Альфа-тимозинові пептиди як ад’юванти протиракових вакцин

1. Фармацевтична комбінація для лікування раку в суб'єкта і для підвищення ефективності протипухлинної вакцини в суб'єкта, яка включає: а) індукуючу імунну відповідь протипухлинну вакцину, здатну викликати відповідь імунної системи в зазначеного суб'єкта та б) кількість, що підвищує ефективність вакцини, альфа-тимозинового пептиду, який підвищує зазначену відповідь імунної системи в зазначеного суб'єкта, в) причому зазначена протиракова вакцина та зазначений альфа-тимозиновий пептид можуть бути введені в організм роздільно або разом. 2. Фармацевтична комбінація за п. 1, у якій зазначений суб'єкт є людиною й зазначена вакцина є вакциною дендритних клітин. 3. Фармацевтична комбінація за п. 1, у якій зазначена вакцина міститься в кількості приблизно від 1 10-9 г до приблизно 1 10-3 г, а зазначений альфа-тимозиновий пептид міститься в кількості приблизно 0,1-20 мг. 4. Фармацевтична комбінація за п. 1, у якій зазначена вакцина міститься в кількості приблизно від 1 10-8 г до приблизно 1 10-4 г, а зазначений альфа-тимозиновий пептид міститься в кількості приблизно 0,5-10 мг. 5. Фармацевтична комбінація за п. 4, у якій зазначеним альфа-тимозиновим пептидом є пептид 2 (19) 1 3 90493 4 лизно 1 10-3 г, причому зазначений альфатимозиновий пептид вводять в організм у кількості приблизно 0,1-20 мг. 11. Спосіб за п. 8, у якому зазначену вакцину вво-8 дять у кількості приблизно від 1 10 г до прибли-4 зно 1 10 г, а зазначений альфа-тимозиновий пептид міститься в кількості приблизно 0,5-10 мг. 12. Спосіб за п. 11, у якому зазначеним альфатимозиновим пептидом є ТА1, причому зазначений пептид ТА1 вводять в організм у кількості приблизно 1,6-3,2 мг. 13. Спосіб за п. 12, у якому зазначений пептид ТА1 вводять в організм в основному одночасно із введенням зазначеної вакцини. 14. Спосіб за п. 12, у якому зазначену вакцину та зазначений пептид ТА1 вводять в організм ін'єкцією. 15. Спосіб за п. 8, у якому зазначену комбінацію вводять зазначеному суб'єкту багаторазово. 16. Спосіб за п. 15, у якому зазначену вакцину вводять зазначеному суб'єкту 4-10 разів протягом курсу введення. 17. Спосіб за п. 16, у якому зазначену вакцину вводять зазначеному суб'єкту раз на три тижні протягом зазначеного курсу введення. 18. Спосіб за п. 17, у якому зазначеним альфатимозиновим пептидом є ТА1, причому зазначений пептид ТА1 вводять двічі на тиждень протягом зазначеного курсу введення. 19. Спосіб за п. 18, у якому зазначений курс введення становить приблизно шість місяців. За даною заявкою заявляється пріоритет на основі попередньої заявки на патент США US 60/633175, поданої 6 грудня 2004 р. Даний винахід стосується лікування раку. У світі основною причиною смерті є ракові захворювання. Неспецифічні підходи до лікування раку, наприклад, хірургія, хіміотерапія та радіотерапія, успішно застосовуються тільки відносно окремих груп пацієнтів. Імунотерапія представляє новий напрямок у лікуванні раку. Основний принцип полягає в забезпеченні організму пацієнта, який піддається лікуванню, здатністю підвищувати імунологічну активність відносно ракових клітин. Існує ряд стратегій, які з'явилися в останні роки й у даний час вивчаються. Ці стратегії включають: перенос алогенних лімфоцитів, внутрішньопухлинну імплантацію імунореактивних клітин, системну вакцинацію для вироблення пухлинноспецифічної імунної відповіді та ін. У даній галузі зберігається потреба в поліпшенні протипухлинного лікування та протиракових композицій. Відповідно до даного винаходу фармацевтична комбінація та спосіб підвищення ефективності протиракової вакцини в суб'єкта, застосування індукуючої імунну відповідь протиракової вакцини, здатної викликати відповідь імунної системи в суб'єкта, і кількість альфа-тимозинового пептиду, який підвищує ефективність вакцини, підвищують зазначену відповідь імунної системи в зазначеного суб'єкта, причому зазначена протиракова вакцина та зазначений альфа-тимозиновий пептид можуть вводитися в організм окремо або спільно. Даний винахід призначений для лікування пухлин та онкологічних захворювань у суб'єкта, краще в ссавця, і найкраще в людини. Прогресуючий рак стійкий до традиційних способів лікування. Деякі протиракові вакцини продемонстрували активність зі зниження прояву захворювання або з припинення прогресування захворювання, пов'язану або не пов'язану з пухлинною відповіддю, а також підвищену виживаність пацієнтів. Введення в організм альфатимозинового пептиду, наприклад, тималфазину (тимозину альфа-1) має позитивний ад'ювантний ефект при лікуванні вакциною онкологічних хворих, який проявляється в зменшенні розміру пухлини й у підвищенні виживаності в пацієнтів із прогресуючим раком, у тому числі в тих, які не проявляють відповідної реакції на введення в організм тільки однієї протиракової вакцини (наприклад, при імунізації дендритними клітинами). Поняття «тимозин альфа-1» і «ТА1» означають пептиди, які мають амінокислотну послідовність, яка описана в патенті US 4079137, суть якого включена в даний винахід у вигляді посилання. Ефективні кількості альфа-тимозинового пептиду є тими кількостями, які забезпечують підвищення активності протиракових вакцин, які можуть бути дозовані одиницями в діапазоні, що становить для TA1 0,1-20мг, краще 0,5-10мг ТА1. Більш переважно, дозована одиниця включає приблизно 1-4мг ТА1. Найкраще, якщо дозована одиниця містить приблизно 1,6-3,2мг ТА1. Тимозин альфа-1 (ТА1), спочатку виділений із фракції 5 тимозину (ТФ5), був секвенований і хімічно синтезований. Пептид TA1 складається з 28 амінокислот з молекулярною масою 3108. Протираковими вакцинами для використання відповідно до даного винаходу є вакцини дендритних клітин. Протиракові вакцини можуть бути введені суб'єкту відповідно до даного винаходу в одній з ефективних доз. Такі дози можуть бути в діапазоні приблизно від 1x10 -9 г до приблизно 1x10 -3 г. В інших варіантах здійснення даного винаходу придатні ефективні дози протиракових вакцин можуть бути в діапазоні приблизно від 1х10 -8г до приблизно 1х10 4г. Ефективна кількість введених доз протиракової вакцини може бути, наприклад, одним з діапазону 1-20, або більше. Бажано протиракову вакцину вводять у вигляді декількох доз, наприклад, приблизно від 2 до приблизно 15 доз, більш краще приблизно 4-10 доз і найкраще приблизно 6 доз. В особливо кращих варіантах здійснення даного винаходу вакцину вводять суб'єкту в здорові лімфатичні вузли один раз у три тижні протя 5 гом курсу лікування. В кращих варіантах здійснення даного винаходу протиракову вакцину, індукуючу імунну відповідь, вводять суб'єкту разом із введенням суб'єкту альфа-тимозинового пептиду, причому вакцину та альфа-тимозиновий пептид вводять суб'єкту роздільно і/або разом. В одному з варіантів здійснення даного винаходу альфа-тимозиновий пептид вводять в основному одночасно із введенням вакцини, принаймні, при одному введенні вакцини. У кращих варіантах здійснення даного винаходу і вакцину, і альфа-тимозиновий пептид вводять в організм ін'єкцією. Переважно і вакцину, і альфатимозиновий пептид вводять суб'єкту багато разів. У кращих варіантах здійснення даного винаходу альфа-тимозиновий пептид вводять двічі на тиждень протягом курсу введення. Особливо краще, якщо курс введення триває приблизно шість місяців. В одному із кращих варіантів здійснення даний винахід застосовний для лікування раку в суб'єктів, які не є респондентами при лікуванні раку тільки однією вакциною. В особливо кращих варіантах здійснення даного винаходу альфа-тимозиновий пептид вводять в організм підшкірною ін'єкцією двічі на тиждень у фармацевтичних дозованих одиницях, які знаходяться у діапазоні приблизно 1-4мг (наприклад, 1,6-3,2мг), разом із введенням суб'єкту протиракової вакцини. Однак слід враховувати, що фармацевтичні дозовані одиниці, які містять альфатимозиновий пептид і/або протиракову вакцину, можуть бути складені будь-яким придатним способом для введення будь-яким придатним шляхом. Відповідно до одного з варіантів здійснення даного винаходу, дозовану одиницю, яка містить альфа-тимозиновий пептид, вводять суб'єкту звичайним способом. Наприклад, дозована одиниця може вводитися частіше одного разу на добу, у тиждень, на місяць і т.д. Дозована одиниця може вводитися двічі на тиждень, наприклад, кожної третьої доби. Дозована одиниця альфатимозинового пептиду також може вводитися, наприклад, тричі за тиждень. Введення в організм альфа-тимозинового пептиду та вакцини може здійснюватися будь-яким придатним способом, наприклад, ін'єкцією, інфузією або перорально. В особливо кращих варіантах здійснення даного винаходу введення в організм здійснюють ін'єкцією. Якщо вакцину та альфа-тимозиновий пептид вводять одночасно, ці препарати можуть бути представлені в єдиній композиції, яка включає вакцину та альфа-тимозиновий пептид. Композиції, які включають вакцину і/або альфа-тимозиновий пептид, можуть також включати один або декілька фармацевтично прийнятних носіїв і необов'язково інші терапевтичні інгредієнти. До складів, придатних для ін'єкції або інфузії, належать водні та неводні стерильні ін'єкційні розчини, які можуть необов'язково містити антиоксиданти, буфери, бактеріостатики та розчини, які забезпечують складам ізотонічність по відношенню до крові реципієнта, який піддається лікуванню, а також водні та неводні стерильні суспензії, які можуть включати суспендуючі агенти та загусники. 90493 6 Склади можуть бути поміщені в однодозові або багатодозові контейнери, наприклад, запечатані ампули та флакони, і можуть зберігатися в ліофілізованому стані, а безпосередньо перед застосуванням потрібно тільки внести стерильний рідкий носій, наприклад, воду для ін'єкцій. Прогресуючий рак стійкий до традиційних способів лікування. Деякі протиракові вакцини продемонстрували активність, виражену в зниженні прояву захворювання або в підвищенні виживаності. Введення в організм альфа-тимозинового пептиду, наприклад, тималфазину (тимозину альфа-1) має позитивний ефект при лікуванні вакциною, виражений в зниженні розміру пухлини та у підвищенні виживаності, у тому числі в пацієнтів із прогресуючим раком, які не проявляють відповідної реакції на введення в організм тільки однієї протиракової вакцини (наприклад, при імунізації дендритними клітинами). Існує три системи, відповідальні за підтримку гомеостазу в організмі людини: імунна, ендокринна та нервова. Імунна система відповідає за репарацію та диференціацію клітин і тканин, а також за підтримку їх ідентичності шляхом збереження внутрішнього та зовнішнього середовища. Отже, двома основними функціями імунної системи є регуляторна функція та ефекторна функція. Обидві ці функції здійснюються однією й тією ж популяцією клітин, що активно реагують на потреби організму. Імунна система відіграє активну роль у терапії раку й може запобігти дисфункції органа та появу новоутворення. З терапевтичної точки зору імунотерапія раку по суті означає стимулювання імунної системи за допомогою різних реагентів, наприклад, вакцин, інфузій Т-клітин або цитокінів. Ці реагенти можуть діяти за декількома механізмами: 1) шляхом стимулювання протипухлинної відповіді, 2) шляхом зниження механізму супресії, 3) зміною пухлинних клітин для підвищення в них імуногенності та чутливості до імунологічного захисту, 4) виправленням стійкості до цитотоксичних лікарських засобів або радіотерапії. Рак виникає в результаті різних генетичних дефектів, які утворюються в генах, що кодують білки, які беруть участь у рості клітин. Складові імунної системи, антитіла та Т-клітини, не можуть розпізнати дефектні гени, але вони розпізнають і реагують на анормальні білки, які кодуються генами, що викликають рак. Імунна система може атакувати рак за допомогою В- та T-лімфоцитів. Антитіла - це білки, вироблювані В-клітинами у відповідь на чужорідну речовину. Кожне антитіло зв'язується зі специфічним антигеном. Основний захист, забезпечуваний антитілами, здійснюється через ефекти ампліфікації системи «комплементу», яка складається приблизно з 20 різних білків. Коли антитіло зв'язується з антигеном, активується специфічний сайт активності антитіла. Цей сайт зв'язує молекулу системи комплементу й викликає каскад реакцій. Опсонізація та фагоцитоз - одні з найбільш важливих проявів комплементу. Вони сильно активують фагоцитоз, здійснюваний нейт 7 рофілами й макрофагами. Цей тип опосередкованого антитілами ефекту відомий як антитілообумовлена клітинозалежна цитотоксичність (АОКЦ). АОКЦ має корисну дію - каталізуванням активності Т-клітин, оскільки білки чужорідних клітин, які руйнуються, представлені в молекулах головного комплексу гістосумісності (ГКГ) антигенпрезентуючих клітин (АПК) як пептиди. Також було встановлено, що антитіла знищують клітини, блокуючи механізми росту, особливо в ракових клітин. Цитотоксичні Т-клітини (CD8+) є специфічними для молекул класу І ГКГ і реагують із пептидними антигенами, експресованими на поверхні клітини, оскільки вони презентовані як білок або пептидні фрагменти, які представлені у ГКГ. Пептиди та ГКГ разом активують Т-клітини. Ці Т-клітини руйнують несучу клітину шляхом перфорування мембрани ферментами або запускаючи аутодеструктивний апоптичний метаболічний шлях, який руйнує ці інвазивні клітини. Хелперні Т-клітини (CD4+) є регуляторами активності імунної системи. CD4+ Т-клітини також розпізнають молекули класу II ГКГ. CD4+ Т-клітини підвищують імунну відповідь за рахунок секреції цитокінів (наприклад, інтерлейкіну-2 (ІЛ2)), у результаті чого стимулюють або Т-клітинну відповідь (Т-хелпер 1), або відповідь антитіл (Т-хелпер 2). Ці цитокіни стимулюють утворення антитіл Вклітинами або підвищують утворення CD8+ Тклітин. CD4+ Т-клітини утворюють серії білкових медіаторів, називаних цитокінами, які впливають на інші клітини імунної системи, підсилюючи відповідну дію імунної системи в цілому. Генетичні зміни ракових клітин (онкоцитів) приводять до появи молекул, які відрізняються від молекул незмінених зрілих клітин. Ці змінені молекули, називані пухлинними антигенами або пухлиноасоційованими антигенами, є мішенню ефекторної реакції. У той же час, онкоцити утворюють цитокіни для індукції реплікації власної ДНК і власних процесів диференціації, наприклад, інтерферон , який секретується інфікованими вірусом клітинами й припиняє реплікацію вірусу в сусідніх клітинах. Інші цитокіни, наприклад ІЛ6 і трансформуючий ростовий фактор (ТРФ ), не можуть репарувати генетичне ушкодження, але індукують клітинну диференціацію й інгібують дію хелперних Тлімфоцитів 1 імунної системи. Токсичний ефект, що індукує процес трансформації клітин, може порушити здатність до імунного захисту (імунний контроль), індукуючи генну мутацію та імуносупресію. Крім того, нові онкоцити, при невдалій спробі репарувати свою змінену ДНК, підвищують вироблення ТРФ і/або родинних цитокінів, індукуючи імунну толерантність до себе, тому генетично змінені клітини приводять до виникнення новоутворення. В останніх дослідженнях було встановлено, що пухлини імуногенні і приблизно формують довгострокову імунологічну пам'ять. Іншою важливою обставиною є рецидив пухлини, що скорочує тривалість життя онкологічних пацієнтів. Організми деяких пацієнтів можуть ініціювати відповідь на традиційне лікування, наприклад, на хіміотерапію, 90493 8 хірургічне втручання або радіотерапію, але пухлина може утворитися заново. Відомо, що в пацієнтів, які піддавалися трансплантації нирки, згодом імовірність повторного виникнення раку в 3-5 разів вища, ніж середня ймовірність за популяцією, що частково може бути пов'язана із тривалою імуносупресією. Антигени - це чужорідні речовини, які розпізнаються та руйнуються клітинами імунної системи. Стаючи канцерогенними, клітини утворюють нові, незнайомі організму антигени. Імунна система може розпізнати ці антигени як чужорідні, і поглинути або навіть зруйнувати ракові клітини. Вірусні білки - вірусу гепатиту В (ВГВ), вірусу Епштейна-Барра (ВЕБ) і папіломавірусу людини (ПВЛ) - важливі для розвитку гепатоклітиної карциноми, лімфоми та раку шийки матки, відповідно. Онкогенні білки, глікозиловані білки та карбогідрати є раковими антигенами. Багато із цих білків розподіляються за різними типами пухлин, причому більше 500 пухлинних антигенів було ідентифіковано. Досить сильної імунної відповіді не виникає в організмі хворих на рак пацієнтів. Білки, що експресуються раковими клітинами, можуть індукувати імунна відповідь. Вакцинація Може бути багато причин, які пояснюють, чому неефективна імунна відповідь. Присутність цитокінів у середовищі не допускає ампліфікацію CD4+ Т-клітин. Пухлини в міру росту можуть секретувати імуносупресорні фактори - або безпосередньо модулюючи імунну відповідь, наприклад, вірусні білки, що зв'язують імунні рецепторні молекули та перешкоджають їх експозиції на поверхні інфікованих вірусом клітин, або діючи через фактори, які секретуються самою пухлиною, що приводить до порушення регуляції активації імунної системи. Імунотолерантність - важливий механізм, за допомогою якого пухлини уникають знищення імунною системою. Розробка стратегій імунотерапії може бути ефективною для повного знищення ракових клітин. Вони зосереджені на одержані більшої «ауто» імуногенності шляхом використання активаторів імунної системи, поставляючи антигеннесучі клітини або переводячи деяких із цих пухлинних антигенних білків в імуногенні пептиди. Клінічно застосовна протиракова вакцина повинна імунізувати проти багатьох білків, націлюючись на важливі білки, залучені в злоякісне переродження. Тому застосування лікарських засобів або речовин, називаних імуномодуляторами, може підвищити або модифікувати природну імунну відповідь, поліпшуючи гістологічні та клінічні результати вакцинації. Успішна імунотерапія повинна бути зосереджена на маніпулюванні регуляторними активностями імунної системи для руйнування ракових клітин і попередження рецидиву. У кращому варіанті свого здійснення даний винахід сфокусований на обох описаних вище імунних активностях. Живі та модифіковані аутологічні пухлинні клітини використовуються для посилення аутологічних не підданих будь-якому впливу дендритних клітин (ДК). Спільне культивування клітин обох типів здійснюється в певному середо 9 вищі для культури клітин для диференціації ДК, що не піддавалися будь-якому впливу, у ДК - індуктори ефекторної реакції. Ці ДК вводять ін'єкцією в здоровий лімфатичний вузол для початку Тклітинної ефекторної реакції проти пухлинних клітин пацієнта. Цей підхід безпечний, мало токсичний для пацієнта та забезпечує істотну та стійку протипухлинну активність у відношенні до прогресуючих та добре сформованих пухлин. Нижче в першу чергу розглядаються пухлинні антигени та клітини, що беруть участь в імунному контролі, а також додаткові форми, які допомагають уникнути розвитку онкологічного захворювання. Також описані основні імунотерапевтичні стратегії, застосовувані в даному винаході. Потім описаний патентоспроможний терапевтичний підхід, його принципи, передбачувані механізми дії та переваги над іншими підходами. Пухлинні антигени (ПА): Релевантні пухлинні антигени можуть бути розділені на дві основні категорії. До першої категорії належать специфічні пухлинні антигени (СПА), виявлені винятково в пухлинних клітинах, які є ідеальною мішенню для імунної атаки. До другої категорії належать пухлиноасоційовані антигени (ПАА), виявлені в пухлинних клітинах, але також і в деяких здорових клітинах, при цьому якісна та кількісна оцінка експресії цих молекул дозволяє їх використовувати для відмінності пухлинних клітин від здорових. Ціль протипухлинної імунотерапії полягає в ефективному лікуванні раку шляхом контролю та підвищення імунної відповіді проти СПА та ПАА. Спонтанна ремісія, спостережувана в деяких випадках злоякісних меланом і карциноми нирки, є доказом досягнення цієї мети. Пухлиноспецифічні антигени (ПCA): Ці антигени можна виявити тільки в онкоцитах. Вони були ідентифіковані в пухлинах експериментальних тварин, у білках людини вірусного походження, у мутованих онкогенах і білках, зв'язаних зі злоякісними фенотипами, спонтанними мутаціями, чиє виникнення може бути пов'язане з нестабільністю геному, властивою злоякісним клітинам. Оцінка метаболічних шляхів презентації антигену через головний комплекс гістосумісності (ГКГ) на Т-клітини пояснює, що не тільки білки зміненої клітинної мембрани можуть бути виявлені як антигени, але також внутрішні або інтерналізовані білки можуть стати специфічними пухлинними антигенами. Т-клітини розпізнають пептиди малого розміру, які утворюються в результаті руйнування цитозольних білків і вбудовуються в пептидну щілину молекули ГКГ. Ці пептиди разом з молекулою ГКГ потім транспортуються на поверхню клітини. Отже, будь-які змінені клітинні білки є потенційними імунними агентами, а не тільки білки, розташовані в мембрані. Таким чином, що нефункціонуючий білок у пухлинній клітині, утворений мутантним алелем, як в р53, потенційно є специфічним пухлинним антигеном. Пухлиноасоційовані антигени (ПАА): ПАА є молекулами пухлинних клітин, які можуть експресуватися деякими здоровими клітинами на певних 90493 10 стадіях диференціації. Їх кількісні або комбіновані експресії у зв'язку з іншими лініями клітин або диференціальних маркерів, або комбінаціями обох, можуть використовуватися для ідентифікації трансформованих клітин. Найбільш вивченими ПАА є онкофетальні антигени, які експресуються під час ембріогенезу, але відсутні або майже не виявляються в нормальній тканині дорослого організму. Прототипом ПАА є карциноембріональний антиген (КНА). -фетопротеїн і сімейство білків MAGE належать до цього типу антигенів. Імунний контроль Генетично трансформовані клітини містять антигенні білки, що відрізняються якісно та кількісно від білків нормальних клітин (відповідно СПА та ПАА). Клітини та гуморальні компоненти, які діють і в уродженій, і в адаптованій імунній відповіді, беруть участь у деструктивній відповіді трансформованої клітини та пухлини, якщо вона була сформована. Клітини, які беруть участь в імунному контролі Природні клітини-кілери (ПК): вони розпізнають і руйнують ГКГ-виснажені клітини. Ці клітини виконують свою функцію через формування пор у мембрані цільової клітини. Ці пори формуються аутоскладанням молекул порфірину в плазматичній мембрані. Структура цих клітин певною мірою гомологічна комплементу С9, і її розташування утворює пору, через яку можуть легко проходити цитолітичні ферменти типу гранзиму. Активування рецепторів Fas і ФНО на поверхні пухлинної клітини являє собою другий механізм. Обидва цих явища активують апоптоз. Такі цитолітичні активності, обумовлені відсутністю молекул ГКГ, є активностями, що відповідають природній імунній відповіді. З одного боку, природні клітини-кілери також кооперуються в прояві активності антитіл, спрямованих проти пухлини. Ці клітини щільно прикріплюються до поверхні пухлинної клітини через рецептори Fc і викликають зазначений вище літичний феномен (перфорин, активування Fas, вплив ФНО ). Ця активність розглядається як складова адаптивної імунної відповіді, викликаної пухлинами. Завдяки своїм функціям, природні клітиникілери стають основною причиною руйнування індукованих вірусом пухлинних клітин і невеликих пухлин на початковій стадії їх розвитку, причому вони активуються під дією інтерферонів та інтерлейкіну 2. Ці інтерлейкіни підсилюють літичні властивості природних клітин-кілерів. Зазначені природні клітини-кілери стають активованими (лейкінактивовані клітини-кілери, ЛАК). Руйнування онкоцитів як відповідь природних клітин-кілерів, пригнічується навіть при незначній кількості мембранних білків ГКГ 1. Однак їх присутність не пригнічує відповідь природних клітинкілерів, якщо він викликаний літичною активністю антитіл, спрямованих на пухлину. Фагоцитарні клітини: Клітини з фагоцитарною активністю проявляють специфічний протипухлинний механізм дії, який може використовуватися з терапевтичними цілями. При активуванні Тлімфоцитами ці клітини можуть передавати в пухлинні клітини: лізоцими, пероксидні радикали, ок 11 сид азоту та ФНО, які руйнують пухлинні клітини за допомогою різних механізмів. Однак їх найбільш важлива протипухлинна активність здійснюється завдяки антиген-презентуючої здатності, в основному презентуючої здатності лімфоцитів CD4. Відомо, що пухлини не мають на своїй поверхні молекул ГКГ2, отже, вони не можуть виявити своїх властивостей пухлинних антигенів по відношенню до клітин-хелперів. Активовані макрофаги можуть здійснювати презентування цих антигенів і індукувати активування і регуляторних, і ефекторних CD4+ лімфоцитів. Вони також презентують антигени лімфоцитам CD8+ та B-клітинам. Найбільш спеціалізованими клітинами в імунній системі, завдяки властивій їм фагоцитарній здатності та здатності до презентації, є дендритні клітини. Одна дендритна клітина може контактувати з 1000 не підданих якому-небудь впливу лімфоцитів CD4, і із цієї причини дендритні клітини представляються в організмі найбільш ефективними. У зв'язку із цим їх використовують у терапевтичних цілях. У даний час ДК розглядають як найкращі ад'юванти, оскільки їх сигнал у штучно контрольованому середовищі індукує стимулювання імунної системи проти пухлини. Ці клітини також є мішенню для інгібувальної секреції пухлинних клітин. Секреція пухлиною простогландину, ТРФ і ІЛ10 впливає на макрофаги за рахунок індукції генерації інгібувальних (і регулюючих) властивостей популяції лімфоцитів при відторгненні. Лімфоцити: найбільш сильну протипухлинну дію мають Т-лімфоцити групи ефекторів CD4 та CD8. Поява та розвиток таких супресорних Тклітинних популяцій, на жаль, не перешкоджає росту та метастазуванню пухлин по всьому організму. Ці супресорні лімфоцити були описані як субпопуляції CD4 лімфоцитів, що несуть СD25позитивний маркер на клітинній мембрані. Ефекторна відповідь Т-клітин безпосередньо вбиває клітини пухлини й активує інші компоненти імунної системи. Протипухлинна імунна дія, спрямована проти популяцій CD4 і CD8, є антигенспецифічною. Ці лімфоцити виявлені не тільки в периферичній крові пацієнтів, але також в інфільтрувальних пухлинних клітинах. Раніше було описано, що активність клітин CD4 найбільш важлива як стримуючий фактор якісної та кількісної протипухлинної відповіді. Однак їх дія залежить від антигенної презентації, здійснюваної відповідними спеціалізованими клітинами, оскільки пухлини не експресують молекули ГКГ II. Навпаки, цитотоксичні Тклітини можуть розпізнавати клітинні антигени в ГКГ І. Однак в упорядкованих умовах і через втрату спів-стимулюючих молекул пухлинні клітини індукують імунологічну толерантність клітин CD8, специфічних відносно пухлин. На противагу їм, лімфоцити CD8 не мають потреби в таких співстимулюючих сигналах для лізису пухлин. Механізми лізису, які вони використовують, схожі з аналогічними механізмами, що використовуються клітинами-кілерами: апоптоз і формування пор у плазматичній мембрані. В-клітини: Потужна дія відповіді реципієнта на імунітет пухлини була підтверджена несподіваним виявленням реакційноздатних протипухлинних 90493 12 антитіл у сироватці хворих. Фундаментальний механізм дії полягає в лізисі клітин за допомогою антитіл (АОКЦ). Механізм антибактеріальної деструкції, якому сприяє комплемент, приблизно має менше значення в протипухлинній дії. У підсумку, декілька експериментів підтвердило припущення про те, що атака специфічного антитіла на пухлину приводить до зникнення антигену, індукуючого імунну відповідь, у результаті формуються (за рахунок негативної селекції) популяції, стійкі до такого літичного механізму. Звідси випливає, що клітини стають чутливими до руйнування клітинамикілерами, якщо антитіла приводять до зникнення комплексів ГКГ І у клітинній мембрані. Декілька моноклональних антитіл, наприклад, герцептин, який діє проти білка онкогену HER2-NEU, розроблявся як комерційний препарат для терапевтичного застосування. Ця молекула експресується в 25% клітин метастазів раку яєчників і раку грудей, причому Управління з контролю над продуктами та ліками США схвалило його терапевтичне застосування для лікування пацієнтів з такими діагнозами. Іншим таким антитілом є продукт ритуксимад, який спрямований проти детермінанту клітин CD20, і тому успішно застосовується для лікування Влімфом. Інші антитіла в даний час проходять клінічні випробування. Імунологія пухлинних клітин: пухлинні клітини мають декілька молекул, які можуть бути мішенню запальної протипухлинної відповіді. Однак хоча лімфоцити, які розпізнають ці антигени, були виділені із крові в ділянці пухлини, не можна викликати результативної ефекторної функції відносно новоутворення. Цитологічні властивості пухлинних клітин пояснюють або дають підставу для пояснення цього феномена: пухлинні клітини не мають на своїй поверхні комплексів ГКГ II, і це є причиною, чому вони не можуть презентувати свої протипухлинні білки лімфоцитам CD4, а також мають слабку експресію комплексу ГКГ І. Ці властивості приводять до пригнічення активності природних клітин-кілерів і до слабкої активації відповіді в клітинах CD8. Ця остання обставина ускладнюється тим, що більшість пухлинних клітин не презентує спів-стимулюючих молекул на своїх поверхнях. Така втрата рецепторів для співстимулюючих молекул викликає розвиток анергії в лімфоцитів CD8. Пухлинні клітини у великій кількості секретують протизапальні речовини. Деякі із цих речовин поки ще не ідентифіковані. Утворення простогландіну відбувається шляхом блокування активації макрофагів. Ця речовина може пригнічуватися одночасним введенням індометацину або інгібіторів СОХ2. Пухлинні клітини також можуть утворювати велику кількість ТПФ або ІЛ10. Ці цитокіни є молекулами, що контролюють диференціацію клітин. Оскільки пухлинні клітини втрачають нормальну клітинну диференціацію, вони також втрачають сигнали негативної регуляції, для того щоб контролювати синтез цієї речовини. Проведені дослідження дозволили встановити паралель між здатностями до метастазування пухлин підшлункової залози, пухлин грудей, гліом, внутрішньоклітиного раку та інших і синтезом цих цитокінів. Їх 13 найбільш важлива дія полягає в приведенні в певний стан антигенпрезентуючих клітин таким чином, що вони індукують появу специфічних супресорних лімфоцитів проти ракових антигенів. Динамічний зв'язок між імунною системою та пухлиною: Методики змішаної культури пухлини та пухлинних клітин дозволили детально досліджувати антигенну композицію цитотоксичних Т-клітин, які діють проти пептидів меланоми. Були клоновані та вивчені амінокислотні послідовності специфічних пухлинних антигенів. У цих дослідженнях зроблено три важливі відкриття. Перше: у меланом є не менше п'яти різних антигенів, які можуть розпізнаватися як цитотоксичні Т-клітини. Друге відкриття полягає в тому, що цитотоксичні Тлімфоцити, які діють проти антигенів меланоми, не розмножуються in vivo. Це означає, що раніше згадані антигени не імуногенні in vivo. Третє відкриття полягає в тому, що можлива негативна селекція in vitro, а також можлива in vivo експресія цих антигенів через присутність специфічних цитотоксичних Т-клітин. Ці відкриття дозволяють сподіватися на застосування протипухлинної імунотерапії. Крім того, встановлено, що ці антигени у своїй природній формі не мають високої імуногенності, тому слід обережно ставитися до можливості селекції пухлинних клітин in vivo, яка може бути не розпізнана й не елімінована цитотоксичними Тклітинами. Для того щоб забезпечити собі можливість росту, пухлина повинна генерувати серію механізмів динамічного відхилення. У випадку протиріччя з будь-якою протипухлинною стратегією, пухлина відповідає адаптацією через розвиток нової форми відхилення. Поява змінених молекул викликає формування гуморальних імунних відповідей через появу специфічних антитіл та їх наступної деструкції за рахунок АОКЦ. Природні клітини-кілери беруть активну участь у цьому явищі. Відбувається індукція селекції популяції таких клітин з низькою експресією відповідних поверхневих антигенів або навіть без цієї експресії. У той же час фагоцитоз зруйнованих клітин індукує відстрочену клітинну імунну відповідь проти цих внутрішньоклітинних антигенів, які можуть бути віднесені до класу І молекул ГКГ. Відбувається нова селекція клітин, які несуть різні антигени, і/або клітин без спів-стимулюючих молекул. У підсумку селекція більшою мірою недиференційованих клітин безпосередньо пов'язана з підвищенням рівня інгібувальних факторів, наприклад, інтерлейкіну 10 і ТРФ , утворених пухлиною. Ці речовини індукують дендритні клітини таким чином, що вони стають промоторами специфічних супресорних клітин. Це явище сприяє розвитку стійкості пухлини, яка може рости та поширюватися зовсім вільно. Такі терапевтичні підходи, засновані на маніпулюванні імунною системою, що ігнорують такі динамічні зміни клітинної популяції, приречені на невдачу, оскільки єдиний вибраний методичний підхід приводить до зазначеного вище явища селекції й через це до невдалих результатів протягом тривалого часу. Відсоток пухлин, що відповідають на єдиний імунотерапевтичний підхід, становить менше 20%, незважаючи 90493 14 на ефективність та силу такого підходу. Отже, для одержання бажаного ефекту в задовільний термін повинна застосовуватися комбінована методика, яка відбиває описану динаміку. Імунотерапія Хоча імунна система організму хазяїна часто нездатна знищити ріст пухлини, є декілька індикаторів можливого маніпулювання та поліпшення імунної системи для знищення пухлини. Деякі із цих індикаторів наступні: присутність пухлинних антигенів, що виявляються у більшості пухлинних клітин, виявлення фіксуємої, хоча й неефективної відповіді організму хазяїна, та краще розуміння механізмів, за допомогою яких пухлинні клітини відторгають імунну відповідь. Попередні методологічні досягнення в цій галузі дали новий імпульс для імунотерапії пухлинними антигенами. Серед них: методики виділення субпопуляцій лімфоцитів, ідентифікації та очищення пухлинних антигенів, одержання селективних за антигеном Т-клітин, підвищення імунних відповідей цитокінами та одержання антитіл, які націлюються на антигени на поверхні пухлини. Моноклональні антитіла (MKA) проти пухлинних антигенів використовуються або окремо, або в сполученні з токсинами, які перешкоджають росту пухлини. Поява моноклональних антитіл означає, що існує можливість націлюватися на пухлині та руйнувати їх. Специфічні пухлинні антитіла правого ізотипу можуть направляти лізис пухлинних клітин природними клітинами-кілерами і активувати природні клітини-кілери за їх Fc рецепторами. Для цього слід виявити специфічний пухлинний антиген, який є молекулою клітинної мембрани. Після цього мишу імунізують вибраним антигеном. Потім селезінку миші видаляють і її тканину розділяють для одержання суспензії клітин лімфоцитів. Потім лімфоцити гібридизують із клітинами мієломи, що утворюють IgG. Одержана суспензія гібридних клітин називається гібридомою. Суспензію розводять і культивують в 96-лунковому планшеті. Гібридні клітини нашаровують таким чином, що в кожній лунці виявляється декілька із них. Потім їх залишають рости, а супернатант із кожної лунки аналізують для визначення тих клітинних клонів, які утворюють антитіла. Потім клони, що секретують IgG розмножують, і утворене антитіло аналізують для визначення його специфічності та ефективності в розпізнаванні різних пухлин того ж клітинного типу, але одержаних від різних пацієнтів. Після цього відібрані клони розмножують. Антитіла, придатні для використання, екстрагують із супернатантів цих клонів. Коли за допомогою молекулярної інженерії Fc частину антитіла заміщують аналогічною частиною, але людського походження, антигенність такої молекули знижується. Такі антитіла називаються «гуманізованими». Управління з контролю над продуктами та ліками CШA недавно схвалило застосування препарату гуманізованих моноклональних антитіл, герцептину для лікування раку грудей. Це антитіло взаємодіє з рецептором ростового фактора HER2/neu. Цей рецептор надлишково експресується майже у чверті пацієнтів з раком грудей. Така над 15 лишкова експресія відповідає за HER-2/neuіндуковану протипухлинну відповідь Т-клітин, хоча HER-2/neu пов'язували з гіршим прогнозом. Припускають, що герцептин діє шляхом блокування взаємодії рецептора і його природного ліганду, тим самим, знижуючи рівень експресії рецептора. Дія цього антитіла може зрости при сполученні його застосування зі звичайною хіміотерапією. Другим антитілом, застосування якого схвалило управління з контролю над продуктами та ліками США, є продукт ритуксимаб, який діє через розпізнавання CD 20. Він застосовується для лікування В-клітин неходжкінської лімфоми. Злиття та групування CD 20 посилає сигнал, який індукує апоптоз лімфоцитів. Моноклональні антитіла, кон'юговані з емульгувальними радіоізотопами, застосовувалися з метою візуалізації пухлин для моніторингу розміру пухлини та постановки діагнозу. У першому відомому випадку успішного лікування раку моноклональними антитілами, використовували антиідіотипові антитіла до мішені тих Вклітин, чий імуноглобулін експресував відповідний ідіотип. Перша частина лікування звичайно приводить до ремісії, але пухлина з'являється знову в мутантній формі, яка не зв'язує антитіло, яке використовувалося в початковій стадії лікування. Цей випадок є переконливим прикладом генетичної нестабільності, яка допомагає пухлині зберегтися. Інші проблеми, пов'язані з терапевтичним застосуванням пухлиноспецифічних або пухлиноселективних моноклональних антитіл, полягають у неефективному знищенні клітин після злиття з моноклональним антитілом і в неефективному проникненні антитіла в масу пухлини. Першу проблему часто вдається уникнути за рахунок зв'язування токсину з антитілом. Для цього призначений реагент, називаний імунотоксином. Два токсини, показаних для цього способу, називаються ланцюгом А рицину та токсином Pseudomonas. Для обох підходів потрібна інтерналізація антитіла, для того щоб відбулося відділення молекули токсину від молекули антитіла в ендоцитному компартменті, у результаті стає можливим проникнення ланцюга токсину й у результаті загибель клітини. У двох інших дослідженнях використовують кон'юговані моноклональні антитіла, з'єднані з хіміотерапевтичними лікарськими засобами, наприклад, з адріаміцином, або з радіоізотопами. У першому випадку за рахунок специфічності моноклонального антитіла до антигену пухлинних клітин відбувається концентрація лікарського засобу за місцем локалізації. Після інтерналізації лікарський засіб вивільняється в ендосоми та проявляє свій цитостатичний або цитотоксичний ефект. Моноклональні антитіла, зв'язані з радіоізотопами, концентруються в вогнищі на поверхні пухлини. Обидва ці підходи корисні, оскільки вони вбивають сусідні пухлинні клітини за рахунок вивільнення лікарського засобу або емісії радіоактивної речовини, які можуть впливати на клітини, сусідні з тими, до яких приєдналося антитіло. Карциноембріональний антиген (KEA) є прикладом пухлинного антигену - мішені моноклональних антитіл. Рецидивуючий колоректальний рак 90493 16 може бути виявлений за допомогою радіоактивно міченого моноклонального антитіла проти KEA. Цей спосіб у даний час знаходиться на стадії дослідження для діагностики та терапії цієї форми новоутворення. Дендритні клітини Було встановлено, що ДК є «родоначальниками» антиген-презентуючих клітин, чиєю природною функцією є обробка та доставка чужорідних антигенів та «сигналів небезпеки» у лімфовузли для презентації Т-клітинам і вироблення захисної імунної відповіді. Після активування та «дозрівання» ДК підвищується їх здатність стимулювати Тклітини. У нормі ДК присутні в шкірі та в інших вісцеральних органах, де вони можуть зіштовхнутися з патогенами та іншими антигенами, і на ранніх дослідженнях було встановлено, що внутрішньошкірна ін'єкція ДК, після їх посилення антигенами, індукує регресію меланоми та колоректального раку. ДК утворяться в кістковому мозку. ІЛ2, ІЛ3, SCF, Fit3L, ФНО та ГM-KCM впливають на їх ранню диференціацію. Цей останній цитокін індукує проліферацію форм, які знаходяться на ранній стадії диференціювання, і сприяє вивільненню цих клітин у кров'яне русло. Однак ДК є найбільш потужними векторами, здатними до генерації імунних відповідей від Т-клітин, які не піддаються будьякому впливу, застосовуваних у процесінгу та доставці протиракових антигенспецифічних вакцин. Протиракові вакцини медичного призначення, засновані на дендритних клітинах (ДК), навантажених протираковими антигенами, являють особливий інтерес, оскільки вони відіграють головну роль в імунітеті. ДК були виявлені по всьому організмі, зокрема в тих ділянках, які використовуються вхідними ділянками для інфекції. У численних дослідженнях, виконаних на тваринних моделях, встановлено, що ДК, навантажені протираковими антигенами, можуть захищати від пухлинного стимулу і що імунізації на основі ДК можуть знизити прогресування раніше імплантованих пухлин. Наприклад, миші, імунізовані дендритними клітинами, навантаженими антигенами клітинної лінії меланоми В16, можуть попередити прогресування імплантованих пухлин. Для імітації фізіологічної міграції ДК у регіональні лімфовузли, ДК вводили різними способами: внутрішньовенно (BB), підшкірно (ПК), внутрішньошкіряно, у лімфовузли, у лімфатичні судини та всередину пухлини. Введення цитокінів, поряд із ДК, може підсилити імунну відповідь, індуковану імунізаціями. У даному винаході тималфазин застосовується як імуностимулятор, що підсилює клінічну відповідь на вакцинацію ДК у пацієнтів, які не є респондентами. У більшості досліджень вакцин на основі ДК додержуються приблизно єдиної схеми. Пацієнтів піддають лейкоферезу для одержання ДК. Звичайно фракція ДК використовується для першої імунізації свіжою, а ДК, що залишилися, консервують заморожуванням для наступного застосування. ДК навантажують антигеном перед імунізацією, хоча в деяких дослідженнях навантаження проводять перед консервуванням заморожуванням та 17 ким чином, що вакцина ДК готова до застосування після відтавання. Оптимальний інтервал або тривалість імунізації невідомі, але звичайно імунізація проводиться один раз на 1-3 тижні. ДК, навантажені непридатними антигенами, також використовують як позитивні і негативні контролі імунізації. Периферичну кров відбирають для моніторингу індукції імунної відповіді, але для проведення інтенсивних імунних аналізів кінцевого продукту може проводитися повторний лейкоферез. Для клінічних досліджень у даний час проводяться різні аналізи. Крім вимірювання активності in vivo, можна описати Т-клітинну відповідь in vitro шляхом визначення утворення цитокіну, за проліферацією або за цитотоксичною активністю Т-клітин у відповідь на імунізуючий антиген. Оскільки дослідження, яке представляється є звичайним, вакцини ДК були з вираженою стійкістю до мінорної токсичності. У даний час проводяться дослідження з іншими потужними онкологічними вакцинами (клітинними вакцинами, вакцинами мелацинами, алогенними клітинними вакцинами з/без БЦЖ, вакцинними онколізатами, вакцинами супернатантів, які не містять клітин, генетичними вакцинаціями, вакцинами вірусних векторів). Було розпочато багато спроб підвищити імуногенність протиракових вакцинацій, у тому числі використовуючи гемоцианін молюска блюдечка (ГМБ) - білка з морського молюска Megathura crenulaa, що живе на узбережжі Каліфорнії та Мексики. ГМБ є великим білком, що викликає імунну відповідь і діє як носій протиракових клітинних антигенів. Протиракові антигени часто є білками відносно невеликого розміру, які можуть бути непомітними для імунної системи. ГМБ забезпечує додаткові сайти розпізнавання для клітин імунної системи, називаних Т-хелперними клітинами, і можуть підвищити активацію інших клітин імунної системи, називаних цитотоксичними Тлімфоцитами (ЦТЛ). Бацила Кальмета-Герена (вакцина БЦЖ): неактивна форма викликаючої туберкульоз бактерії, традиційно використовуваної протягом десятиліть для вакцинації проти туберкульозу. Вакцину БЦЖ додають у деякі протиракові вакцини, розраховуючи, що вона підсилить імунну відповідь на антиген вакцини. Чітко не встановлено, чому БЦЖ може бути особливо ефективна для індукції імунної відповіді. Проте, БЦЖ роками застосовується з іншими вакцинами, у тому числі з вакциною проти туберкульозу. Інтерлейкін-2 (ІЛ2): білок, утворений імунною системою організму, який може підсилити здатність знищувати рак у певних спеціалізованих клітин імунної системи, називаних клітинамикілерами. Хоча він може активувати імунну систему, багато дослідників вважають, що тільки один ІЛ-2 не може запобігти рецидиву раку. Деякі протипухлинні вакцини використовують ІЛ2 для посилення імунної відповіді на специфічні ракові антигени. Колонієстимулюючий фактор гранулоцитів і моноцитів (ГМ-КСФ): білок, який стимулює проліферацію антиген-презентуючих клітин. 90493 18 QS21: рослинний екстракт, який при додаванні в деякі вакцини може поліпшити імунну відповідь. Ці препарати призначені для підвищення біологічної реакції на протиракові вакцини. Раніше не було описане застосування імуностимулюючого препарату широкої дії тимозину альфа-1 (тималфазину) як імуностимулятора в комбінації із протираковими вакцинами. У даному винаході було виявлено, що цей агент модифікує або підвищує біологічну відповідь на вакцинацію дендритними клітинами (протиракові вакцини). Було застосовано імуностимулюючий лікарський засіб для лікування пацієнтів з раком грудей, у яких раніше не було одержано вираженої відповіді на вакцинування дендритними клітинами. Тималфазин альфа 1 або T 1 - пептид, який використовувався завдяки властивій йому імуномодулюючій дії й, у зв'язку із цим, терапевтичному ефекту при деяких захворюваннях, у тому числі при хронічних гепатитах В та С, синдромі набутого імундефіциту (СНІД), первинних імунодефіцитних захворюваннях, при зниженій відповіді на вакцинацію та при раку. Основа ефективності T 1 при цих захворюваннях проявляється головним чином через модулювання імунологічної реактивності. Було встановлено, що цей лікарський засіб має сприятливий вплив на багато параметрів імунної системи й підвищує диференціацію та дозрівання Т-клітин. Природний тималфазин альфа 1 вперше був виділений із тканини вилочкової залози. Чистий синтетичний пептид складається з 28 амінокислот і ацилований з аміно-кінця (молекулярна маса 3108). У даний час TA1 одержують твердофазовим пептидним синтезом. Ендогенний тималфазин може бути виявлений у сироватці, і його рівні в здорових дорослих людей, визначені імуноаналізом, знаходяться в діапазоні 0,1-1нг/мл. Джерело та механізм виділення та регуляції циркуляції тималфазину невідомі. Можливо, тималфазин має внутрішньоклітинні рецептори, оскільки він може складатися в структуровану спіраль в органічних розчинниках і, таким чином, може перетинати мембрану самостійно. Тималфазин стимулює стовбурні клітини до продукування підвищеної кількості зрілих Т-клітин. Додавання тималфазину в культуру стовбурних клітин CD34 людини підвищує тимопоез, що приводить до збільшення загального числа CD3 Тклітин і синтезу інтерлейкіну-7 (ІЛ7) - цитокіну, необхідного для дозрівання тимоцитів. Зрослою домінуючою субпопуляцією були хелперні Т-клітини (CD4). Підвищене формування клітин CD3, CD4 і CD8 у пацієнтів із хронічним гепатитом В24 і раком. Підвищена активність природних клітин-кілерів у різних тваринних моделях, у здорових людей і у СНІД-інфікованих пацієнтів. Тималфазин може підвищити продуктивність -інтерферону, ІЛ2, ІЛ3 і експресію рецептора ІЛ2 з наступною активацією мітогенами або антигенами. Така схема підвищеного утворення цитокіну, тобто -інтерферону та ІЛ2, показує, що тималфазин індукує тип хелперних Т-лімфоцитів 1 імунної відповіді та викликає значне збільшення рівня утво 19 рення ІЛ2, а також знижує рівні утворення цитокінів хелперних Т-лімфоцитів 2 ІЛ4 і ІЛ10. Тималфазин протидіє індукованому дексаметазоном апоптозу в тимоцитах in vitro за типом залежності доза-ефект. Це явище було найбільш вираженим у двічі позитивних (CD4CD8) незрілих Т-клітин. Апоптоз тимоцитів, викликаний сироваткою від мишей з пухлинами, також знижувався при використанні тимозину. Раніше досліджували застосування тималфазину для лікування в людей інфекційних захворювань (гепатиту В, гепатиту С, синдрому набутого імунодефіциту) як агенту, що підсилює дію вакцини, а також для лікування деяких ракових захворювань, але тималфазин не використовували як імуномодулятор при лікуванні протираковими вакцинами. Цей лікарський засіб показав свою ефективність на декількох модельних тваринах з раком, яка полягає в поліпшенні імунної функції. У багатьох хворих раком подавлений клітинний імунітет, і прогресування деяких форм рака ймовірно пов'язане з ослабленою супресією пухлин імунною системою. Механізм дії, який пояснює яким чином тималфазин може поліпшити клінічну відповідь на протиракові вакцини, повністю не встановлений. Його дія може бути пов'язана з багатьма механізмами, властивими цьому лікарському засобу, і/або з іншими, які дотепер не встановлені. Його дія може бути пов'язана з поляризацією цитокіну відносно хелперного Т-лімфоциту 1 і компонента комплементу C1, що у свою чергу приводить до індукції ДК проявляти скоріше ефекторну, ніж супресорну імунну активність. Тималфазин є безпечним лікарським засобом і його можливі побічні ефекти незначні. У даному винаході описано, що застосування ДК - ОВГ є активним імунотерапевтичним лікуванням, яке полягає в періодичній імунізації пацієнтів з аутологічними дендритними клітинами (ДК), що культивуються разом з аутологічними раковими клітинами, гібридизованими з активованими аутологічними В-клітинами (ОВГ). ОВГ застосовують як ракові антигени, а ДК використовують як антиген-презентуючих клітин. У кращих варіантах здійснення даного винаходу описані деякі властивості, які мають перевагу для досягнення терапевтичних результатів у пацієнтів із прогресуючими неопластичними захворюваннями. Хоча доцільно одержати велику кількість клітин, що можливо, наприклад, хірургічним відсіканням шматочка тканини пухлини, кількості ракових клітин, одержаних за допомогою пункціонної біопсії, досить для розробки ОВГ. При цьому пацієнти позбавлені від необхідності піддавати себе будьякому зайвому хірургічному ризику. З іншого боку, і про це згадується нижче, антигенність метастазів, мабуть, є різною в різних органах. Отже, краще використовувати неізвазивний спосіб одержання пухлинних клітин практично від кожної ділянки метастазу в пацієнта. В-лімфоцити - клітини, які, будучи однократно ініційованими, стають через свою ефективність 90493 20 другим найбільш потужним типом антигенпрезентуючих клітин в імунній системі. З іншого боку, якщо культури В-клітин стимулюються ІЛ6, вони можуть продовжувати ріст протягом, принаймні, 6 місяців. Така чутливість до ІЛ6 передається популяції ОВГ після злиття клітин. Отже, ОВГ можна одержати від декількох клітин пухлини та підтримувати in vitro протягом декількох місяців, без втрати їх потенціалу та антигенної різноманітності. Після обробки ДК таким гібридом, вони захоплюють практично всі можливі пухлинні антигени, які присутні в природному стані різних популяцій неопластичних клітин. Ці антигени презентовані на поверхні ОВГ разом із групою спів-стимулюючих і адгезивних молекулярних властивостей активованих В-клітин, які дозволяють здійснювати вкрай ефективне захоплення та переробку дендритними клітинами, навіть при низькому рівні концентрації. Ефективність терапевтичного лікування за участю ДК очевидно безпосередньо пов'язана з тим, з якого джерела одержані ці клітини. Відповідно до літературних узагальнень, приблизно в 68% пацієнтів, яких лікували ДК, одержаними шляхом мобілізації молодих та зрілих форм із кісткового мозку, спостерігалася редукція маси пухлини більш ніж на 50%, а в пацієнтів, яких лікували ДК, одержаними in vitro шляхом диференціації CD34+ або циркулюючих моноцитів, редукція була менш ніж 20%. ДК, що застосовувалися в зразку протоколу даного винаходу, були одержані з лейкоцитної плівки пацієнтів, яких стимулювали низькими дозами ГМ-КСФ протягом п'яти діб. Вони включають колекцію зрілих та незрілих форм і повільну течію CD34+. З іншого боку культивування in vitro із ГМКСФ і ФНО тільки протягом трьох діб й за відсутності ІЛ4 допускає диференціацію ефекторних ДК і перешкоджає диференціації інших можливих презентуючих клітинних форм, наприклад, CD34+, CD14+ або моноцитів. Не було виявлено достовірних статистичних розходжень між імунною відповіддю та виживаністю пацієнтів, якщо ДК, які застосовувалися для імунізації, були одержані шляхом осадження або негативною селекцією з використанням суміші антитіл, серед яких немає CD34+ і CD14+. Зразок протоколу ДК надходять із кісткового мозку. ІЛ3, ЦСЖ, Fit3L, ФНО та ГМ-КСФ впливають на їх ранню диференціацію. Цей останній цитокін індукує проліферацію форм ранньої стадії диференціації та сприяє потраплянню цих клітин у кров'яне русло. Підшкірне введення ГМ-КСФ забезпечує важливий процес - переміщення ДК у кров. Потім їх можна виділити в терапевтично необхідній кількості зі зразка крові, одержаного аферезом, з наступною негативною селекцією, використовуючи для цієї мети комерційний набір StemSep™ для ДК фірми Stem Cell Technology, Ванкувер, Канада. ГМ-КСФ, який використовувався в даному винаході є людським рекомбінантом в Е. coli, що випускається фірмою Cassara Laboratory, Аргентина. Вибрана доза становить 150мкг, введення в організм проводили щодня 21 ввечері (приблизно в 19 год) протягом п'яти діб підряд. Як видно із цієї схеми доз і введення встановлено, що високий ефект пов'язаний із числом одержаних ДК, низьким збільшенням гранулоцитів і появою побічних ефектів. Із цього моменту ДК із кісткового мозку, здатні проникати в кров'яне русло, мають наступні властивості: (1) Здатність проходити через стінки капілярів. Вони також мають низьку рухливість. (2) Виражену здатність до фагоцитозу, але слабку антигенпрезентуючу здатність. (3) Не можна визначити, що вони індукують ефекторну реакцію або реакцію стійкості. Вони надходять у тканину й залишаються в ній у стані готовності, а під впливом цитокіну в мікрооточенні, а також для фагоцитарної дії, вони диференціюють у зрілі форми, що набувають наступних характеристик: (1) Ці мембранні рецептори мутують і набувають здатність мігрувати із тканин у капіляри лімфатичної системи й проходити крізь них. Вони набувають більшої рухливості, але втрачають свою здатність проходити через стінки капілярів. (2) Вони втрачають здатність до фагоцитозу, але підвищують свою антиген-презентуючу здатність. (3) Вони проявляють себе як індуктори регуляторної або ефекторної імунної реакції. Опис лікування Зразки одержували від різних метастазів пацієнта. За допомогою аферезису та наступного процесу, що виконувався в лабораторії, В-клітини пацієнта очищали й активували in vitro протягом 48 год шляхом додавання ІЛ4 і ІЛ6. У підсумку пацієнтів імунізували активованими аутогібридними Bклітинами або гібридними В-клітинами, які спільно культивувалися з дендритними клітинами пацієнта. Така імунізація здійснювалась в здоровий лімфузел один раз кожні три тижні. Одночасно пацієнтам вводили підшкірно 1,6мг тималфазину у вечірній час (від 19 до 21 год) раз на три доби протягом часу імунізації, і в наступні шість місяців після протоколу вакцинації завершують. Такий план вакцинації може, наприклад, включати 4-10 доз, хоча їх число може бути іншим. В-клітини були одержані з лейкоцитної плівки периферичної крові пацієнтів методом гемаферезу. У результаті методом аферезу одержують матеріал, який потім висівають у градієнт FicollHypaque. Мононуклеарне клітинне кільце, одержане в ранній інтерфазі, є джерелом В-клітин, які виділяють негативну селекцію, використовуючи комерційний набір фірми Stem Cell Technology, Ванкувер, Канада. В-клітини культивують у середовищі без сироватки, збагаченої ІЛ4 і ІЛ6. Зразок пухлини одержують хірургічним шляхом або пункціонною біопсією. Одночасне цитологічне підтвердження виділеного матеріалу проводять у кожному випадку. Зразок пухлини механічно розділяють на окремі клітини. Одержану суспензію окремих клітин культивують у середовищі без сироватки, збагаченої альбуміном людини, інсуліном і епідермальним ростовим фактором. Активовані лімфоцити та виділені клітини пухлини потім гібридизують з використанням розчину 90493 22 поліетиленгліколю. Формування ОВГ контролюється імунним подвійним забарвленням із застосуванням CD20 як В-клітинного маркера і антицитокератину або антивіментину залежно від джерела пухлинних клітин. Потім гібриди культивують у середовищі без сироватки, збагаченому інсуліном, епідермальним ростовим фактором і ІЛ6. Аутологічні ДК, одержані гемаферезом після мобілізації з кісткового мозку. Мобілізацію проводять шляхом стимулювання пацієнта ГМ-КСФ протягом 5 діб. Лейкоцитну плівку, яка відповідає подвійному об'єму крові за даним способом, збирають шляхом аферезису на шосту добу. Змішану популяцію незрілих і диференційованих ДК концентрують із лейкоцитної плівки пацієнта. Таке концентрування та стадія очищення можуть виконуватися або диференціальним адгезивним методом, або негативною селекцією. Мононуклеарні клітини розташовані шарами у флаконі для культури тканини, і через чотири години супернатант акуратно вилучають. Потім прикріплені до субстрату клітини культивують у придатному середовищі для культури тканини, описаної нижче. При негативній селекції мононуклеарні клітини інкубують із сумішшю 8 моноклональних антитіл (МАТ) проти: CD3, CD14, CD16, CD19, CD 34, CD56, CD66b та глікофорину А. Кожне моноклональне антитіло кон'югують з імунною магнітною сферою. Суспензію мічених клітин очищають, пропускаючи через магнітне поле. Маркіровані клітини утримуються, а не маркіровані клітини збираються в стерильній пробірці. Одержана суспензія немаркованих клітин складається на 50% (40-60%) з незрілих та зрілих ДК. Суспензію аутологічних збагачених ДК культивують разом з аутологом ОВГ протягом трьох діб в середовищі без сироватки, збагаченому альбуміном людини, ГМ-КСФrh і ФНОrh. ДК відмивають, концентрують і вводять ін'єкцією в один зі здорових лімфовузлів пацієнта після культивування ДК протягом 72 год, потім визначають безпеку, чистоту та потенцію. Дана методика показує декілька властивостей, корисних для одержання гарних терапевтичних результатів у пацієнтів із прогресуючими новоутвореннями. Хоча доцільно одержати велику кількість клітин, що можливо, наприклад, хірургічним відсіканням шматочка тканини пухлини, кількості ракових клітин, одержаних за допомогою пункціонної біопсії, досить для розробки ОВГ. Антигенність метастазів, мабуть, є різною в різних органах. Отже, бажано використовувати неізвазивний спосіб одержання пухлинних клітин практично від кожної ділянки метастазу в пацієнта. В-лімфоцити - клітини, які після активування стають другим найбільш потужним типом антигенпрезентуючих клітин в імунній системі. З іншого боку, якщо культури В-клітин стимулюються ІЛ6, вони можуть продовжувати рости, принаймні, 6 місяців. Ця чутливість до ІЛ6 переноситься на популяцію ОВГ після злиття клітин. Отже, ОВГ можуть бути одержані від декількох пухлинних клітин, підтримуватися й розмножуватися in vitro протягом декількох місяців без втрати 23 свого потенціалу та антигенної різноманітності. Після експозиції ДК таким гібридом вони захоплюють практично всі можливі пухлинні антигени, які є присутніми у природному стані на клітинах різних неопластичних клітинних популяцій. Ці антигени презентовані на поверхні ОВГ разом із групою спів-стимулюючих та адгезивних молекул, властивих активованим В-клітинам, що дозволяє ДК вкрай ефективно захоплювати та переробляти їх, навіть при низьких рівнях концентрації. Оскільки ОВГ презентуються в ДК із початку процесів дозрівання й активування in vitro, допускається інкорпорування пухлинних антигенів за короткий період, протягом якого ДК здатні виконати цей процес. Незабаром після поглинання пухлинних антигенів здатність ДК процесувати і презентувати антигени досягає максимального рівня ефективності. Вони також набувають здатності мігрувати із кровоносних судин у тканині. Таким чином, ін'єкція в лімфовузли представляється більш ефективною, ніж трансфузія вакцини ДК у кров. Однак за одну процедуру мобілізації з кісткового мозку одержують невелике число ДК. Коли ці ДК стимулюються застосуванням антигенів, які представляють всю пухлину, наприклад, лізатом хірургічно вилученого шматочка пухлини, або гібридом пухлинних клітин і ДК, зразки можуть бути розділені на різні частини для досягнення ефективності з часом. З погляду клінічної еволюції, деякі пацієнти мають спонтанну успішну еволюцію при введенні тільки однієї вакцини. Відомо, що в пацієнтів із прогресуючим раком грудей, стійким до хіміо-, радіо- і гормонотерапії, низька виживаність. Був розроблений протокол вакцини аутологічних дендритних клітин (ВДК), у результаті чого може покращитися результат лікування пацієнтів. Було встановлено, що тималфазин (фірма ZADAXIN®) підвищує відповідь хелперних Тлімфоцитів 1, асоційованих з регресією пухлини. Наступне дослідження було проведено для оцінки імунізації дендритними клітинами й з'ясування здатності тималфазину позитивно впливати на наступний стан пацієнтів із прогресуючим раком грудей, які не відповідали на лікування тільки однією вакциною. Наведений нижче приклад ілюструє даний винахід, але не обмежує його. Приклад Піддають лікуванню вісімнадцять пацієнтів із прогресуючим раком грудей, стійким до хіміо-, радіо- і гормонотерапії. Всі пацієнти - жінки з раком грудей четвертої стадії (з метастазами). Вік становить від 39 до 71 року. Пацієнтів лікують вакциною дентритних клітин (за протоколом: Annals of Oncology 15, 2004, додаток 3, реферат iii40 - Dendritic Cell Vaccine for Metastases Breast Cancer). Після другого курсу вакцинації клітинну імунізацію оцінюють, і при величині ІПЛ 20 ОД. (Індекс проліферації лімфоцитів - ІПЛ) вакцинацію продовжують. При відповіді ІПЛ 20 ОД. (імунна відповідь). У групі 2 (n=6) пацієнтам шість разів проводять імунізацію дендритними клітинами, і після другої вакцинації індекс проліферації лімфоцитів (ІПЛ) становить 20 ОД. (імунна відповідь). Група 2 (n=6), пацієнтів шість разів імунізують дендритними клітинами, і після другої вакцинації ІПЛ становить