Біотинові сполуки, спосіб їх отримання, фармацевтична композиція та спосіб її отримання

1 Биотиновые соединения формулы (I) (I) где Q отсутствует или обозначает -NH-(CH2)n-COили -NH-(CH2)n-NH-, 1 2 R обозначает X-Arg-Gly-Asp-Y, A-Cys(R )-B-U или L(Hmo-(Arg-Gly-Asp-Z), причем Z в боковой цепи связан с Q или, если Q отсутствует, с биотином, X и Y - каждый, независимо друг от друга, обозначает аминокислотный остаток или ди-, три-, тетраили пентапептидный остаток, причем аминокислоты, независимо друг от друга, выбирают из группы, состоящей из Ala, Asn, Asp, Arg, Cys, Gin, Glu, Gly, 4-Hal-Phe, His, homo-Phe, lie, Leu, Lys, Met, Nle, Phe, Phg, Pro, Ser, Thr, Trp, Туг или Val, и указанные аминокислоты также могут быть дериватизированы, А отсутствует, обозначает Asp или обозначает пептидный фрагмент, выбираемый из группы, состоящей из Ala-Asp, Thr-Ala-Asp, Lys-Thr-Ala-Asp, Lys-Thr-Ala-Asn, Lys-Thr-Gly-Asp, Lys-Ala-Ala-Asp, Arg-Thr-Ala-Asp, Ser-Ala-Asp, Gln-Ser-Ala-Asp, GipSer-Ala-Asp, Gly-Lys-Thr-Ala-Asp, Asn-Gly-Lys-ThrAla-Asp, Ile-Ser-Ala-Gly, Arg-Ser-Ala-Gly, Cys-AsnGly-Lys-Thr-Ala-Asp, Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-Thr-AlaAsp, Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-Thr-Ala-Asp, Asp вш Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-Thr-Ala-Asp, Gly-Lys-ThrCys(Trt)-Asp, Met-Asp-Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-ThrAla-Asp,Asp-Met-Asp-Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-ThrAla-Asp, В отсутствует, обозначает OH, Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, Gly, His, lie, Leu, Lys, Met, Orn, Phe, 4-Hal-Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val или Nметилированное производное указанных аминокислотных остатков, или пептидный фрагмент, выбираемый из группы, состоящей из Pro-Arg, ProArg-Asn, Pro-Arg-Asn-Pro, Pro-Arg-Asn-Pro-His, ProArg-Asn-Pro-His-Lys, Pro-Arg-Asn-Pro-His-Lys-Gly, Pro-Arg-Asn-Pro-His-Lys-Gly-Pro, Pro-Arg-Asn-ProHis-Lys-Gly-Pro-Ala,Pro-Arg-Asn-Pro-His-Lys-Gly-ProAla-Thr, причем, если R1 обозначает A-Cys(R2)-B-U, то лишь один из остатков А или В может отсутствовать, R2 обозначает Н, алкил с 1-6 С-атомами, Trt, Dpm или Bzl, U обозначает ОН, OR9, NH2, NHR9 или N(R9)2, Z - каждый, независимо друг от друга, обозначает аминокислотный остаток или ди-, три- или тетрапептидный остаток, причем аминокислоты, независимо друг от друга, выбирают из группы, состоящей из Ala, Asn, Asp, Arg, Cys, Gin, Glu, Gly, His, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val или М, причем также указанные аминокислоты могут быть дериватизированы, и аминокислотные остатки связаны друг с другом пептидоподобно через а-амино- и а-карбоксильные группы, причем М содержится всегда, М обозначает NH(Rfe)-CH(R3)-COOH, R3 обозначает -R5-R , -R6-R4, -R7-R4, R4 обозначает OH, NH2, SH или СООН, R5 обозначает алкилен с 1-6 С-атомами, R6 обозначает алкиленфенил с 7-14 С-атомами, R7 обозначает алкиленфенилалкилен с 8-15 Сатомами, R8 обозначает Н, алкил с 1-6 С-атомами или алкиленфенил с 7-12 С-атомами, R9 обозначает алкил с 1-6 С-атомами, Гал обозначает F, CI, Вг или I, и "п" обозначает 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10, причем, если речь идет об остатках оптически активных аминокислот и аминокислотных производных, то включаются как D-, так и L-формы, а также их соли О 00 41981 2 Биотиновые соединения формулы (I) по п 1 Sv Л NH (I) где a) Q отсутствует и R1 обозначает цикло-(АгдGly-Asp-D-Phe-Lys), б) Q отсутствует и R1 обозначает Gly-Gly-Gly-ArgGly-Asp-Ser-Pro-Lys-OH, в) Q отсутствует и R1 обозначает Gly-Gly-Gly-LysThr-Ala-Asp-Cys(Trt)-Pro-OH, г) Q обозначает -NH-fCbbJs-CO- и R1 обозначает L(Hmo-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys), д) Q обозначает -NH-fCbbJs-CO- и R1 обозначает MHmo-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys-Gly), е) Q обозначает -NH-fCbbJs СО- и R1 обозначает MHmo-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-Lys), ж) Q обозначает -NH-fCbbJs-CO- и R1 обозначает L(Hmo-(Arg-Gly-Asp-D-Trp-Lys), 1 з) Q обозначает -NH-fCbhJs-CO- и R обозначает L(Hmo-(Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys), а также физиологически приемлемые соли указанных соединений 3 Соединения формулы (І) по п 1 и их физиологически приемлемые соли в качестве ингибиторов интегрина для борьбы с патологическими ангиогенными заболеваниями, тромбозами, инфарктом сердца, коронарными заболеваниями сердца, артериосклерозами, опухолями, остеопорозом, воспалениями и инфекциями 4 Соединения формулы (I) по п 1 для очистки интегрина путем аффинной хроматографии 5 Соединения формулы (І) по п 1 в качестве диагностических маркеров для анти-биотин-антителореакций в анализе типа ELISA и в FACS-анализе 6 Соединения формулы (І) по п 1 в микроскопии с силовым полем для измерения силы взаимодействий лиганд-рецептор 7 Способ получения соединений формулы (I) по п 1, а также их солей, отличающийся тем, что (а) соединение формулы (II) H-Q-R1 (II), 1 где Q и R имеют указанные в п 1 значения, путем реакции ацилирования вводят во взаимодействие с соединением формулы (III) Изобретение относится к биотиновым соединениям формулы (1) г~~\^* •NH (I) где L обозначает СІ, Вг, І или свободную или реакционноспособную, функционально измененную ОН-группу, или (б) соединение формулы (IV) H-Q-R^ (IV), где R1 имеет указанное в п 1 значение, путем реакции ацилирования вводят во взаимодействие с соединением формулы (V) где Q имеет указанное в п 1 значение, a L обозначает Н, СІ, Вг, І или свободную или реакционноспособную, функционально измененную ОНгруппу, или (в) соединения высвобождают из одного из их функциональных производных путем обработки с помощью сольволизирующего или гидрогенолизирующего средства, и/или основное или кислое соединение формулы (I) путем обработки кислотой или основанием переводят в одну из его солей 8 Способ получения фармацевтических композиций, отличающийся тем, что эффективное количество соединения формулы (I) по п 1 и/или одной из его физиологически приемлемых солей вместе, по меньшей мере, с одним твердым, жидким или полужидким носителем или вспомогательным веществом доводят до пригодной дозировочной формы 9 Фармацевтическая композиция, отличающаяся тем, что она содержит, по меньшей мере, одно соединение формулы (І) по п 1 и/или одну из его физиологически приемлемых солей в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель или вспомогательное вещество где Q отсутствует, обозначает -NH-(CH2)n-CO- или -NH-(CH2)n-NH-, R1 обозначает X-Arg-Gly-Asp-Y, A-Cys(R2)-BU или цикло-(Агд-СІу-Азр-2), причем Z в боковой цепи связан с Q или, если Q отсутствует, с биотином, X и Y каждый независимо друг от друга, обозначает аминокислотный остаток или ди-, три-, тетра- или пентапептидный остаток, причем аминокислоты, независимо друг от друга, выбирают 41981 из группы, состоящей из Ala, Asn, Asp, Arg, Cys, Gin, Glu, Gly, 4-Гал-Рпе, His, гомо-Phe, lie, Leu, Lys, Met, Nle, Phe, Phg, Pro, Ser, Thr, Trp, Туг или Val, и указанные аминокислоты также могут быть дериватизированы, А отсутствует, обозначает Asp или пептидный фрагмент, выбираемый из группы, состоящей из Ala-Asp. Thr-Ala-Asp, Lys-Thr-Aia-Asp, Lys-Thr-AJa-Asn, Lys-Thr-GIy-Asp, Lys-Ala-Ala-Asp, Arg-Thr-AJa-Asp, Ser-Ala-Asp, Gln-Ser-AIa-Asp, Glp-Ser-AJa-Asp, Giy-Lys-Thf-Ala-Asp, Asn-Gfy-Lys-Thr-Ala-Asp, ІІє-Ser-Ala-Gly, Arg-Ser-Aia-Gly. Cys-Asn-Gty-Lys-Thr-AJa-Asp, Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-Thr-AJa-Asp, Asp-Tyr-Cys-Asn-Gty-Lys-Thr-AIa-Asp, Asp-Asp-Tyr-Cy5-Asn-G iy-Lys-Thr-AIa -Asp, Gly-Lys-Thr-CysfTrtJ-Asp, Mei-Asp-Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-Thf-Ala-Asp, Asp-Met-Asp-Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-Thr-Aia-Asp, В отсутствует, обозначает OH, Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, Gly, His, lie, Leu, Lys, Met, Orn, Phe, 4-Гал-Рпе, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val или N-метилированное производное указанных аминокислотных остатков, как пептидный фрагмент, выбираемый из группы, состоящей из Pro-Arg, Pro-Arg-Asn, Pro-Arg-Asn-Pro, Pro-Arg-Asn-Pro-His, Pro-Arg-Asn-Pro-His-Lys, Pro-Arg-Asn-Pro-His-Lys-Gly, PrQ-Arg-Asn-PrG-His-Lys-Giy-Pro, Pro-Arg-Asn-Pro-His-Lys-Gly-Pro-Ala, Pro-Arg-Asn-Pro-His-Lys-G!y-Pro-Aia-Thr, 1 2 причем, если R обозначает A-Cys(R )-B-U, то лишь один из остатков А или В может отсутствовать, R2 обозначает Н, алкил с 1-6 С-атомами, Trt, Dpm или Bzl, U обозначает ОН, OR9, NH2, NHR9 или 9 N(R )2, Z каждый, независимо друг от друга, обозначает аминокислотный остаток или ди-, три- или тетрапептидный остаток, причем аминокислоты, независимо друг от друга, выбирают из группы, состоящей из Ala, Asn, Asp, Arg, Cys, Gin, Glu, Gly, His, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val или М, причем также указанные аминокислоты могут быть дериватизированы, и аминокислотные остатки связаны друг с другом пептидоподобно через а-амино- и а-карбоксильные группы, причем М содержится всегда, М обозначает NH(R8)-CH (R3)-COOH, R3 обозначает -R-R , -R6-R4, -R7-R4, R4 обозначает ОН, NH2, SH или СООН, R5 обозначает алкилен с 1-6 С-атомами, R6 обозначает алкилфенил с 7-14 С-атомами, R7 обозначает алкиленфенилалкилен с 8-14 С-атомами, R обозначает Н, алкил с 1-6 С-атомами или алкиленфенил с 7-12 С-атомами, R9 обозначает алкил с 1-6 С-атомами, Гал обозначает F, CI, Вг или J, и "п" обозначает 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10, причем, если речь идет об остатках оптически активных аминокислот и аминокислотных производных, то охватываются как D-, так и также L-формы, а также к их солям Подобные соединения биотинилированных пептидов описывается, например, в ВОИС 9415956 (биотинилированные антагонисты эндотелинового рецептора), в ВОИС 9413313 (биотинилированные LHRH - антагонисты) или в ВОИС 9418325 (биотинилированный некрозный фактор) Биотинилирование пептидов во время синтеза в твердой фазе на смоле с целью улучшенной возможности очистки описывается T J Lobi и др в Anal Biochem 170, 502 (1988) Подобные соединения циклических и линейных пептидов известны из патентов ФРГ 4310643 и 4336758, европейского патента ЕР-0406428 и ВОИС 89/05150 В основу изобретения положена задача получения новых соединений с ценными свойствами, в частности таких, которые можно применять для приготовления лекарственных средств Найдено, что соединения формулы (1) и их соли при хорошей переносимости обладают очень ценными фармакологическими свойствами Прежде всего, они действуют как ингибиторы интегрина, причем в частности они подавляют взаимодействия av-, Рз- или Рб-интегриновых рецепторов с лигандами, как, например, связывание фибриногена с Рз-интегриновым рецептором Особую эффективность соединения проявляют в случае интегринов аурз, avPs, апьРз, а также a v Pi, ауРб и avp8 Это действие можно обнаружить, например, по методу, который описывается J W Smith и др в J Biol Chem ,265, 12267-12271 (1990) Зависимость возникновения ангиогенеза от взаимодействия между сосудистыми интегринами и внеклеточными матричными протеинами описывается Р С Brooks, R A Clark и D A Cheresh в Science, 264, 569-71 (1994) Возможность ингибирования этого взаимодействия и вместе с этим начала апоптоза (программированная гибель клетки) ангиогенных сосудистых клеток за счет циклического пептида описывается Р С Btooks, A M Montgomery, M Rosenfeld, RA Reisfeld, T-Hu, G Kher и DA Cheresh в Cell, 79, 1157-64 (1994) Соединения формулы (1), которые блокируют взаимодействие интегриновых рецепторов с лигандами, как, например, фибриногена с фибриногенным рецептором (гликопротеин llb/llla), в качестве GP llb/llla - антагонистов предотвращают распространение опухолевых клеток за счет метастаз Это доказывается следующими наблюдениями Распространение опухолевых клеток от локальной опухоли в сосудистую систему происходит за счет образования микроагрегатов (микротромбов) благодаря взаимодействию опухолевых клеток с тромбоцитами Опухолевые клетки экранируются за счет защиты в микроагрегате и не распознаются клетками иммунной системы Мик 41981 роагрегаты могут внедряться в стенки сосудов, благодаря чему облегчается дальнейшее проникновение опухолевых клеток в ткань Так как образованию микротромбов способствует связывание фибриногена с фибриногенными рецепторами на активированных тромбоцитах, то GP lla/lllb - антагонисты можно рассматривать как эффективные ингибиторы метастаза Соединения формулы (1) можно применять в качестве биологически активных веществ в лекарственных средствах в медицине и ветеринарии, в частности для профилактики и/или терапии таких заболеваний, как тромбоз, миокардиальный инфаркт, артериосклероз, воспаления, апоплексия, стенокардия, опухолевые заболевания, остеолитические заболевания, как остеопороз, патологические ангиогенные заболевания, как, например, воспаления, офтальмологические заболевания, диабетическая ретинопатия, дегенеративные изменения в области желтого пятна (сетчатки), близорукость, гистоплазмоз, ревматический артрит, остеоартрит, рубеотическая глаукома, язвенный колит, болезнь Крона, атеросклероз, псориаз, рестеноз после ангиопластики, вирусная инфекция, бактериальная инфекция, грибковая инфекция, при острой почечной недостаточности и при заживлении ран для поддерживания процесса заживления Соединения формулы (1) можно применять в качестве антимикробно действующих веществ при операциях, где используются биоматериалы, имплантаты, катетеры или электростимуляторы сердца При этом они действуют антисегтгически Эффективность антимикробной активности можно обнаруживать с помощью способа, описанного Р Valentin - Weigund и др , в Infection and Immunity, 2851-2855(1988) Так как соединения формулы (1) представляют собой ингибиторы связывания фибриногена и вместе с этим лигандов фибриногенных рецепторов с тромбоцитами, их можно применять ин виво в качестве диагностических средств с целью выявления и локализации тромбов в сосудистой системе, так как биотинильный остаток является УФ-обнаруживаемым остатком Соединения формулы (1) можно применять в качестве ингибиторов связывания фибриногена, также как в качестве эффективного лечебного средства для изучения метаболизма тромбоцитов в различных стадиях активирования или внутриклеточных сигнальных механизмов фибриногенного рецептора Обнаруживаемая единица "биотиновой метки" позволяет, после связывания с рецептором, исследовать указанные механизмы Выше- и нижеуказанные сокращения аминокислотных остатков обозначают остатки следующих аминокислот Abu = 4-амино-масляная кислота, Aha = 6-амино-гексановая кислота, 6-аминокапроновая кислота, Ala = аланин, Asn = аспарагин, Asp = аспарагиновая кислота, Arg = аргинин, Cys = цистеин, Dab = 2,4-диамино-масляная кислота, Dap = 2,3-диаминопропионовая кислота, Gin = глутамин, Glp = пироглутаминовая кислота Glu = глутаминовая кислота, Gly = глицин, His = гистидин, homo-Phe = гомо-фенилаланин, Не = изолейцин, Leu = лейцин, Lys = лизин, Met = метионин, Nle = норлейцин, Огп = орнитин, Phe = фенилаланин, Phg = фенилглицин, 4-Hal-Phe = 4-галоген-фенилаланин, Pro = пролин, Ser = серии, Thr = треонин, Тгр = триптофан, Туг = тирозин, Val = валин, а также Bit Далее приводятся следующие обозначения ВОС = трет-бутоксикарбонил, CBZ = бензилоксикарбонил, DCCI = дициклогексилкарбодиимид, ДМФ = диметилформамид, Et = этил, Fmoc = 9-флуоренилметоксикарбонил, HOBt = 1-гидроксибензотриазол, Me = метил, МВНА = 4-метил-бензгидриламин, Mtr = 4-метокси-2,3,6-триметилфенил-сульфонил, OBut = сложный трет-бутиловый эфир, ОМе = сложный метиловый эфир, OEt = сложный этиловый эфир, РОА = феноксиацетил, TFA (ТФК) = три фтору ксусная кислота, Trt = тритил (три фен ил метил) Поскольку вышеуказанные аминокислоты могут находиться в различных энантиомерных формах, то включаются все выше- и нижеуказанные эти формы и также их смеси (например, DL - формы), например, в качестве составной части соединений формулы 1 Далее, аминокислоты, например, в качестве составной части соединений формулы (1), могут быть снабжены соответствующими, само по себе известными защитными группами Предлагаемые согласно изобретению соединения также включают так называемые пролекарственные производные, т е измененные, например, с помощью алкильных или ацильных групп, Сахаров или олигопептидов соединения формулы (1), которые в организме быстро расщепляются до эффективных, предлагаемых согласно изобретению соединений Предметом изобретения, далее, является способ получения соединений формулы (1) по п 1 формулы изобретения, а также их солей, отличающийся тем, что (а) соединение формулы (II) H-Q-R1, 1 (II) где Q и R имеют указанное в п 1 формулы изобретения значение, путем реакции ацилирования вводят во взаимодействие с соединением формулы (III) 41981 где L обозначает СІ, Br, I или свободную или реакционноспособную, функционально измененную ОН-группу, или (б) соединение формулы (IV) H-R1, (IV) 1 где R имеет указанное в п 1 формулы изобретения значение, путем реакции ацилирования вводят во взаимодействие с соединением формулы (V) Н где Q имеет указанное в п 1 формулы изобретения значение и L обозначает Н, Cl, Br, J или свободную или реакционноспособную, функционально измененную ОН-группу, или (в) соединения высвобождают из одного из их функциональных производных путем обработки с помощью сольволизирующего или гидрогенолизирующего средства, и/или основное или кислое соединение формулы (1) путем обработки кислотой или основанием переводят в одну из его солей Выше- и нижеуказанные остатки Q, R1 и L имеют указанные в случае формул (II) и (III) значения, если не указано ничего другого В вышеприведенных формулах, алкил предпочтительно обозначает метил, этил, изопропил или трет -бутил Алкилен предпочтительно обозначает метилен, этилен, пропилен, бутилен, пентилен или гексилен Алкиленфенилом предпочтительно является бензил или фенетил Алкиленфенилалкилен предпочтительно обозначает 4-метилен-бензил или 4-этилен-бензил Остаток -R6-R4 предпочтительно обозначает 2-, 3- или 4-гидроксибензил, 2-, 3- или 4-4-аминобензил, 2-, 3- или 4-меркагтго-бензил, 2-, 3- или 4карбоксибензил, далее, предпочтительно обозначает 2-, 3- или 4-гидроксифенетил, 2-, 3- или 4аминофенетил, 2-, 3- или 4-меркагтгофенетил, 2-, 3- или 4-карбоксифенетил Q предпочтительно обозначает 6-аминогексановую кислоту (6-аминокапроновую кислоту) или отсутствует М предпочтительно обозначает Dap, Ser, Cys, Asp, D-Asp, Dab, гомосерин, гомоцистеин, Glu, D-Glu, Thr, Orn, Lys, D-Lys, 4-аминометил-Рпе или 4-аминометил-О-Рпе X предпочтительно обозначает Ala Asn Asp Arg Cys Gin Glu Gly His tie Leu Lys Mel, Phe Pro Ser Thr Trp, Т у или Val и м , щ к и ю п я к п п о Lys Gly Lys Ala Lys p Ala Tyr Gly Tyr Ala Tyr ji Ala Pne Gly Phe Ala Phe p Aia Тут GSy Gly Phe Giy Gly Lys Gly Gly Tyr Gly Aia Phe Gly Ala Lys Giy A)a Arg Gly Asp Lys Gly Gly Gly Туг-Gly Gly Gly Phe Gly Giy Gly Lys Gly Gly Ala Tyr-Giy Gly Aia Phe Gty-GJy Ala Lys Giy Gfy p Ala Tyr Gly Gly JJ A!a Phe Gly Gly p Aia Lys Gly Gfy Gly Gly Tyr Gly Giy Gly Gfy Phe Gly Gly Gly Gly, Lys Giy Giy Ala Gly Tyr Gly Giy Ala Gly Phe Giy Giy Aia Gly Lys Giy Gly p Aia Giy Tyr Gly Gly 2 Ala Giy »*nPhe Giy Giy 0 Ala Gly Y предпочтительно обозначает Ala Asn Asp Arg Cys Gin Glu Giy His lie Leu Lye, Met Phe Pro Ser Thr Tip Туг и ги Val JJICC пршюііигсіьіга Туг Aia Tyr Asn Тут Asp Tyr Arg Тут Cys Tyr Girt Tyr Glu Tyr Gly Tyr His Тут Me Tyr-leu Tyr-Lys Туг-Мзі Тут Phe Tyr Pro Tyr Ser Phe Cys P іе Gin Phe Glu Phe Giy Prie His Phe lie Phe Leu Phe Lys Phe Met, Phe Phe Phe Pro Phe Ser Phe-Thr Phe Trp, Phe Tyr Phe Va! Trp Aia Trp Asn, Tip Asp Trp Arg Trp Cys Trp Gin Trp Glu Trp Gly Trp His Trp lie Trp-Leti Trp Lys Trp Met Trp Phe Trp Pro Trp Ser Trp Thr Trp Trp Trp Tyr Trp Va1 Asp Ala Asp Asn, Asp Asp Asp Arg Asp Cys Asp Gin Asp Glu Asp Gly Asp №s Asp-!!e, Asp Leu Asp L>s Asp Met Asp Phe Asp Pro Asp Ser Asp Thr, Asp Trp Asp Тут Asp Vai Ser Pro Lys Tyr Pro Lys Phe-Pro-Lys Trp Pro Lys Asp Pro-Lys Ser Gly Lys Tyr Gly Lys Phe Gfy-Lys, Trp Gly Lys Asp Gly Lys Ser Ala Lys Tyr Ala Lys Phe Ala Lys Trp Ala L/s Asp Ala Lys Ser Pro A!a Ser Leu Lys Tyr Leu Lys Phe LPU Lys Trp Leu Lys Asp Leu Lys Ser lie Lys Tyr ile-Lys Рг-е Пе Lys Trp lie Lys Asp fie L>s Ser Pro Aia Ser Tyr Pro Ala Ser Phe Pro Ala Ser Trp Pro Ala Ser Asp Pro Aia Ser Ser Gly Aia Ser Tyr G!y Ala S J Phe Gty-Aia Se' Trp Gly Aia Ser Asp Gly Ala Ser Ser Ala Ala Ser Туг Ala Ala Ser Phe Ala Ala Se Trp Ala Ala Ser Asp AJa Ala Ser Ser Vai Ala Ser ту г у а !fi,\sSer Phe Val Ala Ser Trp Va Afs be Asp Vai Ala Ser Se' Leu Aia Se' Tyr Leu Aia Ser Phe Leu A a Se r Tfp Leu Ala Ser Asp Leu A a Ser Ser lie A ! a Ser 1 yr і є л.Із Ser Phe lie Ala Ser Trp lie Ala Ser Asp tie Ala Ser Ser Pro Aia Se' Ser Tyr Pro A h Ser Ss>r Ph» Pro Ala Ser Ser Trp Pro Ala Ser Se' Asp Pro Ala Ser Ser Ser Giy Ala Ser Ser T^r Gly Aia Si.; Ser Р*іе Gly-AIa Ser-Ser Trp Gly Ala Ser Ser Asp Gly Aia Ser Ser Ser Ala Aia Ser Ser Tyr Ala Ala Ser Ser Phe Ala Ala Ser Ser Trp Aia Ala Ser Ser Asp Ala Aia Ser Ser Ser Va Ala Ser Ser Tyr,Vai Ala Set-Ser Pht Val A'a Ser Ser Trp V i l Ala Ser Sar Asp Va! Ala Ser Ser Ser Leu Aia Ser Ser Tyr Leu Ala Ser Ser Phe Leu Ala Ser Ser Trp Leu Ala Ser Se Asp Leu Aia Ser Ser Se! Me Ala Ser Sec Tyr ile Aia Sar Ser Phe lie Ala Ser Se Trp lie Aid Se Ser *-e Asp iie Ala Se- Ser Указанные в значениях X, Y и Z аминокислоты и аминокислотные остатки могут быть также дериватизированы, причем предпочтительны Nметильные, N-этильные, N-пропильные, N-бензильные или С а -метильные производные Далее, предпочтительны производные Asp и Glu, в частности сложные метиловые, этиловые, пропиловые, бутиловые, трет -бутиловые, неопентиловые или бензиловые эфиры карбоксильных групп боковых цепей, далее, также производные Arg, который в -NH-C(=NH)-NH2-rpynne может быть замещен ацетильным, бензоильным, метокси карбон ильным или этокси карбон ильным остатком Далее, указанные в значениях для X и Y аминокислоты и аминокислотные остатки могут быть снабжены соответствующими, само по себе известными защитными группами Z предпочтительно обозначает М, далее предпочтительно обозначает D Phe-M D Тгр-М D-Туг-М O-Phe Lys D Phe 0 Lys D Trp Lys D-Trp-D Lys D Tyr Lys D Tyr D Lys D Phe Orn О Phe Dab D Phe Dap, D Phe-D Orn D Phe O-Dab D Phe D Dap D Phe-4 імшюиетм L Phe, 0 Phe^i- іммію чині D Phe D Trp А лминомеш] Phe D Trp-4 імшючстиі D-Phe D ТуМ-лчиіюмеіи і Phe D Tyr-4 імніюмоіи i-D-Phe D-Phe Asp D Phe D Asp D Trp Asp D Trp D Asp D Tyr Asp D Tyr D-Asp D Phe Cys D-Pfie-D Cys D-Trp Cys D Trp D Cys D-Tyr Cys O-Tyr D-Cys Phe D Lys Trp D Lys Туг О Lys Phe-Om Phe flab Phe Dip Trp Orn, Trp Dab Trp Dap Tyr Orn Tyr Dab Tyr Dap Phe-4 ттшомети і О Phe Trp 4 ашшочега і D Phe Tyr-4 ачгшо ш л і н - D Phe Phe D Asp Trp 0 Asp Tyr D Asp Phe D Cys Trp О Cys Tyr D-Cys D Phe Lys Giy D Phe M Giy D Trp Lys Giy D-Trp M Gly D Tyr Lys Gly D Tyr M Gly D Phe Val Lys D Phe Gly Lys D-Phe Ala Lys D Phe Me Lys О Phe I eu Lys D Trp Val Lys D Trp Gly-Lys D-Trp Ala Lys О Trp Ile L>s D-Trp Leu Lys DTyrVal-Lys D-Tyr G l y l y s D-Tyr Aia Lys D Tyr-iie-Lys D Tyr Leu Lys іалее М Pro Ala Ser Ser 41981 Соединения формулы (1) могут иметь один или несколько хиральных центров и поэтому могут находиться в различных стереоизомерных формах Формула (1) охватывает все эти формы Соответственно этому, предметом изобретения являются в частности те соединения формулы (1), в которых, по меньшей мере, один из указанных остатков имеет одно из вышеуказанных предпочтительных значений Некоторые предпочтительные группы соединений могут быть выражены следующими частичными формулами (1а) (1е), которые соответствуют формуле (1) и где подробнее не указанные остатки имеют данные в случае формулы (1) значения, где, однако, в 1а Q отсутствует и R1 обозначает X-ArgGly-Asp-Y, в 16 Q обозначает -NH-(CH2)5-CO- и R1 обозначает X-Arg-Gly-Asp-Y, в 1в Q обозначает -NH-(CH2)5-CO- и R1 обозначает L(HKno-(Arg-Gly-Asp-Z), в 1г Q обозначает-NH-(CH2)5-CO- и R1 обозначает L(Hmo-(Arg-Gly-Asp-M), в 1д Q обозначает -NH-(CH2)5-CO- и R1 обозначает A-Cys (R2)-B, и в 1е Q обозначает -NH-(CH2)n-CO-, R1 обозначает X-Arg-Gly-Asp-Y и "п" обозначает 1, 2, 3, 4, 5 или 6 Соединения формулы (1) и также исходные вещества для их получения получают впрочем само по себе известными способами, которые описаны в литературе (например, как Губен-Вейл, Методы органической химии, изд Georg-Thieme, Штутгарт), а именно при реакционных условиях, которые известны и пригодны для указанных взаимодействий При этом можно употреблять также сами по себе известные, здесь подробнее не упомянутые варианты Исходные вещества, если желательно, также можно получать in situ, так что их не выделяют из реакционной смеси, а тотчас вводят во взаимодействие далее для получения соединений формулы (1) Соединение формулы (1) предпочтительно можно получать тем, что соединения формулы (II) вводят во взаимодействие с соединениями формулы (III) Соединения формул (II) и (III) как правило известны Если они неизвестны, то их можно получать само по себе известными способами В соединениях формулы (III) остаток -CO-L обозначает предварительно активированную карбоновую кислоту, предпочтительно галоидангидрид карбоновой кислоты, симметричный или смешанный ангидрид или сложный активированный эфир Такого рода остатки для активирования карбоксильной группы в типичных реакциях ацилирования описаны в литературе (например, в ГубенВейл, Методы органической химии, изд GeorgThieme, Штутгарт) Активированные сложные эфиры целесообразно получают in situ например, путем добавки HOBt или N-гидроксисукцинимида L обозначает предпочтительно Н, CI, Вг или -ON-сукцинимид Взаимодействие осуществляется как правило в инертном растворителе, в присутствии кислотосвязующего средства, предпочтительно органи ческого основания, как триэтиламин, диметиланилин, пиридин или хинолин, или избытка карбоксильного компонента формулы (III) Также может оказаться благоприятной добавка гидроксида карбоната или бикарбоната щелочного или щелочноземельного металла или другой соли слабой кислоты щелочного или щелочноземельного металла, предпочтительно калия, натрия, кальция или цезия Время реакции, в зависимости от применяемых условий, составляет от нескольких минут до 14 дней, реакционная температура составляет -30°С - 140°С, обычно -10°С - 90°С, в особенности примерно 0°С - примерно 70°С В качестве инертных растворителей пригодны, например, углеводороды, как гексан, петролейный эфир, бензол, толуол или ксилол, хлорированные углеводороды, как трихлорэтилен, 1,2дихлорэтан, тетрахлорид углерода, хлороформ или дихлорметан, спирты, как метанол, этанол, изопропанол, н-пропанол, н-бутанол или трет-бутанол, простые эфиры, как диэтиловый эфир, диизопропиловый эфир, тетрагидрофуран (ТГФ), или диоксан, простые гликолевые эфиры, как этиленгликольмонометиловый и -моноэтиловый простой эфир (метилгликоль или этилгликоль), этиленгликольдиметиловый простой эфир (диглим), кетоны, как ацетон или бутанон, амиды, как ацетамид, диметилацетамид или диметилформамид (ДМФ), нитрилы, как ацетонитрил, сульфоксиды, как диметилсульфоксид (ДМСО), сероуглерод, карбоновые кислоты, как муравьиная кислота или уксусная кислота, нитросоединения, как нитрометан или нитробензол, сложные эфиры, как этилацетат, вода, или смеси указанных растворителей Соединения формулы (1), далее, можно получать тем, что соединения формулы (IV) вводят во взаимодействие с соединениями формулы (V) Исходные соединения формулы (IV) и формулы (V) как правило известны Если они неизвестны, то их можно получать само по себе известными способами В соединениях формулы (V) остаток -CO-L обозначает предварительно активированную карбоновую кислоту, предпочтительно галоидангидрид карбоновой кислоты, симметричный или смешанный ангидрид или активированный сложный эфир Такого рода остатки для активирования карбоксильной группы в типичных реакциях ацилирования описаны в литературе (например, ГубенВейл Методы органической химии, изд GeorgThieme, Штутгарт) L предпочтительно обозначает CI, Вг или -ON-сукцинимид Взаимодействие соединений формулы (IV) с соединениями формулы (V) протекает при таких же условиях относительно реакционного времени, температуры и растворителя, как это описано для взаимодействия соединений формулы (II) с соединениями формулы (III) Линейные соединения формулы (1) с открытой цепью, в которых R1 обозначает X-Arg-GlyAsp-Y или A-Cys (R2)-B, далее, можно получать тем, что в последней стадии твердофазного синтеза биотин вводят в реакцию сочетания в том же цикле, как и обычную защищенную на N-конце аминокислоту, в качестве последнего компонента 41981 и биотинпептид при обычных условиях отщепляют от смолы Твердофазный синтез, отщепление и очистку осуществляют как описывается A Jonczyk и J Meienhofer в Peptides Proc 8th Am Pept Symp Eds V Hruby и D H Rich, Pierce Comp III, с 73-77 (1983), или аналогично способам, описанным в Angew Chem 104, 375-391 (1992) Линейные соединения с открытой цепью формул (II) и (IV) впрочем можно получать обычными способами аминокислотного и пептидного синтеза, которые, например, описаны в указанных стандартных работах и патентных заявках, например, также по твердофазному синтезу согласно Mernfield (В F Gysm и R В Mernfield, J Am Chem Soc , 94, 3102 и последующие (1972) Циклические соединения формулы (II) и формулы (IV), в которых R1 обозначает цикло(Arg-Gly-Asp-Z), можно получать путем циклизации линейных соединений, как, например, описывается в патенте ФРГ 4310643 или в Губен-Вейл, указано выше, том 15/П, с 1-806 (1974) Соединения формулы (1), далее, можно получать тем, что их высвобождают из их функциональных производных путем сольволиза, в частности гидролиза, или путем гидрогенолиза Предпочтительными исходными веществами для сольволиза, соответственно, гидрогенолиза, являются такие, которые вместо одной или нескольких свободных амино- и/или гидроксильных групп содержат соответствующие защищенные амино- и/или гидроксильные группы, предпочтительно такие, которые вместо Н-атома, связанного с N-атомом, несут защитную для аминной функции группу, например, такие, которые соответствуют формуле (1), однако вместо ЫИг-группы содержат NHR1-rpynny (где R1 обозначает защитную для аминной функции группу, например, ВОС или CBZ) Далее, предпочтительны исходные вещества, которые вместо Н-атома гидроксильнои группы содержат защитную для гидроксильнои функции группу, например, такие, которые соответствуют формуле (1), однако, вместо гидроксифенильной группы содержат R''O-фенильную группу (где R" обозначает защитную для гидроксильнои функции группу) В молекуле исходного вещества может быть несколько одинаковых или разных - защищенных амино- и/или гидроксильных групп В случае, если имеющиеся защитные группы отличаются друг от друга, то их во многих случаях можно отщеплять селективно Выражение "защитная для аминной функции группа" общеизвестно и относится к группам, которые пригодны для защиты (блокирования) аминогруппы от химических взаимодействий, которые, однако, легко отщепляются, после того, как в других местах молекулы прошла желательная химическая реакция Типичными для таких групп являются, в частности, незамещенные или замещенные ацильные, арильные, аралкоксиметильные или аралкильные группы Так как защитные для аминной функции группы удаляют после желательной реакции (или последовательности реакций), то их род и величина не критические, однако, предпочтительны группы с 1-20, в особенности 1 8, С-атомами Выражение "ацильная группа" в свя зи с настоящим способом нужно понимать в самом широком смысле Оно охватывает производимые от алифатических, аралифатических, ароматических или гетероциклических карбоновых кислот или сульфокислот ацильные группы, а также, в частности, алкоксикарбонильные, арилоксикарбонильные, и прежде всего а рал ко кс и карбон ильные группы Примерами такого рода ацильных групп являются алканоил, как ацетил, пропионил, бутирил, аралканоил, как фенилацетил, ароил, как бензоил или толуил, арилоксиалканоил, как РОА, алкокси карбон ил, как метоксикарбонил, этоксикарбонил, 2,2 2-трихлорэтоксикарбонил, ВОС, 2-иодэтоксикарбонил, аралкилоксикарбонил, как CBZ ("карбобензокси"), 4-метоксибензилоксикарбонил, FMOC, арилсульфонил, как Mtr Предпочтительными, защитными для аминной функции группами являются ВОС и Mtr, далее, CBZ, Fmoc, бензил и ацетил Выражение "защитная для гидроксильнои функции группа" также общеизвестно и относится к группам, которые пригодны для защиты гидроксильнои группы от химических взаимодействий, которые, однако, легко удаляются, после того, как в других местах молекулы прошла желательная химическая реакция Типичными для таких групп являются вышеуказанные незамещенные или замещенные арильные, аралкильные или ацильные группы, далее, также алкильные группы Природа и величина защитных для гидроксильнои функции групп не критические, так как их снова удаляют после желательной химической реакции или последовательности реакций, предпочтительны группы с 1-20, в особенности 1-10 С-атомами Примерами защитных для гидроксильнои функции групп являются, между прочим, бензил, п-нитробензоил, п-толуолсульфонил, трет-бутил и ацетил, причем особенно предпочтительны бензил и трет -бутил СООН-группы в аспарагиновой кислоте и глутаминовой кислоте предпочтительно защищаются в форме их сложных трет -бутиловых эфиров (например, Asp (OBut)) Высвобождения соединений формулы (1) из их функциональных производных достигают в зависимости от используемой защитной группы-, например, с помощью сильных кислот, целесообразно с помощью ТФК или хлорной кислоты, однако, также с помощью других сильных неорганических кислот, как соляная кислота или серная кислота, сильных органических карбоновых кислот, как трихлоруксусная кислота, или сульфокислот, как бензол- или п-толуолсульфокислота Присутствие дополнительного инертного растворителя возможно, но не всегда необходимо В качестве инертных растворителей пригодны предпочтительно органические, например, карбоновые кислоты, как уксусная кислота, простые эфиры, кактетрагидрофуран или диоксан, амиды, как ДМФ, галогенированные углеводороды, как дихлорметан, далее, также спирты, как метанол, этанол или изопропанол, а также вода Далее, применяют смеси вышеуказанных растворителей ТФК предпочтительно применяют в избытке без добавки другого растворителя, хлорную кислоту используют в виде смеси из уксусной кислоты и 70%-ной хлорной кислоты в соотношении 9 1 Температуры реакции для расщепления целесообразно составляют примерно с 0° 41981 до примерно 50°С, предпочтительно работают при температуре 15-30°С (комнатная температура) Группы ВОС, OBut и Mtr можно отщеплять, например, предпочтительно с помощью ТФК в дихлорметане или с помощью примерно 3-5 н HCI в диоксане при 15-30°С, FMOC-группу можно предпочтительно отщеплять с помощью примерно 5-50%-ного раствора диметиламина, диэтиламина или пиперидина в ДФМ при 15-30°С Тритильную группу используют для защиты аминокислот гистидина, аспарагина, глутамина и цистеина Отщепление осуществляют, в зависимости от желательного целевого продукта, с помощью ТФК/10% тиофенола, причем тритильная группа отщепляется от всех указанных аминокислот, при использовании смеси ТФК/анизол или ТФИ/гиоанизол отщепляются только тритильная группа от His, Asn и Gin, в противоположность чему она остается в Cys-боковой цепи Гидрогенолитически удаляемые защитные группы (например, CBZ или бензил) можно отщеплять, например, путем обработки водородом в присутствии катализатора (например, катализатора на основе благородного металла, как палладий, целесообразно на носителе, как уголь) В качестве растворителей при этом пригодны вышеуказанные, в особенности, например, спирты, как метанол или этанол, или амиды, как ДМФ Гидрогенолиз, как правило, проводят при температурах примерно 0-100°С и давлениях примерно 1-200 бар, предпочтительно при 20-30°С и давлении 1 10 бар Гидрогенолиз CBZ - группы протекает, например, хорошо в присутствии 5-10%-ного палладия-на-угле в метаноле или с помощью формиата аммония (вместо водорода) в присутствии Pd/C в смеси метанола с ДМФ при 20-30°С Основание формулы (1) с помощью кислоты можно переводить в соответствующую соль присоединения кислоты, например, путем взаимодействия эквивалентных количеств основания и кислоты в инертном растворителе, как этанол, и последующего выпаривания Для этого взаимодействия применяют, в частности, кислоты, которые дают физиологически приемлемые соли Так, можно применять неорганические кислоты, например, серную кислоту, азотную кислоту, галогенводородные кислоты, как соляная кислота или бромоводородная кислота, фосфорные кислоты, как ортофосфорная кислота, сульфаминовую кислоту, далее, органические кислоты, в частности, алифатические, эпициклические, аралифатические, ароматические или гетероциклические одно- или многоосновные карбоновые, сульфоновые или серные кислоты, например, как муравьиная кислота, уксусная кислота, пропионовая кислота, пивалиновая кислота, диэтилуксусная кислота, малоновая кислота, янтарная кислота, пимелиновая кислота, фумаровая кислота, малеиновая кислота, молочная кислота, винная кислота, яблочная кислота, лимонная кислота, глюконовая кислота, аскорбиновая кислота, никотиновая кислота, изоникотиновая кислота, метан- или этансульфокислота, этандисульфокислота, 2-гидроксиэтансульфокислота, бензолсульфокислота, п-толуолсульфокислота, нафгалин-моно- и ди-сульфокислоты, лаурилсерная кислота Соли с физиологически неприемлемыми кислотами, например, пикраты, можно при менять для выделения и/или очистки соединений формулы (1) С другой стороны, кислоту формулы (1) путем введения во взаимодействие с основанием можно переводить в одну из ее физиологически приемлемых солей металла или аммония В качестве солей применяют при этом, в частности, соли натрия, калия, магния, кальция и аммония, далее, замещенные аммониевые соли, например, диметил-, диэтил- или диизопропил-аммониевые соли, моноэтанол-, диэтанол- или диизопропиламмониевые соли, циклогексил-, дициклогексиламмониевые соли, дибензилэтилендиаммониевые соли, далее, например, соли с аргинином или лизином Предметом изобретения, далее, является применение соединений формулы (1) и/или их физиологически приемлемых солей для приготовления фармацевтических композиций, в частности, нехимическим путем При этом их вместе, по меньшей мере, с одним твердым, жидким и/или полужидким носителем или вспомогательным веществом и в случае необходимости в комбинации с одним или несколькими другими биологически активными веществами доводят до пригодной дозировочной формы Предметом изобретения, далее, являются фармацевтические композиции, содержащие, по меньшей мере, одно соединение формулы (1) и/или одну из его физиологически приемлемых солей Эти композиции можно применять в качестве лекарственных средств в медицине или ветеринарии В качестве носителей применяют органические или неорганические вещества, которые пригодны для кишечного (например, перорального), парентерального, топического введения или для введения в форме ингаляционного распыления и не реагируют с новыми соединениями, например, как вода, растительные масла, бензиловые спирты, алкиленгликоли, полиэтиленгликоли, триацетат глицерина, желатина, углеводы, как лактоза или крахмал, стеарат магния, тальк, вазелин Для орального применения, в частности, служат таблетки, пилюли, драже, капсулы, порошки, грануляты, сиропы, соки и капли, для ректального применения служат свечи, для парентерального применения служат, в частности растворы, предпочтительно масляные или водные растворы, далее, суспензии, эмульсии или имплантаты, для топического применения служат в особенности мази, кремы или пудры Новые соединения можно также лиофилизовать и полученные лиофилизаты применять, например, для приготовления инъецируемых препаратов Указанные композиции могут быть стерилизованы и/или они могут содержать вспомогательные вещества, как придающие скользкость, например, таблеткам, вещества, консерванты, стабилизаторы и/или смачиватели, эмульгаторы, соли для влияния на осмотическое давление, буферные вещества, красители, вкусовые вещества и/или некоторые другие биологически активные вещества, например, один или несколько витаминов Для введения в виде ингаляционного распыления можно применять распылители, которые содержат биологически активное вещество либо растворенным, либо суспендиро 41981 ванным в выталкивающем (рабочем) газе или смеси выталкивающих газов (например, СОг или фторхлоруглеводороды) Целесообразно при этом применять биологически активное вещество в микронизированной форме, причем может быть добавлен один или несколько дополнительных, физиологических приемлемых растворителей, например, этанол Растворы для ингаляций можно вводить с помощью обычных ингаляторов Соединения формулы (1) и их физиологически приемлемые соли можно применять в качестве ингибиторов интегрина при борьбе с заболеваниями, в частности, патологическими ангиогенными заболеваниями, тромбозами, инфарктом сердца, коронарными заболеваниями сердца, артериосклерозами, опухолями, остеопорозом, воспалениями и инфекциями При этом предлагаемые согласно изобретению вещества, как правило, можно вводить по аналогии с другими веществами, имеющими в продаже пептидами, в частности, однако, по аналогии с описанными в патенте США А-4472305 соединениями, предпочтительно в дозировках примерно 0,05-500 мг, в особенности 0,5-100 мг, на дозировочную единицу Суточная дозировка составляет примерно 0,01-2 мг/кг веса тела Специальная доза для каждого пациента, однако, зависит от самых различных факторов, например, от эффективности используемого специального соединения, от возраста, веса тела, общего состояния здоровья, пола, от стоимости, от момента и пути введения, от скорости выделения, комбинации лекарственных средств и тяжести соответствующего заболевания, которая имеет значение для терапии Предпочтительно парентеральное введение Далее, новые соединения формулы (1) можно применять в аналитической биологии и молекулярной биологии При этом используют способность к комплексообразованию между биотинильным остатком и гликопротеином авидином Применения комплекса биотин-авидин известны из статьи Е А Bayer и М Wilchek в Methods of Biochemical Analysis, 26, 1-45 (1980) (лит 1) Новые соединения формулы (1) можно применять в качестве интегриновых лигандов для приготовления колонок для аффинной хроматографии с целью получения в чистом виде интегрина Комплекс из дериватизированного авидином носителя, например, сефарозы, и новых соединений формулы (1) получается само по себе известными способами, как описывается, например, в (литі) По этой причине здесь далее не останавливаются на этом способе, а отсылают к соответствующей литературе, например, (лит 1) В качестве полимерных носителей пригодны само по себе известные в химии пептидов полимерные твердые фазы предпочтительно с гидрофильными свойствами, например, сшитые полисахара, как целлюлоза, сефароза или сефадекс®, акриламиды, полимеры на основе полиэтиленгликоля или Tentakel-полимеры® Новые соединения формулы (1) также можно применять в качестве диагностических маркеров для анти-биотин-антитело-реакций в анализе ферментного иммуносорбентного типа и FACSанализе (с флуоресцентным активированием ус тановка для сортировки клеток) Известно применение антибиотин-антител для обнаружения биотина согласно М Berger, Biochemistry, 1_4, 23382342 (1975) Применение дериватизированного биотином иммуноглобулина IgG в иммуноферментном анализе (ELISA) описано U Holmkov Nielsen и др , в Journal of Chromatogr, 297, 225233(1984) В J Immunol Methods, 181, 55-64 (1995) J Gao и S J Shattil описывается ELISA-тест на обнаружение веществ, которые ингибируют (хиь Рш -активирование интегрина Для обнаружения используют здесь биотинилированный фибриноген Применение поточной цитометрии в клинической диагностике клеток описано G Schmitz и G Rothe в DG Klmische Chemie Mitteilungen, 24 (1993) часть 1, с 1-14 Далее, соединения формулы (1) можно использовать в микроскопии с силовым полем (атомная силовая микроскопия AFM) для измерения силы взаимодействий лиганд-рецептор Лиганд предпочтительно обозначает комплекс из авидина и новых соединений формулы (1) Рецептор предпочтительно обозначает интегриновый рецегтгор E-L Florin и др в Science, 264, 415-417 (1994) описали измерения адгезионных сил между функционализированным авидином микроскопом с силовым полем и биотинилированной агарозой Выше и нижеуказанные, все температуры указываются в °С В нижеследующих примерах "обычная обработка" обозначает добавляют, если необходимо, воду, устанавливают, если необходимо, в зависимости от строения целевого продукта, рН-значения в пределах 2-10, экстрагируют этилацетатом или дихлорметаном, разделяют, органическую фазу сушат над сульфатом натрия, растворитель выпаривают и остаток очищают путем хроматографии на силикагеле и/или путем кристаллизации Rf-значения указываются при использовании силикагеля, растворитель смесь этилацетата с метанолом в соотношении 9 1 RZ - время удерживания (минуты) в случае ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии) в следующих системах[А] Колонка Nucleosil 7C 18 250x4 мм, элюент А 0,1% ТФК в воде, элюент В 0,1% ТФК в ацетонитриле, истечение 1 мл/мин , градиент 20-50% В/30 мин [В] 50-минутный градиент 0-80% пропан-2-ола в воде с 0,3% ТФК при 1 мл/мин на колонке с Lichrosorb® RP Select В (7 мкм) 250x4 мм [С] Колонка Lichrospher (5 мкм) 100 RP 8 125x4 мм, элюент А 0,01 М фосфат натрия, рН=7,0, элюент В 0,005 М фосфат натрия, рН=7,0/60 объемн % пропан-2-ола, истечение 0,7 мл/мин, градиент 1-99% В/50 мин Масс-сп ектрометрия (MS) El (ионизация электронным ударом) М + FAB (бомбардировка быстрыми атомами) (М+Н)+ DMPP - смола обозначает 4-(2',4'-диметоксифенил-гидроксиметил) феноксисмолу, сверхкислая лабильная (неустойчивая) смола, которая позволяет осуществлять синтез защищенных в боковых цепях пептидов 41981 Пример 1. 0,6 г Fmoc-l_ys(Boc)-OH растворяют в 100 мл дихлорметана, смешивают с 1,2 эквивалентами DMPP-смолы, 1,4 эквивалентами HOBt и 1,4 эквивалентами DCCI и перемешивают в течение 12 часов при комнатной температуре После удаления растворителя получают Fmoc-l_ys(Boc)-DMPP-CMOлу В синтезаторе пептидов Fmoc-Pro-OH конденсируют с H-l_ys(Boc)-DMPP-CMonoH [высвобождение из Fmoc-l_ys(BOC)-DMPP-CMonbi с помощью смеси пиперидин/ДМФ (20%)] тем, что используют трехкратный избыток защищенного) пролина Реакцию сочетания с DCCi/HOBt осуществляют при комнатной температуре Получают Fmoc-ProLys(BOC)-DMPP-CMony Аналогичным образом путем последующего отщепления Fmос-защитной группы и последовательных сочетаний с FmocSer-(But)-OH, Fmoc-Asp(OBut)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Arg(Mtr)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH и Bit-OH при повторяющихся при каждом сочетании реакционных условиях, ^ Fmoc-Pro-GH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc~Asp(OBut)-OH, Fmoc-Aia-OH, Fmoc-Thr(But)-OH, Fmoc-Arg(Mtr)-OH и Bii-OH В -t-Arg-Tdr-A!a-AEp--Cys{Trt)-Pro-0 Н, о Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Asp(OBut)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser(Bui)-OH и Bit-OH Bit-Ser-Aia Asp-Cys{Trt)-Pfo-OH, с Fmoc-Pro-Oh, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Asp(OBui)-OHt Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser(Bui)-OH, Fmoc-GlnfTrt)-OH и Bif-OHBit-Gln~Ser-A!a-Asp-Cys{Trt}-.Pro-OH, с Fmoc-Pro-OH Fmoc-Cys{Tft) OH. Fmac-Asp{OBui)-OH. Fmoc Ala-OH, Fmoc Ser(Bui)-OH Fmoc-Glp-OH и Brt-OH Bit-GIp Ser-Ala-Asp-Cys(Trt)-Pro-OH t- Fmoc-Pro OH. Fmoc-CysfFrt) OH, Frroc-Gly-OH, Fmoc Aia OH Fmoc Sof(But)-OH. Fmoc-Ile-OH и Bii-OH B't-lle Ssr-Ala-Gfy-Cys(Tj1)-Pro OH с Fmoc-Pro-OH. FnTOC-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ala-OH, rmoc-Ser(But) OH, Frnoc-Arg(Mlr)-OH и 8i!-OH Bil-Arg-Ser A!a-G!y Cys(Trt)-Pro OH, - высвобождения а-амино-группы с помощью смеси пиперидина с ДМФ (20%), - промывки с помощью диметилацетамида и - введения во взаимодействие с Fmoc-аминокислотой, соответственно, Bit-OH, получают Bit-Gly-Gly-Gly-Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-Ser(But)-ProLys(Boc)-DMPP-CMony Смолу промывают с помощью CF3SO3H (CH2CI2) Н2О и получают Bit-GlyGly-Gly-Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-Ser(But)-Pro-Lys(BOC)ОН с Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Cys(Tr1)-OH, Fmoc-Asp(OBu!>-OH, Fmoc Gly-OH, Fmoc-Gfy-OH, Fmoc-Lys(BOC) ОН и Bit-OH Bif-Lys-Gly-Gly-Asp-Cys(Trt)-Pfo-OH, с Fmoc Cys(Trt}-OHr Fmoc-Asp(OBut)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Thr(But)-OH. Fmot>Lys(BOC)-OH и Bit-OH Bii-Lys-Thr-Aia-Asp-Cys(Trt)-OH, После отщепления защитных групп с помощью 2н HCI в диоксане, удаления растворителя, обработки остатка в ТФК/СН2СІ2 и осаждении с помощью диэтилового эфира очищают через RPВЭЖХ Получают Bit-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-SerРго-І_уз-ОНх2ТФК, RZ IBI = 12,14, FAB1056 с Fmoc-Thr(6ut)-OH Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Pro-OH, Гтас-Gty-OH, Fmoc-Lys(BOC) OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc Asn(Tft)-OH, Fmoc-Arg{Mtt)-OH, Fmoc-Pfo-OH, Fmoc-Cys(Tft)-OH, Fmoc-Asp(OBut)-OH, Fmoc Ala-OH и Bit-OH а) при отщеплении защитных групп с помощью ТФК и 10% тиофенола Пример 2. Аналогично примеру 1, путем последовательных сочетаний DMPP-солы с Brt-Ala-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-His-Lys-Gly-Pro Aia-Thr-OH, б) при отщеплении защитных групп с помощью ТФК и 10% тиоанизола Fmoc-Pro-OH, Fmoc-CysfT^-OH, Fmoc-Asp{OBut)~ ОН, Frnoc-Ala-OH Fmoc-Thr(But}-OH Fmoc-Lys(BOC]-OH, Fmoc-Gly-OH Fmoc-Gfy-OH Fmoc-Gty-OH м 8it-0H Bit-Ala-Asp-Cys(Trt) PrG-Arg-Asn-Pro-His-Lys-Giy-Pfo-Aia-Thf-OH, с Fmoc-Thr(But)-OH. Fmoc-A!a-OH, Fmoc-Pro-OH. Fmoc-G!y OH. Fmoc-Lys(BOC)-OH, Fmoc-His(Trt}-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH Fmoc-Arg(№)-OH, Fmoc-Pro-OH. Fmoc-Cys{Trt)-OH. Fmoc-AspfOBul)-OH Fmoc-Cys(Trt)-OH Fmoc-Trir{But)-QH, F-noc-Lys(BOC)-OH Fmoc Gly-OH a Bii-OH получают Bit-Giy-GiyGly-Ly5(BOC)-Thr(Bu[!-Ala-Asp(OBut)-Cys(Trt)-Pro-DMPPCMOTJ Путем отщепления от смолы, отщепления защитных групп и очистки получают а) при отщеплении защитных групп с помощью ТФК и 10% тиофенола Brt-Gly-G!y-Gly-lys-Thr-AS3-Asp CysSTri)-Pro-OH x 2 Т#К, HZ [В}=27 6, FAB 1273 Bit Giy Lys Thf Cys Asp Cys-Pro-Arg-Asn-PfO-His-lys-Gly-Pro-AlaThr-OH Аналогичным образом получают путем конденсации DMPP-смолы б) при отщеплении защитных групп с помощью ТФК и 10% тиоанизола с Fmoc-Prc-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Asp{OBut)-OH, Fmoc-Ala-OH Fmoc-Thr(But)-OH, Fmoc-Lys(BOCj-OH u Bit-OH Bit Lys-Thr-A!a-Asp-Cys(Trt)-Pfo-OH, Bit Gly Lys Thf Cys(Trt) Asp-Cys(Trt)-Pro Arg-Asn-Pro-His-LysGfy-Pro Ala-Thr-OH, с Fmoc-Gly-OH, Fmoc Lys(BGC)-OH, Fmoc-His{Tft)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc Asn(Tr1}-OH Fmoc-Arg(Mtr)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Asp(OBut)-OH Fmoc-Ala-OH. Fmoc-Thr(Bu!)-OH, Fmoc-Lys(BOC) ОН и Bit-OH с Fmoc-Pro-OH, Frnoc-Cys(Trt!-OH, Fmoc-Asp(OBut}-OH, Fmoc-Aia-OH, Fmoc-AIa-OH Fmoc-lys(BOC)-OH i* Bit-OH Bii-L>5-AIa Ala Asp-Cys(Trt)-Pro-OH, 10 41981 а) при отщеплении защитных групп с помощью ТФК и 10% тиофенола С Fmoc HisfTrt) OH Fmoc Pro OH Fmoc Asn{Trt)-QH Fmoc Arg(Mtr) OH Fmoc Pro OH Fmoc CysfTrtj OH Fmoc Asp(OBut} OH FmocAlaOH Fmoc Thr(But) OH Fnoc Lys(BOC) ОН В Lys Thr Ala Asp Cys Pro Arg Asn Pro His Lys Gly OH и Bit OH Bit Lys Thf Ala Asp Cys(Trt) Pro Arg Asn Рго-His OH с Fmoc Arg(M r) OH Fmoc Pro OH Fmoc CysfTri) OH б) при отщеплении защитных групп с помощью ТФК и 10% тиоанизола FmocAsp(OBut) OH Fnoc Ala OH Fmoc Thr{BL-t)-OH Frnot, Lys/BOC) ОН л 8ft OH Brt Lys Thr Ala Asp CysfTrtj Pro Arg OH Bit Lys Thr Ala Asp CysfTrt) Pro A g Asn Pro His Lys Gly OH (BOC) ОН и Bit OH 8ft Lys Thr Ala Asp CysfTrt} Pro-OH 8tf Lys Thr Ata Asp Cys(Trt) Pro Arg Asn Pro His-Lys Gly Pro Aia Thr OH С moc-NMeAia-OH Fmoc CysfTrt) OH Fmoc Asp(OBut)-OH Fmoc Ala OH Fmoc ThrfBut) OH Fmoc Lys(BOC)-OH -A Bit OH С Frnoc G!y OH Fmoc Lys(BOC) OH Fmoc HisfTrt) OH Fmoc Pro OH Fmoc Asn{Trt) OH Fmoc Arg(Mlr) OH Fmoc Pro OH Fmoc CysfTrf) OH 8ft Lys Thr Ala Asp CysfTrt) NMeAJa OH Fmoc Asp(ORui) OH Frnoc Aia OH Fmoc Thf(But) OH Frnoc Lys(BOC) OH Fmoc Gly ОН к Brt OH Пример 3 К раствору из 3 05 г i_(HKno-(Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys) [получен путем циклизации H-Arg(Mtr)Gly-Asp(OBut)-D-Phe-Lys(BOC)-OH до цикло(Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-D-Phe-Lys(BOC)) и последующего отщепления защитных групп] в 100 мл дихлорметана добавляют 1 7 г общедоступно получаемого (+)-биотинил-І\І-сукцинимид ильного сложного эфира и 0 5 г триэтиламина Перемешивают в течение 5 часов при комнатной температуре и получают после обычной обработки цикло(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(Ns-Bit)) хТФК RZ (В) 11 32 FAB 830 а) при отщеплении защитных групп с помощью ТФК и 10% тиофенола ВИ G!y Lys Thr Ala &>p Cys Pro Arg Asn Pro His Lys Giy OH б) при отщеплении защитных групп с помощью ТФК и 10% тиоанизола В ! Gly Lys Thr Al= Asp C>sTrt) Pro Arg «sn Pro His L>s Gly OH с Fmoc Thr(Bul) OH Fmoc Ala OH Fmoc Pro OH Fmoc Gly OH Fmoc Lys(6OC) OH Fmoc His(Trt) OH Fmoc Pro OH Fmoc AsnfTrt) OH Fmoc Arg(Mtr) OH Fmoc Pro OH Fmoc CysfTrt) OH Пример 4 Аналогично примеру 3 из 3 05 цикло-(АгдGly-Asp-D-Phe-Lys) и 2 3 г общедоступного (+) Nсукцинимидального сложного эфира биотинил-6аминокапроновой кислоты ("А") и 0 5 г триэтиламина получают цикло-(Агд-СІу-Азр-О-Ргіе-іу5(МгВіт.-Агіа))хТФК RZ[C]23 67 FAB 943 Аналогичным образом из "А" и нижеследующих циклических соединений цикло-(Агд-СІу-А5р-О-Тгр-І_у5) цикло-(Агд-СІу-А5р-О-Туг-І_у5) 4Hmo-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-D-Lys) Fmoc AspfOBut) OH F m o c A l a O H Fmoc ThixBut) ОН и Bii OH Bit Thr Ala Asp Cys Pro Aro, Asn Pro Hss Lys Gly Pro Ala Thr OH о Fmoc Thf(But) OH Fmoc Ala OH Fmoc Pro OH Fmoc Gly OH Fmoc Lys(BOC) OH Frnoc His(TrtJ OH Fmoc Pro OH f m o c AsnfTrt) OH Fmoc ArgfM(r) OH Fmoc Pro OH Frnoc Cys(Trl) OH Fmoc AspfO But) OH Fmoc Ala ОН и Btt OH В і Ala Asp Cys Pro Arg Asn Pro H s Lys Gfy Pro Ala Thr OH c- Fmoc Gly OH Fmoc Lys(BQC) OH Fmoc His(Trt) ОИ Fmoc Pro OH Fmoc-AsniTrt) OH Fmoc Arg(M(r)-OH Fmoc Pro-QH Fmoc Cys(Trt) OH Fmoc Asp(QBut) OH Fmoc Ala ОН и Bit OH Bit Ala Asp Cys Pro Arg Asn Pro His Lys-Gry OH •Gly-Asp •D-Phe-Cys} С Fmoc Pro OH Fmoc Asnrjrt) OH Fmoc Arg(Mtr)-OH Fmoc Pro OH Fmoc CysfTrt) OH Fmoc Asp(OBut) OH FmocAla-OH Frnoc Thr(But)-OH Fmoc Lys(BOC) ОН и Bit OH цйкяо~(Агд G!y-Asp •D-Phe-Dab) цикло-(Агд- Gly-Asp -D-Trp-0-Cys) ЦИКЛ0-