Олігопептид, який розпізнається та протеолітично розщеплюється вільним простатичним антигеном, спосіб визначення протеолітичної активності вказаного антигену, спосіб ідентифікації сполук, які інгібують протеолі

1 Олигопептид, содержащий от 6 до 100 аминокислот, который распознается и протеолитически селективно расщепляется свободным специфическим антигеном простаты в ферментативно активной форме, не образующей комплекс с какой-либо ингибирующей молекулой, и который содержит связь Gln-Ser либо связь Tyr-Ser, либо связь между гомологичными им изостерическими и/или изоэлектронными аминокислотами, расщепляемую специфическим антигеном простаты 2 Олигопептид по п 1, отличающийся тем, что содержит от 6 до 12 аминокислот 3 Олигопептид по п 1, отличающийся тем, что имеет следующую аминокислотную последовательность a) AsnLysIleSerlyrGlnjSer (SEQ ID No 1 3 ) , b) LysIleSerTyrGlrlSer (SEQ ID No 1 4 ) , C) GlyGl.AsrClyVaieirLysAspVa-SsrS-rsXaaSe'-IleTyrlSerSin ThrSlu ( E ID N 15), SQ o d) SlyLysaiylleSe-SerGlnTyrlSerAsnThrGlueiuArgUu ( E SQ ID No 2), e) AsnLysIleSerTyrTyrlSer (SEQ ID No 127), f) AsnLysAlaSerTyrGlniSer (SEQ ID No 128), g) SerTyrSlnlSerSer h) LysTysGlnjSerSer (SEQ ID No 129), (SEQ ID Ho 140), ИЛИ і ) hArgTyrGln!SerSer (SEQ ID No 1 4 1 ) ; где hArg представляет собой гомоаргинин, а Хаа представляет собой природную аминокислоту 4 Олигопептид по п 3, отличающийся тем, что имеет следующую аминокислотную последовательность a) AsnLysIleSerTyrGlnlSerSer (SEQ E No 16), D b) AsnLysIleSerTyrSlniSerAla (SEQ ID No 130), c) AsnLysIleSerTyrGlnlSerSerSer (SEQ ID Nol7), d) AlaAsnLysIleSerTyrGlnlSerSerSer (SEQ ID No 13), e) LysIleSe-TyrSin|SerSerSerThr61u f) aiyei^AsrGiyVa ThrGlu (SEQ ID Ho 4), (SEQ ID No 19), ThrGlu (SEQ '3 4o 5), h) AlaAsnLysUeSerTyrTyr|Ser (SEQ ID No 131), i) AlaAsnLysAlaSerIyrGln|Ser fSEQ ID Ho 13£), 3) SerTyrGlnlSerSerThr (SEQ ID No 133), k) SerTyrGlnjSerSerSer (SEQ ID No 134), 1) LysTyrGlnjSerSerSer (SEQ ID No 142), m) MrgTyrGlnJSerSerSer (SEQ ID No 143), или n) SerTyrGlnjSerSerLeu (SEQ ID No 135), 5 Олигопептид по п 3, отличающийся тем, что имеет следующую аминокислотную последовательность a) AsnLysCeSerTyrGlnjSerSerSerThr (SEQ ID M 10), o b) AlaAsntysIleSerTyrGlniSerAla (SEQ m No 136), c) AsnLys;:eSerTyr61n|SerSerSerTbrGlu (SEQ I N 3), D o d) AiaAsrLysIleSerTyrGlnlSerSerSerThrG.L (SEQ ID N 11), o e) 61ymuAsnSlyVal01nLysAspValSerGlnArgSerIleTyr|Ser61n Thr61u (SEQ ID No 4), О C O Ю Ю З f) AlaAsnLysIleSerryrTyriSer-Ser 55371 (SEQ I N 13?), D o g) AlaAsnLysIleSerTyrTyr|SerAla h) AlaAsiLysAlsSerTyrGH Зегдіа і ) A.aSerTyrCinlSerSe-L-eu (SEQ I N 138), D o (SEQ ID Ho 139), или (SEQ ID Ho 9 4 ) , 6 Олигопептид по п 3, отличающийся тем, что имеет следующую аминокислотную последовательность 7 Олигопептид по п 1, отличающийся тем, что выбран из группы AsrArgIleSerIyrGln[Ser (SEQ 10 No 21), Asru-ysValSerTyrGln] Ser (SEQ ID No 22), AsnLysMetSerTyrGln[SerSer (SEQ ID No 23), AsnLysLeaSerTyrGln|SerSer AsnLysIlelhrTyrGIn ISerSerSe (SEQ ID No 24) (SEQ ID No 25), AsnLysIleSerPheGln|SerSerSer (SEQ ID No 26) AsrLysI-eSerTrDGln|SerSerSerTnr (SEQ ID No 27), AsnLysIleSerlyrAsnjSerSerSerThr AsnLysIleSerTyrGlnjThrSerSerThr (SEQ ID No 28), (SEQ ID No 29), AsnLysIleSerTyrGlnjSer (SEQ ID No 30), einLysIleSerTyrGInlSerSer (SEQ ID No 31), AsnArglleThrTyrGlnjSerSerSer (SEQ ID No 32), AsnArg-IIeSerPneGlnlSerSerSerTir (SEQ ID M 33), o AsnArglleSerTrpGlnlSerSerSerTnr (SE^ ID No 35), AsnArglleSerTyrGlnlThrSerSerThr (SEQ ID No 36), AsnLysUeThrTyrGlnlTrirSerSer-Thr (SEQ ID No 37), AsnLysLeuSerTyrSlnlTto-SerSerT.hr (SEQ ID No 38 ) ; GlnLys^euSerTyrGlnjSerSerSerThr (SEQ ID No 39) AsnArgLeuSe^TyrGln]Tr-Se-SerTrr (SEQ ID No 40) ; AsnLysValSerPheGlnjSerSerSerThr AsnArgValSerTrpGln[SerSerSerThr (SEQ ID No 41), (SEQ ID No 42) ; GlnLysValSerTyrGln Se~SerSerThr (SEQ ID No 43) ? GlnLysIleSerTyrG.nlT^rSerSerThr (SEQ ID No 34), AsnLysIleSerTyrGln^SerSerSerlhr (SEQ ID No 44). 8 Олигопептид по п 1, отличающийся тем, что представляет собой 9 Способ определения протеолитической активности свободного специфического антигена простаты в образце, включающий в себя следующие стадии (а) осуществление реакции субстрата, где субстрат представляет собой олигопептид, содержащий от 6 до 100 аминокислот, который распознается и протеолитически селективно расщепляется свободным специфическим антигеном простаты в ферментативно активной форме, не образующей комплекс с какой-либо ингибирующей молекулой, и который содержит связь Gln-Ser либо связь ТугSer, либо связь между гомологичными им изостерическими и/или изоэлектронными аминокислотами, расщепляемую специфическим антигеном простаты, с образцом, и (б) регистрацию расщепления субстрата 10 Способ по п 9, отличающийся тем, что олигопептид содержит от 6 до 12 аминокислот 11 Способ по п 9, отличающийся тем, что стадия регистрации расщепления субстрата включает в себя анализ реакционной смеси с помощью жидкостной хроматографии высокого разрешения 12 Способ идентификации соединений, ингибирующих протеолитическую активность специфического антигена простаты, включающий в себя следующие стадии (а) осуществление реакции субстрата, где субстрат представляет собой олигопептид, содержащий от 6 до 100 аминокислот, который распознается и протеолитически селективно расщепляется свободным специфическим антигеном простаты в ферментативно активной форме, не образующей комплекс с какой-либо ингибирующей молекулой, и который содержит связь Gln-Ser либо связь ТугSer, либо связь между гомологичными им изостерическими и/или изоэлектронными аминокислотами, расщепляемую специфическим антигеном простаты со свободным специфическим антиге 55371 ном простаты в присутствии испытуемого соединения, и (б) регистрацию расщепления субстрата, при которой на способность испытуемого соединения ингибировать протеолитическую активность специфического антигена простаты в ферментативно активной форме, не образующей комплекс с какой-либо ингибирующей молекулой, указывает снижение уровня расщепления субстрата по сравнению с расщеплением субстрата в отсутствие испытуемого соединения 13 Способ по п 12, отличающийся тем, что олигопептид содержит от 6 до 12 аминокислот 14 Способ по п 12, отличающийся тем, что стадия регистрации расщепления субстрата предусматривает анализ аналитической смеси с помощью жидкостной хроматографии высокого разрешения 15 Конъюгат, используемый для лечения рака предстательной железы, который содержит цитотоксический агент, связанный с олигопептидом, содержащим от 6 до 100 аминокислот, который распознается и протеолитически селективно расщепляется свободным специфическим антигеном простаты в ферментативно активной форме, не образующей комплекс с какой-либо ингибирующей молекулой, и который содержит связь Gln-Ser либо связь Tyr-Ser, либо связь между гомологичными им изостерическими и/или изоэлектронными аминокислотами, расщепляемую специфическим антигеном простаты, причем указанный цитотоксический агент связан с указанным олигопептидом посредством ковалентной связи или химического линкера, и цитотоксический агент выбирают из доксорубицина и винбластина или их цитотоксических производных 16 Конъюгат по п 15, отличающийся тем, что олигопептид содержит от 6 до 12 аминокислот 17 Конъюгат по п 15, отличающийся тем, что цитотоксическим агентом является доксорубицин или его цитотоксическое производное 18 Конъюгат по п 17, отличающийся тем, что имеет формулу I о он о XL отсутствует или представляет собой аминокислоту, выбранную из группы аминокислот, включающей в себя a) фенилаланин, b) лейцин, c) валин, d) изолейцин, e) (2-нафтил)аланин, f) циклогексилаланин, д) дифенилаланин, h) норвалин и і) норлейцин, 1 R представляет собой водород или -(C=O)R , и 1 R представляет собой Сі-Сє-алкил или арил 19 Конъюгат по п 18, отличающийся тем, что олигопептид содержит от 6 до 12 аминокислот 20 Конъюгат по п 18, отличающийся тем, что олигопептид является олигомером, содержащим аминокислотную последовательность, выбираемую из a) AsnLysIleSerTyrGlnlSer (SEQ ID No 13), b) LysIleSerTyrGlnjSer (SEQ ID No 14), c) SlyGluAsnaiyValGlnlysAspValSerGMaaSerlleTyrlSerSln ThrGlu (SEQ I N 15), D o d) SlyLysSlyileSerSerSinTyTlSerAsnTtrSluQluArgLeu (E SQ ID N 2), o e) AsnLysIleSerTyrTyr|Ser (SEQ ID No 1273, f) AsnLysAla5er!yr6In|5er (SEQ 19 No 1 2 8 ) . ї ) SerlyrGlnlSerSer (SEQ ID No 1S9), h) hArgTyrGlnfSerSer (SEQ ID No 141); где hArg представляет собой гомоаргинин, а Хаа представляет собой любую природную аминокислоту, XL отсутствует или представляет собой аминокислоту, выбранную из a) лейцина, b) изолейцина и c) вал и на и R представляет собой ацетил, пивалоил или бензоил 21 Конъюгат по п 17, отличающийся тем, что представляет собой о СИ 3 О он о *Г сн2он "он сн3о о он б ___ Q -ШЕИГОПЄПТИД~Н в которой «олигопептид» представляет собой олигопептид, содержащий от 6 до 100 аминокислот, который распознается и протеолитически селективно расщепляется свободным специфическим антигеном простаты в ферментативно активной форме, не образующей комплекс с какой-либо ингибирующей молекулой, и который содержит связь Gln-Ser либо связь Tyr-Ser, либо связь между гомологичными им изостерическими и/или изоэлектронными аминокислотами, расщепляемую специфическим антигеном простаты, он і х где X представляет собой H£N-4snLysIleSerTyrGlnSer-C0 (SEQ. ID. No: 13), HzN-AsnLysIleSerTyrGlnSerSer-C (SEQ. ID. No: 16) 55371 О H2N-Asm,ys;i6SerTyrGlnSerSerSer-C (SEQ ID. No: 17), M-AsnLysIlsSerTyrGlnSerSerSerThr-C (SEQ. ID. No. 10),, 0 II HgN-AsnLvsIleSerTyrSlnSerSerSerThrGlu-C 0 Ii AcHN—LysTyrGlnSerSerNle-C (SEQ ID №: 3) 0 H24-AlaAsnLys:ieSerTyr61nSerSerSerTrirGlu-C "и (SEQ. ID. No: СО 2 СН Э 11), -7 0 AcHN—AlaAsnLysI leSerTyrQlnSerSerSerTbr-C CSEQ. ID. No: 117) 0 AcHN—AlaAsnLysSleSerTyrG.nSerSerSerThrLeu-C(SEQ ID.No ""СН2СН3 сн 3 с СНз і 0 Н CONH -СШ5Г onenT'^-C-NHg 70), 0 AcHN—AlaAsnLysAlaSerlyrGlnSerAlaSerThrleu-C (SEQ.ID.No 118), 0 ii AcHN—AiaAsnL/sAIaSe'-TyrGlnSerAlaSe'-L.eiJ-C0 (SEQ.ID.No;119), AcHN—AiaASRLysAlaSerTyrGInSerSerSerLeu-G0 (SEQ. ID.Ho.t2G); AchN—AlaAsriLysAlaSerTyrGlnSerSerbeu-C0 (SEQ ID No:121)? AcHN—SerTyrGlnSerSerSerLeu-O 0 (SEQ. ID.Mo: 146). 22 Конъюгат по п 15, отличающийся тем, что характеризуется формулой II ОН CSEQ. ID.No: 144), в которой «олигопептид» представляет собой олигопептид, содержащий от 6 до 100 аминокислот, который распознается и протеолитически селективно расщепляется свободным специфическим антигеном простаты в ферментативно активной форме, не образующей комплекс с какой-либо ингибирующей молекулой, и который содержит связь Gln-Ser либо связь Tyr-Ser, либо связь между гомологичными им изостерическими и/или изоэлектронными аминокислотами, расщепляемую специфическим антигеном простаты 23 Конъюгат по п 21, отличающийся тем, что олигопептид содержит от 6 до 12 аминокислот AcHN™hArgTyrGlnSerSerSerLeu-C(SEQ. ID. No-145) ; 0 II AcHN—LysTy-GlnSerSerSerUu-О (SEQ. ID. No. 124), И И Л Настоящая патентная заявка является частичным продолжением одновременно рассматриваемой заявки per №08/404833, поданной 15 марта 1995, которая, в свою очередь, является частичным продолжением одновременно рассматриваемой заявки per №08/267092, поданной 28 июня 1994 По предварительным данным, в 1994г в США, число диагностированных случаев заболеваний раком предстательной железы у мужчин составляет 200000, при этом, смертность от этого заболевания может составить 38000 человек (Garmck, М В (1994) The Dilemmas of Prostate Cancer Scientific American, April 72 - 81), Таким образом, рак предстательной железы является одним из наиболее часто диагностируемых раковых заболеваний (помимо рака кожи) у мужчин в США, и занимает второе место по смертности от рака (после рака легких) Простатический антиген (PSA) представляет собой одно-цепочечный гликопротеин в ЗЗкДа, который почти исключительно продуцируется эпителием предстательной железы человека, и присутствует в сперме человека в количестве от 0,5 до 2,0мг/мл (Nadji, М , Taber, S Z , Castro, A ,etal (1981) Cancer 48 1229, Papsidero, L , Kunyama, M , Wang, M et al (1981) JNCI 66 37, Qu i, S D , Young, C Y F , Bihartz, D L , (1990), J Urol 144 1550, Wang, M С , Valenzuela, LA , Murphy, G P , et al (1979), Invest Urol 17 159) В этом гликопротеине имеется одна углеводная единица, которая присоединена к остатку аспарагина 45, и которая составляет 2 - ЗкДа от общей молекулярной массы PSA представляет собой протеазу с химотрипсинподобной специфичностью (Chnstensson, А, Laurell, С В, Lilja, H (1990) Eur J Biochem 194 755 - 763) Было показано, что PSA является ответственным, главным образом, за растворение гелевой структуры, образующейся при эякуляции, путем протеолиза основных (мажорных) белков, содержащихся в геле спермы, например, таких, как семеногелин I и семеногелин II, и фибронектин (Lilja, H, (1985) J Clm Invest 76 1899, Lilja, H, Oldbnng, J , Rannevik, G , et al (1987) J Clm Invest 80 281, McGee R S , Herr, J C (1988) Biol Reprod 39 499) PSA - опосредованный протеолиз гелеобразующих белков способствует образованию нескольких растворимых фрагментов семеногелина I и семеногелина II и растворимых фрагментов фибронектина с разжижением эякулята и высвобождением все более подвижных сперматозоидов (Lilja, Н , Laurell, С В (1984), Scand J Glm Lab Invest 44 447, McGee, R S Herr, J С (1987), Biol Reprod 37 431) Кроме того, 55371 простатический антиген (PSA) обладает способностью к протеолитическому расщеплению IGFBP - 3 (белка, связывающегося с инсулиноподобным фактором роста), что позволяет IGF (инсулиноподобному фактору роста) специфически стимулировать рост PSA - секретирующих клеток (Cohen etal,(1992)J Clm Endo & Meta , 75 1046-1053) Преобладающей молекулярной формой сывороточного PSA является комплекс, образованный PSA с альфа 1 - антихимотрипсином, и составляющий до 95% от всего обнаруживаемого сывороточного PSA (Chnstensson, A , Bjork, Т , Nilsson, 0 , et al (1993) J Uro 150 100 - 105, Lilja, H, Chnstensson, A, Danlen, U (1991) Clm Chem 37 1618 -1625, Stenman, U H , Lemoven, J , Alfthan, H , et al (1991) Cancer Res 51 222 - 226) Ткань предстательной железы (нормальная ткань, доброкачественная гиперпластическая ткань и злокачественная ткань) высвобождает преимущественно зрелую ферментативне активную форму PSA, поскольку такая форма необходима для образования комплекса с альфа 1 - антихимотрипсином (Mast, А Е , Enghild, Т J , Pizzo, S V , et al (1991), Biochemistry 30 1723 - 1730, Perlmutter, D H , Glover, G l , Rivetna, M, et al, (1990) Proc Natl Acad Sci USA 87 3753 - 3757) Поэтому в микроокружении PSA - секретирующих клеток предстательной железы PSA, очевидно, процессируется и секретируется в своей зрелой ферментативно активной форме, не конъюгированной с какой либо ингибирующей молекулой PSA также образует стабильные комплексы с альфа 2 - макроглобулином, но, поскольку это приводит к инкапсуляции PSA и полной потери PSA - зпитопов, то смысл in vivo - образования такого комплекса пока не ясен Свободная неконъюгированная форма PSA составляет минорную фракцию сывороточного PSA (Chnstensson, A , Bjork, Т , Nilsson, 0 , et al (1993) J Urol 150 100-150, Lilja, H , Chnstensson, A, Dahlen, U (1991) Clm Chem 37 1618 - 1625) Размер этой формы сывороточной PSA аналогичен размеру формы PSA, присутствующей в семенной жидкости (Lilja, Н , Chnstensson, A , Dahlen, U (1991) Clm Chem 37 1618 - 1625), однако, пока неизвестно, может ли свободная форма сывороточного PSA быть зимогеном, внутренне гидролизованной неактивной формой зрелого PSA, или PSA, обладающим ферментативной активностью Однако, представляется маловероятным, что свободная форма сывороточного PSA обладает ферментативной активностью, поскольку присутствующий в сыворотке молярный избыток обоих непрореагировавших альфа 1 - антихимотрипсина и альфа 2 - макроглобулина значительно превышает (в 100 - 1000) раз детектируемые сывороточные уровни свободной ЗЗкДа - формы PSA (Chnstensson, A, Bjork, Т, Nilsson, О ( et al, (1993) J Urol 150 100-105, Lilja, H , Chnstensson, A, Danlen, U (1991), Clm Chem, 37 1618-1625) Измерение уровней PSA в сыворотке может оказаться полезным при наблюдении за развитием аденокарциномы предстательной железы (Duffy, M S (1989) Ann Clm Biochem 26 379 387, Brawer, U К & Lange, P H (1989), Urol Suppl 5 11-16, Hara, M & Kimura, H (1989), J Lab Clm Med 113 541 - 548), хотя по имеющимся данным, 10 повышение концентраоди PSA в сыворотке наблюдается также при доброкачественной гиперплазии предстательной железы и после хирургической операции на предстательной железе (Lilja, Н, Chnstensson, A, Dahlen, U (1991) Clm Chem 37 1617 - 1625) Кроме того, известно, что метастазы предстательной железы секретируют иммунореактивный PSA, так как у пациентов с удаленной предстательной железой и с распространенными метастазами рака предстательной железы обнаруживаются высокие уровни сывороточного PSA (Ford, Т F , Butcher, D N , Masters, R W , et al (1985) Brit J Urology 57 50-55) Поэтому цитотоксическое соединение, которое активируется посредством протеолитической активности PSA, должно быть специфическим к клеткам предстательной железы, а также к PSA секретирующим метастазам предстательной железы В соответствии с этим, целью настоящего изобретения является получение новых олигопептидов, которые селективно и ферментативно расщепляются активным свободным простатическим антигеном (PSA) Другой целью настоящего изобретения является разработка количественного анализа на ферментативную активность PSA с использованием новых олигопептидов Следующей целью настоящего изобретения является получение новой противораковой композиции, которая может быть использована для лечения рака предстательной железы, и которая включает в себя новые олигопептиды, конъюгированные с цитотоксическим агентом Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение способа лечения рака предстательной железы, предусматривающего введение новой противораковой композиции Было идентифицировано несколько сайтов расщепления, в которых семеногелин I селективно протеолитически гидролизуется свободным PSA Описываюся олигопептиды, имеющие аминокислотные последовательности, которые распознаются и протеолитически расщепляются свободным простатическим антигеном (PSA) Такие олигопептиды могут быть использованы в анализа in vivo и in vitro для определения протеазной активности свободного простатического антигена (PSA) Кроме того, указанные олигопептиды могут быть включены в терапевтические средства, которые содержат конъюгаты этих олигопептидов и известные цитотоксические агенты, и которые могут быть использованы для лечения рака предстательной железы Краткое описание рисунков (Фиг) Фиг 1а и 1 b Первичная аминокислотная последовательность семеногедина I Показана первичная аминокислотная последовательность семеногелина I (SEQ ID No 1) Показаны также сайты протеолитического расщепления ("CS") простатическим антигеном (пронумерованные в соответствии с относительной аффинностью сайта по отношению к PSA гидролизу), при этом фрагменты белка пронумерованы начиная от амино-конца Фиг 2 Аффинность в отношении гидролиза 55371 12 11 синтетических одигопептидов зано также, что они обладают цитотоксичностью против клеточной линии (DuPRO), которая не секБыло получено гнездовое множество синтетиретирует свободный PSA ческих олигопептидов, и эти олигопептиды были подвергнуты гидролизу ферментативно активным Настоящее изобретение относится к новым свободным PSA в течение различных промежутолигопептидам, которые специфически распознаков времени Полученные результаты представются свободным простатическим антигеном (PSA), лены в Таблице 2 (ND = не определяли) Для обои которые могут быть протеолитически гидро значения аминокислот был использован лизованы благодаря ферментативной активности однобуквенный код, где А = Ala, Е = Glu, G = Gly, H свободного простатического антигена Такими = His, I = Не, К = Lys, L = Leu, N = Asn, Q = Gin, P = олигопептидами являются олигомеры, имеющие Aro, S = Ser, T = Thr, Y = Tyr аминокислотную последовательность, выбранную из следующих последовательностей Фиг За и ЗЬ Аффинность в отношении гидроa) Asnl_yslleSerTyrGln|Ser(SEQ ID N 13) o лиза синтетических олигопептидов b) LyslleSerTyrGIn | Ser ( E ID N 14) SQ o Получали синтетические олигопептиды, котоc) GlyGluAsnGlyValQlnl_ysAspValSerGlnXaaSerlleTyr|SerGln ThrGlu (SEQ ID N 15) o рые были подвергнуты гидролизу ферментативне d) GlyLysGlyleSerSerGlnTyr|SerAsnThrGluGluArgl_eu (SEQ ID N 2) o активным PSA в течение четырех (4) часов На e) AsnLyslleSerTyrTyr|Ser(SEQ ID N 127) o фиг приводится процент олигопептида, гидролиf)Asnl_ysAlaSerTyrGln|Ser(SEQ ID N 128) o g) SerTyrGIn | SerSer ( E ID N 129) SQ o зованного за этот период времени Результаты h) LysTyrGIn | SerSer ( E ID N 140) SQ o представлены в Таблице 4 i)hArgTyrGln|SerSer(SEQ ID N 141) o Фиг 4 Данные о цитотоксичности нерасщепгде hArg представляет собой гомоаргинин, а ляемых конъюгатов "олигопептид - доксорубицин" Хаа представляет собой любую натуральную амиДанные, представленные на фиг, иллюстринокислоту руют сравнительную цитотоксичность доксорубиВ одном из вариантов осуществления нацина и конъюгата доксорубицина, ковалентно свястоящего изобретения олигопептидами являются занного с олигопептидом (Соединение 12Ь), олигомеры, имеющие аминокислотную последокоторый не содержит сайта протеолитического вательность, выбранную из следующих последорасщепления простатическим агентом ICso для вательностей a) AsnLyslleSerTyrGIn I SerSer ( E ID N 16) SQ o доксорубицина составляет О.ЗмкМ, тогда как докb) AsnLyslleSerTyrGlnlSerAla ( E ID N 130) SQ o сорубицин, модифицированный ацетилированным c) AsnLyslleSerTyrGIn | SerSerSer ( E ID N 17) SQ o олигопептидом, имеет более чем в 300 раз меньd) AlaAsnl_yslleSerTyrGln|SerSerSer(SEQ ID N 18) o e) LyslleSerTyrGIn | SerSerSerThrGlu ( E ID N 19) SQ o ший ICso Этот конъюгат не имеет ВЭЖХ - обнаруf) GlyGluAsnGlyValGlnLysAspValSerGlnArgSerlleTyrlSerGIn ThrGlu (SEQ ID живаемых примесей немодифицированного докN 4) o сорубицина Олигопептид, взятый отдельно, не g) GlyGluAsnGlyValGlnLysAspValSerGlnSerSerlleTyrlSerGIn ThrGlu (SEQ ID N 5) o обладает заметной цитотоксической активностью h) AlaAsnTyslleSerTyrTyr|Ser(SEQ ID N 131) o i)AlaAsnLysAlaSerTyrGln|Ser(SEQ ID N 132) o Фиг 5 Аффинность in vitro - расщепления своj) SerTyrGIn | SerSerThr ( E ID N 133) SQ o бодным PSA олигопептидов, конъюгированных с k) SerTyrGIn | SerSerSer ( E ID N 134) SQ o I) LysTyrGIn | SerSerSer ( E ID N 142) SQ o докеорубицином m hArgTyrGIn | SerSerSer ( E ID N 143) ) SQ o Получали конъюгаты олигопептидов с докеоn) SerTyrGIn SerSerLeu ( E ID N 135) SQ o рубицином и эти конъюгаты подвергали гидролизу В более предпочтительном варианте осущеферментативне активным свободным PSA в течествления настоящего изобретения олигопептидание четырех (4) часов На рисунке приводится ми являются олигомеры, имеющие аминокислотпроцент конъюгата, ферментативне расщепляеную последовательность, выбранную из мого в олигопептиде за этот период времени Последующих последовательностей лученные результаты представлены в Таблице 5 a) AsnLyslleSerTyrGIn |SerSerSerThr ( E ID N 10) SQ o b) AlaAsnLyslleSerTyrGIn | SerAla ( E ID N 136) SQ o Фиг 6 Аффинность расщепления одигопептиc) AsnLyslleSerTyrGIn | SerSerSerThrGlu (SEQ ID N 3) o дов, конъюгированных с докеорубицином, в конcl) AlaAsnLyslleSerTyrGIn | SerSerSerThrGlu (SEQ ID N 11) o e) GlyGluAsnGlyValGlnLysAspValSerGlnArgSerlleTyrlSerGIn ThrGlu (SEQ ID диционированной клетками среде N 4) o Конъюгаты олигопептидов с докеорубицином f) AlaAsnLyslleSerTyrTyr | SerSer ( E ID N 137) SQ o подвергали реакции в течение четырех (4) часов с g) AlaAsnLyslleSerTyrTyr | SerAla ( E ID N 138) SQ o h) AlaAsnLysAlaSerTyrGln|SerAla ( E ID N 139) SQ o культуральной средой, кондиционированной клетi) AlaSerTyrGIn | SerSerLeu ( E ID N 94) SQ o ками LNCaP (которые, как известно, секретируют В еще более предпочтительном варианте свободный PSA) или клетками DuPRO (которые не осуществления настоящего изобретения олигосекретируют свободный PSA) На рисунке привопептидами являются олигомеры, имеющие следится процент конъюгата, гидролизованного в дующую выбранную аминокислотную последоваолигопептиде за этот период времени Получентельность, ные результаты представлены в Таблице 6 a) GlyArgLysAlaAsnLyslleSerTyrGlnlSerSerSerThrGluGluArg ArgLeuHisTyr GlyGluAsnGly ( E ID N 6) SQ o Фиг 7 Данные о цитотоксичности гидродизоИспользуемая в настоящем подробном описаванных конъюгатов одигопептида и доксорубицинии фраза "олигомеры, имеющие аминокислотную на последовательность" относится к олнгомерам, Данные, представленные в Таблице 7 иллюсостоящим примерно из 6 - 100 аминокислотных стрируют цитотоксичность (IC50) доксорубицина, остатков , и содержащим в своей аминокислотной ковалентне связанного с олигопептидом, содерпоследовательности описанную специфическую жащим сайт протеолитического расщепления своаминокислотную последовательность, которая бодным PSA, направленную против раковой клепротеолитически расщепляется свободным PSA, точной линии, которая, как известно, секретирует свободный PSA Для некоторых конъюгатов пока Так, Например, ОЛИГОМер GlnLeuAspAsnLyslleSer 13 55371 TyrGlnlSerSerSerThrHisGlnSerSer (SEQ ID No 20) С О Д е р Ж И Т Э М И Н О КИСЛОТНуЮ ПОСЛеДОВатеЛЬНОСТЬ AsnLyslle TyrGlnlSerSerSerThr (SEQ ID No 10) Э ПОЭТОМУ ВХОДИТ В О б Ъ ем настоящего изобретения При этом следует отметить, что такие олигомеры не являются семеногелином I и семеногелином II Кроме того, следует отметить, что настоящее изобретение относится также к олигомерам, где Nконцевая аминокислота или С-концевая аминокислота, или обе концевые аминокислоты являются модифицированными Такими модификациями являются, но не ограничиваются ими, ацилирование амино-группы у N-конца и образование амидной группы для замены карбоксильной группы у Сконца, Добавление указанных групп может быть осуществлено в процессе твердофазного синтеза олигомера Так, например, присоединение Сконцевой аминокислоты к твердофазной смоле может быть осуществлено с помощью амина, который приводит к образованию амидной группы после кислотного отщепления олигомера от смолы Таким образом, используемый выше термин "олигомеры, имеющие аминокислотную последовательность" означает следующие соединения, но не ограничивается ими AlaAsnLyslleSerTyrQIn | SerSerSerThrGlu-амид (SEQ ID No 11) Ac-AlaAsnLyslleSerTyrGIn | SerSerSerThrLeu (SEQ ID No 70) Ac-AlaAsnLyslleSerTyrGIn | SerSerSerThrGlu-амид (SEQ ID No 11) Исходная аминокислота Ala Arg Asn Asp Glu Gin Gly He Leu Lys Met Орнитин Phe Ser Thr Trp Tyr Val Так, например, ниже следующие олигопептиды могут быть синтезированы способами, хорошо известными любому специалисту, и должны, как предполагается, протеолитически расщепляться свободным PSA, AsnArglleSerTyrGIn | Ser ( E ID N 21) SQ o AsnLysValSerTyrGIn | Ser ( E ID N 22) SQ o AsnLysMetSerTyrGIn | SerSer ( E ID N 23) SQ o AsnLysLeuSerTyrGIn | SerSer ( E ID N 24) SQ o AsnLyslleThrTyrGIn | SerSerSer ( E ID N 25) SQ o AsnLyslleSerPheGIn | SerSerSer ( E ID N 26) SQ o AsnLyslleSerTrpGIn | SerSerSerThr ( E ID N 27) SQ o AsnLyslleSerTyrAsn | SerSerSerThr ( E ID N 28) SQ o AsnLyslleSerTyrGIn | ThrSerSerThr ( E ID N 29) SQ o AsnLyslleSerTyrGIn | Ser ( E ID N 30) SQ o GlnLyslleSerTyrGIn | SerSer ( E ID N 31) SQ o AsnArglleThrTyrGIn | SerSerSer ( E ID N 32) SQ o AsnArglleSerPheGIn | SerSerSerThr ( E ID N 33) SQ o AsnArglleSerTrpGIn | SerSerSerThr ( E ID N 35) SQ o AsnArglleSerTyrGIn | ThrSerSerThr ( E ID N 36) SQ o AsnLyslleThrTyrGIn | ThrSerSerThr ( E ID N 37) SQ o AsnLysLeuSerTyrGIn | ThrSerSerThr ( E ID N 38) SQ o GlnLysLeuSerTyrGIn | SerSerSerThr ( E ID N 39) SQ o 14 Ac-AlaAsnLyslleSerTyrGIn | SerSerSerThrLeu-амид (SEQ ID No 70) Ac-AlaAsnLyslleSerTyrGIn | SerAlaSerThrGlu-амид (SEQ ID No 73) Ac-AlaAsnLyslleSerTyrGIn | SerSerLysThrGlu-амид (SEQ ID No 74) Ac-AlaAsnLyslleSerTyrGIn | SerSerThrGlu-амид (SEQ ID No 75) Ac-AlaAsnLyslleSerTyrGlnlSerSerGlnThrGlu-амид (SEQ ID No 78) Ac-AlaAsnLyslleSerTyrGIn | SerAlaLysThrGlu-амид (SEQ ID No 79) Ac-AlaAsnLyslleSerTyrGIn | SerThrGlu-амид (SEQ ID No 81) Ac-AlaAsnLysSerTyrGIn | SerSerThrGlu-анид (SEQ ID No 82) Ac-AlaAsnLysAlaSerTyrGIn | SerAlaSerThrGlu-амид (SEQ ID No 84) Ac-AlaAsnGlulleSerTyrGIn | SerAlaSerThrGlu-анид (SEQ ID No 85) Ac-AsnLyslleSerTyrGlnlSerSer-амид (SEQ ID No 16) Ac-LyslleSerTyrGIn ISerSer-анид (SEQ ID No 86) Ac-SerTyrGIn [serSerThrGlu-амид (SEQ ID No 87) Ac-AlaSerTyrGIn | SerSerThrGlu-анид (SEQ ID No 89) Ac-AlaAsnLyslleSerTyrTyrlSerSerSerThrGlu-амид (SEQ ID No 92) Ac-AlaAsnLyslleSerTyrTyrlSerAlaSerThrGlu-амид (SEQ ID No 93) Ac-AlaSerTyrGIn | SerSerLeu-анид (SEQ ID No 94) Ac-AlaAsnSerTyrGIn | SerSerSerThrGlu-амид (SEQ ID No 95) Ac-AlaSerTyrGIn | SerSerSerThrGlu-анид (SEQ ID No 96) Ac-SerTyrGIn | SerSerSerThrGlu-анид (SEQ ID No 97) Ac-AlaAsnLysAlaSerTyrGlnlSerAlaSerCys-амид (SEQ ID No 98) Для каждого специалиста по пептидной химии совершенно очевидно, что некоторые аминокислоты в биологически активном олигопептиде могут быть заменены гомологичными, изостерными и/или изоэлектронными аминокислотами, но при этом биологическая активность такого модифицированного олигопептида аналогична биологической активности исходного олигопептида Нижеследующий список аминокислотных замещений носит чисто иллюстративный, а не ограничивающий характер Замещающая аминокислота Gly Lys, Орнитин Gin Glu Asp Asn Ala Val, Leu, Met, Nle He, Val, Met, Nle Аго, Орнитин Leu, He, Nle, Val Lys, Arg Tyr, Trp Thr Ser Phe, Tyr Phe, Trp Leu, He, Met, Nle AsnArgLeuSerTyrGIn | ThrSerSerThr ( E ID N 40) SQ o AsnLysValSerPheGIn | SerSerSerThr ( E ID N 41) SQ o AsnArgValSerTrpGIn | SerSerSerThr ( E ID N 42) SQ o GlnLysValSerTyrGIn | SerSerSerThr ( E ID N 43) SQ o GlnLyslleSerTyrGIn | ThrSerSerThr ( E ID N 34) SQ o AsnLyslleSerTyrGIn | SerSerSerThr ( E ID N 44) SQ o Аналогично, нижеследующие олигопептиды могут быть синтезированы способами, хорошо известными любому специалисту, и должны, как предполагается, протеолитически расщепляться свободным PSA GlyGluGlnGlyValGlnLysAspValSerGlnSerSerlleTyr | SerGlnThr Glu ( E ID SQ N 45) o GlyGluAsnGlyLeuGlnLysAspValSerGlnSerSerlleTyr | SerGlnThr Glu ( E ID SQ N 47) o GlyGluAsnGlyValAsnLysAspValSerGlnSerSerlleTyr | SerGlnThr Glu ( E ID SQ N 48) o GlyGluAsnGlyValGlnArgAspValSerGlnArgSerHeTyr | SerGlnThr Glu ( E ID SQ N 49) o GlyGluAsnGlyValGlnLysAspValSerGlnLysSerlleTyr | SerGlnThr Glu ( E ID SQ N 50) o GlyGluAsnGlyValGlnLysAspLeuSerGlnThrSerlleTyr | SerGlnThr Glu ( E ID SQ N 51) o GlyGluAsnGlyValGlnLysAspValSerGlnSerSerllePhe | SerGlnThr Glu ( E ID SQ 15 55371 N 5) o 2 Gy l A n l V l l L s s M t eGn eS re y | T r l T r Gu ( E I l Gu s Gy aGn y A p eS r l S r el T r hGn h l S Q D N 5) o 3 GlyGluAsnGlyValGlnLysAspValSerGlnArgSerlleTyr | hG T r Gu ( E I Tr l h l SQ D n N 5) o 4 GlyGluAsnGlyValGlnLysAspValSerGlnSerSerlleTyr | S r l S r Gu ( E I eG e l S Q D n N 5) o 5 GlyGluAsnGlyValGlnLysAspValSerGlnArgSerlleTyr | S r s T r Gu ( E I eA n h l S Q D N 5) o 6 Glyl_ysAlaleSerSerGlnTyr|SerAsnThrGluGluArgl_eu ( E I N 5 ) SQ D o 7 GlyArgGlyleSerSerGlnTyrlSerAsnThrGluGluArgLeu ( E I N 5 ) SQ D o 9 Glyl_ysGlyleThrSerGlnTyr|SerAsnThrGluGluArgl_eu ( E I N 6 ) SQ D o 0 GlyLysGlyleSerThrGlnTyrlSerAsnThrGluGluArgLeu ( E I N 6 ) SQ D o 1 Glyl_ysGlyleSerSerAsnTyr|SerAsnThrGluGluArgl_eu ( E I N 6 ) SQ D o 2 Alal_ysGlyleSerSerGlnTyr|SerAsnThrGluGluArgl_eu ( E I N 6 ) SQ D o 3 Glyl_ysGlyleSerSerGlnPhe|SerAsnThrGluGluArgl_eu ( E I N 6 ) SQ D o 4 Glyl_ysGlyleSerSerGlnTyr|ThrAsnThrGluGluArgl_eu ( E I N 6 ) SQ D o 5 Glyl_ysGlylleSerSerGlnTyr|SerAsnSerGluGluArgl_eu (SEQ ID No 58 и Glyl_ysGlylleSerSerGlnTyr|SerAsnThrAspGluArgl_eu (SEQ ID No 4 6 ) и т п Символ " І", включенный в аминокислотную последовательность, указывает на точку протеолитического расщепления олигопептида свободным PSA Настоящее изобретение также относится к способу анализа на протеолитическую активность свободного PSA в композиции Этот способ является одним из важных аспектов настоящего изобретения и заключается в использовании аналитической системы, которая позволяет количественно определить содержание свободного PSA, присутствующего в некоторых физиологических жидкостях и тканях Кроме того, этот анализ не только позволяет контролировать выделение и очистку свободного PSA, но также может быть положен в основу метода скрининга для идентификации ингибиторов протеолитической активности свободного PSA В общих чертах, этот метод заключается просто в определении способности композиции, которая, как предполагается, содержит ферментативне активный свободный PSA, протеолитически расщеплять олигопептид В основном, процедуру анализа осуществляют с использованием одного из олигонуклеотидов, описанных выше Однако, может оказаться предпочтительным разработать такой анализ, в котором олигопептид, содержащий сайт расщепления, был бы помечен меткой, например, радиоактивной меткой, присутствие которой как в нерасщепленном олигопептиде, так и в части олигопептида, оставшегося после расщепления и содержащего эту метку, можно было бы измерить Кроме того, настоящее изобретение относится к способу идентификации соединений (называемых далее соединениями-кандидатами), которые ингибируют протеолитическуи активность свободного PSA При этом предусматривается, что такой способ скрининга может быть с успехом использован для идентификации любого соединениякандидата, которое является ингибитором, независимо от того, имеет или не имеет данное соединение-кандидат белковую или пептидиловую структуру Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу определения способности испытуемого соединения ингибировать протеолитическую активность свободного PSA, причем указанный способ предусматривает (а) осуществление реакции субстрата, имеющего аминокислотную последовательность, распознаваемую и селективно протеолитически расщепляемую свободным простатическим 16 антигеном, со свободным простатическим антигеном в присутствии испытуемого соединения, и (Ь) установление факта расщепления субстрата, где на способность испытуемого соединения ингибировать протеолитическую активность указывает снижение уровня расщепления субстрата по сравнению с расщеплением субстрата в отсутствии испытуемого соединения По своей разработке и осуществлению анализ в целях скрининга соединений-кандидатов является довольно простым, и во многом похож на вышеописанный анализ для определения протеолитической активности Так, например, после получения относительно очищенного препарата свободного PSA, желательно просто смешать испытуемое соединение с протеолитическим препаратом, предпочтительно в таких условиях, при которых PSA может осуществлять свою функцию расщепления, но в отсутствие ингибирующего соединения Так, например, желательно включить в смесь определенное количество олигопептида, имеющего специфический сайт расщепления PSA, такого, как олигопептиды, описанные выше Таким образом, можно измерить способность испытуемого соединения снижать относительный уровень расщепления олигопептида в присутствии испытуемого соединения В соответствии с этим, для оценки относительной ингибирующей способности испытуемого соединения желательно измерить или как-нибудь иначе определить активность свободного PSA в отсутствие добавляемого испытуемого соединения по сравнению с активностью в присутствии испытуемого соединения Настоящее изобретение также относится к противораковым композициям, которые могут быть использованы для лечения рака предстательной железы Такие композиции содержат олигопептиды настоящего изобретения, ковалентне связанные с цитотоксическим агентом либо непосредственно, либо с помощью химического линкера Эта комбинация олигопептида и цитотоксического агента может быть определена как конъюгат В идеальном случае, цитотоксическая активность цитотоксического агента является очень низкой или вообще отсутствует, если олигопептид, содержащий сайт протеолитического PSAрасщепления, связан непосредственно или с помощью химического линкера с цитотоксическим агентом и является интактным Кроме того, в идеальном случае цитотоксическая активность цитотоксического агента значительно возрастает или возвращается до уровня активности немодифицированного цитотоксического агента после протеолитического гидролиза связанного олигопептида в сайте расщепления Наиболее предпочтительным, хотя и необязательным, вариантом осуществления настоящего изобретения является получение конъюгата, где олигопептид и химический линкер, если он присутствует, отделяются от цитотоксического агента под действием протеолитически активного свободного PSA и любых других нативных протеолитических ферментов, присутствующих в окружающей ткани» высвобождая, тем самым, немолифицированный цитотоксический агент во внутреннюю среду организма в месте 55371 18 17 протеолитического расщепления стоящего изобретения При этом следует отметить, что олигопептид Особенно предпочтительной группой цитотокнастоящего изобретения, коньшгированный с цисических агентов настоящего изобретения являтотоксическим агентом, независимо от того, являются лекарственные средства, имеющие следуюется ли он ковалентне связанным с этим агентом щие формулы непосредственно или с помощью химического Группа метотрексатов формулы (1) линкера, необязательно должен быть олигопептидом, наиболее распознаваемым и наиболее легко COR9 расщепляемым свободным PSA, Так, например, I і >~СОЖСНСНгСНгСОгН выбор олигопептида для включения в противораковую композицию может быть осуществлен исхоR8 (1) дя из его селективности, протеолитической расщепляемости простатическим агентом, и R 2 представляет собой амино-или гидроксицитотоксической активности конъюгата цитотоксигруппу, ческого агента и протеолитического остатка (или, R представляет собой водород или метил, в идеальном случае, немодифицированного цитоR8 представляет собой водород, фтор, хлор, токсического агента), являющейся следствием бром или ЙОД, такого расщепления R9 представляет собой гидрокси-группу, или Поскольку коньюгаты настоящего изобретения группу, образующую соль карбоновой кислоты могут быть использованы для модификации данГруппа митомицинов формулы (2) ного биологического ответа, то цитотоксический О агент не должен быть ограничен лишь классичерн2осоынг скими типами химических терапевтических аген-ОСН3 тов Так, например, цитотоксический агент может быть белком или полипептидом, обладающим нужной биологической активностью Такими белками могут быть, например, токсин, такой, как абгде RIU представляет собой водород или мерин, рицин А, экзотоксин pseudomonas, или дитил фрерийный токсин, белок, такой, как фактор Группа блеомицинов формулы (3) некроза опухоли, альфа-интерферон, бетаC N 2 NH, OH интерферон, Фактор роста нервной ткани, тромбоцитарный фактор роста, тканевый активатор плазминогена, или модификаторы биологического ответа, такие как лимфокины, интерлей-кин-1 ("IL1"), интерлейкин-2 ("IL-2"), интерлейкин-6 ("IL-6"), фактор, стимулирующий образование колоний гранулоцитов и макрофагов (GM-CSF), фактор колоннеобразования гранулоцитов (G-CSF) или другие факторы роста Предпочтительными цитотоксическими агентами являются, в основном, алкилирующие агенты, антипролиферативные агенты, тубулинсвязывающие агенты и т п Предпочтительными классами цитотоксических агентов являются, например, семейство антрациклиновых лекарственных средств, лекарственные средства, относящиеся к винка-соединениям, митомицины, блеомицины, цитотоксические нуклеозиды, семейство птеридиновых лекарственных средств, диинены и подофиллотоксины Особенно предпочтительными соединениями вышеуказанных классов являются, например, доксорубицин, карминомицин, даунорубицин, аминоптерин, метотрексат, метоптерин, дихлорометотрексат, митомицин С, порфиромиодн, 5-фтороурацил, 6меркаптопурин, цитозинарабинозид, подофиллотоксин или его производные, такие как этопозид или это поз ид фосфат, мелфалан, винбластин, винкристин, лейрозидин, виндезин, лейрозин и т п Другими подходящими цитотоксическими агентами являются эстрамустин, цисплатин и циклофосфамид При этом каждый специалист может осуществить соответствующие химические модификации с образованием нужного соединения, которое является более пригодным для проведения реакций в целях получения конъюгатов на (3) CN2 OH R представляет собой гидрокси-группу, амино-группу, Сі-Сз-алкиламино-группу, ди(Сі-Сзалкил)амино-группу, С4-Сє-полиметиленаминогруппу, + № -CHg; или -Ш Мелфалан формулы (4) ^Г~Г4(СН 3 СН 2 СІ) 2 6-Меркаптопурин формулы (5) (4) SH Цитозинарабинозид формулы (6) (5) 19 20 55371 2 2 HN А HO OH Подофиллотоксины формулы (7) R J N, R (6) N, H її? U) R представляет собой водород, метил, бром, фтор, хлор или иод 23 R представляет собой-ОН или -NH2, 24 R представляет собой водород, бром, хлор или йод, или Антрациклиновые антибиотики формулы (10) о он о R представляет собой водород или метил, R14 представляет собой метил или тиенил, или их фосфатные соли Лекарственные средства группы винкаадкадоидов формулы (8) R (8) £ ! представляет собой Н, СНз или СНО, в 17 1t 17 1f случае,, когда R и R взяты отдельно, д 18 16 R18 представляет собой Н, причем, один Н или является этилом, а другой является из R 17 и R 1 7 1ft ОН, а в том случае, когда R и R взяты вместе с атомами углерода, с которыми они связаны, они образуют оксирановое кольцо, где R16 является этилом, 1Q R представляет собой водород, ( d Сзалкил)-СО, или хлор-замещенную группу ( d Сзалкил)-СО, Дифторонукдеозиды формулы (9) о. хн2он (10) где R представляет собой -СНз, СНгОН, СН2ОСО(СН2)зСНз или -СН2ОСОСН(ОС2Н5)2, 3 R представляет собой -ОСНз, -ОН или Н, R4 представляет собой -NH2, -NHCOCF3, 4морфолинил, З-циано-4-морфолинил, 1пиперидинил, 4-метокси-1-пипериди-нил, бензиламин, дибензиламин, цианометиламин или 1циано-2-метоксиэтиламин, R5 представляет собой -ОН, -ОТНР или -Н и R6 представляет собой -ОН или -Н, при условии, что R6 не является -ОН, если R5 =-ОН или -ОТНР Эстрамустин (11) {СІСН г СН г ) 2 МСОО' Циклофосфамид (12) Ґ (9) R представляет собой основание, имеющее одну из формул, Самыми предпочтительными лекарственными средствами являются антрациклиновые антибиотики Формулы (10), описанные ранее При этом следует отметить, что указанные структурные формулы описывают соединения, которые являются лекарственными средствами или производными лекарственных средств, имеющими различные родовые или тривиальные названия В нижеприведенной Таблице 1 представлены некоторые антрациклиновые лекарственные средства (и их родовые или тривиальные названия), которые являются особенно предпочтительными для 55371 21 использования в настоящем изобретении ЄНЗ ОСН} снаон осі із СІІгОСОСІ!(ОС2]І5Й ОСНз an он СІ ПО! І CtilOI! С112ОН ОСМі ОСІ Із ОСІІЗ ОСІІЗ ІІ2ІЗСНЗ £4 NH2 NH2 МН2 NH2 NH2 NH2 NH2 NH2 NHC0CF3 S5 ОН ОН ОН ОН ОН ОН Н ОТН ОН Ей " ні н її' н а) алмврнатквныч гааванаем поукоруйидана. Из соединений, представленных в Таблице 1, наиболее предпочтительным лекарственным средством является доксорубицин Доксорубицин (обозначаемый также "DOX") представляет собой антрациклин формулы (10), где R1 является СН2ОН, R3 является -ОСН 3 , R4 является -NH 2 , R5 является -ОН, a R6 является -Н Олигопептиды, пептидные субъединицы и производные пептидов (также называемые пептидами) настоящего изобретения могут быть синтезированы из составляющих их аминокислот методом стандартного пептидного синтеза, предпочтительно методом твердофазного синтеза Затем пептиды очищают с помощью обращенно-фазовой высокоразрешающей жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) Стандартные методы пептидного синтеза описаны, например, в следующих работах Schroeder et al , "The Peptides", Vol 1, Academic Press 1965, Bodansky et al , "Peptide Synthesis", Interscience Publishers, 1966, McOmie (ed ) "Protective Groups in Organic Chemystry", Plenum Press, 1973, Barany et al , "The Peptides Analysis, Synthesis, Biology" 2, Chapter 1, Academic Press, и Stewart et al , "Solid Phase Peptide Syntetic", Second Edition, Pierce Chemical Company, 1984 Содержание этих работ вводится в настоящее описание посредством ссылки Конъюгаты настоящего изобретения, содержащие олигопептид, имеющий сайт PSAрасщеплення и цитотоксический агент, могут быть аналогичным образом синтезированы методами, хорошо известными специалистам по клинической биохимии Так, например, свободная аминовая часть на цитотоксическом агенте может быть ковалентне присоединена к олигопептиду у карбоксильного конца, в результате чего образуется амид Аналогичным образом, амидная связь может быть образована путем ковалентного связывания амино-группы олигопептида с карбоксильной группой цитотоксического агента Для этих целей может быть использован такой реагент, как комбинация гексафторофосфата 2-(1 Нбензотриазол-1-ил)-1,3,3-тетраметилурония (известного как HBTU) и гидрата 1гидроксибензотриазола (известного как НОВТ), дициклогексилкарбодиимида (DCC), г\1-этил-1\1-(3диметиламинопропил)-карбодиимида (EDO), дифенилфосфорилазида (DPPA), гексафторофос 22 фата бензотриазол-1 -ил-окси-трис(диметиламино)фосфония (ВОР), и т п Кроме того, конъюгат настоящего изобретения может быть образован посредством непептидильной связи между сайтом расщепления PSA и цитотоксическим агентом Так, например, цитотоксический агент может быть ковалентне присоединен к карбоксильному концу олигопептида посредством гидроксильной группы на цитотоксическом агенте, в результате чего образуется споживэфирная связь Для этих целей может быть использован такой реагент, как комбинация HBTU и НОВТ, комбинация ВОР и имидазола, комбинация DCC и DMAP и т п Карбоновая кислота может быть также активирована путем образования нитрофенилового эфира или т п , и подвергнута реакции в присутствии DBU (1,8-диазабицикло 5,4,0 ундек-7-ен) Конъюгат настоящего изобретения может быть также образован путем присоединения олигопептида к цитотоксическому агенту посредством линкерной единицы Такие линкерные единицы могут содержать, например, бикарбонилалкильный бирадикал, с помощью которого аминовую часть цитотоксического агента соединяют с линкерной единицей, в результате чего образуется амидная связь, а амино-конец олигопептида соединяют с другим концом линкерной единицы, в результате чего тоже образуется амидная связь Могут быть также использованы другие линкерные единицы, которые являются стабильными в условиях физиологической среды при отсутствии свободного PSA, но которые могут расщепляться после гидролиза в соответствующем сайте протеолитического расщепления под действием PSA Кроме того, могут быть использованы такие линкерные единицы, которые после PSAгидролиза в сайте протеолитического расщепления остаются связанными с цитотоксическим агентом, но при этом активность такого производного цитотоксического агента, образовавшегося после расщепления, заметно не уменьшается по сравнению с немодифицированным цитотоксическим агентом При этом очевидно, что в процессе синтеза соединений настоящего изобретения может оказаться необходимым защитить или блокировать различные реактивные функциональные группы, присутствующие в исходных соединениях или в промежуточных соединениях, и в этом случае нужную реакцию осуществляют на других частях молекулы После завершения нужных реакций, или по истечении необходимого периода времени такие группы обычно удаляют, например, путем гидролиза или гидрогенолиза Указанные стадии блокирования и деблокирования являются традиционными процедурами в органической химии Для выбора подходящих защитных групп, которые могут быть использованы при получении соединений настоящего изобретения, специалисты могут обратиться к работам Protective Groups in Organic Chemistry, McOmie, ed , Plenum Press, NY, (1973), и Protective Groups in Organic Synthesis, Green, ed , John Wiley & Sons, NY, NY (1981) Примерами подходящих амино-защитных групп могут служить С-і-Сю алканоильные группы, 24 Реакционная схэма 1 23 55371 такие как формил, ацетил, дихлорацетил, пропионил, гексаноил, 3,3-диэтилгексаноил, у-хлорбутрил и т п , Сі-Сю алкоксикарбонильные и CsС15 арилокси-карбонильные группы, такие как трет-бутоксикарбонил, бензи-локсикарбонил, аллилоксикарбонил, 4-нитробензилоксикарбонил, флуоренилметилоксикарбонил и циннамоилоксикарбонил, галоген-(Сі-Сю)-алкоксикарбонильная группа, такая как 2,2,2-трихлорэтоксикарбонил, и Сі-Сі5 арилалкилтные и алкенильные группы, такие как бензил, фенетил, аллил, тритил и т п Другими обычно используемыми аминозащитными группами являются группы в форме енаминов, полученных с помощью р-кетоэфиров, таких как метил- или этилацетоацетат Подходящими карбокси-защитными группами могут быть, например, С-і-С-ю алкильные группы, такие как метил, трет-бутил, децил, галоген-Сі-Сю алкильные группы, такие как 2,2,2-трихлорзтил и 2-йодзтил, С5-С15 арилалкильные группы, такие как бензил, 4-метоксибензил, 4-нитробензил, трифенил-метил, дифенилметил, Сі-Сю алканоилоксиметильные группы, такие как ацетоксиметил, пропионоксиметил и т п , и такие группы, как фенацил, 4-галогенфенацил, аллил, диметилаллил, три-( d-Сзалкил), силил, например, триметилсилил, р-п-толу-олсулъфонилэтил, р-п-нитрофенилтиоэтил, 2,4,6-триметилбензил, р-метилтиоэтил, фталимидометил, 2,4-динитро-фенилсульфенил, 2-нитробензгидрил и родственные группы Аналогично, подходящими гидроксизащитными группами могут быть, например, формильная группа, хлорацетильная группа, бензильная группа, бензгидрильная группа, тритильная группа, 4-нитробензил ьная группа, триметилсилилъная группа, фенацильная группа, третбутильная группа, метокейметильная группа, тетрагидропиранильная группа и т п Предпочтительный вариант получения олигопептида, конъюгированного с антрациклиновым антибиотиком дозоксорубици-ном, представлен в нижеследующих Реакционных схемах, где проиллюстрирован синтез конъюгатов настоящего изобретения СН 2 ОН он СН 3 О сн, 1 3 Реакционная схема 11 СН 3 ОН 'он •ащита 14 25 Реакционная схема 111 55371 26 Реакционная схема 1У ОН снчо о Q он сн л о 1 1 HN N 2 H о СИ сн он V Т 1 6 "H N 27 28 55371 Реакционная: схема 7 о Реакционная схема Л. о он \ снгон ''он сн. H NB, нагревание обратным ^аяозшь никои СН,0 : сн 3 = со а сн 3 вкнблаотнн 11 S о 1 ншо і анигопептиді о ?н Реакционная схема 71 Реакционная схема VI иллюстрирует получение конъюгатов олигопептидов настоящего изобретения с винкаалкалоидным цитотоксическим агентом винбластином Показано присоединение N-конца олигопептида с винбластином (S Р Капd u k u n e t a l . J Med Chem E8 1079-1088(1985)) Однако, можно ожидать, что конъюгирование олигопептида в других положениях и функциональных группах винбластина и в С-конце олигопептида также приведет к получению соединений, которые могут быть использованы для лечения рака предстательной железы Кроме того, следует отметить, что могут быть также получены конъюгаты, где N-конец олигопептида настоящего изобретения ковалентне связан с одним цитотоксическим агентом, таким как винбластин, а С-конец этого олигопептида одновременно связан с другим цитотоксическим агентом, который может быть тоже винбластином, или другим цитотоксическим агентом, таким как доксорубицин Такой полицитотоксический конъюгат может обладать большими преимуществами, чем конъюгат, содержащий лишь один цитотоксический агент . H3N 2. Ас2О,пирЩИН ""CH2CH3 он СНдО '3 ; CON, -"СН г СН э сн э о ОСОСНз 13 о 1 II CONH -олигопеиид-С-Шг Конъюгат "олигопептид-цитотоксический агент" настоящего изобретения, в котором цитотоксическим агентом является предпочтительный цитотоксический агент дозоксорубицин, может быть представлен общей формулой 29 ЗО 55371 HgN-AsriLysIleSerTyrGlnSer-C (SEQ. ID. No: 13) 0 H^N-AsnLysUeSerTyrSlnSerSer-C CE ID. No; 16) SQ H2N-AsnLysrieSerTyr61nSerSerSer-C- олигопептид-R где "олигопептид" представляет собой олигопептид, который специфически распознается свободным простатическим антигеном (PSA), и который может быть протеолитически расщеплен под действием ферментативной активности свободного простатического антигена, Х_ отсутствует или представляет собой амино| кислоту, выбранную из a) фенилаланина, b) лейцина, c) вал и на, d) изолейцина, e) (2-нафтил)аланина, f) дифенилаланина, д) норвалина и п) норлейцина, R представляет собой водород или -(C=O)R1, и R1 представляет собой Сі-Сє-алкил или арил В предпочтительном варианте конъюгата "олигопептид-цитотоксический агент" "олигопептид" представляет собой олигомер, который имеет аминокислотную последовательность, выбранную из a) Asnl_yslleSerTyrGln|Ser(SEQ I N 13) D o b) LyslleSerTyrGIn | Ser (SEQ I N 14) D o c) QlyGluAsnGlyValQInLysAspValSerQInXaaSerlleTyrlSerGlnThrGlu ( E ID SQ N 15) o d) GlyLysGlyleSerSerGlnTyr|SerAsnThrGluGluArgl_eu (SEQ I N 2) D o e) AsnLyslleSerTyrTyr|Ser(SEQ I N 127) D o f)Asnl_ysAlaSerTyrGln|Ser(SEQ I N 128) D o g) SerTyrGIn | SerSer (SEQ I N 129) D o h)hArgTyrGln|SerSer(SEQ I N 141) D o где Хаа является любой натуральной аминокислотой, Xi отсутствует или является аминокислотой, выбранной из a) лейцина, b) изолейцина, c) норлейцина и d) валина, и R представляет собой ацетил, пивалоил или бензоил Конкретными примерами конъюгата "олигопептид-цитотоксический агент" настоящего изобретения являются нижеследующие соединения о он о сн э о где X представляет собой ( E ID. No. 1?) SQ HiN-AsnLysIleSerTyrGlnSerSerSerThr-l (SEQ. ID. No: 10) 0 H2«-AsnLysIleSerTyr61nSerSerS&rThrSlu-C ( E I No: 3) SQ D 0 H2N-AlaAsnL/5lleSerTyrGlnSerSerSerThr31u-0ll) {E ID. NSQ o 0 AcHN~AlaAsnLysIleSerTyrGlnSer3erSerThr-C- (.581. ID No: 117) 0 kdm—AlaAsnLysIleSerlyreinSerSerSerThrLea-C- (SEQ. ID.No. 70) 0 II 4сШ—AlaAsnLysAlaSerTyrSlnSerftlaSerThrLeu-C (SEQ ID Ho. 118) 0 I! AcHff—AlaAsnLysAlaSerTyrGlnSerAlaSerLeu-C0 (SEQ.ID.No:119) AcHN—AlaAsriLysAlaSerTyrGlnSerSerSerLeu-C ?SEQ. ID.No: 120) ftcHN—AlaAsnlysAlaSsrTyr61nSerSerLeu-C- (SEQ ID No-121) 0 If AcHN—SerTyrfalnSerSerSerLeu-C (SEQ. ID. No; 144) 0 AcHN—hArgTyrGlnSerSerSerLeu-C (SEQ ID. No: 145) 0 АсШ—lysTyrGlfiSterSerSerLeu-C (SEQ. ID.No: 124) ШИ Е 0 AcHN—LystyrGlnSerSerNle-C (SEQ ID.Ho.146) Как хорошо известно специалистам, и как очевидно из настоящего изобретения, пептидиловые терапевтические агенты, такие как конъюгаты "олигопептид-цитотоксический агент" настоящего изобретения предпочтительно имеют концевые амино-группы любого олигопептидного заместителя, которые защищены соответствующей защитной группой, такой как ацетил, бензоил, пивалоил и т п Такая защита концевых амино-групп снижает или устраняет возможность ферментативной деградации указанных пептидиловых терапевтических агентов под действием экзогенных аминопептидаз, присутствующих в плазме крови теплокровных животных В соответствии с настоящим изобретением, конъюгаты олигопептида и цитотоксического агента вводят пациенту в виде фармацевтической композиции, содержащей конъюгат Формулы (1) и фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель или разбавитель Используемый в настоящем описании термин "фармацевтически приемлемый" относится к тем агентам, которые могут быть использованы при лечении или диагностики 55371 32 31 теплокровных животных, например, человека, лозуя опубликованную последовательность семеношади, свиньи, коровы, мыши, собаки, кошки или гелина 1 (Lilja, H , Abrahamsson, P А , Lundwall, A , других млекопитающих, а также птиц или других (1989)), Biol Chem 264, 1894 - 1900) (рис 1), мы теплокровных животных При этом, предпочтисконструировали PCR-праймеры (PCRтельным является парентеральный способ введеполимеразная цепная реакция) для клонирования ния, а в частности, внутривенное, внутримышечкДНК семеногелина из коммерчески доступной ное, подкожное, внутрибрюшинное или кДНК-библиотеки, кодирующей белки представнутрилимфатическое введение Указанные претельной железы (Clonetech, Palo Alto, CA) Очипараты могут быть получены с использованием щенную кДНК семеногелина встраивали в бактеносителей, разбавителей или наполнителей, коториальный экспрессирующий вектор рТАС рые обычно используются в этих целях В этой (Lmemeyer, D L , Kelh, I J , Mmke, J G , Gimenezсвязи, см , например, Remington's Pharmaceutical Gallego, G, DeSalvo, J & Thomas, K A , (1987) Sciences, 16th ed , 1980, Mack Publishing Company, Bio/Technology 5, 960 - 965) кДНК семеногелина edited by Osol et al Эти композиции могут вклюконструировали таким образом, что эпитоп тубучать в себя белки, например, сывороточные беллина находился у карбоксильного конца белка ки, такие как альбумин сыворотки человека, буфесеменогелина Семеногелин, экспрессированный ры или забуферивающие соединения, такие как с помощью бактериального вектора, очищали на фосфаты, другие соли или электролиты и т п колонке с антителом против тубулина Очищенный Подходящими разбавителями являются, наприбелок семеногелин 1 смешивали с простатичемер, стерильная вода, изотонический раствор, ским антигеном (PSA) (изготовленным промышводный раствор декстрозы, многоатомный спирт ленным путем (York Biologicals International, Stony или смеси таких спиртов, например, глицерин, Brook, NY)), в молярном отношении 100 /1 (семепропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т п Уканогелин 1/PSA) в 12мМ Трис, рН 8,0, 25мМ NaCI, занные композиции могут содержать консерванты, 0,5мМ СаСЬ, а затем инкубировали в течение такие как фенетиловый спирт, метил- и пропилпаразличных промежутков времени Гидролизат рабены, тимеросал и т п Если необходимо, то в фракционировали с помощью электрофореза в композицию может быть включено от около 0,05 полиакриламидном геле и переносили путем элекдо около 0,20% масс, антиоксиданта, такого как трофореза на фильтровальную бумагу Pro-Blott метасульфит натрия или бисульфит натрия (Applied Biosystems, Inc , Foster City, CA ) в буфере CAPs (Matsudaira, P, (1987) J Biol Chem 252, Композицию для внутривенного введения из10035 - 10038) Фильтровальную бумагу ProBlott готавливают предпочтительно так, чтобы количеокрашивали кумасси синим для идентификации ство вводимого пациенту конъюгата составляло от новых PSA-продуцированных фрагментов семенооколо 0,01 до около 1г Предпочтительное количегелина 1 Новые фрагменты вырезали из фильтра ство вводимого конъюгата составляет в пределах скальпелем и определяли их последовательности от около 0,2 до около 1г Конъюгаты настоящего После идентификации протеолитических фрагизобретения могут быть эффективными в широментов посредством гидролиза в различные пеком диапазоне доз в зависимости от таких факториоды времени проводили реакцию гидролиза в ров, как тяжесть заболевания, на которое направтечение 10 минут Затем определяли относительлено лечение, модифицируемый биологический ную аффинность PSA для 5 потенциальных сайэффект, который желательно достигнуть, способ тов расщепления в последовательности семеновведения конъюгата, возраст, вес и состояние гелина 1, а именно сайт 349/350 > сайт 375/376 > пациента, а также другие факторы, которые должсайт 289/290 > сайт 315/316 > сайт 159/160 Отноны быть учтены лечащим врачом Таким образом, сительные аффинности были получены исходя из количество конъюгата, необходимое для введения интенсивности окраски кумасси синим каждого данному пациенту, должно быть определено инPSA-продуцированного пептидного фрагмента дивидуально для каждого пациента Эти интенсивности имели приблизительные отношения 3 1 0,6 0,3 При этом следует отметить, что хотя в примерах, приведенных ниже, описаны конкретные реагенты и реакционные условия, однако, очевидно, Пример 2 что существо и объем настоящего изобретения Получение олигопептидов, содержащих сайт также охватывают и различные их модификации PSA-опосредованного расщепления Поэтому нижеследующие процедуры и примеры Олигопептиды получали путем твердофазного носят лишь иллюстративный характер и не должсинтеза, где введение аминокислот осуществляли ны рассматриваться как некое ограничение изопо схеме двойного присоединения на автоматичебретения ском пептидном синтезаторе Applied Biosy-stems модели 430А Деблокирование и отделение олигоПРИМЕРЫ пептида от полимерного носителя осуществляли Пример 1 путем обработки жидкой фтористоводородной Идентификация сайта PSA-опосредованного кислотой Олигопептиды очищали с помощью расщепления семеногедина препаративной жидкостной хроматографии высоРазжижение семенного геля соответствует кого давления на обращенно-фазовой колонке с протеолитической фрагментации семеногелина двуокисью кремния С18 с использованием гради(Lilja, Н, Lauren, С В , (1984) Scand J Clm Clab ента водной 0,1% трифторуксусной кислоInvest 44, 447 - 452) Полагают, что протеолитичеты/ацетонитрила Идентичность и гомогенность ская фрагментация обусловлена, главным обраолигопептидов были подтверждены с помощью зом, активностью простатического антигена (Lilja, анализа аминокислотного состава жидкостной Н , (1985) J Clm Invest 76, 1899 - 1903) Исполь 33 55371 хроматографией высокого давления и массспектрометрического анализа путем бомбардировки быстрыми атомами Олигопептиды, полученные этим методом, представлены на фиг 2 Пример 3 Оценка распознавания олигопептидов свободным PSA Олигопептиды, полученные как описано в Примере 2, отдельно растворяли в буфере для PSA-гидролиза (12мМ трис (гидроксиметил)аминометан, рН 8,025мМ NaCI, 0,5мМ CaCI2) и полученный раствор добавляли к PSA в молярном отношении 100 1 Реакцию прекращали через различные промежутки времени путем добавления трифторуксусной кислоты (TFA) до конечного объема 1% (объем / объем) Погашенную реакцию анализировали с помощью ЖХВД на обращенно-фазовой колонке С18 с использованием градиента 0,1% TFA / ацетонитрила Результаты оценки представлены на фиг 2 Другие олигопептиды, полученные, как описано в Примере 2, были проанализированы тем же способом, за исключением того, что реакцию гасили через 4 часа Результаты оценки показаны на фигЗ Удаление аспарагинового остатка из амино-конца олигопептида приводит к значительному ослаблению PSAопосредованного гидролиза пептида, а присутствие остатка глутаминовой кислоты в карбоксильном конце пептида, очевидно, не играет решающей роли в распознавании простатическим антигеном Пример 4 Получение нерасщепляемых конъюгатов одигопептида и доксорубицина Производные доксорубицина, показанные в Таблице 3, были получены в соответствии со следующей общей реакцией К смеси доксорубицина (Sigma) и соответствующего пептида (полученного путем твердофазного синтеза или закупленного в готовом виде (Sigma)) в ДМСО добавляли HBTS и НОВТ вместе с диизопропилэтиламином и реакционную смесь размешивали в течение ночи Затем неочищенную реакционную смесь очищали с помощью препаративной ВЭЖХ на обращенно-фазовой колонке с С18, используя градиент 0,1% трифторуксусной кислоты (TFA) в ацетонитриле / 0,1% TFA в воде о он о СН,0 сн он о Соединения 12а А1а-Н R MS (исходный ион) 615 657 799,5 12Ь 12с Ala-N-Ac Ala-Ala-Ala-N~Ac Ш Ala-Ser-Ala-Gly-Thr-!=ro-61y-Ala-H-Ac 1199 (SEQ.ID to 1£) Пример 5 In vitro-анадиз цитотоксичности пептидиловых 34 производных доксорубицина Цитотоксичности нерасщепляемых конъюгатов олигопептида и доксорубицина (полученных, как описано в Примере 4) против линии клеток, которые, как известно, подвергаются цитолизу под действием немодифицированного доксорубицина, оценивали посредством анализа с использованием аламарового синего Для этого клеточные культуры клеток опухоли предстательной железы LNCaP, которые представляют собой метастатические клетки аденокарциомы предстательной железы, выделенные из пункцион-ной биопсии лимфатического узла (LNCaP FGC Американская коллекция типовых культур, АТСС CRL 1740), или клеток DuPRO в 96-луночных планшетах разводили средой, содержащей различные концентрации данного конъюгата (конечный объем лунки планшета составляет 200мкл) Затем клетки инкубировали в течение 3 дней при 37°С, после чего в лунку добавляли 20мкл аламарового синего После этого клетки снова инкубировали и аналитические планшеты прочитывали на ELISA-ридере EI-310 при двух длинах волн 570 и бООнм через 4 и 7 часов после добавления аламарового синего Затем вычисляли относительный процент жизнеспособности клеток при различных концентрациях испытуемых конъюгатов по сравнению с контрольными культурами (в отсутствие конъюгата) Оценивали также цитотоксичности немодифицированного дозоксорубицина и немодифицированного олигопептида На фигЗ представлены данные цитотоксичности' для характерного соединения (Соединения 12d) Пример 6 Оценка ферментативной активности простатического антигена, происходящего из клеток LNCaP Ферментативная активность была продемонстрирована путем инкубирования кондиционированной клетками LNCaP бессывороточной среды (примерно 200-кратно концентрированной) с рекомбинантным белком семеногелином 1 Затем приблизительно 0,5мкг иммунореактивного PSA в концентрированной кондиционированной среде (определенной с помощью ELISA HYBPIDTECH (Tandem E)) смешивали приблизительно с Змкг рекомбинантного семеногелина 1 и инкубировали в течение 4 часов при 37°С По окончании инкубирования гидролизованную смесь анализировали с помощью Вестерн-блот-анализа Результаты показали, что очищенный PSA из спермы и PSA из LNCaP-кондиционированной среды давали идентичные протеолитические карты рекомбинант-ного белка семеногелина 1 Таким образом клетки LNCaP продуцируют ферментативне активный PSA Клетки LNCaP являются он-когенными у "голых" (бестимусных) мышей и продуцируют детектируемые уровни циркулирующего PSA Пример 7 Получение расщепляемых конъюгатов олигопептида-доксорубицина Производные доксорубицина, в которых олигопептид, протеолитически расщепляемый свободным PSA, ковалентне связан с амином углеводной части доксорубицина, были получены в соответствии со следующей общей реакцией к 35 смеси дозоксорубицина (Sigma) и соответствующего пептида (полученного путем твердофазного синтеза, как описано в Примере 2) в ДМСО добавляли HBTS и НОВТ вместе с диизопропилэтиламином и реакционную смесь перемешивали в течение ночи Неочищенную реакционную смесь очищали с помощью препаративной ВЭЖХ на обращенно-фазовой колонке с С-18, используя градиент 0,1% трифторуксусной кислоты (TFA) в ацетонитриле / 0,1% TFA в воде В случае если на пептиде присутствовали реакционноспособные амино-группы, то эти функциональные группы обычно блокировали флуоренилметилоксикарбонильной защитной группой, которую затем удаляли путем обработки вторичным амином, таким как пиперидин и т п , а затем конъюгировали с доксорубицином Конъюгаты настоящего изобретения имеют структуру общей формулы Off 0 и могут быть обозначены как "Ас-пептид-DOX (З1)" Конъюгаты, полученные этим способом представлены на фиг 5 в Таблице 5 Пример 8 Оценка распознавания конъюгатов "олигопептид-доксорубицин" свободным PSA Конъюгаты, полученные как описано в Примере 7, отдельно растворяли в буфере для PSAгидролиза (12мМ трис(гидроксиметил)аминометан, рН 8,0, 0,25мМ NaCI, 0,5мМ CaCIo), и полученный раствор добавляли к PSA в молярном отношении 100 1 Реакцию гасили через различные промежутки времени путем добавления трифторуксусной кислоты (TFA) до конечной концентрации 1% (объем / объем) После гашения реакции реакционную смесь анализировали с помощью ВЭЖХ на обращенно-фазовой колонке с С-18 с использованием градиента водной 0,1% TFA / ацетонитрила Результаты оценки показаны на фиг 5 в Таблице 5 Пример 9 Оценка расщепления конъюгатов "одигопептид-доксорубицин" в кондиционированной клетками среде Кондиционированные клетками бессывороточные среды МЕМа (не содержащие фенолового красного) собирали через 3 дня после их добав 55371 36 ления либо к клеточной линии LNCaP, либо к клеточной линии Dupro (полученных, как описано в J Urology, 146 915 - 919 (1991)) Эти среды 20кратно концентрировали с использованием концентратора Amicon® Centnprer™ с молекулярномассовой отсечкой 10000 LNCaPкондиционированная среда содержала свободный PSA-белок в средней концентрации приблизительно 100нг/мл, как было определено с помощью набора для иммунодетекции Tandem®-E PSA (Hybntech®) При этом в кондиционированной клетками Dupro среде свободного простатического антигена обнаружено не было ЮОмкл-порции концентрированной кондиционированной среды смешивали с 35мкг конъюгата олигопептида-доксорубицина, полученного как описано в Примере 7, и смесь инкубировали при 37°С в течение периодов времени 0,4 и 24 часа Затем реакции прекращали путем добавления ZnCb (до конечной концентрации 0,01 М) и анализировали с помощью ВЭЖХ на обращеннофазовой колонке с CD18 и с использованием градиента водной 1% TFA / ацетонитрила в целях определения процента гидролизованного конъюгата пептида-цитотоксического агента Результаты оценки представлены на фиг 6 в Таблице 6 Пример 10 In vitro-анализ цитотоксичности пептидидовых производных доксорубицина Цитотоксичность расщепляемых конъюгатов олигопептида-доксорубицина (полученных как описано в Примере 7) против линии клеток, которые, как известно, подвержены цитолизу под действием немодифицированного доксорубицина, оценивали с помощью анализа с использованием аламарового синего, как описано в Примере 5 Для этого клеточные культуры опухолевых клеток предстательной железы LNCaP или клеток Dupro в 96-луночных планшетах разводили средой, содержащей различные концентрации данного конъюгата (конечный объем лунки планшета составлял 200мкл) Затем клетки инкубировали в течение 3 дней при 37°С, и в аналитическую лунку добавляли 20мкл аламарового синего После этого клетки снова инкубировали и аналитические планшеты прочитывали на ELISA-ридере EL-310 при двух длинах волн 570 и бООнм через 4 и 7 часов после добавления аламарового синего Затем вычисляли относительный процент жизнеспособности клеток при различных концентрациях испытуемых конъюгатов по сравнению с контрольными культурами (в отсутствие конъюгата) В этом же самом анализе оценивали также цитотоксичность конъюгатов по сравнению с цитотоксич-ностью немодифицированного доксорубицина и немодифицированного олигопептида Результаты анализа представлены на фиг 7 в Таблице 7 37 55371 38 CUKGCK пошшдешатеяьносгвй S Q I K E LISTING E ES C Общая гнформащя:, (1) G N R L 2 F R A I K E E A K O H TO : Заявитель: (і) APPLICANT: DeFeo-Jones, Deborah Fang, Dong-Мед. Garsky, Victor M. Jones, Rayroond E. oliff, Allen I, Название яз обретения: новые ЇЇІЮТШ (її) TITLE OF INVENTION; HOVEL PEPTIDES { Ш Ї NUMBER OF SE0U2HCES: І46 Чнедо последовательное?»!: 146 (IV) C R E P N E C A D E S O R SO D N E D R S : У Д С І Т Ї : НАНИаї Штат !D) STATE: HEN JERSEY ,{E) COUNTRY: U.S.A. (Г) Z » , 07065 ю ( v , e t m (Al (В) EC) (D) m R E A D A B L E ш HSDIXJM TYPE: Floppy d i s k І ^ Д HOOlfeJEH: ГИбЯИЙ ДЯСК COHPOTER: IBM PC compatible КОМЯЬЮЇврї PG COBIKCfUMt С Ш OfERATIRG SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS ОПбрЩЩОНІШЯ а РС{)0 SOFTWARE: P a t a n c l n IReiease # 1 . 0 , Version #1ЛЄ П в а Программное бобвопвчваав: (vi) C0RRENT AP?LJCATIOK DATA: ЙЩНЫв Н&СТОЯЩвй (AJ APPLICATION NUiffiEE: НвЬИр ЗЯЯВКИ! (В) FILING DATS: Д а ї а ЙОДОЖ • і о CLASSIFICATION: КяасснфакацаяЇ АТТОКНЕЇ/AGENT 1ЫРШКАТЮИ: Д (A) NAME: Muthard, David А.ЙМЯ, фаМИЛКЯ ї JB) REGISTRATION SOMBER: 35,297 РвПСТрВЩОШШ^к SO H F R H E D C F N M E : EE E C / O K? U BR Н НШвр:35297 / 1 d x ) TELECOMMUNICATION INFORMATICS Т в Л в р Ю (A) TELEPHONE: ^08)594-3903 ТвЛвФОН:чЭуо|ЬУ4ЗжЗа (в) T E L E F M : {908)554-4720 Телефакс: (908)594-4720 (2) INFORMATION FOR SEQ I D NO;i: Данные я а о л в ю в а т в д ь н о с т а : $Щ (и SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) (Б) (о (D) IJ.I) tin) LENGTHT 462 amiEG ac^ds М И Н а : 4 6 2 аМИЕОККСЯОТЫ TYPE: ammo a c i d ТИПЇ ШИШОКИСЯОТНаЯ sTRANDEiaffiss: s i n g l e TOPOLOGY: l i n e a r MOLECULE TYPE: peptidefjm молекулы: I'D в і ю с я в д о в а т е і Ш 9 О т и : Щвзхшршстш пвшгад HYPOTHETICAL; H ГиПОТвІЯЧНОСТЬ! НвТ O AKTI-SSKSE: ш А н т и с м ы с л о в а я : нет (v) FRAGMENT TYPE: internal Т И Н їв м а s ТЕЖ! ШаШОВЯ ДецоЧвЧВОСЇЬї Т MOLECCLE TYPE; peptide HYPOTHETICAL: N O _ iv) мггі-SENSE- яо ІІЙІОТ8ЯКЧНООТЬЇ НвТ Айгисшоловаяг нет (v) FRAGMENT TYPE: internal : (Х1Ї SEQUENCE DESCRIPTION: ТіИ О т с а к г е п о с л е д о в а т е л ь н о с т а £EQ I D И З : SEQ ID H 0 : 1 2 : Ala S e r A l a G l y T h r Р т а O l y A l a 1 5 (25 INFORMATION FOR SEQ ID N0=13: (i) SEOUENCE CHARACTSEISTICS: (к) LENGTH: 7 ammo acids (B) TYPE: азпіпо acid (C) STRANSEDKSSS: smgie (D) TOPOLOGV: l i n e a r ДЗЕНЫв П©СЛвДОВаТЄДЬН0СТВ JBQ ID JKSt Шр8ЖЇЇ9Ш0ТШШ ПОСДвДОВаТвЛЬНООТИї Д а ш а ? V аМНШОКИСДОТ ТНЯТ вШШвИСЛОТНаЯ ЦвПОЧвЧЯООТЬt 0ДЮЦ9ШЧвЧНаЯ Тодолошя: й ( ї ї ) HOLEC0LE TYPE- peptide ( i l l ) HYPOTHETICAL. N O Ї Ш І ШіЯЄЯуЛаї Д6ШВД ' ( 1 V ) ANTI-SENSE: s o . TmiQTStИЧЙОСТЬt НвТ Лнтисшояоваяі нэт (V) РЕШЗМЕЫТ TYPE: i t i t e r n a l . Описание Еослвдоватвдьностй Ж і ID M S (XI) SEQX^KCE DESCRIPTION; SEQ ID N0:13: Asn Lys lie Ser Tyr Gin Ser і 5 :