більше двох разів. Етанольні екстракти об'єднували і концентрували для видалення етанолу при зниженому тиску до 4л. 4л нбутанолу, насиченого водою, додавали у концентрований розчин. Одержаний розчин перемішували до однорідності шляхом струшування. Потім шар н-бутанолу збирали і водний шар також екстрагували більше 4 разів шляхом додання н-бутанолу, насиченого водою. П'ятикратні н-бутанольні екстракти об'єднували і концентрували досуха з одержанням сапонінів (33,1 г). Сапоніни розчиняли у метанолі і змішували з силікагелем (60 г), і потім нагрівали до випаровування розчинника досуха. Змішаний зразок хроматографували на колонці з силікагелем (3 л), яка була заповнена сухим способом, і елюювали градієнтною сумішшю хлороформ-метанол-вода. Елюат хлороформ-метанолвода (60:40:10, нижня фаза), що містить Тимосапонін ВІІ, збирали і концентрували досуха з одержанням неочищеного продукту (2 ,3 г). Неочищений продукт далі хроматографували на колонці з силікагелем (500 мл) і елюювали хлороформомметанолом-водою. Елюат хлороформ-метанолвода (65:35:10, нижня фаза) збирали у фракції по 50 мл на фракцію. Фракції 15-23 концентрували досуха з одержанням продукту (0,67 г). Продукт розчиняли у 32% метанолі і хроматографували на колонці з силікагелем RP-18 (600 мл). Колонку елюювали послідовно 32% метанолом (1800 мл) і 34% метанолом (1800 мл) і потім регенерували 90% метанолом (1200 мл). Елюати 32% метанолу і 34% метанолу збирали у фракції по 50 мл на фракцію і чистоту кожної фракції детектували за допо 13 85710 могою HPLC. Фракції 13-21 об'єднували і концентрували для видалення метанолу до невеликого об'єму і потім ліофілізували до одержання Тимосапоніну ВІІ (0,34 г). Чисто та, детектована за допомогою HPLC, була 75,5%. Продукт розчиняли у 30% ацетоні, кип'ятили на водяній бані при 95°С Комп’ютерна в ерстка І.Скворцов а 14 протягом 5 годин і концентрували для видалення ацетону, і потім ліофілізували до одержання Тимосапоніну ВІІ (0,33 г). Вихід продукту становив 0,033% неочищеного медичною матеріалу і чистота була 93,4%. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601