Біополімер з тканин молюсків, спосіб його виділення та біологічні властивості

1 Бюполімер з тканин молюсків, який містить азотистий компонент, який відрізняється тим, що бюполімер характеризується масовою часткою (в % на суху речовину) вуглеводів - 58,0-59,0, мінеральних речовин - 2,1-2,9, азотистих речовин 5,1-5,5, ЛІПІДІВ - 0,3-1,1, та має біологічну активність антиоксидантну, цукрознижувальну, гепатопротекторнутатиреотропну 2 Спосіб виділення бюполімеру, що включає ферментативний гідроліз сировини, очищення та концентрування гідролізату, який відрізняється тим, що як вихідну сировину використовують тканини молюсків - мідії, рапани та ампулярм, гідроліз здійснюють з використанням амілолітичнихта протеолітичних ферментів, концентруванням пдролізаторів до 34,0-36,0 % вмісту сухих речовин, а виділення бюполімеру - спиртоосадженням за природними значеннями рН 6,4-6,6 та кінцевої концентрації спирту в суміші, що обстежується, 73,0-75,0% Винахід відноситься до біотехнологм та може бути використано для одержання препаратів, в т ч бюдобавок лікувального та профілактичного призначення з тканин молюсків, наприклад, МІДІЙ, рапани та ампулярм Відомо спосіб вилучення та обробки мукополісахаридів (або глікозамшогліканів - за новою класифікацією), глікопротешів (Гп) та супутніх речовин [2] з тканин та органів тварин або людини, бактеріальних клітин, рослин (в т ч морських водоростей) або рідин біологічного походження (наприклад, молочної сироватки) Спосіб передбачає подрібнення об'єкта, що досліджується, та обробку його в буферному водному рідкому середовищі при рН 7,5-9,5, температурі 15-80°С протягом 1-12 годин з подальшим автоклавуванням при температурі 100-110°С протягом 0,5-3 годин, сепарацією, фільтрацією та, за необхідності, концентрацією екстрактів Для екстракції використовують буферний розчин дезоксихолату-натрію або трис (пдроксиметил) аміноетану або N-трис (пдроксиметил) гліцидин Одержані екстракти придатні для ліофільного сушіння, а також для подальшого виділення з них глікозамшогліканів та Гп Недолік способу полягає в застосуванні для екстракції речовин, що не допускаються до використання в харчових виробництвах [3] Зазначений спосіб можливо віднести до аналогу способу, що заявляється Найбільш близьким до способу, що заявляється, можливо віднести препарат з тканин морських гідробіонтів "Орбітар" та спосіб його одержання [1] Препарат являє собою білковий гідролізат з тканин молюсків, одержаний шляхом кислотного гідролізу подрібненої сировини при 100-110°С протягом 15-24 годин, нейтралізацією гідролізату до рН 4,5-6,0 та подальшою обробкою його не модульованим фізичним полем протягом 1-30 хв Одержаний препарат містить 25-30% сухих речовин, рН 4,5-6,0 та 0,8-1,0 % азоту аміногруп Недолік способу полягає в жорстких умовах кислотного гідролізу (100-110°С, 15-24 год), практично знешкоджуючих вуглеводний компонент, властивий молюскам і, який більшою мірою визначає біологічну активність препарату з молюсків Для нас найбільший інтерес представляють нативні сполуки білкових комплексів глікозамшогліканів та Гп, що легко дисоціюють, які входять у склад багатофункціональних бюмолекул і склада О ю о (О 60504 ють предмет винаходу В основу винаходу покладено такі завдання - поширити спектр об'єктів, що використовуються для виділення білкових комплексів глікозаміногліканів та глікопротешів (далі по тексту - бюполімерів БП), - забезпечити умови для виділення БП, що дозволяють зберегти їх специфічну біологічну активність, - скоротити тривалість процесу гідролізу, знизивши при цьому витрати електроенергії та реактивів Покладені завдання досягаються тим, що заявлений БП відрізняється специфічністю складу та містить вуглеводний компонент, азотисті та мінеральні речовини, а також ЛІПІДИ В визначених процентних співвідношеннях, він має специфічну біологічну активність, а спосіб одержання здійснюють таким чином, що як вихідну сировину використовують тканини молюсків - мідії, рапани, ампулярм, які піддають специфічному м'якому короткотривалому ферментативному гідролізу з подальшим спиртоосадженням БП з гідролізатів з 34-36% вмістом сухих речовин та їх ліофільним сушінням Суттєві ВІДМІТНІ ознаки винаходу, що заявляється, полягають в - використанні тканин мідії, рапани та ампулярм як джерела одержання БП, - способі та умовах гідролізу сировини, - особливостях умов виділення БП, - складі виділеного БП, - специфічній біологічній активності БП Істотність умов виділення БП, що заявляється, обґрунтовується нижченаведеними прикладами Приклад 1-26 Подрібнені молюски піддають ступінчатому гідролізу під впливом амілолітичних ферментів (аамілаз) при гідромодулі 1 2, t 59-60°C, рН 5,4-5,6 протягом 40 хв , потім під впливом протеолітичних ферментів (протосубтиліну нейтрального) при 5557°С, природних значеннях рН протягом ще 40 хв , одержаний гідролізат очищують центрифугуванням (2000 об/хв, 10 хв), концентрують до вмісту сухих речовин (СР) - 10,0-20,0-30, 40, 50, 60 та 65% Кожний з одержаних гідролізатів поділяють на 4 аліквотні частини, до кожної з яких додають при перемішуванні етиловий спирт у співвідношенні гідролізат спирт - 1 1 , 1 1,5, 1 2,0, 1 3,0 Суміш витримують при кімнатній температурі та перемішуванні протягом 1 години, потім на холоді не менше 2 годин, після чого водно-спиртову суміш зливають декантацією Масу, що залишилася, збезводнюють центрифугуванням, одержаний осад БП знов розчиняють у невеликій КІЛЬКОСТІ води та знов пересаджують за вказаними вище умовами та спрямовують на ліофільне сушіння Результати прикладів наведено в таблицях 1 та 2 З даних табл 1, 2 виходить, що максимальна маса БП, вилученого з гідролізатів з різноманітним вмістом СР, змінюється в межах (70,1-74,7)% та забезпечується (71,4-75,6)% концентрацією спирту в суміші гідролізат спирт (приклади 4, 8, 11, 12, 15, 16, 18, 19, 22, 23, 24) Зданих цих же табл 1 та 2 виходить, що визначальним моментом в процесі вилучення БП є не співвідношення гідролізат спирт (1 1, 1 1,5, 1 2, 1 3), а концентрація спирту в суміші гідролізат спирт Наприклад, при значній обводнюваності вихідного гідролізату необхідна концентрація спирту (>70%) досягається в суміші при співвідношенні 1 3 (приклади 4, 8, 12), в міру того, як збільшується вміст СР в вихідному гідролізаті, ця ж концентрація спирту в суміші досягається співвідношенням гідролізат спирт- 1 2 (приклади 11, 15, 19 та ін ) і навіть 1,0 1,5 (приклади 18, 22, 25) Оптимальною концентрацією спирту в суміші гідролізат спирт, що забезпечує максимальне вилучення БП, прийнято концентрацію спирту (73,0-75,0) % Збільшення концентрації спирту в суміші > 75,0 % не є доцільним, тому що практично не впливає на масу комплексу, що виділяється, зменшення концентрації спирту «« 56,6 19,8 зо 35,6 -52,6 21,3 40,2 зз -57,6 25,9 4 19. 443 25,6 зі 48,9 ЗО, 34^-74,6 33,7 5 40,0_726 2 9 25,3 -45'5-73,5 28,9 з5 50,5 31,86 8 60504 Оптимальним прийнято варіант з природними значеннями активної реакції середовища рН 6,46,6 Зміна рН, як в кисле (приклади 27, ЗО, 33), а також в слабко-лужне середовище (приклади 29, 31, 35) не дозволяє збільшити масу бюполімеру, що виділяється Таким чином, наведені приклади 1-35, свідчать про те, що оптимальні умови виділення бюполімеру з тканин молюсків передбачають гідроліз останніх з використанням амілолітичних (при t 5960°С, т-40 хв , рН 5,4-5,6) та протеолітичних (при t 55-57°С, т-40 хв ) ферментів, очищення одержаних гідролізатів центрифугуванням (2000 об/хв), концентрування їх до (34,0-36,0)% вмісту СР та виділення БП з гідролізатів за природними значеннями рН 6,4-6,6 та (73,0-75,0)% концентрації спирту в суміші гідролізат спирт з подальшим переосадженням БП за вказаними вище умовами та його ліофільним сушінням Таблиця 4 Дані про ХІМІЧНИЙ С ;клад біополі мерів з тканини молюсків Масова ХІМІЧНИЙ склад, % на абсолютно суху речовину частка Моносахаридний склад Об'єкт Азот Мінер БП %від дослідження маси СР Уронові Гексозазагаль- речови- ЛІПІДИ Сіалові 2 2| гексози ' Пентози ний ни к-ти 11 міни1'2) к-ти 2 ' сировини 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Бюполімер з тканини -МІДІЇ 40,0±2,0 18,4±0,6 12,3±0,3 13,6±0,3 9,5±0,2 5,2±0,2 5,1±0,4 2,9±0,3 1,1±0,4 -рапани 27,0±1,7 17 7±0,5 13,1±0,4 12,5±0,2 9,7±0,2 4,9±0,3 5,5±0,2 5,0±0,5 0,3±0,1 -ампулярм 29,3±1,5 17,9±0,5 12,9±0,3 13,1±0,3 9,4±0,2 5,1±0,3 5,4±0,2 4,7±0,5 0,3±0,2 - обов'язковий компонент полімерного ланцюга глікозаміногліканів, 2| - обов'язкові компоненти олігомерного ланцюга глікопротешів В таблиці 4 наведено ХІМІЧНИЙ склад бюполіпентоз і гексозамінів - для олігомерних ланцюгів мерів, виділених з тканини МІДІЙ, рапани та ампуглікопротешів Одержані дані свідчать про те, що лярм для тканин молюсків характерна наявність БП, які З даних табл 4 видно, що вуглеводний компоявляють собою білкові комплекси глікопротешів та нент у складі БП переважає та складає в середньглікозаміногліканів, котрі є важливим компонентом ому 58,4% від маси СР Вуглеводний склад БП складного МІЖКЛІТИННОГО матриксу молюсків різноманітний в його складі ідентифіковано гексоДані з амінокислотного (АК) складу БП навези, сіалові кислоти, пентози, гексозаміни та уродено в табл 5 Наведені дані свідчать про ПОВнові кислоти Наявність останніх (гексозамінів і НОЦІННІСТЬ АК складу білкового компонента уронових кислот) характерно для полімерних ланбюполімеру цюгів глікозаміногліканів, а гексоз, сіалових кислот, Таблиця 5 Амінокислотний склад білкового (пептидного) компонента БП з тканини молюсків Назва амінокислот 1 Масова частка АК, г на 100 г натуральної речовини БП з тканини молюсків 3 МІДІЙ з рапани з ампулярм 2 3 4 Незамінні АК Лізин 1,35/7,40 ГІСТИДИН 0,34/1,87 Треонш Валін Фенілаланін Метіонін Ізолейцин Лейцин Триптофан Сумарний вміст АК Замінні АК Аргінін Аспарагінова кислота Серин Глутамшова кислота 0,83/4,58 0,61/3,34 0,63/3,46 0,43/2,35 0,47/2,57 1,14/6,29 0,37/2,03 6,17/33,89 1,45/7,98 1,89/10,42 0,87/4,77 3,29/18,10 0,92/5,12 0,45/2,50 0,94/5,21 0,93/5 15 0,75/4,17 0,34/1,91 0,77/1,30 1,58/8,80 0,31/1,74 6,99/38,80 0,87/5,06 0,44/2 56 0,78/4,54 0,84/4,89 0,69/4,02 0,45/2,62 0,69/4,01 1,28/7,45 0,39/2,27 6,43/37,44 0,99/5,50 1,77/9,80 0,92/5,11 2,83/15,70 1,27/7,39 1,70/9,90 0,80/4,66 2,95/17,18 60504 Гліцин Аланін Тирозин Пролін Цистеїн Таурин Сумарний вміст АК 10 1,26/7,04 0,97/5,31 0,62/3,40 0,98/5,37 0,25/1,10 0,15/2,67 11,68/62,12 Мінеральний склад БП, наведений в табл 6, свідчить про присутність більшості життєво важливих елементів, а також про екологічну чистоту 0,83/4,61 0,87/4,82 0,64/3,53 1,1/6,13 0,23/1,27 0,63/3,51 10,81/59,98 Продовження таблиці 5 0,83/4,83 0,85/4,95 0,61/3,55 0,97/5,65 0,18/1,05 0,58/3,38 10,74/62,54 досліджуваного комплексу — важкі метали присутні у кількостях значно менших за тих, що допускаються граничнодопустимими концентраціями Таблиця 6 Мінеральний склад бюполімерів з молюсків Масова частка мінеральних речовин на сиру речовину Макроелементи, г/кг Об'єкт досліджень Бюполімери з Са 4,80 2,13 2,00 МІДІЇ рапани ампулярм Мп 1,23 0,56 0,65 нд 0 04 0,03 0,03 рапани ампулярм Na 6,30 4,27 3,92 Fe 25 45 14,67 16,32 МІДІЇ As 2,41 2,68 2,17 Мд 0,59 0,55 0,45 К 1,95 2,31 2,03 Р 2,70 1 85 2,15 Ni 5,76 1,76 2,09 Co 0,32 0,12 0,08 Zn 9,45 5,94 4,44 Cd 0,31 0,19 0,15 Мікроелементи, мг/кг Ва 0,76 0,27 0,44 Сг 1,38 0,21 0,74 Важкі метали, мг/кг МІДІЇ рапани ампулярм РЬ 0,03 0,02 0,03 ЛІПІДНИЙ склад БП наведено в табл 7 Слід відзначити, що для ЛІПІДІВ БП з тканини рапани та ампулярм характерно високий вміст насичених жирних кислот (НЖК), а з тканини МІДІЙ поліненасичених жирних кислот (ПНЖК) Останні визначають біологічну активність ЛІПІДІВ, тому ЛІПІДИ бюполімерів з тканини мідії мають значно більшу (в 5 разів) біологічну активність, що виражена в од вітаміну F, ніж з тканини рапани та ампулярм Си 6,14 1,79 1,94 негативними значеннями окислювальновідновного потенціалу (що свідчить про антиоксидантні властивості) та величиною антиоксидантної активності, що визначається хемолюмінісцентним методом в присутності пероксидисульфіту Na, при рН 12,0, змінюється в межах 15,2-15,8 Бюполімер характеризується максимумами в області УФ-спектру поглинання при X 220, 260 нм Гель-хро мато граф ія БП на сефадексі G-50 дозволила виявити в його складі 3 комплекси з максимумом поглинання в УФ-області при X 200, 250 нм, X 220 та 250 нм, X 210, 260 нм, що свідчить про його гетерогенність Бюполімер з тканин молюсків, що заявляється, є розчинним у воді , в фізрозчині зі створенням колоїдних розчинів, він термостабільний, його водний розчин витримує температуру 95-100°С протягом 45-50 х в , є полярним, характеризується Таблиця 7 ЛІПІДНИЙ склад бюполімерів з молюсків НЖК 181 2 1,1 3 20,0 4 37,3 Масова частка, % ПНЖК 22 5 182 183 20 4 105 5 6 7 8 8,6 5,7 7,7 6,8 ра 0,3 51,5 35,1 29 0,4 0,7 0,9 41 9,0 3,9 ам 0,3 50,1 36,7 2,2 1,8 0,4 0,5 3,3 8,2 2,8 Об'єкт досліджень 1 Л І П І Д И МІДІЙ ЛІПІДИ пани 1| ЛІПІДИ пулярм Вміст ЛІПІДІВ, % наСР Біологічна активність ЛІПІДІВ (вітамін F), од/г жиру 22 6 всего 9 2,5 10 38,3 11 19,4 1) - у рапани та ампулярм в загальних ліпідах домінують (до 67%) не ЛІПІДИ 11 60504 12 Таблиця 8 Динаміка глікемії під час тесту толерантності до глюкози у щурів, які вживали БП, метформін та placebo водночас з ІН'ЄКЦІЯМИ дексаметазону (X±sx) Характер впливу 1 Інтактний контроль Дексаметазон + placebo Дексаметазон + метформін Дексаметазон + БП з МІДІЇ Доза, п/п Базальний г/кг рівень, ммоль/л 2 3 4 5 4,28±0,28 Глікемія крові (ммоль/л) через введення глюкози хв після 5 4,52±0 57 зо 60 120 5 6 7 6 93±0,44 5,86±0,41 " 4,56±0,12' 17,86±0,3211 11,90±0,1711 10,70±0,3011 02 5 3,70±0,42 8,61±1,0621 6 64±0,55 2| 0,4 5 4,36±0,22 7,80±0,32 6,34±0,62 2| Інтегральна глікемія, ммоль/л 8 21,63±1 2 1 " 44,13±1,16 11 4,78±0,27 2| 23,73±2,13 21 4,9±0,5921 23,4±23 11 21 Примітка 1) - достовірність ВІДМІН у порівнянні з інтактним контролем, Р