Спосіб біологічного тестування харчових продуктів на акриламід

Реферат: Спосіб біологічного тестування харчових продуктів на акриламід включає інкубацію тесторганізмів інфузорій, введення їх в розчин досліджуваної речовини, підрахунок кількості тесторганізмів у фіксованому об'ємі суміші, внесення в мікроакваріуми добову культуру інфузорії Stylonichia mytilus або Colpoda steinii і додавання розчину досліджуваної речовини, підрахування початкової чисельності інфузорій, доведення об'єму суміші розчином досліджуваної речовини до половини кожного мікроакваріума, витримування 60 хвилин, після чого вдруге підраховують чисельність інфузорій і по кількості тест-організмів, що вижили, оцінюють кількість та ступінь токсичності акриламіду. UA 82926 U (54) СПОСІБ БІОЛОГІЧНОГО ТЕСТУВАННЯ ХАРЧОВИХ ПРОДУКТІВ НА АКРИЛАМІД UA 82926 U UA 82926 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі аналізу гігієнічної безпеки харчових продуктів і продовольчої сировини, а саме до визначення наявності акриламіду у харчових продуктах способом біотестування. Відомий спосіб біологічного тестування токсичності акриламіду і його похідних в дослідах in vitro на культурі фібробластів легкого ембріона людини та in vivo на білих мишах при внутрішньочеревному введенні (Соловский М.В. Исследование токсичности in vitro и in vivo полиакриламида и некоторых анионных сополимеров акриламида / М.В. Соловский, М.Ю. Еропкин, Е.М. Еропкина, Смирнова М.Ю., Белохвостова А.Т. // Токсикологический вестник.2012. - № 2. - С. 24-26). Цей спосіб дає достатньо точні результати, але дуже тривалий і вимагає наявності достатньо специфічного біологічного матеріалу. Найбільш близьким аналогом є спосіб визначення токсичності ("ГОСТ 13496.7-97 Зерно фуражное, продукты его переработки, комбикорма. Методы определения токсичности"), згідно з яким токсичність біопроби визначають за допомогою інфузорій Tetrahymena pyriformis, Stylonychia mytilus, Colpoda steinii послідовно в три етапи. Попередньо готують середовища для проведення досліджень: середовище для культивування та поживне середовище для інфузорій. На першому етапі здійснюють екстракцію токсичних речовин із подрібненої зернової маси чи комбікорму за допомогою ацетону. На другому етапі здійснюють випарювання ацетону до повного випарювання екстрагента і додають середовище для культивування, змивають із стінок чашки маслянистий екстракт, здійснюють повторне випарювання до повного зникнення запаху 3 розчинника, додають 1-2 см екстракту, фільтрують у флакони і доводять рН до 7,0-7,5. На 3 третьому етапі беруть 1 см екстракту, додають 3-и або 5-ти добову культуру інфузорій Tetrahymena pyriformis і двічі через 30 та 60 хв. визначають ефект біопроби в краплині під мікроскопом шляхом підрахунку живих і загиблих інфузорій у відсотках, який залежить від ступеня токсичності проби зерна або корму. Найближчий аналог і корисна модель, що заявляється, мають такі спільні ознаки: - використання як тест-організмів культури інфузорій; - інкубація тест-організмів інфузорій; - оцінювання біологічної активності об'єкта шляхом підрахунку кількості інфузорій. Але спосіб аналог має наступні недоліки: - необхідність попереднього приготування спеціального поживного середовища для інфузорій і витримка їх у ньому 3-5 діб; - визначення токсичної дії акриламіду проводять в три етапи, що подовжує термін виконання дослідження; - використовують водно-ацетонове середовище для екстракції досліджуваних зразків, яке може специфічно впливати на тест-організми і його дія може не збігатися з механізмом дії акриламіду, що може призвести до похибки в результатах. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб біологічного тестування харчових продуктів на акриламід, в якому за рахунок використання добової культури інфузорій Stylonichia mytilus або Colpoda steinii забезпечити отримання однозначного результату щодо ступеня токсичності наявного в зразку акриламіду, прискорення проведення тестування, а також спрощення процесу через те, що спосіб не вимагає використання спеціального складного обладнання і приготування спеціальних поживних середовищ для отримання 3-х та 5-ти добових культур. Запропонований спосіб дозволяє швидко виявити потенційно небезпечні об'єкти, що важливо при біологічному та екологічному моніторингу харчових систем. Поставлена задача вирішується в способі біологічного тестування харчових продуктів на акриламід, що передбачає інкубацію тест-організмів інфузорій, введення їх в розчин досліджуваної речовини і підрахунок кількості тест-організмів у фіксованому об'ємі суміші, згідно з корисною моделлю, добову культуру інфузорії Stylonichia mytilus або Colpoda steinii вносять в мікроакваріуми і додають розчин досліджуваної речовини, після адаптації тест-організмів підраховують початкову чисельність інфузорій, доводять об'єм суміші розчином досліджуваної речовини до половини кожного мікроакваріума і витримують 60 хвилин, після чого вдруге підраховують чисельність інфузорій і по кількості тест-організмів, що вижили, оцінюють кількість та ступінь токсичності акриламіду. У способі, що заявляється, використовується добова культура інфузорій Stylonichia mytilus або Colpoda steinii, термін проведення біотестування значно скорочений. Виживаність інфузорій вираховують по середньому значенню не менше 3-5 підрахунків в мікроакваріумах по формулі: N   N2   100 , де:    N1  N - виживаність, % 1 UA 82926 U 5 10 N1 - середня арифметична кількість інфузорій на початку досліду (за результатами не менше 5-ти досліджень), особин N2 - середня арифметична кількість інфузорій через 1 год. експозиції (за результатами не менше 5-ти досліджень), особин 100 - коефіцієнт перерахунку у відсотки. Приклади здійснення способу. Контроль: В п'ять акваріумів вносять добову культуру інфузорій Stylonichia mytilus у кількості 3 0,02 см в такій послідовності: в перший мікроакваріум 15 особин, в другий - 16, в третій - 16, четвертий - 14, п'ятий - 13. Через годину експозиції підраховують кількість живих інфузорій:  73  15+16+15+14+13=73. N   5   100   14,6   100  98,65 .    74     14,8   15 20 25 30 35 40 45 50 55 5 Приклад 1. В п'ять мікроакваріумів вносили добову культуру інфузорій Stylonichia mytilus у 3 кількості 0,02 см , в такій послідовності: в перший мікроакваріум 13 особин, в другий - 15 3 особин, в третій - 12, четвертий - 13, п'ятий - 15. Додавали по 0,2 см розчину досліджуваної речовини - соку свіжої картоплі, розбавленого водою у відношенні 1:5. Через 5 хв., після адаптації тест-організмів у розчині, здійснювали підрахунок початкової сумарної кількості інфузорій, яка складала 68 особин. Через 60 хвилин експозиції вдруге проводили підрахунок чисельності інфузорій у мікроакваріумах. Результати впливу акриламіду на Stylonichia mytilus через 1 годину експозиції наведені у таблиці 1. 3 Приклад 2. Добову культуру інфузорій Stylonichia mytilus у кількості 0,02 см вносили в п'ять 3 мікроакваріумів, додавали по 0,2 см розчину досліджуваної речовини - модельний зразок соку свіжої картоплі, розбавленого водою у відношенні 1:5 з додаванням 10 мг акриламіду на 100 г суміші. Через 5 хв., після адаптації тест-організмів у розчині, здійснювали підрахунок початкової сумарної кількості інфузорій, яка склала 66 особин. Через 60 хвилин експозиції вдруге проводили підрахунок чисельності інфузорій у мікроакваріумах. Результати впливу акриламіду на Stylonichia mytilus через 1 годину експозиції наведені у таблиці 1. Приклад 3. Здійснювали аналогічно прикладу 2, але як модельний зразок використовували сік свіжої картоплі, розбавлений водою у відношенні 1:5 з додаванням 50 мг акриламіду на 100 г суміші. Результати впливу акриламіду на Stylonichia mytilus через 1 годину експозиції наведені у таблиці 1. Приклад 4. Здійснювали аналогічно прикладу 2, але як модельний зразок використовували сік свіжої картоплі, розбавлений водою у відношенні 1:5 з додаванням 100 мг акриламіду на 100 г суміші. Результати впливу акриламіду на Stylonichia mytilus через 1 годину експозиції наведені у таблиці 1. Приклад 5. Здійснювали аналогічно прикладу 1, але як досліджуваний зразок використовували екстракт з картопляних чіпсів, розбавлений водою у відношенні 1:5. Результати впливу акриламіду на Stylonichia mytilus через 1 годину експозиції наведені у таблиці 1. Приклад 6. Здійснювали аналогічно прикладу 1, але як досліджуваний зразок використовували екстракт з кукурудзи для попкорну, розбавлений водою у відношенні 1:5. Результати впливу акриламіду на Stylonichia mytilus через 1 годину експозиції наведені у таблиці 1. Приклад 7. Здійснювали аналогічно прикладу 1, але як досліджуваний зразок використовували екстракт з кукурудзи для попкорну після термообробки, розбавлений водою у відношенні 1:5. Результати впливу акриламіду на Stylonichia mytilus через 1 годину експозиції наведені у таблиці 1. Приклад 8. Здійснювали аналогічно прикладу 1, але експозиція склала 3 години. Результати наведені в таблиці 2. Приклад 9. Здійснювали аналогічно прикладу 2, але експозиція склала 3 години. Результати наведені в таблиці 2. Приклад 10. Здійснювали аналогічно прикладу 3, але експозиція склала 3 години. Результати наведені в таблиці 2. Приклад 11. Здійснювали аналогічно прикладу 4 але експозиція склала 3 години. Результати наведені в таблиці 2. Приклад 12.3дійснювали аналогічно прикладу 5 але експозиція склала 3 години. Результати наведені в таблиці 2. 2 UA 82926 U 5 10 15 20 25 30 Приклад 13. Здійснювали аналогічно прикладу 6, Результати наведені в таблиці 2. Приклад 14. Здійснювали аналогічно прикладу 7, Результати наведені в таблиці 2. Приклад 15. Здійснювали аналогічно прикладу 1, інфузорії Colpoda steinii. Результати наведені в таблиці 3. Приклад 16. Здійснювали аналогічно прикладу 2, інфузорії Colpoda steinii. Результати наведені в таблиці 3. Приклад 17. Здійснювали аналогічно прикладу 3, інфузорії Colpoda steinii. Результати наведені в таблиці 3. Приклад 18. Здійснювали аналогічно прикладу 4, інфузорії Colpoda steinii. Результати наведені в таблиці 3. Приклад 19. Здійснювали аналогічно прикладу 5, інфузорії Colpoda steinii. Результати наведені в таблиці 3. Приклад 20. Здійснювали аналогічно прикладу 6, інфузорії Colpoda steinii. Результати наведені в таблиці 3. Приклад 21. Здійснювали аналогічно прикладу 7, інфузорії Colpoda steinii. Результати наведені в таблиці 3. Приклад 22. Здійснювали аналогічно прикладу 15, Результати наведені в таблиці 4. Приклад 23. Здійснювали аналогічно прикладу 16, Результати наведені в таблиці 4. Приклад 24. Здійснювали аналогічно прикладу 17, Результати наведені в таблиці 4. Приклад 25. Здійснювали аналогічно прикладу 18 Результати наведені в таблиці 4. Приклад 26. Здійснювали аналогічно прикладу 19 Результати наведені в таблиці 4. Приклад 27. Здійснювали аналогічно прикладу 20, Результати наведені в таблиці 4. Приклад 28. Здійснювали аналогічно прикладу 21, Результати наведені в таблиці 4. 3 але експозиція склала 3 години. але експозиція склала 3 години. як тест-культуру використовували як тест-культуру використовували як тест-культуру використовували як тест-культуру використовували як тест-культуру використовували як тест-культуру використовували як тест-культуру використовували але експозиція склала 3 години. але експозиція склала 3 години. але експозиція склала 3 години. але експозиція склала 3 години. але експозиція склала 3 години. але експозиція склала 3 години. але експозиція склала 3 години. UA 82926 U Таблиця 1 Результати дослідження впливу акриламіду на Stylonichia mytilus за 1 годину експозиції Сумарна кількість Сумарна кількість Виживаність Stylonichia mytilus Stylonichia mytilus Ступінь № Досліджувані зразки Stylonichia на початку за 1 годину токсичності mytilus, % експозиції, особин експозиції, особин Вода-контроль 74 73 98,7 не токсичний 1 Сік картоплі свіжої 68 67 98,5 не токсична Модельний зразок соку картоплі свіжої 2 66 57 86,4 не токсичний з додаванням 10 мг/100 г акриламіду Модельний зразок соку картоплі свіжої 3 60 47 78,3 слаботоксичний з додаванням 50 мг/100 г акриламіду Модельний зразок соку картоплі свіжої 4 62 20 32,3 токсичний з додаванням 100 мг/100 г акриламіду 5 Картопляні чіпси 74 43 58,1 слаботоксичні Кукурудза для поп6 70 69 98,6 не токсична корна Кукурудза для поп7 корна після 64 50 78,1 слаботоксична термообробки 4 UA 82926 U Таблиця 2 Результати дослідження впливу акриламіду на Stylonichia mytilus за 3 години експозиції № 8 9 10 11 12 13 14 Сумарна кількість Сумарна кількість Stylonichia mytilus Виживаність Stylonichia mytilus Ступінь Досліджувані зразки на початку Stylonichia за 3 години токсичності експозиції, mytilus, % експозиції, особин особин Сік картоплі свіжої 68 66 97,1 не токсична Модельний зразок соку картоплі свіжої з додаванням 10 66 56 84,9 не токсичний мг/ 100 г акриламіду Модельний зразок соку картоплі свіжої 60 41 68,3 слаботоксичний з додаванням 50 мг/100 г акриламіду Модельний зразок соку картоплі свіжої 62 10 16,1 токсичний з додаванням 100 мг/100 г акриламіду Картопляні чіпси 74 32 43,2 слаботоксичні Кукурудза для поп70 67 95,7 не токсична корна Кукурудза для попкорна після 64 44 68,8 слаботоксична термообробки 5 UA 82926 U Таблиця 3 Результати дослідження впливу акриламіду на Colpoda steinii за 1 годину експозиції № 15 16 17 18 19 20 21 Сумарна Сумарна кількість кількість Виживаність Colpoda steinii на Colpoda steinii Досліджувані зразки Colpoda steinii, початку експозиції, за 1 годину % особин експозиції, особин Сік картоплі свіжої 70 68 98,6 Модельний зразок соку картоплі свіжої 64 58 90,6 з додаванням 10 мг/100 г акриламіду Модельний зразок соку картоплі свіжої 60 51 85,0 з додаванням 50 мг/100 г акриламіду Модельний зразок соку картоплі свіжої 82 33 40,2 з додаванням 100 мг/100 г акриламіду Картопляні чіпси 68 41 60,3 Кукурудза для поп64 63 98,4 корна Кукурудза для попкорна після 67 58 86,6 термообробки Ступінь токсичності не токсична не токсичний не токсичний токсичний слаботоксичні не токсична не токсична Таблиця 4 Результати дослідження впливу акриламіду на Colpoda steinii за 3 години експозиції № 22 23 24 25 26 27 28 Сумарна Сумарна кількість кількість Colpoda steinii за Colpoda steinii Виживаність Досліджувані зразки 3 години на початку Colpoda steinii, % експозиції, експозиції, особин особин Сік картоплі свіжої 70 67 95,71 Модельний зразок соку картоплі свіжої 64 57 89,06 з додаванням 10 мг/100 г акриламіду Модельний зразок соку картоплі свіжої 60 48 80,00 з додаванням 50 мг/100 г акриламіду Модельний зразок соку картоплі свіжої 82 30 36,6 з додаванням 100 мг/100 г акриламіду Картопляні чіпси 68 34 50,0 Кукурудза для поп64 62 96,88 корна Кукурудза для попкорна після 67 48 67,61 термообробки 6 Ступінь токсичності не токсична не токсичний не токсичний токсичний слаботоксичні не токсична слаботоксична UA 82926 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 Спосіб біологічного тестування харчових продуктів на акриламід, що передбачає інкубацію тесторганізмів інфузорій, введення їх в розчин досліджуваної речовини і підрахунок кількості тесторганізмів у фіксованому об'ємі суміші, який відрізняється тим, що добову культуру інфузорії Stylonichia mytilus або Colpoda steinii вносять в мікроакваріуми і додають розчин досліджуваної речовини, після адаптації тест-організмів підраховують початкову чисельність інфузорій, доводять об'єм суміші розчином досліджуваної речовини до половини кожного мікроакваріума і витримують 60 хвилин, після чого вдруге підраховують чисельність інфузорій і по кількості тесторганізмів, що вижили, оцінюють кількість та ступінь токсичності акриламіду. Комп’ютерна верстка С. Чулій Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 7