Поліморфна форма рифаксиміну (варіанти), спосіб її одержання (варіанти) і її застосування у медичних препаратах

1. Поліморф a рифаксиміну, який відрізняється тим, що має вміст води нижче 4,5%, бажано від 2,0 % до 3,0 %, і має порошкову рентгенівську дифрактограму з піками при кутах 2Q дифракції 6,6°, 7,4°, 7,9°, 8,8°, 10,5°, 11,1°, 11,8°, 12,9°, 17,6°, 18,5°, 19,7°, 21,0°, 21,4°, 22,1°. 2. Поліморф b рифаксиміну, який відрізняється тим, що має вміст води вище 4,5%, бажано від 5,0% до 6,0%, і має порошкову рентгенівську дифрактограму з піками при кутах 2Q дифракції 5,4°, 6,4°, 7,0°, 7,8°, 9,0°, 10,4°, 13,1°, 14,4°, 17,1°, 17,9°, 18,3°, 20,9°. 3. Поліморф g рифаксиміну, який відрізняється тим, що має вміст води від 1,0% до 2,0% і має порошкову рентгенівську дифрактограму з піками при кутах 2Q дифракції 5,0°, 7,1°, 8,4°. 4. Спосіб одержання рифаксиміну a , який відрізняється тим, що один молярний еквівалент рифаміцину О вводять у реакцію з надлишком 2аміно-4-метилпіридину, бажано, з 2,0-3,5 молярними еквівалентами, у суміші розчинників, яка складається з води та етилового спирту з об'ємним співвідношенням від 1:1 до 2:1, протягом 28год. при температурі 40-60°С; обробляють реакційну суміш при кімнатній температурі розчином аскорбінової кислоти у суміші води, етилового спирту і концентрованої водної гідрохлорної кислоти; доводять рН реакційної суміші до 2,0 концентрованою водною гідрохлорною кислотою; фільтрують суспензію; промивають одержану тверду 2 (19) 1 3 86384 4 фаміцину О вводять у реакцію з надлишком 2аміно-4-метилпіридину, бажано, з 2,0-3,5 молярними еквівалентами, у суміші розчинників, яка складається з води та етилового спирту з об'ємним співвідношенням від 1:1 до 2:1, протягом 28год. при температурі 40-60°С; обробляють реакційну суміш при кімнатній температурі розчином аскорбінової кислоти у суміші води, етилового спирту і концентрованої водної гідрохлорної кислоти; доводять рН реакційної суміші до 2,0 концентрованою водною гідрохлорною кислотою; фільтрують суспензію; промивають одержану тверду речовину тією ж сумішшю розчинників вода/етиловий спирт, що була використана у попередній реакції; очищають отриманий сирий рифаксимін розчиненням його в етиловому спирті при температурі 45-65°С; осаджують додаванням води; воду додають до етанольного розчину сирого рифаксиміну, знижують температуру до 28-32°С для того, щоб почалась кристалізація, одержану суспензію охолоджують до 0°С і витримують з перемішуванням при температурі протягом 6-24 год.; потім фільтрують, і одержану тверду речовину сушать до досягнення вмісту води у ній від 1,0% до 2,0%. 7. Спосіб одержання рифаксиміну a , який відрізняється тим, що рифаксимін g суспендують у суміші етилового спирту і води з об'ємним співвідношенням 7:3; підігрівають суспензію при температурі 38-50°С і з перемішуванням витримують при цій температурі протягом 6-36год.; фільтрують суспензію; промивають одержану тверду речовину водою; і сушать до досягнення вмісту води у ній нижче 4,5%, бажано від 2,0% до 3,0%. 8. Спосіб одержання рифаксиміну b , який відрізняється тим, що рифаксимін g суспендують у суміші етилового спирту і води з об'ємним співвідношенням 7:3; підігрівають суспензію при температурі 38-50°С і з перемішуванням витримують при цій температурі протягом 6-36год.; фільтрують суспензію; промивають одержану тверду речовину водою; і сушать до досягнення вмісту води у ній вище 4,5%, бажано від 5,0% до 6,0%. 9. Спосіб одержання рифаксиміну g , який відрізняється тим, що рифаксимін a або рифаксимін b розчиняють в етиловому спирті при температурі 50-60%; додають демінералізовану воду до досягнення об'ємного співвідношення 7:3 між етиловим спиртом і водою; охолоджують розчин до 30°С з енергійним перемішуванням; охолоджують одержану суспензію до 0°С і витримують її при цій температурі протягом 6-24 год.; фільтрують і промивають одержану тверду речовину водою і сушать до досягнення вмісту води нижче 2,0%. 10. Спосіб одержання рифаксиміну b , який відрізняється тим, що витримують рифаксимін a у середовищі з відносною вологістю вище 50% протягом 12-48год. 11. Спосіб одержання рифаксиміну a , який відрізняється тим, що рифаксимін b сушать під атмосферним тиском або у вакуумі, або у присутності висушуючого агента, при температурі між кімнатною і 105°С протягом 2-72год. 12. Застосування рифаксиміну поліморфної форми a або b або g у виготовленні медичних препаратів з антибітичною активністю для перорального або місцевого застосування. 13. Застосування за п. 12, яке відрізняється тим, що препарати для перорального застосування містять ексципієнти, вибрані з групи, яку складають розріджувачі, зв’язувальні агенти, змащувальні агенти, дезінтегратори, барвники, смакові та підсолоджувальні агенти. 14. Застосування за п. 12 або 13, яке відрізняється тим, що препарати для перорального застосування використовують у формі, вибраній з групи, яку складають таблетки з покриттям і без покриття, тверді і м'які желатинові капсули, пігулки з цукровим покриттям, льодяники, вафельні пластівці, гранули і порошки у герметичних пакетах. 15. Застосування за п. 12, яке відрізняється тим, що препарати для місцевого застосування містять ексципієнти, вибрані з групи, яку складають парафін, масло, поверхнево активні жирні кислоти. 16. Застосування за п. 15, яке відрізняється тим, що препарати для місцевого застосування використовують у формі, вибраній з групи, яку складають мазі, помади, креми, желе і лосьйони. Винахід стосується поліморфних форм α, β і γ рифаксиміну, способів їх приготування і їх використання виготовленні у медичних препаратах для перорального або локального введення. Рифаксимін (INN; див. The Merck Index, XIII Ed., 8304) є антибіотиком, що належить до класу рифаміцинів, зокрема, це піридоімідазорифаміцин, описаний у італійському патенті IT 1154655. У Європейському патенті ЕР 0161534 описано спосіб його приготування з рифаміцину О (The Merck Index, XIII Ed., 8301). В обох цих патентах описано загальні способи очищення рифаксиміну, згідно з якими кристалізацію можна проводити з належних розчинників або систем розчинників, і на прикладах показано, що продукт реакції можна кристалізувати з суміші (7:3) етиловий спирт/вода і сушити як при атмосферному тиску, такі у вакуумі.. У жодному з цих патентів не визначено експериментальних умов кристалізації і сушіння, а також конкретних кристалографічних характеристик одержаного продукту. Присутність різних поліморфів була раніше не відомою і тому експериментальні умови, описані в обох цих патентах, з хімічної точки зору були призначені для одержання однорідного продукту прийнятної чистоти, але не стосувались кристалографічних аспектів продукту. 5 Несподівано було виявлено, що існують деякі поліморфні форми, формування яких залежить не лише від розчинника, але й від умов, пов'язаних з часом і температурою кристалізації і сушіння. У цій заявці ці поліморфні форми позначено як рифаксимін α (Фіг.1) і рифаксимін β (Фіг.2) згідно з їх відповідними специфічними дифрактограмами, а слабокристалічна форма з високим вмістом аморфного компонента була позначена як рифаксимін γ (Фіг.3). Характеристики поліморфних форм рифаксиміну були визначені з використанням порошкової рентгенівської дифракції. Ідентифікація і визначення характеристик цих поліморфних форм і, отже, визначення експериментальних умов для їх одержання є дуже важливими для сполук, які, подібно до рифаксиміну, надходять у продаж як медичні препарати як для звичайного, так і ветеринарного застосування. Відомо, що поліморфізм сполуки, що може бути використана як активний агент у медичних препаратах, може впливати на фармакотоксикологічні властивості ліків. Різні поліморфні форми активного агента можуть мати різні біозасвоюваність, розчинність, стабільність, колір, пластичність, текучість і придатність до обробки і тому можуть мати різні профілі токсикологічної безпечності, різні клінічну ефективність і спосіб отримання. Зазначене вище підтверджується тим фактом, що державні органи, що дають дозвіл на продаж ліків, вимагають такої стандартизації і контролю способів виробництва активних агентів, щоб вони давали однорідні і стійкі результати стосовно поліморфізму у партіях продукції (CPMP/QWP/96, 2003 - примітки для посібників з хімії активних речовин; СРМР/ІСН/96 - примітки для посібників: тестові процедури і критерії прийнятності для нових лікувальних продуктів: хімічні речовини; введено в дію у травні 2000p.). Потреба у згаданій вище стандартизації в області римафіцинових антибіотиків була підкреслена у роботі Henwood S.Q., Villiers M.M., Liebenberg W., Loetter A.P., Drug Development and Industrial Pharmacy (Розробка ліків і промислова фармацевтика), 26(4), 403-408, 2000, де було показано, що різні парти рифампіцину (INN) від різних виробників мають різні характеристики поліморфності і тому мають різні профілі розчинності і, як наслідок, відповідно різні фармакологічні якості. Застосування процесів кристалізації і сушіння, описані у згаданих вище патентах, як було виявлено, дозволяє при деяких експериментальних умовах отримати слабокристаліч-ну форму рифаксиміну, а при інших експериментальних умовах інші кристалічні форми рифаксиміну. Крім того, було виявлено, що деякі параметри, не згадані у цих патентах (наприклад, умови зберігання і відносна вологість довкілля) сильно впливають на форму поліморфа. Поліморфні форми згідно з винаходом досі не були відомі і щодо них нема ніяких гіпотез. Вважалось, що результатом завжди є єдиний гомогенний продукт незалежно від способу одержання у межах описаних умов і незалежно від умов кристалізації, сушіння і зберігання. 86384 6 Було виявлено, що утворення форм α, β і γ залежить від присутності води у розчиннику, температури кристалізації продукту і кількості води у продукті наприкінці фази сушіння. Форми α, β і γ рифаксиміну були синтезовані і є об'єктом винаходу. Було виявлено також, що присутність води у твердому рифаксиміні є оборотною, тобто у придатних зовнішніх умовах може відбуватись поглинання і/або виділення води. Внаслідок цього рифаксимін може переходити з одної форми у іншу залишаючись у твердому стані і не потребує для цього розчинення і рекристалізації. Наприклад, при доданні води гідратацією поліморф ос після досягнення вмісту води вище 4,5% перетворюється у поліморф β, який після втрати води у процесі сушіння до рівня нижче 4,5% перетворюється у поліморф α. Ці результати є дуже важливими, оскільки визначають умови певних стадій промислового виробництва, які раніше не розглядались як критичні для визначення поліморфізму продукту, як, наприклад, промивання кристалізованого продукту або умови продукту, як, наприклад, промивання кристалізованого продукту або умови зберігання кінцевого продукту, або характеристики контейнера для зберігання. Рифаксимін виявляє його широку протибактеріальну активність у шлунково-кишковому тракті проти локалізованих шлунково-кишкових бактерій, які викликають інфекційну діарею, включаючи анаеробні штами. Були повідомлення, що рифаксимін характеризується дуже незначною системною абсорбцією внаслідок його хімічних і фізичних характеристик (Descombe J.J. et al. Pharmacokinetic study of rifaximin after oral administration in healthy volunteers. Int J Clin Pharmacol Res, 14. (2), 51-56, 1994). Нами було виявлено, що рівень системної абсорбції' рифаксиміну можна модулювати (і це є частиною винаходу) введенням пацієнту індивідуальних поліморфних форм рифаксиміну, а саме, рифаксиміну α, рифаксиміну β і рифаксиміну γ. Можна досягти 600-разової варіації адсорбції у межах від 0,001 до 1нг/мл у крові. Така різниця у біозасвоюваності є важливою, оскільки може впливати на фармакологічні і токсикологічні властивості цих трьох поліморфізмів рифаксиміну: α, β і γ. Фактично рифаксиміни α і β дуже слабо абсорбуються при пероральному введенні, а рифаксимін γ виявляє деяку абсорбцію. Рифаксиміни α і β, які практично не абсорбуються, можуть діяти лише при топічному введенні пацієнту, включаючи випадки, пов'язані з шлунково-кишковим трактом, але мають дуже низьку токсичність. Рифаксимін γ, який помірно абсорбується, може знайти переважне застосування проти системних мікроорганізмів, які ховаються і частково уникають дії топічних антибіотиків. Щодо шкідливих наслідків терапевтичного застосування рифаксиміну, можна відзначити виникнення бактеріальної стійкості до антибіотиків. 7 Взагалі у терапевтичній практиці бактеріальна стійкість до одного або іншого антибіотика може виникнути, якщо з'являється стійкий штам. У випадку рифаксиміну це є особливо важливим, оскільки рифаксимін належить до родини рафаміцинів, член якої, рифампіцин, широко застосовується у лікуванні туберкульозу. Сучасний короткий курс лікування туберкульозу є комбінованою терапією, яка включає використання чотирьох активних фармацевтичних інгредієнтів: рифампіцину, ізоніациду, етамбутолу і піразинаміду, причому головну роль грає рифампіцин. Отже, будь-які ліки, які знижують ефективність терапії, викликаючи селективну стійкість до рифампіцину, є шкідливими (Kremer L et al "Re-emergence of tuberculosis: strategies and treatment", Expert Opin. Jnvestig. Drugs, 11 (2), 153-157,2002). У принципі, з огляду на структурну подібність між рифаксиміном і рифампіцином, застосування рифаксиміну може викликати селекцію стійких штамів М. tuberculosis і перехресну стійкість до рифампіцину. Щоб уникнути негативних явищ, необхідно контролювати кількість системно абсорбованого рифаксиміну. З цієї точки зору різниця у системній абсорбції форм α, β і γ рифаксиміну є важливим фактором, оскільки була показана можливість селекції стійких мутантів навіть при субінгібіторних концентраціях рифаксиміну, наприклад, у межах від 0,1 до 1 мкг/мл (Marchese A. et al., In vitro activity of rifaximin, metronidazole and vancomycin against clostridium difficile and the rate of selection of spontaneously resistant mutants against representative anaerobic and aerobic bacteria, including ammonia-producing species. Chemotherapy, 46(4), 253-266, 2000). Відзначене вище показує важливість поліморфних форм рифаксиміну і різних промислових способів приготування чистих одиночних форм згідно з винаходом, які мають різні фармакологічні властивості. Відповідно, стає зрозумілою важливість винаходу, який виявив існування зазначених вище поліморфних форм рифаксиміну і дав різні варіанти промислового виготовлення чистих одиночних форм з різними фармакологічними властивостями. Згадані вище форми α, β і γ можна використовувати як чисті гомогенні продукти при виробництві медичних препаратів, що містять рифаксимін. Як уже відзначалось, спосіб виробництва рифаксиміну з рифаміцину О, описаний у ЕР 0161534, є неповноцінним з точки зору очищення і ідентифікування одержаного продукту. Він має певні обмеження також у тому, що стосується синтезу, оскільки передбачає, наприклад, дуже великі тривалості реакції', від 16 до 72год., що є неприйнятним для промислового виробництва, оскільки не забезпечує відновлення in situ окисленого рифаксиміну, який може утворитись у реакційній суміші. Отже, ще одним об'єктом винаходу є поліпшений спосіб промислового виробництва форм α, β і γ рифаксиміну як кінцевих продуктів, придатних для використання як очищені і гомогенні активні 86384 8 агенти при виробництві медичних препаратів, що містять такі активні агенти. Винахід стосується форми α, форми β і форми γ антибіотика, відомого як рифаксимін (INN), способів їх виробництва і їх використання у виготовленні медичних препаратів для перорального або топічного введення. Процес згідно з винаходом включає реакцію одного молярного еквівалента рифаміцину О з надлишком 2-аміно-4-метилпіридину, бажано, у кількості 2,0 - 3,5 молярних еквівалентів, у суміші води і етилового спирту (з об'ємним відношенням від 1:1 до 2:1) як розчинника, протягом 2 - 8 год. при температурі 40 - 60°С. Наприкінці реакції реакційну масу охолоджують до кімнатної температури і з енергійним перемішуванням разом з аскорбіновою кислотою вносять у суміш води, етилового спирту і водної концентрованої гідрохлорної кислоти для зниження невеликого вмісту окисленого рифаксиміну, що утворився протягом реакції Нарешті доданням концентрованого водного розчину гідрохлорної кислоти доводять рН до 2,0 для кращого видалення надлишку 2-аміно-4-метилпіридину, який був використаний у реакції. Суспензію фільтрують і тверду речовину промивають тим же розчинником, тобто сумішшю води і етилового спирту, що використовували у реакції. Цей напівзакінчений продукт є "сирим рифаксиміном". Сирий рифаксимін безпосередньо піддають наступній стадії очищення. У іншому варіанті, якщо напівзакінчений продукт підлягає зберіганню протягом тривалого часу, сирий рифаксимін може бути підданий сушінню у вакуумі при температурі нижче 65°С протягом 6 - 24год., і такий напівзакінчений продукт називають "сухим сирим рифаксиміном". Одержаний у такий спосіб сирий рифаксимін і/або сухий сирий рифаксимін очищують розчиненням у етиловому спирті при температурі 45 - 65% і кристалізацією доданням води, бажано у масовій кількості 15 - 70% відносно етилового спирту, використаного для розчинення, і витриманням одержаної суспензії при температурі 0 - 50°С протягом 4 - 36 год., з перемішуванням. Суспензію фільтрують і одержують тверду речовину, яку промивають водою і сушать у вакуумі або під нормальним тиском з висушуючим агентом або без нього, при температурі між кімнатною і 105°С протягом 2 - 72 год. Одержання форм α, β і γ залежить від умов кристалізації. Зокрема, важливими є склад суміші розчинників, з якої проводять кристалізацію, температура, при якій витримують реакційну суміш після кристалізації, і тривалість втримання при цій температурі. Точніше, рифаксимін γ одержують, коли розчин доводять до температури 28 - 32°С для ініціювання осадження і одержану суспензію після цього охолоджують до 0°С і витримують при цій температурі протягом 6 - 24 год. Суспензію фільтрують, тверду речовину промивають демінералізованою водою і сушать до досягнення вмісту води 1,0 - 2,0%. 9 Рифаксиміни α і β одержують, коли температуру спочатку доводять до 28 - 32°С для ініціювання осадження, потім доводять суспензію до температури 40 - 50°С і витримують при цій температурі протягом 6 - 24 год., після чого швидко охолоджують до температури 0°С протягом 1560 хвил., фільтрують і тверду речовину промивають водою і сушать. Стадія сушіння є важливою при одержання поліморфних форм α і β рифаксиміну і має проводитись під контролем належними методами для визначення вмісту води, наприклад, з використанням метода Карла Фішера для контролю кількості залишкової води у продукті після сушіння. Рифаксимін α або рифаксимін β отримують в залежності від кінцевого вмісту воду, а саме, нижче або вище 4,5%, а не від тиску і температури, при яких досягається це критичне граничне процентне значення вмісту води. Фактично ці дві поліморфні форми з вищим або нижчим вмістом води можна одержати сушінням у вакуумі або при атмосферному тиску, при кімнатній або високій температурі, у присутності висушуючих агентів або без них, за умови, що сушіння триває протягом часу, необхідного для досягнення водної процентної характеристики для кожної з поліморфних форм. Поліморфну форму β отримують, коли сушіння, кристалізацію і промивання водою зупиняють при значеннях вмісту води вище 4,5%, виміряного методом Карла Фішера, бажано, 5,0 - 6,0%, а поліморфну форму α отримують, продовжуючи сушіння, доки вміст води не стане нижчим 4,5%, бажано, 2,0 - 3,0%. Усі форми α, β, γ рифаксиміну є гігроскопічними, поглинання ними води є оборотним за певних умов, а саме умов тиску і вологості довкілля, і тому вони можуть перетворюватись з однієї форми в іншу. Якщо поліморфну форму α витримати при відносній вологості вище 50% протягом 12 - 48 год., вона перетворюється у поліморфну форму β, яку у свою чергу сушінням до зниження вмісту води нижче 4,5%, бажано 2,0 - 3,0%, можна перетворити у поліморфну форму α. Інший тип переходу відбувається між формою γ і формами α і β. Він має місце залежно від температури у фазі осадження рифаксиміну. Зокрема, форму γ можна перетворити у форми α або β витриманням суспензії форми γ рифаксиміну у суміші розчинників етиловий спирт/вода (7:3, об'єм/об'єм) при температурі 38 - 50°С з енергійним перемішуванням протягом 6 - 36 год. Фільтрування і промивання демінералізованою водою з подальшим сушінням до досягнення вмісту води вище 4,5%, бажано, 5,0 - 6,0%, дає поліморфну форму β, а продовження сушіння до досягнення вмісту води нижче 4,5%, бажано, 2,0 3,0%, дає поліморфну форму α. Рифаксиміни α і β можне перетворити у рифаксимін γ, розчиняючи їх в етиловому спирті з подальшою обробкою одержаного розчину, описаною для приготування форми γ. Ці переходи від однієї форми до іншої є дуже важливими для визначення об'єму винаходу, оскільки вони можуть бути альтернативним способом 86384 10 одержання бажаної форми при виробництві медичних препаратів. Отже винахід включає придатні для промислового використання способи перетворення рифаксиміну γ у рифаксимін α або β, перетворення рифак-симінів α або β у рифаксимін γ, перетворення рифаксиміну α у рифаксимін β і перетворення рифаксиміну β у рифаксимін α. Процес перетворення рифаксиміну γ у рифаксимін α або β включає суспендування рифаксиміну γ у суміші етиловий спирт/вода (7:3, об'єм/об'єм), підігрівання суспензії до 38 -50°С і енергійне перемішування її при цій температурі протягом 6-36 год. Далі суспензію фільтрують, тверду речовину промивають водою і сушать, причому поліморфна форма β утворюється, коли сушінням досягають вмісту води 5,0 - 6,0%, виміряного методом Карла Фішера, а поліморфна форма α утворюється, коли подальшим сушінням досягають вмісту води 2,0 3,0%. Процес одержання форми уз рифаксиміну а або β включає розчинення форми α або β з перемішуванням у етиловому спирті при температурі 50 - 60°С, додання води до одержання суміші етиловий спирт/вода з об'ємним співвідношенням 7:3 (об'єм/об'єм), охолодження розчину до 30°С з енергійним перемішуванням, охолодження рясного осаду до 0°С і витримання суспензії з перемішуванням протягом 6 - 24 год. Далі суспензію фільтрують, тверду речовину промивають водою і сушать до досягнення вмісту води нижче 2%, одержуючи ри-факсимін γ. Процес перетворення форми α у форму β складається з витримання порошку рифаксиміну α у середовищі з відносною вологістю 50% протягом часу, достатнього для досягнення вмісту води у порошку вище 4,5% (звичайно 12-48 год). Процес перетворення форми β у форму α складається з сушіння порошку рифаксиміну β під вакуумом або при нормальному тиску з висушуючим агентом або без нього, при температурі між кімнатною і 105°С протягом 2 - 72 год. для досягнення вмісту води у порошку нижче 4,5%, бажано, 2,0 - 3,0%. З вищевикладеного зрозуміло, що у фазі зберігання продукту треба вдаватись до особливих застережних засобів, щоб умови довкілля не змінили вмісту води у продукті. Цього можна досягти, якщо зберігати продукт у довкіллі з контрольованою вологістю або у закритих контейнерах, запобігаючи цим значним змінам вмісту води. Поліморф рифаксиміну α характеризується вмістом води нижче 4,5%, бажано 2,0 - 3,0%, і порошковою рентгенівською дифрактограмою (Фіг.1), яка має піки при кутах 2Θ дифракції 6,6°, 7,4°, 7,9°, 8,8°, 10,5°, 11,1°, 11,8°, 12,9°, 17,6°, 18,5°, 19,7°, 21,0°, 21,4°, 22,1°. Поліморф рифаксиміну β характеризується вмістом води вище 4,5%, бажано 5,0 6,0%, і порошковою рентгенівською дифрактограмою (Фіг.2), яка має піки при кутах 2Θ дифракції 5,4°, 6,4°, 7,0°, 7,8°, 9,0°, 10,4°, 13,1°, 14,4°, 171°, 17,9°, 18,3°, 20,9°. Поліморф рифаксиміну γ внаслідок слабкої кристалізації характеризується значно біднішою порошковою рентгенівською дифрактограмою 11 86384 (Фіг.3), яка має піки при кутах 2Θ дифракції 5,0°, 7,1°, 8,4°. Дифрактограми були одержані на інструменті Philips X'Pert з геометрією Брегга-Брентано у таких робочих умовах: Рентгенівська трубка: мідь, Опромінювання: К(α1), К(α2), Напруга і струм генератора: 40 кВ, 40 мА, Монохроматор: графіт, Крок: 0,02, Тривалість кроку: 1,25 с, Початкове і кінцеве значення кута 2Θ: 3,0° + 30,0°. Оцінювання вмісту води у зразках, що аналізувались, виконували методом Карла Фішера. Рифаксимін α, рифаксимін β і рифаксимін γ суттєво відрізняються один від одного також біозасвоюваністю і внутрішньою розчинністю. Дослідження біозасвоюваності трьох поліморф було проведене на самицях гончих собак пероральним введенням їм дози 100мг/кг одного з поліморфів, взяттям зразків крові з яремної вени від кожної тварини перед введенням дози і через 1,2,4, 6, 8 і 24 год. після кожного введення, перенесенням зразків у пробірки з гепарином і сепарацією плазми центрифугуванням. Плазму кількісно аналізували на рифаксимін методом РХ-МС/МС (Рідинна Хроматог-рафіяМас-Спектрографія/Мас-Спектрографія), реєстрували максимальну концентрацію плазми (Сmax) i час досягнення Сmax (tmax) i обчислювали площу під кривою залежності концентрації від часу (AUC). Експериментальні дані (Таблиця 1) показують, що рифаксимін α рифаксимін β абсорбуються дуже незначно, а абсорбція рифаксиміну γ становить 0,1-1нг/мл (Сmax = 0,668нг/мл). Таблиця 1 Фармакокінетичні параметри поліморфів рифаксиміну після одноразового перорального введення 100 мг/кг капсулами самицям собак Поліморф α Поліморф β Поліморф γ СМах ng/ml Середнє 2,632 1,096 668,22 tmax год. Середнє 9,5 4 2,25 AUC4-24 нг-год./мл Середнє 13 11 3908 Тести на власне розчинення для кожного з трьох поліморфів, які проводили за методикою, описаною у монографії 1087, crop. 2512 - 2513 USP (US Pharmacopoeia) 27, показали значні різниці між для рифаксиміну а, рифаксиміну β і рифаксиміну γ. Зразок кожного поліморфу рифаксиміну був внесений у прес-форму і підданий тиску 5 тон за допомогою гідравлічного пресу для отримання компактної таблетки. Прес-форму з компактованою таблеткою встановлювали у лабораторному перемішувальному пристрої у розчиняючому середовищі і перемішували обертаннями за допомогою цього пристрою. 12 Цей тест проводили у розчиняючому середовищі яким слугував водний фосфатний буфер з рН 7.4 і лаурилсульфат натрію, при температурі 37±0,5°С. Тест показав значні різниці у швидкості власного розчинення для цих трьох поліморфів. Компактована таблетка рифаксиміну α розпалась через 10 хвил. і це не дозволило обчислити значення власної розчинності. Власна розчинність рифаксиміну γ перевищувала цей параметр для рифаксиміну β приблизно у 10 разів; це відповідає тому, що його біозасвоюваність у більш, як 100 разів перевищує біозасвоюваність рифаксиміну β. Наведені результати експериментів підтверджують різниці між трьома поліморфами рифаксиміну. Форми α, β і γ можна використовувати у виробництві препаратів, що мають антибіотичну активність і містять рифаксимін і призначені для перорального і топічного застосування. Медичні препарати для перорального введення містять рифаксимін α або β, або γ разом з звичайними добавками, зокрема, розріджуючими агентами, наприклад, манітолом, лактозою і сорбітолом; зв'язуючими агентами, наприклад, крохмалями, желатинами, цукрами, похідними целюлози, природними смолами і полівінілпіролідоном; змащуючими агентами, наприклад, тальком, стеаратами, гідрогенованими рослинними оліями, поліетиленгліколем і колоїдним діоксидом силіцію; дезінтеграторами, наприклад, крохмалями, целюлозами, альгінатами, смолами і ретикульованими полімерами; забарвлюючими, смаковими і підсолоджуючими агентами. В об'єм винаходу входять всі тверді препарати, придатні для перорального введення, наприклад, таблетки з покриттям і без покриття, капсули з м'якого і жорсткого желатину, пігулки з цукровим покриттям, льодяники, вафельні пластівці, гранули і порошки у герметичних пакетах. Медичні препарати для топічного використання містять рифаксимін ос або β, або γ разом з звичайними добавками, наприклад, білим петролатумом, білим воском, ланоліном і його похідними, стеариловим спиртом, пропіленгліколем, лаурилсульфатом натрію, етерами жирних поліоксиетиленових спиртів, естерами жирних поліоксиетиленових кислот, сорбітановим моностеаратом, гліцериловим моностеаратом, пропіленгліколевим моностеа-ратом, поліетиленгліколями, метилцелюлозою, гідроксиметилпропілцелюлозою, натрійкарбоксиметилцелюлозою, колоїдним алюмінієм і силікатом магнію, альгінатом натрію. В об'єм винаходу входять всі препарати для топічного використання, наприклад, мазі, помади, креми, желе і лосьйони. Далі наведено приклади, що ілюструють, але не обмежують винаходу. Результати показують, що форми α, β і γ можна отримати, маніпулюючи кристалізацією і сушінням. Приклад 1. Приготування сирого рифаксиміну і висушеного сирого рифаксиміну У тригорлу колбу, обладнану механічним перемішувачем, термометром і дефлегматором при кімнатній температурі послідовно вносять 120мл демінералізованої води, 96мл етилового спирту, 13 63,5г римафіцину О і 27,2г 2-аміно-4метилпіридину. Суміш нагрівають до 47±3°С і перемішують при цій температурі 5год., потім охолоджують до 20±3°С і протягом 30 хвил. додають окремо приготовлену суміш 9мл демінералізованої води, 12,6мл етилового спирту, 1,68г аскорбінової кислоти і 9,28г водної концентрованої гідрохлорної кислоти. Після цього суміш перемішують протягом 30 хвил. при внутрішній температурі 20±3°С і потім при тій же температурі краплями додають концентровану гідрохлорну кислоту до досягнення рН 2,0. Після завершення додання суміш перемішують протягом 30 хвил. при внутрішній температурі 20°С, осад фільтрують і промивають сумішшю 32мл демінералізованої води і 25мл етилового спирту. Одержаний сирий рифаксимін (89,2г) сушать під вакуумом при кімнатній температурі протягом 12 год. і отримують 64,4г "сухого сирого рифаксиміну" з вмістом води 5,6% і дифрактограмою, що відповідає поліморфній формі β. Подальше сушіння продукту у вакуумі до досягнення постійної маси дає 62,2г сухого сирого рифаксиміну з вмістом води 2,2% і дифрактограмою, що відповідає поліморфній формі α. Продукт є гігроскопічним, і одержані поліморфні форми є оборотними: поліморфна форма α поглинає воду з атмосфери, доки не досягне, залежно від відносної вологості і тривалості, вмісту води вище 4,5% і не перетвориться у поліморфну форму β, яка через сушіння втрачає воду і перетворюється у поліморфну форму ос з вмістом води 2,0 - 3,0%. Приклад 2. Приготування рифаксиміну γ 163мл етилового спирту і 62,2г висушеного сирого рифаксиміну при кімнатній температурі вносять у тригорлу колбу, обладнану механічним перемішувачем, термометром і дефлегматором. Суспензію перемішують при температурі 57±3°С до повного розчинення твердого матеріалу і через 30 хвил. при тій же температурі додають 70мл демінералізованої' води. Після цього за 40 хвил. доводять температуру до 30°С і витримують при цій температурі до повної кристалізації, далі протягом 2 год. знижують температуру до 0°С і витримують при цій температурі 6 год. Суспензію фільтрують і тверду речовину промивають демінералізованою водою (180г). Сушіння у вакуумі при кімнатній температурі до досягнення постійної маси дає 52,7г чистого рифаксиміну уз вмістом води 1,5%. Форма γ характеризується порошковою рентгенівською дифрактограмою з помітними піками при кутах 2Θ дифракції 5,0°, 7,1°, 8,4°. Приклад 3. Приготування рифаксиміну α 62,2г висушеного сирого рифаксиміну і 163мл етилового спирту при кімнатній температурі вносять у тригорлу колбу, обладнану механічним перемішувачем, термометром і дефлегматором. Суспензію перемішують при температурі 57±3°С до повного розчинення твердого матеріалу і через 30 хвил. при тій же температурі додають 70мл демінералізованої води. Після цього за 40 хвил. доводять температуру до 30°С і витримують при цій температурі до повної кристалізації. Далі температуру доводять до 40°С і при цій температурі пере 86384 14 мішують протягом 20 год., потім температуру протягом 30 хвил. знижують до 0°С і суспензію негайно фільтрують. Тверду речовину промивають демінерапізованою водою (180мл) і сушать у вакуумі при кімнатній температурі до досягнення постійної маси, одержуючи 51,9г рифаксиміну α з вмістом води 2,5% і порошковою рентгенівською дифрактограмою з піками при кутах 2Θ дифракції" 6,6°, 7,4°, 7,9°, 8,8°, 10,5°, 11,1°, 11,8°, 12,9°, 17,6°, 18,5°, 19,7°, 21,0°, 21,4°, 22,1°. Приклад 4. Приготування рифаксиміну α 89,2г сирого рифаксиміну і 170мл етилового спирту при кімнатній температурі вносять у тригорлу колбу, обладнану механічним перемішувачем, термометром і дефлегматором і суспензію гріють при температурі 57±3°С до повного розчинення твердого матеріалу. Доводять температуру до 50°С і при цій температурі протягом 30 хвил. додають 51,7мл демінералізованої води. Далі протягом 1 год. доводять температуру до 30°С і витримують суспензію при цій температурі протягом 30 хвил., одержуючи рясну кристалізацію. Далі температуру доводять до 40°С і при цій температурі перемішують протягом 20 год.., потім температуру протягом 30 хвил. знижують до 0°С і суспензію негайно фільтрують. Тверду речовину промивають демінералізованою водою (240мл) і сушать у вакуумі при 65°С до досягнення постійної маси і одержують 46,7г рифаксиміну α з вмістом води 2,5%. Приклад 5. Приготування рифаксиміну α Повторюють процедуру Прикладу 3 з підвищенням температури до 50°С і з зниженням до 7 год. тривалості витримання суспензії. Одержаний продукт є ідентичним продукту Прикладу 3. Приклад 6. Приготування рифаксиміну β Кристалізацію висушеного сирого рифаксиміну проводять згідно з процедурою Прикладу 3. Сушіння під вакуумом при кімнатній температурі контролюють засобами методу Карла Фішера і припиняють, коли вміст води досягає 5,0%. Це дає 52,6г рифаксиміну β, що підтверджується порошковою рентгенівською дифрактограмою з піками при кутах 2Θ 5,4°, 6,4°, 7,0°, 7,8°, 9,0°, 10,4°, 13,1°, 14,4°, 171°, 17,9°, 18,3°, 20,9°. Приклад 7. Приготування рифаксиміну α з рифаксиміну γ 5г рифаксиміну γ суспендують у суміші 13мл етилового спирту і 5,6мл води і суспензію з перемішуванням гріють при 40°С протягом 24 год. у колбі, обладнаній механічним перемішувачем, термометром і конденсатором. Суспензію фільтрують і тверду речовину промивають видою і сушать у вакуумі при кімнатній температурі до досягнення постійної маси. Це дає 4г рифаксиміну, порошкова рентгенівська дифрактограма якого відповідає поліморфній формі α і вмісту води 2,6%. Приклад 8. Приготування рифаксиміну уз рифаксиміну α 15г рифаксиміну α і 52, 4мл етилового спирту вносять у тригорлу колбу, обладнану механічним перемішувачем, термометром і конденсатором і суспензію гріють з перемішуванням при температурі 50°С до повного розчинення твердого матеріалу. 15 До прозорого розчину протягом 30 хвил. з перемішуванням додають 22,5мл води, утворену суспензію з енергійним перемішуванням охолоджують до 0°С і витримують при цій температурі 6 год. Далі частину суспензії відбирають, фільтрують, промивають демінералізованою водою і сушать у вакуумі при 30°С до досягнення постійної маси. Одержаний продукт (3,7г) має дифрактограму, що відповідає формі γ і вмісту води 1,7%. Решту суспензії з енергійним перемішуванням при 0°С витримують ще 18 год. і потім фільтрують, промивають демінералізованою водою і сушать у вакуумі при 30°С до досягнення постійної маси. Це дає 9г продукту, порошкова рентгенівська дифрактограма якого відповідає поліморфній формі γ і вмісту води 1,6%. Приклад 9. Приготування рифаксиміну α з рифаксиміну β 5г рифаксиміну β з вмістом води 5,0% сушать у вакуумі при 30°С протягом 8 год. і одержують 4,85г рифаксиміну α з вмістом води 2,3%. Приклад 10. Приготування рифаксиміну β з рифаксиміну α 5г рифаксиміну ос з вмістом води 2,5% витримують 40 год. у атмосфері з відносною вологістю 56%, утвореною насиченим водним розчином тетрагідрату нітрату натрію, і одержують 5,17г рифаксиміну β з вмістом води 5,9%. Приклад 11. Біозасвоюваність у собак при пероральному введенні 12 20-тижневих чистокровних собак - самиць гончих масою від 5,0 до 7,5кг були розділені на 3 групи по 4. Першій групі давали рифаксимін а, другій рифаксимін β і третій - рифаксимін γ за описаною далі процедурою. Кожна собака отримала перорально 100 мг/кг одного з поліморфів рифаксиміну у желатинових капсулах і від кожної собаки з яремної вени було взято зразок крові 2мл перед кожним введенням і через 1,2,4,6,8 і 24 год. після введення. Кожний зразок був внесений у гепариновану пробірку і центрифугований; плазму поділили на дві 500мл аліквоти і заморозили при -20°С. Методом РХ-МС/МС був проведений аналіз плазми на вміст рифаксиміну і були обчислені такі параметри: Сmax - максимальна концентрація рифаксиміну у плазмі; Тmax – час досягнення Сmax; AUC - площа під кривою залежності концентрації від часу, обчислена лінійним трапецоїдальним методом. Результати у таблиці 1 показують значно краще абсорбування рифаксиміну γ (більш, ніж у 102 86384 16 рази) порівняно з рифаксиміном α і рифаксиміном β, які практично не абсорбуються. Приклад 12. Тест на власну розчинність Зразок кожного поліморфу рифаксиміну (100 мг) був підданий тесту на власну розчинність за методикою, описаною у монографії 1087, crop. 2512 - 2513 USP (US Pharmacopoeia) 27. 100мг поліморфу рифаксиміну були внесені у прес-форму і піддані тиску 5 тон пуансоном гідравлічного пресу. Компактовану таблетку формували у пресформі з одним боком певної площі, відкритим на дні прес-форми, внаслідок чого від 50% до 75% таблетки могли розчинитись у відповідному розчиняючому середовищі. Затисний елемент, що утримував прес-форму, був встановлений у лабораторному перемішувальному пристрої, занурений у скляний резервуар з розчиняючим середовищем і підданий перемішуванню обертанням при 100об./хвил. перемішувальним пристроєм при температурі 37± 0.5°С. Розчиняюче середовище у скляному резервуарі містило 1000мл 0,1 Μ водного фосфатного буфера з рН 7.4 з 4,5г лаурилсульфату натрію і мало температуру 37± 0.5°С протягом всього тесту. Зразки розчину по 2мл були взяті через 15, 30, 45 і 60 хвил. після початку процедури розчинення і кількісно аналізовані рідинною хроматографією високого розрізнення на розчинення рифаксиміну. Таблетки з рифаксиміну α завжди розпадались не пізніше, ніж через 10 хвил., причому також при низьких концентраціях (0.1% і 0.3%) лаурилсульфату натрію і навіть за відсутності зазначеної ПАР, і тому власну розчинність було неможливо обчислити. Власна розчинність рифаксиміну γ кожного разу приблизно у 10 разів перевищувала власну розчинність рифаксиміну γ (див. Таблицю 2). Таблиця 2 Власна розчинність у 0,1 Μ водному фосфатному буфері, рН 7,4, з лау-рилсульфатом натрію Час (хвил.) 15 30 45 60 Власна швидкість розчинення (мг/хвил./см2) Розчинність рифаксиміну (мг/см2) Поліморф β Поліморф γ 0,28 2,6 0,50 4,2 0,72 6,44 0,94 9,04 0,0147 0,1444 17 Комп’ютерна верстка Д. Шеверун 86384 Підписне 18 Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601