Спосіб визначення токсичних речовин в харчових продуктах біологічним методом

Реферат: Винахід належить до галузі гігієнічної безпеки харчових продуктів і продовольчої сировини та екологічної безпеки, а саме до визначення токсичних органічних та неорганічних речовин у харчових продуктах методом біотестування. Заявлено спосіб, в якому досліджуваний зразок подрібнюють, після чого здійснюють екстракцію токсичних речовин ацетоно-водним розчином при заданих параметрах вмісту ацетону і певному співвідношенні досліджуваний зразок:розчинник. Далі екстракт концентрують і до концентрату додають ацетон. Після цього добову культуру інфузорій Stylonichia mytilus вносять в 5 мікроакваріумів в кількості 10-20 3 3 особин у водному розчині об'ємом 0,01-0,02 см , додають 0,2 см дослідної проби і витримують протягом 1-5 хв., а після адаптації інфузорій Stylonichia mytilus підраховують початкову їх кількість, витримують 40-60 хв. і вдруге підраховують їх кількість, а ступінь токсичності оцінюють по кількості інфузорій Stylonichia mytilus, що вижили. UA 109044 C2 (12) UA 109044 C2 UA 109044 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до галузі гігієнічної безпеки харчових продуктів і продовольчої сировини та екологічної безпеки, а саме до визначення токсичних органічних та неорганічних речовин у харчових продуктах методом біотестування. Відомий спосіб біотестування води і ґрунту на забруднення полютантами (важкими металами, пестицидами) за ступенем пригнічення фототаксиса, який дозволяє провести аналіз протягом однієї-двох діб. Як біоіндикатори використовуються представники родини ряскових (Lemna minor L.), причому ступінь токсичності визначають за кількістю клітин, які загинули, та за інтенсивністю забарвлення листків барвником сафраніном, який дозволяє підвищити точність біотестування. На основі результатів складають шкалу забруднень (див. патент РФ № 2135994, 6 МПК G01 N33/18). Спосіб включає поміщення біотестерів в аналізовану воду, витримку їх у воді із додаванням токсиканта 18-24 години. По кількості і інтенсивності забарвлених сафраніном біотестерів (мертвих клітин або частини листа) складають бонітувальну шкалу ушкодження біотестера. При аналізі одного зразка на важкі метали в еталоні виявилися забарвленими до 10 % клітин від усієї площі вегетативного листочка, при великій концентрації металу старі листочки забарвлювалися повністю, зі зменшенням концентрації живими, тобто незабарвленими, залишалися тільки точки росту. При деяких концентраціях зеленими були лише частини листочка. Пестициди викликали інгібірування фототаксису хлоропластів і їх кількість після 10 хвилин дії сильним світлом зменшувалася. При вітальному фарбуванні усіх листочків реакція біотестера на препарати була різною. Антіо - листочки повністю забарвлені, децис і дерозал (карбендазим) - молоді листочки не забарвлені, старі - забарвлені на 90 %, суми-L - молоді не забарвлені тільки в точках росту, старі - 90 % забарвлення. Недоліком способу є необхідність тривалого витримування ряски малої в розчині токсиканта, використання барвника для визначення ушкоджених ділянок або всієї листової пластинки, а також необхідність попереднього складання шкали для біотестування. Відомий спосіб визначення наявності і концентрації інсектициду метафосу і продукту гідролізу фосфорорганічного нітроароматичного інсектициду пара-нітрофенолу у водному 7 середовищі (див. патент РФ № 2175352, МПК C12Q1/02, A01N57/14, A01N33/18, G01N33/18, C12Q1/02, C12R1/40), що передбачає підготовку біоіндикатора шляхом культивування бактерій Pseudomonas putida на твердому поживному середовищі, яке не містить досліджувані речовини. Змивають отриману біомасу фосфатним буфером з рН 7,45 (при використанні штаму Pseudomonas putida З-11), з рН 8,1 (при використанні штаму Pseudomonas putida БА-11). Інкубують біомасу в тому ж буфері. В отриманому біоіндикаторі реєструють концентрацію кисню за допомогою кисневого електрода при 35 °C. Додають до біоіндикатора досліджувану речовину, реєструють в отриманій суміші концентрацію кисню. По різниці швидкостей споживання кисню бактеріями визначають концентрацію досліджуваної речовини. Недоліком цього способу є необхідність попереднього вирощування біомаси, що викликає втрату часу, необхідно використовувати буфери з певним рН, що звужує спектр речовин, які можливо визначити запропонованим способом, використовують спеціальне обладнання для реєстрації вмісту кисню за допомогою електрода при фіксованій температурі, що також звужує коло контамінантів, які визначають цим способом. Найбільш близьким за технічною суттю до запропонованого способу є спосіб визначення токсичності ("ГОСТ 13496.7-97 Зерно фуражное, продуктыего переработки, комбикорма. Методы определения токсичности"), згідно з яким токсичність біопроби визначають за допомогою інфузорій послідовно в два етапи. Попередньо готують середовища для проведення досліджень. На першому етапі здійснюють екстракцію токсичних речовин із подрібненої зернової маси чи комбікорму за допомогою ацетону. Наважку 10 г поміщають в ємність на 25 3 см і здійснюють екстракцію ацетоном при співвідношенні 1:(1-1,5), залежно від виду 3 досліджуваного продукту можливо додати на 2 см ацетону більше. Відділяють твердий залишок фільтруванням і екстракцію повторюють при енергійному струшуванні. На другому 3 етапі із об'єднаних екстрактів відбирають 0,5 см в стакан із підготовленою водою при співвідношенні 1:(80-100) згідно із таблицею. Після цього в 5 мікроакваріумів вносять добову культуру інфузорій Stylonychia mytilus або Colpoda steinii або Tetrachimena pyriformis і в залежності від виду використаних інфузорій через 30, 60 хв., 3-24 годин визначають ефект 3 біопроби в краплині або мікроакваріумі у 0,2 см дослідної проби під мікроскопом шляхом підрахунку живих і загиблих інфузорій у відсотках, який залежить від ступеня токсичності проби зерна або корму. Цей спосіб вибрано прототипом. Прототип і корисна модель, що заявляється, мають такі спільні ознаки: - як тест-організми використовують культуру інфузорій; - здійснюють попередню підготовку харчової сировини шляхом подрібнення; 1 UA 109044 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 - екстракцію токсичних речовин; - при необхідності регулюють рН досліджуваного екстракту; - введення інкубованих тест-організмів в розчин досліджуваної речовини; - біологічну активність об'єкта оцінюють шляхом підрахунку кількості інфузорій. Але спосіб за прототипом має наступні недоліки: - наявність етапу з функціональним навантаженням, що призводить до повної загибелі тесторганізмів, вимагає додаткового часу, витрат реактивів, але не є достатньо показовим; - використання способу передбачає лише аналіз твердої маси, із якої здійснюється екстракція і не може бути використаний для рідких харчових або нехарчових субстанцій; - спосіб визначення не дає змоги отримати достовірні значення при невисоких концентраціях токсикантів внаслідок розведення підготованих екстрактів у 160-350 разів. В основу винаходу поставлено задачу розробити спосіб визначення токсичних речовин в харчових продуктах біологічним методом, в якому за рахунок проведення екстракції токсичних речовин ацетоно-водним розчином та умов екстракції: співвідношення ацетону і води, масовому співвідношенню розчинника і досліджуваного зразка, а також витримки добової культури інфузорій Stylonichia mytilus в отриманому таким чином концентраті, забезпечити отримання однозначного результату щодо ступеня токсичності неорганічних і органічних речовин та/або їх сумішей, підвищити чутливість методу і достовірність результатів, а також спрощення за рахунок того, що спосіб не вимагає використання спеціального складного обладнання. Поставлена задача вирішена в способі визначення токсичних речовин в харчових продуктах біологічним методом, що передбачає подрібнення досліджуваного зразка, екстракцію токсичних речовин, інкубацію тест-організмів, введення їх в розчин досліджуваного зразка і підрахунок кількості тест-організмів у фіксованому об'ємі суміші, тим, що на відміну від прототипу екстракцію токсичних речовин здійснюють ацетоно-водним розчином з вмістом 30-70 % ацетону при масовому співвідношенні досліджуваного зразка і розчинника, рівному 1:(0,1-20,0), і рН=4,87,0, отриманий екстракт концентрують шляхом випарювання до зникнення запаху ацетону, до сконцентрованого екстракту додають ацетон при співвідношенні ацетон:концентрат, рівному (0,1-0,3):(9,7-9,9), після цього добову культуру інфузорій Stylonichia mytilus вносять по 0,01-0,02 3 3 см в 5 мікроакваріумів в кількості 10-20 особин у кожний мікроакваріум, додають 0,2 см дослідної проби і витримують протягом 1-5 хв., а після адаптації інфузорій Stylonichia mytilus підраховують початкову їх кількість, витримують 40-60 хв. і вдруге підраховують їх кількість, а ступінь токсичності оцінюють по кількості інфузорій Stylonichia mytilus, що вижили. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю заявлених ознак можна пояснити наступним. Технічним результатом даного способу є: - спрощення процесу; - підвищення чутливості визначення токсичних речовин в харчових продуктах: - підвищення достовірності отриманих результатів. Спрощення досягається за рахунок: - використання одного виду мікроорганізмів - інфузорій Stylonichia mytilus; - використання ацетоно-водної суміші для екстракції токсичних речовин, тобто немає необхідності у підборі системи розчинників для різних видів продуктів і токсикантів. Підвищення чутливості і достовірності досягається за рахунок зменшення ступеня розведення проб, як під час екстракції, так і при проведенні дослідження. Так, у прототипі загальне розведення проби, із якої екстрагують токсикант, досягає 1:(160-350), у способі, що заявляється, максимальне розведення сягає 1:200, при цьому враховується вологість досліджуваної проби. Крім того, використання ацетоново-водної суміші дозволяє досягти більш повного вилучення токсичних речовин різної фізико-хімічної природи, що підтверджено проведеними дослідженнями (табл. 1). Так, використання тільки ацетону для екстракції навіть при мінімальному розведенні за пропонованим способом не дозволяє достовірно визначити токсичність зразку - ступінь виживання Stylonichia mytilus склала 84,7 %, тобто, він є нетоксичним, а використання ацетоново-водної суміші для аналогічного зразку дозволило з'ясувати, що він є слаботоксичним - ступінь виживання склала 65,2 %, тобто значною мірою підвищується чутливість методу і достовірність отриманих результатів. У способі, що заявляється, використовується добова культура інфузорій Stylonichia mytilus, токсичність визначається при низькому вмісті у зразку токсичних речовин. Виживаність інфузорій вираховують по формулі: N   N2   100 , де:  N  1  - виживаність, % N 2 UA 109044 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 N1 - середня арифметична кількість інфузорій на початку досліду (за результатами не менше 5-ти досліджень), шт.; N2 - середня арифметична кількість інфузорій через 1 год. експозиції (за результатами не менше 5-ти досліджень), шт.; 100 - коефіцієнт перерахунку у відсотки. Ступінь токсичності неорганічних та органічних речовин, що можуть бути визначені запропонованим способом, залежить від їх сумарного вмісту, хімічної природи і належності до різних видів токсикантів: важкі метали, органічні речовини, у тому числі, різні групи пестицидів (інсектициди, фунгіциди, гербіциди), глікозиди, речовини білкового походження тощо. Запропонований спосіб дозволяє швидко виявити потенційно небезпечні об'єкти, які містять контамінанти неорганічного та органічного походження, що важливо для визначення безпеки харчових продуктів і продовольчої сировини та екологічної безпеки, а також моніторингу якості харчових систем. Здійснення заявлюваного способу ілюструється наступними прикладами. Приклад 1. Об'єкт дослідження - зерно пшениці. Спочатку приготували контрольне дослідження. В п'ять мікроакваріумів внесли добову культуру інфузорій Stylonichia mytilus у кількості 0,02 3 см в такій послідовності: в перший мікроакваріум 14 особин, в другий - 13, в третій - 12, 3 четвертий - 13, п'ятий - 13, додавали 0,2 см ацетоново-водного розчину у співвідношенні 0,5:9,5. Через годину експозиції підраховували кількість живих інфузорій: 13+12+13+14+13=65.  65   13    N   5   100     100  100,00  65   13   5 Далі взяли наважку 10 г подрібненого зерна пшениці, додали інсектицид "Бульдог" (бетацифлурин) і нітрат свинцю (сіль важкого металу) у кількості по 1 гранично допустимій 2+ концентрації (ГДК) кожного компонента - інсектициду і Рb і екстрагували ацетоно-водним розчином при співвідношенні ацетон:вода 1:1, наважка: екстрагент 1:3, брали по 0,2 см суміші у 5 мікроакваріумів, додавали добову культуру інфузорій, залишали на 3 хв. для адаптації, підраховували початкову кількість інфузорій, через 60 хв. здійснювали повторний підрахунок і визначали ступінь токсичності. Сумарна кількість інфузорій Stylonichia mytilus на початку експозиції 69 особин, через 60 хв. 45 особин. Виживаність склала 65,2 %. Ступінь токсичності - слаботоксичний. Приклад 2. Об'єкт дослідження - сливи. Контрольний зразок - вода. 3 Наважку слив 10 г подрібнювали, вичавлювали сік (6 см ), із якого здійснювали екстракцію ацетоно-водним розчином при співвідношенні ацетон:вода (1:1). Екстракт випарювали до 3 відсутності запаху ацетону до об'єму 4,94 см , отримували концентрат, до якого додавали 0,06 3 см ацетону і отримували дослідну пробу. Брали добову культуру інфузорій у 5 мікроакваріумів, 3 щоб у кожній пробі містилося від 10 до 20 особин Stylonichia mytilus, додавали по 0,2 см дослідної проби, залишали на 2 хв. для адаптації, підраховували початкову кількість інфузорій, через 60 хв. здійснювали повторний підрахунок і визначали ступінь токсичності. Приклади 3-6 ілюструють визначення токсичності на модельних зразках соку сливи із 2+ 2+ додаванням різної кількості солей важких металів (Рb і Cd ) у вигляді нітрату свинцю і хлориду кадмію. Результати впливу важких металів на Stylonichia mytilus наведені у таблиці 2. 2+ Як видно із наведених даних, вже додавання 1 ГДК Рb дозволяє визначити зразок як слаботоксичний, оскільки на початку експозиції було 68 особин Stylonichia mytilus, а після експозиції залишилося 47 особин, виживаність склала 69,1 %, те саме можливо сказати і про 2+ зразок 5 із 1 ГДК Cd - виживаність 65,7 %, а от наявність по 1 ГДК кожного важкого металу 2+ (зразок 6) призводить до виживаності 55,7 %, в той же час, 2 ГДК Рb (зразок 4) дає виживаність 60,6 %. Приклад 7. Об'єкт дослідження - яблука. 3 Наважку яблук 1 г подрібнювали, отримували пюре, із якого здійснювали екстракцію 10 см ацетоно-водним розчином із урахуванням вмісту вологи в продукті таким чином, щоб співвідношення ацетон:вода було 1:3, екстракт випарювали до відсутності запаху ацетону, 3 додавали 0,3 см ацетону для утримання ліпорозчинних речовин у екстракті, додавали для 3 3 нейтралізації 0,2 см розчину NaHCO3 до рН 5,1, доводили об'єм до 10 см водою, далі використовували цей розчин для дослідження. Добову культуру інфузорій Stylonichia mytilus у 3 кількості 0,01 см , в якій міститься від 10 до 20 особин вносили в мікроакваріуми, додавали 0,2 3 см екстракту, отриманого із пюре яблук або модельної системи, що включала екстракт зразка 3 UA 109044 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 яблучного пюре та інсектицид "Бульдог" (бета-цифлурин) в ацетоново-водній суміші. Через 5 хв., після адаптації тест-організмів у розчині, здійснювали підрахунок початкової кількості інфузорій, через 60 хв. експозиції вдруге проводили підрахунок чисельності інфузорій. Зразки контролю та яблук виявилися нетоксичними. Приклади 8-14 ілюструють визначення токсичності на модельних зразках - екстрактах із яблучного пюре із додаванням різної кількості інсектициду "Бульдог". Дані наведені в таблиці 3. Як видно із наведених даних, при наявності у модельній системі інсектициду "Бульдог" у -4 3 -4 3 кількості 1·10 мг/см із 68 залишилося інфузорій 66 особин, у кількості 2·10 мг/см із 66 -4 3 залишилося 57 особини інфузорій, при кількості інсектициду 4·10 мг/см із 69 залишилося 53 -4 3 особини; при кількості інсектициду 6·10 мг/см в п'яти мікроакваріумах із 67 залишається із 37 особин - слаботоксичний ефект, а при збільшенні кількості інсектициду із 68 залишається 25 особин і менше - виявляється токсичний ефект. Приклади 15-17 ілюструють вивчення токсичності соку картоплі свіжої із додаванням охлорфенолу (приклад 16); суміші о-хлорфенолу і інсектициду "Бульдог" (приклад 17); при наявності у картоплі соланіну (приклади 19-22) та суміші соланіну і інсектициду "Бульдог" (приклад 23). Дані наведені в табл. 4. Як видно із даних, наведених у таблиці 4, картопля свіжа подрібнена (зразок 18) нетоксична, в модельних зразках із вмістом соланіну 0,05 мг/г, 0,2 мг/г, 0,25 мг/г токсичний ефект виявлений при наявності від 0,25 мг/г соланіну або при наявності у суміші 1 мг/г соланіну та пестициду -4 3 "Бульдог" у кількості від 1·10 мг/см - в мікроакваріумах залишається 27 і 25 особин відповідно. Приклади 24-25 ілюструють вивчення токсичності пюре кабачків (приклад 24) і на модельних зразках пюре кабачків із додаванням суміші о-хлорфенолу і інсектициду "Бульдог" (приклад 25), 2+ а також із додаванням суміші о-хлорфенолу і нітрату свинцю (іонів важкого металу Рb приклад 26). Дані наведені в таблиці 5. Як видно із даних, наведених у таблиці 5, пюре із кабачків нетоксичне, додавання суміші о-4 хлорфенолу і інсектициду "Бульдог" по 1·10 мг/г призводить до наявності токсичного ефекту -4 із 64 інфузорій Stylonichia mytilus залишається 23, наявність суміші 1·10 мг/г о-хлорфенолу і -4 2+ 2,5·10 мг/г Рb , який додавали у вигляді солі нітрату свинцю також призводить до виживання 25 особин із 63. Окрім цього, були проведені дослідження впливу суміші фунгіциду "Тілт" (пропіконазолу) та інсектициду "Децис" (альфа-циперметрина) в модельній системі, які показали, що наявність двох видів токсикантів призводить до підвищення порогу чутливості інфузорій Stylonichia mytilus. Дані наведені у таблиці 6. Доведено, що інфузорій Stylonichia mytilus можливо використовувати для визначення токсичності речовин різної хімічної природи. Вплив токсичного білка рицину виявлений при -4 -5 наявності від 1·10 мг/г та більше або при наявності рицину у кількості 5·10 мг/г та пестициду -4 3 "Бульдог" у кількості від 1·10 мг/см - в мікроакваріумах залишається 27 і 23 особини відповідно. Дані наведені в таблиці 7. При додаванні у модельну систему алкалоїду стрихніну токсичний ефект виявлений при 3 наявності алкалоїду в кількості від 0,5 мг/дм та при наявності суміші його із пестицидом -4 3 -5 "Бульдог" у кількості від 1·10 мг/см або суміші із пестицидом "Бульдог" у кількості від 5·10 3 3 мг/см та нітрату свинцю у кількості 0,25 мг/дм - в мікроакваріумах залишається 26 і 23 особини відповідно. Результати впливу алкалоїду і пестициду на Stylonichia mytilus наведені у таблиці 8. Вплив різних токсикантів та модельних сумішей наведені в таблицях 9-12. Таблиця 1 Результати дослідження впливу екстрагенту контамінантів шляхом визначення виживаності Stylonichia mytilus Досліджувані зразки Подрібнене зерно пшениці + 1 ГДК інсектициду "Бульдог" + 1 ГДК Рb2+ Склад екстрагенту Сумарна кількість Stylonichia mytilusim початку експозиції, особин ацетон 72 4 Сумарна кількість Виживаність Stylonichia Stylonichia Ступінь токсичності mytihts через mytilus, % 60 хв. експозиції, особин 61 84,7 Нетоксичний UA 109044 C2 Продовження таблиці 1 Результати дослідження впливу екстрагенту контамінантів шляхом визначення виживаності Stylonichia mytilus Досліджувані зразки Склад екстрагенту Сумарна кількість Stylonichia mytilusim початку експозиції, особин Подрібнене зерно пшениці + 1 ГДК ацетон:вода інсектициду "Бульдог" + 1 ГДК Рb2+ 1:1 Подрібнена сушена морква + 1 ГДК ацетон 2+ інсектициду "Севін" + 1 ГДК Cd Подрібнена сушена морква + 1 ГДК ацетон:вода інсектициду "Севін" + 1 ГДК Cd2+ 1:1 Подрібнені огірки + 1 ГДК інсектициду ацетон "Севін" + 1 ГДК Рb2+ Подрібнені огірки + 1 ГДК інсектициду вода "Севін" + 1 ГДК Рb2+ Подрібнені огірки + 1 ГДК інсектициду ацетон:вода "Севін" + 1 ГДК Рb2+ 1:1 Сумарна кількість Виживаність Stylonichia Stylonichia Ступінь токсичності mytihts через mytilus, % 60 хв. експозиції, особин 69 45 65,2 Слаботоксичний 73 58 79,5 Слаботоксичний 67 35 52,2 Слаботоксичний 68 51 75,0 Слаботоксичний 70 57 81,4 Нетоксичний 65 38 58,5 Слаботоксичний Примітка: 3 ГДК інсектициду "Бульдог"=0,0002 мг/см ; 3 ГДК інсектициду "Севін"=0,0001 мг/см ; 2+ 3 ГДК Рb =0,0005 мг/см ; 2+ 3 ГДК Cd =0,00003 мг/см Таблиця 2 Вплив важких металів на виживаність Stylonichia mytihts № прикладів 2 3 4 5 6 Досліджувані зразки Вода-контроль Сік із слив Модельний зразок соку слив із додаванням 2+ 1 ГДК Рb Модельний зразок соку слив із додаванням 2+ 2 ГДК Рb Модельний зразок соку слив із додаванням 2+ 1 ГДК Cd Модельний зразок соку слив із додаванням 2+ 2+ 1 ГДК Рb + 1 ГДК Cd 2+ Сумарна кількість Stylonichia mytilus на початку експозиції, особин 65 69 Сумарна кількість Stylonichia mytilus через 1 год. експозиції, особин 65 68 68 Виживаність Stylonichia mytilus, % Ступінь токсичності 100,0 98,6 Нетоксичний Нетоксичний 47 69,1 Слаботоксичний 71 43 60,6 Слаботоксичний 67 44 65,7 Слаботоксичний 70 39 55,7 Слаботоксичний 3 ГДК Рb =0,5 мг/дм ; 2+ 3 ГДК Сd =0,03 мг/дм 5 UA 109044 C2 Таблиця 3 Вплив фунгіциду "Бульдог" (бета-цифлурину) на виживаність Stylonichia mytilus у зразка яблук № прикладів 7 8 9 10 11 12 13 14 Досліджувані зразки Екстракт із яблучного пюре Модельний зразок екстракту із яблучного пюре з додаванням 0,5 ПДК препарату "Бульдог" Модельний зразок екстракту із яблучного пюре з додаванням 1,0 ПДК препарату "Бульдог" Модельний зразок екстракту із яблучного пюре з додаванням 2,0 ПДК препарату "Бульдог" Модельний зразок екстракту із яблучного пюре з додаванням 3,0 ПДК препарату Бульдог Модельний зразок екстракту із яблучного пюре з додаванням 4,0 ПДК препарату "Бульдог" Модельний зразок екстракту із яблучного пюре з додаванням 5,0 ПДК препарату "Бульдог" Модельний зразок екстракту із яблучного пюре з додаванням 6,0 ПДК препарату "Бульдог" Сумарна Сумарна кількість кількість Stylonichia Stylonichia Виживаність Ступінь mytilus на mytilus через Stylonichia токсичності початку 1 год. mytilus, % експозиції, експозиції, особин особин 70 69 98,6 Нетоксичний 68 66 97,1 Нетоксичний 66 57 86,4 Нетоксичний 69 53 76,8 Слаботоксичний 67 37 55,2 Слаботоксичний 68 25 36,8 Токсичний 70 12 17,1 Токсичний 69 3 4,3 Токсичний Примітка: 3 ГДК інсектициду "Бульдог"=0,0002 мг/см 6 UA 109044 C2 Таблиця 4 Результати дослідження впливу органічних контамінантів на виживаність Swlonichia mytilus № прикладів 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Досліджувані зразки Сік картоплі свіжої Модельний зразок соку картоплі свіжої з додаванням 0,5 ГДК охлорфенолу Модельний зразок соку картоплі свіжої з додаванням 0,5 ГДК охлорфенолу + 1,0 ГДК інсектициду "Бульдог" Картопля свіжа подрібнена Модельний зразок екстракту із вмістом -2 соланіну 1·10 мг/г соланіну Модельний зразок екстракту із вмістом -2 соланіну 5·10 мг/г соланіну Модельний зразок екстракту із вмістом соланіну 0,2 мг/г соланіну Модельний зразок екстракту із вмістом соланіну 0,25 мг/г соланіну Модельний зразок екстракту із вмістом соланіну 0,15 мг/г соланіну + 0,5 ГДК інсектициду "Бульдог" Сумарна кількість Stylonichia mytilus на початку експозиції, особин 71 Сумарна кількість Stylonichia mytilus через 45 хв. експозиції, особин 69 62 Виживаність Stylonichia mytilus, % Ступінь токсичності 97,2 Нетоксичний 42 67,7 Слаботоксичний 66 24 36,4 Токсичний 71 68 95,8 Нетоксична 68 64 94,1 Нетоксичний 69 57 82,6 Нетоксичний 67 34 50,7 Слаботоксичний 70 27 38,6 Токсичний 66 25 37,9 Токсичний Примітка: 3 ГДК о-хлорфенолу=0,1 мг/дм ; 3 ГДК інсектициду "Бульдог"=0,2 мг/дм ; 2+ 3 ГДК Рb =0,5 мг/дм ; Соланін у кількості 1-5 мг/100 г - безпечно, 23-27 мг/100 г - токсична доза 7 UA 109044 C2 Таблиця 5 Результати дослідження впливу органічних контамінантів на виживаність Stylonichia mytilus № прикладів 24 25 26 Досліджувані зразки Пюре кабачків Модельний зразок із пюре кабачків з додаванням 1 ГДК охлорфенолу + 0,5 ГДК інсектициду "Бульдог" Модельний зразок із пюре кабачків з додаванням 1 ГДК охлорфенолу + 0,5 ГДК 2+ Рb Сумарна кількість Stylonichia mytilus на початку експозиції, особин 69 Сумарна кількість Stylonichia mytilus через 45 хв. експозиції, особин 68 64 63 Виживаність Stylonichia mytilus, % Ступінь токсичності 98,6 Нетоксичне 23 35,9 Токсичний 25 39,7 Токсичний Примітка: 3 ГДК о-хлорфенолу=0,1 мг/дм ; 3 ГДК інсектициду "Бульдог"=0,2 мг/дм ; 2+ 3. ГДК Рb =0,5 мг/дм Таблиця 6 Вплив суміші фунгіциду "Тілт" (пропіконазолу) та інсектициду "Децис" (альфа-циперметрину) на виживаність Stylonichia mytilus Досліджувані зразки 1 Модельний зразок по 0,25 ГДК Модельний зразок по 0,3 ГДК Модельний зразок по 0,4 ГДК Модельний зразок по 0,3 ГДК "Децис" та 0,5 ГДК "Тілт" Модельний зразок по 0,5 ГДК Модельний зразок по 1 ГДК Модельний зразок по 1,5 ГДК Модельний зразок по 2 ГДК 5 Сумарна кількість Stylonichia mytilus на початку експозиції, особин 2 Сумарна кількість Stylonichia mytilus через 1 год. експозиції, особин Виживаність Stylonichia mytilus, % Ступінь токсичності 3 4 5 65 53 81,5 Нетоксичний 62 50 80,6 Нетоксичний 63 41 65,0 Слаботоксичний 65 27 41,5 Токсичний 64 25 39 Токсичний 62 22 35,5 Токсичний 66 21 31,8 Токсичний 63 19 30,2 Токсичний Примітка: 3 ГДК фунгіциду "Тілт"=0,0001 мг/см ; 8 UA 109044 C2 ГДК інсектициду "Децис"=0,0001 мг/см 3. Таблиця 7 Результати дослідження впливу контамінантів на виживаність Stylonichia mytilus Досліджувані зразки Сумарна кількість Stylonichia mytilus на початку експозиції, особин Модельний зразок з додаванням -5 3 1·10 мг/см рицину Модельний зразок з додаванням -5 3 5·10 мг/см рицину Модельний зразок з додаванням -4 3 1·10 мг/см рицину Модельний зразок з додаванням -4 3 1·10 мг/см рицину + 1 ГДК інсектициду "Бульдог" Сумарна кількість Stylonichia Виживаність mytilus через Stylonichia 60 хв. mytilus, % експозиції, особин Ступінь токсичності 70 57 81,4 Нетоксичний 66 41 62,1 Слаботоксичний 67 27 40,3 Токсичний 65 23 35,4 Токсичний Примітка: -4 летальна доза рицину для мишей 3·10 мг/г; 3 ГДК інсектициду "Бульдог"=0,0002 мг/см Таблиця 8 Результати дослідження впливу різних токсикантів на виживаність Stylonichia mytilus Досліджувані зразки Пюре полуниці Модельний зразок пюре полуниці з додаванням 3 0,3 мг/дм стрихніну Модельний зразок пюре полуниці з додаванням 3 0,5 мг/дм стрихніну Модельний зразок пюре полуниці з додаванням 3 0,7 мг/дм стрихніну Модельний зразок пюре полуниці з додаванням 3 0,3 мг/дм стрихніну та 1 ГДК інсектициду "Бульдог" Модельний зразок пюре полуниці з додаванням 0,3 мг/дм стрихніну + 0,5 ГДК інсектициду "Бульдог" + 0,5 ГДК Pb(NO3)2 5 Сумарна кількість Stylonichia mytilus на початку експозиції, особин 69 Сумарна кількість Stylonichia mytilus через 60 хв. експозиції, особин 69 68 Виживаність Stylonichia mytilus, % Ступінь токсичності 100 Нетоксичне 49 72,1 Слаботоксичний 67 35 52,2 Слаботоксичний 71 28 39,4 Токсичний 69 26 37,7 Токсичний 66 25 37,9 Токсичний Примітка: летальна доза стрихніну для мишей 0,5 мкг/г; 9 UA 109044 C2 3 ГДК інсектициду "Бульдог"=0,0002 мг/см ; 2+ 3 ГДК Рb =0,5 мг/дм Таблиця 9 Результати дослідження впливу токсикантів на Stylonichia mytilus у соку слив № з/п 1 2 Вид токсиканту Мінімальна доза, мг/кг Виживаність 0,1 0,2 0,2 0,01 0,005 0,2 62,4 % 51,1 % 79,2 % Пестициди: "Севин" "Фозалон" "Бульдог" Солі важких металів: 2+ Cd 2+ Hg 2+ Pb 3 Допустимі рівні, не більше, мг/кг Класичний мутаген K2Сr2O7 0,03 0,005 модельний зразок, 0,09 мг/кг 0,02 0,005 0,5 0,060 модельний зразок, 1,5 мг/кг 0,2 0,01 66,1 % 39,5 % 55 % 76 % 39,4 % 75 % Таблиця 10 Вплив інсектициду "Бульдог" (бета-цифлурину) на виживаність Stylonichia mytihts Досліджувані зразки Вода-контроль Модельний зразок 0,5 ГДК Модельний зразок 1 ГДК Модельний зразок 1,5 ГДК Модельний зразок 2 ГДК Модельний зразок 3 ГДК Модельний зразок 4 ГДК Сумарна кількість Сумарна кількість Виживаність Stylonichia mytilus Stylonichia mytilus Stylonichia mytilus, Ступінь токсичності на початку через 1 год. % експозиції, особин експозиції, особин 65 65 100,0 Нетоксичний 65 64 98,5 Нетоксичний 60 52 86,7 Нетоксичний 72 57 79,2 Слаботоксичний 66 51 77,3 Слаботоксичний 61 36 58,1 Слаботоксичний 65 25 38,5 Токсичний Примітка: 3 ГДК інсектициду "Бульдог"=0,0002 мг/см 5 10 UA 109044 C2 Таблиця 11 Результати дослідження впливу інсектициду "Децис" (альфа-циперметрину) + CdCl2 на виживаність Stylonichia mytilus Сумарна кількість Сумарна кількість Виживаність Stylonichia Stylonichia mytihts Досліджувані зразки Stylonichia mytilus, mytilusim початку через 60 хв. % експозиції, особин експозиції, особин 0,5 ГДК "Децис" + 0,5 63 44 69,8 2+ ГДК Cd Сік слив+0,5 ГДК 64 41 64,0 2+ "Децис" + 0,5 ГДК Сd 1 ГДК "Децис" + 63 32 50,8 2+ 1ГДКС(1 Сік слив +1 ГДК 66 33 50,0 2+ "Децис" + 1 ГДК Сd 2,0 ГДК "Децис" + 63 27 42,9 2+ 1 ГДК Сd Сік слив+2 ГДК 62 25 40,3 2+ "Децис" + 1 ГДК Сd 2,0 ГДК "Децис" + 2 64 25 39,1 2+ ГДК Сd Ступінь токсичності Слаботоксичний Слаботоксичний Слаботоксичний Слаботоксичний Слаботоксичний Токсичний Токсичний Примітка: 3 ГДК інсектициду "Децис"=0,0001 мг/см , 2+ 3 ГДК Cd =0,00003 мг/см Таблиця 12 Результати дослідження впливу пестициду "Севін" (альфа-нафтил-N-метилкарбамату) + CdCl2 на виживаність Stylonichia mytilus Досліджувані зразки Сік слив + 0,25 ГДК 2+ "Севін" + 0,25 ГДК Cd Сік слив + 0,5 ГДК 2+ "Севін" + 0,5 ГДК Cd Сік слив + 1,0 ГДК 2+ "Севін" + 1 ГДК Cd Сік слив + 2,0 ГДК 2+ "Севін" + 1 ГДК Cd Сумарна кількість Сумарна кількість Stylonichia Stylonichia mytihts mytilusim початку через 45 хв. експозиції, експозиції, особин особин Виживаність Stylonichia mytilus, % Ступінь токсичності 63 54 85,7 Нетоксичний 64 44 68,8 Слаботоксичний 66 37 56,1 Слаботоксичний 62 24 38,7 Токсичний Примітка: 3 ГДК пестициду "Севін"=0,0001 мг/см ; 2+ 3 ГДК Cd =0,00003 мг/см ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 Спосіб визначення токсичних речовин в харчових продуктах біологічним методом, який включає подрібнення досліджуваного зразка, екстракцію токсичних речовин, інкубацію тест-організмів, введення їх в розчин досліджуваного зразка і підрахунок кількості тест-організмів у фіксованому об'ємі суміші, який відрізняється тим, що екстракцію токсичних речовин здійснюють ацетоноводним розчином з вмістом 30-70 % ацетону при масовому співвідношенні досліджуваного зразка і розчинника, рівному 1:(0,1-20,0), і рН=4,8-7,0, отриманий екстракт концентрують 11 UA 109044 C2 5 шляхом випарювання до зникнення запаху ацетону, до сконцентрованого екстракту додають ацетон при співвідношенні ацетон:концентрат, рівному (0,1-0,3):(9,7-9,9), після цього добову 3 культуру інфузорій Stylonichia mytilus вносять по 0,01-0,02 см в 5 мікроакваріумів в кількості 103 20 особин у кожний мікроакваріум, додають 0,2 см дослідної проби і витримують протягом 1-5 хв., а після адаптації інфузорій Stylonichia mytilus підраховують початкову їх кількість, витримують 40-60 хв. і вдруге підраховують їх кількість, а ступінь токсичності оцінюють по кількості інфузорій Stylonichia mytilus, що вижили. Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 12