Спосіб одержання гідрохлориду 1(10)b-епокси-13-диметиламіно-5,7a,6,11b(н)-гвай-3(4)-єн-6,12-оліду, ліофілізованого протипухлинного засобу “арглабін”

Спосіб одержання гідрохлориду 1(10)епокси-13-диметиламіно-5,7,6,11(Н)-гвай-3(4)єн-6,12-оліду, у якому послідовно: 3 96305 вують хлороформ, потім екстраговані речовини (смолку) очищають від баластових компонентів обробкою водно-спиртовою сумішшю. Смолку, отриману на стадії очищення, ділять на індивідуальні компоненти методом колонкової хроматографії на силікагелі протягом 72 годин. При елююванні бензолом виділяють фракції, що містять арглабін. Після відгону бензолу одержують технічний Арглабін, що піддають перекристалізації, амінуванню й гідрохлоруванню з одержанням диметиламінопохідного. Тривалість стадії синтезу 48 годин. Амінування проводять диметиламіном з одержанням розчину, що містить аміноарглабін. Потім зі спиртового розчину аміноарглабіну барботируванням хлористим воднем виділяють технічний гідрохлорид диметиламіноарглабіну. Отриманий продукт піддають очищенню методом кристалізації з наступним сушінням і ліофілізацією. Даний спосіб з використанням хлороформної екстракції рослинної сировини має наступні недоліки: - хлороформ є дорогим розчинником і має токсичну дію; - тривалість екстракції становить 6-8 годин; - використання методу колонкової хроматографії при поділі смолки тривале за часом і становить 72 години, а елюент бензол, що при цьому застосовується, є також токсичним розчинником; - тривалість стадії синтезу диметиламінопохідної близько 48 годин. Завданням і технічним результатом винаходу є розробка способу одержання протипухлинного засобу на основі природного сесквітерпенового лактону (1), що дозволяє виключити використання токсичних реагентів і забезпечити значне зниження тривалості процесу. Зазначений технічний результат забезпечується в способі одержання гідрохлориду 1(10) епокси - 13 - диметиламіно-5,7 , 6,11 (Н)-гвай3(4)-ен-6,12-оліду, ліофілізованого, протипухлинного засобу, що має радіосенсибілізуючі та імуномодулюючі властивості, що включає екстрагування рослинної сировини - полині гладкої Artemisia glabella Kar. et Kir., поділ отриманої смолки на індивідуальні компоненти з одержанням технічного арглабіну, з якого синтезують гідрохлорид диме 4 тиламіноарглабіну, з наступним його очищенням, сушінням і ліофілізацією, у якому екстрагування проводять із використанням у якості екстрагенту 5 рідкого діоксиду вуглецю при тиску 150±210 Па й температурі 60 °С±0,5, поділ смолки на індивідуальні компоненти здійснюють методом препаративної флюїдної хроматографії із застосуванням зверненої фази З18, при синтезі гідрохлориду диметиламіноарглабіну технічний Арглабін розчиняють в ацетонітрилі при масовому співвідношенні 1:10 з додаванням диметиламоній диметилкарбамату у мольному співвідношенні 1:1,62. Для апробації промислової технології виділення Арглабіну з використанням устаткування фірми "Flavex" (Німеччина) проведена екстракція 600 кг трави полині гладкої при заданих за запропонованим способом умовах екстракції. Результати показали, що вміст арглабіну в СО2-екстракті в 2 рази вище, ніж у хлороформному екстракті за відомим способом. Собівартість виділення Арглабіну із СО2-екстракту нижче за рахунок економії розчинників. Метод СО2-екстракції сприяє селективному добуванню арглабіну з рослинної сировини й супроводжується закономірним зменшенням залишкового вмісту арглабіну в шроті. Результати експерименту по підбору оптимальних умов виділення арглабіну наведені в табл.1, з якої видно, що найбільший вміст арглабіну в СО2-екстракті 28,5 % 5 досягається при тиску 15010 Па, температурі 60 °С, часу екстракції 75 хв. Витрати СО2 становлять 100 кг/год. Вміст арглабіну в екстракті після СО2екстракції визначають методом високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ). Аналіз проводять на рідинному хроматографі фірми HEWLETT PACKARD Agilent 1100 Series з УФ-детектором за наступних умов: - аналітичний стовпчик, заповнений сорбентом Zorbax СВ-З18 4,6x150 мм, з розміром часток 5 мкм; - сполука рухливої фази ацетонітрил-вода в співвідношенні 50:50; - детектування при довжині хвилі 204 нм; - температура стовпчика кімнатна; - швидкість рухливої фази 0,75 мл/хв; - об'єм проби, що вводиться 20 мкл. Таблиця 1 Вміст арглабіну в СО2-екстракті в залежності від умов екстрагування № дослідження 1 2 3 4 Тиск екст- Температура ракції, екстракції, 5 10 Па °С 100 150 200 150 50 50 50 60 Потік СО2, кг/год Витрати СО2, кг/год Час екстракції, хв г % Вміст арглабіну в СО2-екстракті, % 80 80 80 80 45 102 100 100 25 64 70 75 31,3 126 233 157 3,15 4,66 3,14 24,0 26,3 20,0 28,5 Точне навішення досліджуваного зразка СО2екстракту розчиняють в 10 мл рухливої фази при ретельному перемішуванні. Отриманий розчин Вихідекстракту кількісно переносять у мірну колбу місткістю 25 мл, доводять об'єм розчину до мітки й перемішують. Отриманий розчин фільтрували через мембранний фільтр із розміром пор 0,45 мкм. По 20 мкл фільтрату й розчину достовірного зразка арг 5 96305 лабіну хроматографували в умовах, описаних вище. Кількісний вміст арглабіну (X) у відсотках визначали методом порівняння із зовнішнім стандартом по формулі: X S1  mo  25 100 , S o  m1  25 де S1 - середнє значення площ піку арглабіну на хроматограмах розчину, що досліджується; So - середнє значення площ піку арглабіну на хроматограмі розчину достовірного зразка; mo - навішення арглабіну достовірного зразка, г; m1 - навішення СО2-екстракту, г; 25 - розведення. Дані по вмісту арглабіну в пробі СО2-екстракту трави полині гладкої й шроту наведені в табл.2. За результатами проведених експериментів видно, що максимальний вихід серед перших се5 параторів відзначається при режимі: тиск 15010 6 Па й температура 60 °С. При цьому збільшується вихід цільової речовини й значно скорочується час екстракції, ніж при хлороформній екстракції, що використовується раніше. Отриманий вуглекислотний екстракт піддають очищенню від ліпідної фракції, білкових речовин, хлорофілу шляхом обробки його водно-спиртовою сумішшю в співвідношенні 1:2 при температурі 70 °С, з відстоюванням фільтрату в холодильнику 24 години при температурі 10-15 70 °С. Оброблену суміш фільтрують, збирають в окрему ємність, залишок на фільтрі піддають водно-спиртовій обробці тричі при співвідношенні 1:2, фільтрати поєднують і упарюють до 1/5 вихідного об'єму. До упарюваного фільтрату в співвідношенні 1:1 додають етилацетат, розчин поміщають у сепаратор, перемішують протягом 5 хвилин, чекаючи чіткого поділу шарів. Шари розділяють, нижній водний шар тричі екстрагують етилацетатом. Етилацетатні добування поєднують, етилацетат упарюють до сухого стану. Вихід очищеного екстракту становить 73,3 % розраховуючи на густий екстракт. Таблиця 2 Визначення вмісту арглабіну в зразках після СО2-екстракції методом ВЕРХ № Найменування Параметри екстп/п зразка рагування Опис Вміст Вихід (усьо- Вміст арг- Вміст арглаарглабіну, го) лабіну біну (у переКількість % від рахуванні на зразка, загальної абсолютно г % г % г кількості суху сироекстракту вину) % Пастоподібна Екстракт по5 15010 Па/70°С речовина 1 лині гладкої жовтого ко3 години Сепаратор 1 льору Дрібний поШрот полині 150105Па/70°С рошок зеле2 гладкої но-сірого ко3 години льору Пастоподібна Екстракт по5 15010 Па/60°С речовина 3 лині гладкої жовтого ко3 години Сепаратор 1 льору Дрібний поШрот полині 150105Па/60°С рошок зеле4 гладкої но-сірого 3 години кольору Очищений екстракт передають на стадію препаративної хроматографії для виділення індивідуальної сполуки на установці по препаративній флюїдній хроматографії "Super Pure -350". Хроматографічний поділ здійснюється за допомогою ізокритичної системи розчинників (ацетонітрил - вода при співвідношенні 1:1) на зверненій фазі C18 з дискретно працюючою установкою. Діа5 пазон робочого тиску становить від 5010 до 5 32010 Па, температура від 5 до 80 °С, швидкість потоку співрозчинника від 20 до 350 мл/хв у системі, внутрішній діаметр колонки 10 см. Чистота 67,26 1,71 5,12 76,79 15,58 11,96 4,49 20,16 89,10 1336,53 0,06 0,8 73,62 2,82 4,55 15,78 90,40 1355,94 0,06 0,81 0,06 6,85 102,75 12,74 13,09 0,06 отриманого технічного арглабіну за допомогою установки по препаративній флюїдній хроматографії "Super Pure-350" становить 99 %. Використання методу препаративної флюїдної хроматографії із застосуванням зверненої фази С18 дозволяє проводити поділ на індивідуальні компоненти за 3 години, у той час як у відомому способі на поділ методом колонкової хроматографії потрібно 72 години. Крім того, при колонковій хроматографії використовується токсичний розчинник бензол, що виключається в способі, який заявляється. 7 Для подальшого одержання водорозчинної форми лактону синтезують гідрохлорид його диметиламінопохідної - гідрохлорид 1(10)  - епокси 13 - диметиламіно-5,7, 6,11(Н)-гвай-3(4)-ен-6,12олід (1). Вихідна речовина - сесквітерпеновий лактон арглабін (2) розчиняють в ацетонітрилі при масовому співвідношенні 1:10. Потім в ацетонітрильний розчин по краплях при перемішуванні протягом 10 хвилин додають диметиламоній диметилкарбамат у мольному співвідношенні вихідна речовина : диметиламоній диметилкарбамат, рівному 1:1,62. Після повної конверсії вихідної речовини (протягом 25 хвилин) упарюють ацетонітрил і залишки диметиламоній диметилкарбамату на роторному випарнику. Після завершення процесу в реакційну суміш додають етилацетат, охолоджений до температури 5-15 °С успіввідношенні 1:2. При повільному перемішуванні при температурі 12-15 °С±0,3 (початок реакції) ведуть процес барботирування газоподібним хлористим воднем (НСl), реакція закінчується при температурі 16-18 °С±0,5. Оптимальна тривалість реакції 15 хв. Подачу газу зупиняють при досягненні в межах рН 5,2-5,5 ±0,05. Після завершення процесу реакційну суміш переносять у колбу ротаційного випарника місткістю 2 л, надлишок етилацетату й хлористого водню відганяють до сироподібного стану. До отриманого розчину доливають попередньо охолоджений до температури 10 °С абсолютний етилацетат (99,9 %) і енергійно струшують до випадання білих кристалів. Колбу із масою, що кристалізується, витримують у холодильнику при температурі 12-15°С протягом 1 години. Кристали, що випали, відфільтровують крізь фільтр Шотта й промивають на цьому ж фільтрі охолодженим етилацетатом. Відфільтровані кристали після перекристалізації з етилацетату висушують на ротаційному випарнику при температурі 40-70 °С протягом 1 години. Досушування кристалів проводять у вакуум-сушильній шафі при температурі 4050 °С, тиску 5-10 мм.рт.ст. до втрати маси при висушуванні не вище 0,5 %. Отриманий продукт являє собою білий кристалічний порошок гідрохлориду диметиламіноарглабіну (1) виходом 90 %. У запропонованому способі на стадії синтезу гідрохлориду диметиламіноарглабіну використовується диметиламоній диметилкарбамат на відміну від диметиламіну у відомому способі, що дозволило скоротити тривалість стадії синтезу з 48 до 3 годин. Субстанцію гідрохлориду диметиламіноарглабіну (1) використовують для одержання ліофілізованої лікарської форми. Кінцевий продукт (субстанція) розчиняють у воді для ін'єкцій з розрахунку: 2 г сухі речовини 100 мл води. Отриманий 2 %-вий розчин ліофілізують у такий спосіб. Розчин фільтрують, використовуючи фільтраційну установку "Sartorius" через стерильну капсулу "Sartobran", розміром пор 0,45 мкм, 0,2 мкм відповідно в стерильну скляну ємність. Отриманий фільтрат за допомогою автомата "Роза-2" розливають в ампули по 2 мл і сушать у ліофілізаторі LZ-45. Роздозований розчин в ампулах поміщають у касети. Касети покривають листами стерильного пергаменту й поміщають у низькотемпературні столи "Debri" виробництва 96305 8 Голландія для заморожування при -40 °С, не менш ніж на 12 годин. Після закінчення процесу заморозки касети з ампулами розміщають на етажерки субліматор й поміщають у вакуумний казан субліматора LZ-45 для проведення процесу сублімаційного сушіння. Через 1 годину після занурення етажерки в казан субліматора підключають вакуумний насос, далі в міру досягнення необхідного значення вакууму (не менше 5-6 МПа) подають підігрів полиць на етажерки субліматора, приблизно через 2 години після початку процесу сушіння. Полки нагрівають поступово до +55 (+5 °С), додаючи від 0 °С до +55 °С пс 5 °С на кожній годині сублімаційного сушіння. На мінусовій температурі - від 0 °С до -30 °С по 10 °С. Перехід продукту з мінусової температури на плюсову відбувається на 12-13-ій годині сушіння. Кінцева температура продукту не повинна перевищувати +50, +52 °С. Тривалість сушіння 24 години. Дійсність препарату визначають за температурою плавлення, ІЧ-спектру, ВЕРХ-аналізу. Як видно з вищенаведених даних, спосіб, що заявляється, здійснюється в умовах, що відповідають нормам GMP, а саме: - рідкий діоксид вуглецю є нетоксичним екстрагентом; - виділення індивідуальної сполуки здійснюється на установці по препаративній флюїдній хроматографії "Super Pure -350" із застосуванням зверненої фази З18; - на стадії синтезу здійснюється модифікування з використанням диметиламоній диметилкарбамату. Субстанцію препарату - гідрохлорид 1(10) епокси-13-диметиламіне- 5,7,6,11(Н)-гвай-3(4)ен-6,12-олід (1), в експерименті вивчають на протипухлинну активність на 11 штамах експериментальних пухлин. До арглабіну чутливі наступні штами пухлин, що перевиваються: карцинома легенів, солідні пухлина Ерліха, аденокарцинома молочної залози Са - 755, саркома 37, лімфоцитарна лейкемія Р388, лімфоїдна лейкемія L-1210, саркома М -1, карциносаркома Уокера, альвеолярний рак слизової оболонки печінки РС-1 пацюків при внутрішньочеревинному й внутрішньопухлинному введенні препарату в максимально стерпних дозах (МСД). Арглабін також проявляє ефективність відносно переривчастих пухлин, стійких до проспідину, рубоміцину й сарколізину. Установлено, що препарат «Арглабінліофілізований» ефективно впливає на початкові етапи формування метастазів, тобто знижує можливість їх появи. Арглабін має здатність оптимізувати окислювально-відновні процеси й метаболізм у сполучнійтканині. Визначена імуномодулююча дія арглабіну, що проявляється переважним впливом на Т-клітинну ланку імунітету і залежна від дози препарату. Арглабін має властивість коректувати імунодепресивний ефект цитостатиків. Виявлено, що арглабін є конкурентним інгібітором фарнезилювання RAS-онкобілків, знижує 9 експресію RAS-генів і вміст АТФ, викликає апоптоз пухлинних кліток. Препарат має досить високий показник часу втримання в організмі, що становить майже 22 години. Арглабін швидко проникає із центральної камери (кров) у периферичні тканини. Протягом першої години найбільші концентрації препарату створюються в селезінці й легенях, через 3 години він накопичується також у печінці й кістякових м'язах. Препарат у максимально-стерпних дозах не впливає на морфологічний склад периферичної крові й кісткового мозку, не порушує функціонального стану печінки, нирок, серцево-судинної системи, дихання, периферичної нервової системи. При внутрішньовенному, внутрішньочеревинному, внутрішньом'язовому, підшкірному введенні препарат не викликає місцево-дратівної дії. Не виявлені алергізуючі й пірогенні властивості. Арглабін також не має ембріотоксичних, тератогенних і мутагенних властивостей. Клінічне вивчення «Арглабіну - ліофілізованого» на І фазі проведено на 53 хворих з III-IV стадією злоякісного процесу 11 локалізацій. Однократна доза коливалася від 240 до 480 мг на день. Препарат уводився внутрішньовенно у формі струменя у вигляді 2 % водного розчину. При наявності у хворих асциту й плевриту 2 % розчин уводився в порожнину в дозі 480 мг (на фізрозчині). Виявлено, що препарат у рекомендованих дозах не має токсичності, не чинить пригнічуючої дії на кровотворення, не порушує функції внутрішніх органів, периферичної нервової системи. Друга фаза клінічних випробувань препарату проведена на 72 хворих з IV стадією пухлинного процесу 11 локалізацій (рак печінки, легені, шлунка, молочної залози, прямої кишки, стравоходу, яєчника, підшлункової залози, підщелепної слинної залози, лімфосаркома й ін.). У результаті II фази клінічних випробувань отримані наступні результати: - часткова регресія пухлини 32 (44,4 %); - стабілізація процесу 12 (16,7 %); - прогресування процесу 28 (38,9 %) пацієнтів. Оцінка об'єктивного ефекту монохіміотерапії препаратам проведена за критерієм, рекомендованим Всесвітньою організацією охорони здоров'я та Міжнародним протираковим союзом. Найбільш кращі результати хіміотерапії арглабіном отримані при первинному раку печінки, молочної залози, легенів і яєчника. Лікування хворих дисемінованим раком молочної залози проведено в трьох групах, сформованих методом рандомізації: I група - монохіміотерапія арглабіном (15 хворих); II група - арглабін у комбінації зі схемою CMF (15 хворих) III група - хіміотерапія за схемою CMF (15 хворих) - контрольна. Разова доза арглабіну в середньому склала 240 мг, сумарна - 4,8р. Високого показника часткової регресії й стабілізації процесу досягнуто в II групі (арглабін + CMF). 96305 10 Вивчено виживаність хворих дисемінованим раком молочної залози (розрахунки за Е. Kaplan P. Meier). У групі хворих, що одержували тільки «Арглабін-ліофілізований» шестимісячна виживаність склала 57,8 %, річна 3,9 %. Медіана виживаності 6,3 місяці. У групі хворих, що одержували тільки поліхіміотерапію за схемою CMF, дані показники склали, відповідно -72,0 % і 17,3 %, а медіана виживаності - 7,6 місяця. Більш високі показники спостерігалися в групі тих, хто одержував арглабін у комбінації з поліхіміотерапією за схемою CMF, де шестимісячна виживаність -100%, річна 39,1 %. Медіана виживаності -10,9 місяців (Р < 0,05). Після лікування спостерігали зменшення об'єму пухлини в першій і другій групах наприкінці променевої терапії й перед операцією вірогідно більше (Р < 0,001), ніж у хворих третьої групи. Патоморфоз пухлини III-IV ступеня в першій і другій групах склав відповідно 64 ± 9,8 % і 50 ± 0,2 %, тоді як у третій групі - 37±9,5%. Визначено кумулятивні показники виживаності (розрахунки за Е. Kaplan-p.Meier). Трирічна виживаність серед хворих першої й третьої груп виявилася однаковою й склала відповідно 23,9±7,8% і 24,417,8%, тоді як у другій групі - 45,2±9,1%. Аналогічну картину спостерігали й при вивченні безрецидивної виживаності. При цьому в першій і третій групах 3-х річна виживаність склала відповідно 5,2+4,1% і 5,2±4,1%, у другій групі 32,5+8,6%. Медіана виживаності в першій і третій групах була однаковою - 3+0,03 роки, у другій групі цей показник був вірогідно вище, ніж у попередніх двох групах і склав 7,4±0,2 роки. При використанні «Арглабіну-ліофілізованого» на 34 пацієнтах з дисемінованими формами пухлин і розвиненою стійкістю до хіміопрепаратів у комбінації з хіміотерапією в інкурабельних і ослаблених хворих (індекс Карновського 60-70 %) отриманий позитивний ефект в 44%. Ці результати свідчать про хіміосенсибілізуючу здатність «Арглабіну-ліофілізованого». «Арглабінліофілізований» є препаратом вибору в ослаблених та інкурабельних хворих, коли інші види стандартної протипухлинної терапії не прийнятні. Проведено дослідження на 55 хворих первинним раком печінки, розподілених на 3 групи: 1 група (контрольна) - отримувала поліхіміотерапію (26 хворих). 2 група отримувала «Арглабін ліофілізований» у разовій дозі з розрахунку 5 мг/кг 2 ваги (185 мг/м ) внутрішньовенно протягом 20-21 днів (17 хворих). 3 група отримувала «Арглабін ліофілізований» з розрахунку 5 мг/кг ваги (185 2 2 мг/м ) в/в у комбінації із фторурацилом 600 мг/м 1,8 день (12 хворих). Ефективність хіміотерапії визначалася за критерієм ВООЗ. Виживаність розраховувалася актуриальним методом. Річна виживаність у першій і другій групах хворих, що одержували поліхіміотерапію стандартними препаратами й чисто «Арглабіном ліофілізованим» склала відповідно: 32,2% і 32,3 %. 11 У третій групі виживаність вірогідно перевищувала показники перших двох груп - 55,1 %(Р< 0,05). Визначення медіани виживаності також показало, що вона була вище в третій групі й склала 15,3 місяці, у той час як у першій і в другій групах 7,85 і 8,45 місяців, відповідно. При лікуванні «Арглабіном- ліофілізованим» 45 хворих раком легені в основному із TЗN1MO стадією захворювання, з них - 6 після пробної торакотомії, первинних хворих було 21, повторних після раніше застосованих курсів променевої і хіміотерапії - 24. У всіх хворих мало місце гістологічне підтвердження діагнозу: пласкоклітинний рак в 16, дрібноклітинний - в 12, залізистий -10 і недиференційований рак - в 7 пацієнтів. I. Основна група: «Арглабін-ліофілізований» 240 мг із 1 по 20 день, метотрексат 25 мг 1,4,8,11 дні, ендоксан 1,0г 1.5,9 дні (15 хворих). II. Контрольна група 1: «Арглабінліофілізований» 240 мг із 1 по 20 день (15 хворих). III. Контрольна група 2: метотрексат 25 мг 1, 4, 8, 11 дні, ендоксан 1,0г 1,5,9 дні (15 хворих). При проведенні хіміотерапії у частини хворих «Арглабіном-ліофілізованим» відзначалося поліпшення загального стану, зменшення кашлю і болей у грудній клітині, оцінене в основному в 1 бал. До кінця лікування у більшої частини хворих досягнута стабілізація процесу. У двох хворих першої контрольної групи відзначалося прогресування захворювання. Частина хворих надійшла в стаціонар повторно через місяць після закінчення першого курсу лікування. При контрольному обстеженні практично у всіх хворих продовжувала визначатися стабілізація процесу. Визначено ефективність препарату «Арглабінліофілізований» у якості радіосенсибілізуючого засобу для променевої й хіміопроменевої терапії в 20 хворих місцевопоширеним раком молочної залози. Повна й часткова регресія пухлини досягнута в 19 з 20 хворих у досліджуваній групі (95,5%), причому в 4 (20,0 %) з них відзначена повна резорбція пухлини. У контрольній групі об'єктивний протипухлинний ефект склав 70%. Для більш об'єктивної оцінки лікування «Арглабіномліофілізованим» при гістологічному дослідженні операційного матеріалу визначався ступінь лікувального патоморфозу в пухлині й метастатично змінених лімфовузлах. Третій ступінь лікувального патоморфозу (некроз, фіброз, одиничні дегенеративно змінені клітини раку зафіксовані вії (55%) хворих досліджуваної групи й у 4 (20%) пацієнток контрольної групи. Повний і виражений протипухлинний ефект за морфологічним критерієм відзначений в 14 (70%) хворих, що одержували «Арглабін-ліофілізований», що в 3,5 рази вище, ніж у групі контролю (20%). Установлено, що «Арглабінліофілізований» у разовій дозі 5 мг/кг, що вводиться внутрішньовенно у формі струменя за 15 хв. до променевої терапії через день не має побічні ефекти й добре переноситься хворими. Таким чином, «Арглабін - ліофілізований» має виражений радіосенсибілізуючий ефект», вірогідно збільшуючи частоту об'єктивних регресій і частоту вираженого лікувального патоморфозу (III-IV сту 96305 12 пеня) як у первинній пухлині, так і в метастатично змінених лімфовузлах. Дослідження інтерферонового (ІФН) статусу й цитокінового профілю в 18 жінок з раком молочної залози в динаміці до й після променевої терапії із застосуванням препарату «Арглабінліофілізований» свідчать, що він відновлює механізм синтезу наступних цитокінів: ІФН-, ІЛ-2, протизапального цитокіну - ІЛ-4, ФНО-, ІЛ-1. В обстежених хворих після лікування препаратом «Арглабін-ліофілізований» відзначено: 1. Зниження ІФН, що спонтанно виробляється у всіх пацієнтів. 2. Підвищення до норми здатності до продукції ІФН- та ІФН- у середньому в 40% хворих. 3. Підвищення чутливості до препаратів ІФН- і ІФН- в 44% і 11% хворих, відповідно. 4. Чутливість до імуномодулюючих препаратів (рідостин, циклоферон і аміксин) поліпшувалася в 30-40% випадків, а до досліджуваного препарату «Арглабін-ліофілізований» - в 40%-50% випадків. Також показано, що у всіх хворих з позитивним клінічним ефектом при терапії, що включає препарат «Арглабін-ліофілізований», відзначена експресія генів ІФН- і ІЛ-2 (50%) або тільки ІЛ-2 (50%). При цьому активність генів зазначених цитокінів в інших пацієнтів відзначена лише в 27% і 73% випадків, відповідно. Відомо, що ці цитокини виробляються Th 1-лімфоцитами, і придушення активності Th1 зі зниженням вироблення IFN- або ІЛ-2 приводить до більш важкого плину захворювання. Терапія із застосуванням «Арглабінуліофілізованого», судячи із цих показників, може бути ефективна. Відзначено, що при позитивному клінічному ефекті терапії із застосуванням препарату «Арглабін-ліофілізований» мРНК ІЛ-12 - цитокіну, що приймає участь у розвитку Th1-типу імунної відповіді, визначалася в 60% хворих, що в 2 рази частіше, ніж в інших пацієнтів. Проведені дослідження також показали, що мРНК ІЛ-1 визначалася практично у всіх обстежених хворих після лікування. При цьому відзначена активність мРНК ІЛ-6 і ІЛ-8 при позитивному клінічному ефекті в 70% і 60% пацієнтів, відповідно, а при стабілізації стану - в 80% і 70% хворих, відповідно. Одночасно з дослідженням ІФН статусу й оцінкою експресії генів цитокінів за рівнем синтезу їх мРНК, у тих же хворих з раком молочної залози визначали вміст цитокінів (методом ІФА) у сироватці крові й при культивуванні клітин крові. Після курсу проведеного лікування «Арглабіном -ліофілізованим» відзначена нормалізація або тенденція до нормалізації кількості досліджених цитокінів, що визначаються у сироватці крові, в 2040% обстежених жінок. При цьому також показано, що в 10-30% хворих підвищувався в сироватці крові вміст цитокінів, що могло свідчити про активацію клітин імунної системи. Дані, отримані в ході дослідження стану системи інтерферону й цитокінів у хворих раком молочної залози в рамках клінічного випробування препарату «Арглабін-ліофілізований», свідчать про високу імуномодулюючу здатність досліджено 13 го препарату у даній групи хворих. Переваги запропонованого способу одержання протипухлинного засобу "Арглабін": - наявність промислової сировинної бази - полинь гладка (Artemisia glabella Kar. et Kir.) оброблюється в експериментальному господарстві Карагандинського фармацевтичного заводу (Казахстан, м. Караганда) на площі 5,6 га із щорічним виробництвом 6,0 т сухої маси для наступної переробки. У перспективі до 2010 року планується щорічне виробництво сировини довести до 40 т у рік; - цільова речовина - сесквітерпеновий лактон 1(10)  - епокси -5, 7 , 6(Н)-гвай-3(4), 11(13)-діен6, 12-олід (2) екстрагують із сировини полині гладкої із застосуванням екологічно чистої технології з використанням нетоксичного екстрагенту - рідкого діоксиду вуглецю, що відповідає нормам GMP, тому що виключає добування токсичним розчинником хлороформом; - вихід цільової речовини при екстракції рідким діоксидом вуглецю в 2 рази вище, ніж при хлоро Комп’ютерна верстка В. Мацело 96305 14 формній екстракції розраховуючи на повітряносуху сировину; - запропонований спосіб забезпечує значне зниження тривалості процесу: час екстракції скорочується в 2 рази (з 6 годин до 3 годин), хроматографічного поділу в 36 разів (з 72 годин до 3 годин); стадії синтезу в 16 разів (з 48 годин до 3 годин); - виділення й очищення індивідуальної сполуки здійснюється на установці по препаративній флюїдній хроматографії "Super Pure - 350" із застосуванням зверненої фази С18, при цьому виключається використання токсичного розчинника бензолу; - стадія синтезу субстанції гідрохлориду 1(10)- епокси - 13 - диметиламіно-5,7, 6,11(Н)гвай-3(4)-ен-6,12-оліду (1) здійснюється з використанням диметиламоній диметилкарбамату замість диметиламіну; - результати клінічних випробувань показали високу радіосенсибілізуючу, імуномодулюючу дію протипухлинного засобу "Арглабін", отриманого за запропонованим способом. Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601