Пептид- антагоніст gnrh, фармацевтична композиція та спосіб інгібування з його застосуванням

1 Пептид-антагоніст GnRH, що має формулу X-D-Nal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser-Xaa5-Xaa6-Leu-Xaa8Pro-Хааю та його фармацевтично прийнятні солі, де X - ацильна група, що має не більше 7 атомів карбону або Q, eQ-c=C-NRH, a R - Н чи нижчий алкіл, А - 4СІ, 4F, 4Br, 4NO2, 4СН3, 4ОСН3, 3,4СІ2, або а С Ме4СІ, Хаа 6 - D-Aph(Q 2 ), D-Amf(Q 2 ), D-Lys(Nic), D-Cit, DHci або D-3Pal, де Q 2 - For, Ac, З-амшо-1,2,4триазол, Q або Qi, Xaas - Lys(ipr), Arg, Har, Arg(Et 2 ), або Har(Et 2 ), a Хааю - D-Ala-NH 2 , D-Ala-ол, АІа-ол, NHCH 2 CH 3 , Gly-NH 2 , AzaGly-NH 2 , Ala-NH 2 , Agl-NH 2 , D-Agl-NH 2 , Agl(Me)-NH 2 , або D-Agl(Me)-NH 2 , за умови, що а аміногрупа Xaas може бути метилованою, а також за умови, що коли Хаає включає D- чи L-Hor, або D- чи L-lmz, тоді Xaas може мати як Qi - For, Ac або 3-амшо-1,2,4-триазол, а також, що коли Хаає включає Q, то Xaas також може включати Q 2 Пептид-антагоніст GnRH за п 1 , який відрізняється тим, що в ньому X, А та Xaas визначені у п 1, Q - карбамоїл або метилкарбамоїл, D-Pal - D-3Pal, Хаа 5 - 4Aph(Qi) або 4Amf(Qi), де Qi н. о О (D-чиЬ-Ног) fl Хаа 5 - Aph(Qi) або Amf(Qi), де Qi (D-чиЬ-Ног) о (D-nnL-Ifflz) Хаа6 - D-4Aph(Q2), D-4Amf(Qi), де Q2- Q або D- чи L-Hor, або D- чи L-lmz, за умови, що коли Q2 - Q, то Qi теж може бути Q, а Хааю - D-Ala-NH2, D-Ala-ол або АІа-ол 3 Пептид-антагоніст GnRH за п 1 чи 2, який відрізняється тим, що в ньому Qi - D-Hor чи L-Hor 4 Пептид-антагоніст GnRH за будь-яким з пунктів 1-3, який відрізняється тим, що в ньому X - Ас, Хаа8 - Lys(ipr), а Хааю - D-Ala-NH2 5 Пептид-антагоніст GnRH за будь-яким з пунктів 1-4, який відрізняється тим, що в ньому Xaas 4Aph(D- чи L-Hor), а Хаа6 - D-4Aph(Ac), D4Aph(atz) або D-3Pal ю 00 ю 58547 6 Пептид-антагоніст GnRH за будь-яким з пунктів 1-4, який відрізняється тим, що в ньому Хаа5 4Aph(D- чи L-Hor), Q 2 - Q, a R - Н чи метил 7 Пептид-антагоніст GnRH за будь-яким з пунктів 1-4, який відрізняється тим, що в ньому Хаа5 4Aph(D- чи L-Hor), а Хаа 6 - D-Cit або D-Hci 8 Пептид-антагоніст GnRH за будь-яким з пунктів 1-4, який відрізняється тим, що в ньому Хаає - D4Aph(D-Hor) 9 Пептид-антагоніст GnRH за п 1 , який відрізняється тим, що в ньому X - For, Ac, Acr, Pn, By, VI, Vac, Bz або Q, Q визначено у п 1, A-4CI4H4F, D-Pal є D-3Pal, Хаэ5 - Aph(Qi) або Amf(Qi), де Qi є D-ізомером, Lізомером або сумішшю D/L-ізомерів Ног, чи Imz, X a a 6 - D - A p h ( Q 2 ) , D-Amf(Q 2 ), D-Lys(Nic), D-Cit4H DPal, д е О 2 - For, Ac, О ч и Qi, Xaas - Lys(ipr), a Х а а ю - D-Ala-NH 2 , D-Ala-ол, АІа-ол, NHCH 2 CH 3 або Gly-NH 2 10 Пептид-антагоніст GnRH за п 9, який відрізняється тим, що в ньому Q - D- чи L-Hor, a Xaas Amf(Qi), в якому R - Н чи метил 11 Пептид-антагоніст GnRH за п 9, який відрізняється тим, що в ньому X - Ас чи Q, R - Н чи метил, Хаа 6 - D-4Aph(Qi), D-4Amf(Qi), або D-3Pal, a Q 2 Q чи Qi, а Хааю - D-Ala-NH 2 12 Пептид-антагоніст GnRH за п 1, який відрізняється тим, що має формулу Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-D-4Aph(L-Hor)-Xaa 6 Leu-I_ys(ipr)-Pro-Xaaio де Хаа 6 - D-4Aph(Ac), D-3Pal, О-4Аргі(карбамоіл), D-4Amf (карбамоїл), D-4Amf(метилкарбамоїл) або D-4Aph(D-Hor), а Х а а і 0 - D-Ala-NH 2 , D-Ala-ол або АІа-ол 13 Пептид антагоністу GnRH за п 12, який відрізняється тим, що має формулу Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-D-4Aph(L-Hor)-D4Aph(L-Hor)-D-4Aph(carbamoyl)-Leu-Lys(ipr)-Pro-DAla-NH 2 14 Фармацевтична композиція для інгібування секреції гонадотропшів у ссавців, яка включає як активний інгредієнт ефективну КІЛЬКІСТЬ антагоніс Цей винахід відноситься взагалі до пептидів, які є антагоністами гонадотропін-вивільняючого гормону людини (GnRH) і мають корисні фізичні, ХІМІЧНІ і біологічні властивості Конкретніше, запропонований винахід відноситься до декапептидів, які пригнічують гонадну функцію і вивільняють стероїдні гормони прогестерону і тестостерону протягом довготривалого періоду, а також до способів вживання фармацевтичних сполук, що містять такі декапептиди, для такої мети, а особливо для управління станами, що є результатом пперсекрецм гонадних стероїдів Фолікул-стимулюючий гормон (FSH) та лютеінізуючий гормон (LH), які ІНОДІ ВІДНОСЯТЬ ДО ГО надотропінів або гонадотропшових гормонів, вивільняються слизовими залозами, які з'єднані ту GnRH за будь-яким з пунктів 1-12 у сполученні з нетоксичним розріджувачем 15 Спосіб діагностики in vivo та in vitro станів, при яких GnRH викликає надлишкову гормональну секрецію або ріст пухлин, згідно з яким застосовують антагоністичний GnRH пептид за будь-яким з пп 1-13 т а спостерігають гормональну секрецію або розмноження пухлинних клітин 16 Спосіб інгібування секреції гонадотропшів у ссавців, згідно з яким застосовують таку КІЛЬКІСТЬ фармацевтичної композиції за п 13, яка призводить до суттєвого зниження рівнів LH та FSH 17 Інтермедіат для виготовлення пептидуантагоністу GnRH формули 1 2 X - D-Nal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser(X )-Xaa 5 -Xaa 6 -Leu4 5 Lys(ipr)(X )-Pro-X , де 1 X - протекторна група а -аміногрупи, А - 4СІ або 4F, X 2 - Н або протекторна група гідроксилу, Хаа 5 - 4Aph(Qi) або 4Amf(Qi), де Qi - D- чи Lізомер, або суміш D/L-ізомерів груп (D-чи L-Hor) О (О-чиЬ-Ітг) Xaa6 - D-Aph(Q2), D-Amf(Q2) або D-Pal, де Q2 - Ac, Qi, карбамоїл або метилкарбамоїл, X4 - кислотно-лабільна протекторна група а аміногрупи, X 5 - D-Ala-, Gly-, Ala-, Agl-, D-Agl-NH2, Agl(Me)-, або D-Agl(Me)-CMona, N-(Et2)- смола, амід D-Ala, Gly, або Ala, етиламід, AzaGly-NH2, або ОН за умови, що а -аміногрупа Xaas може бути метилованою стеблом з гіпоталамусом Вивільнення гормону передніми долями слизових залоз звичайно потребує попереднього вивільнення таких гормонів, які виробляються гіпоталамусом, як декапептиди GnRH Вживання аналогів GnRH, які є антагоністичними відносно нормального функціонування GnRH використовують для пригнічення секреції гонадотропінів, особливо у ссавців, та пригнічення або затримки овуляції Пошук поліпшених антагоністів GnRH призвів до створення антиду, тобто [Ac-D-2Nal1 D4CIPhe2, D-3Pal3, Lys(Nic)5, d-Lys(Nic)6, llysS, DAla10(-GnRH, та цетрореліксу, тобто [Ac-D-2Nal1, D-4CIPhe2, D-3Pal3, D-Cit6, D-Ala10(-GnRH У патенті США № 5,516,887 описані антагоністи GnRH, 58547 які вважають більш ефективними ніж антид у пригніченні тестостерону плазми, наприклад, [Ac-D2Nal 1 , D-4CIPhe 2 , D-3Pal 3 , D-Ne-Kap6aM0in Lys 6 , 1 lys , D-Ala (-GnRH, який позначають як антареЛІКС У патенті США № 5,296,468 від 22 березня 1994 року, розкриті мету і синтез ряду антагоністів GnRH, в яких бічні ланцюги вибраних залишків реагують з утворенням, деякі з яких практично спонтанно перетворюються в потрібний гетероцикл, наприклад, 3-амшо-1,2,4-тріазол (atz) Такі ціаногуанідшові групи будують на основі омегааміногрупи бічного ланцюга такої амінокислоти, як лізин, орнітин, 4-амінофенілаланін (4Арп) чи його аналог з подовженим ланцюгом, як-то 4аміногомофенілаланін (4Апр) Антагоністи GnRH з такими суттєво модифікованими чи неприродними амінокислотами в позиціях 5 та 6 виявляють гарну біологічну здатність, а ті, що створені на основі 4Лрп звичайно позначають як кращі Одним з найкращих є Азалін В, тобто [Ac-D-2Nal 1 D-4CIPhe 2 , D-3Pal 3 , 4Aph(atz) 5 D-4Aph (atz) 6 , llys 8 , D-Ala 10 (-GnRH В патенті США розкрито бюздатні антагоністи GnRH, в яких аміно-заміщені бічні фенілаланінові ланцюги залишків в позиціях 5 та 6 s є ацилованими, одним з особливо потужних декапептидів є ацилін, тобто [Ac-D-2Nal 1 D4CIPhe 2 , D-3Pal 3 4Aph(Ac) 5 D-4Aph(Ac) 6 , llys 8 , DAla 1 0 (-GnRH Незважаючи на гарні властивості цієї групи антагоністів GnRH дослідження продовжували для подальшого поліпшення антагоністів GnRH, особливо тих, що виявляють довготривалу біологічну активність Часто буває важливим, щоб аналог пептиду виявляв довготривалу активність з огляду на секрецію LH, здатність, яку можна посилити СТІЙКІСТЮ пептиду до руйнування протеолітичними ферментами в організмі при показаннях для коротко-та довготривалого лікування Крім того вважають, що для полегшення застосування цих сполук до ссавців, зокрема людини, без гелеутворення надзвичайно важливою перевагою таких декапептидних антагоністів GnRH є висока розчинність у воді при нормальних фізіологічних значеннях рН, тобто приблизно від 5 до 7,4 Винайдено, що деякі ІНШІ модифікації залишку в позиції 5 або у залишках в позиціях 5 та 6 для цього підкласу антагоністів GnRH, які включають цетрорелікс, антарелікс, ацилін, антид та ІНШІ, несподівано дали сполуки, які при вживанні підшкірно виявляють, зокрема, переваги, що полягають у довготривалій бюактивності Ці модифікації зроблено в залишку 4амшоРЛе чи його еквіваленту 4Апр, або 4-амінометилфенілаланшу (4Amf), де первинна аміногрупа зв'язана з метильною групою, приєднаною в 4-або параположенні В таких модифікаціях аміногрупа бічного ланцюга реагує з ізоціанатом з утворенням сечовинної групи, або реагує з гетероциклічною карбоновою кислотою, яка містить щонайменше 2 атоми Нітрогену, які розташовані так, що утворюють сечовинну групу Кращим гетероциклічним реагентом є D- чи L-пдрооротова кислота (Ног) (C 4 N 2 H5(O2)COOH або D- чи І_-2-імідазолідон-4карбонова кислота (Imz) Взагалі, було знайдено, що декапептиди антагоністів GnRH нижченаведеної формули та близько споріднені аналоги та фармацевтичне прийнятні солі мають поліпшені фармакологічні властивості, зокрема, довготривалу бюактивність X-D-Nal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser-Xaa 5 -Xaa 6 -LeuХаає-Рго-Хааю, Де X - ацильна група, що має до 7 атомів карбону або Q, І І fleQ-C=C-NHR, a R - Н чи нижчий алкіл, А-4СІ, 4F, 4Br, 4NO 2 , 4СН 3 4ОСН 3 , 3,4СІ 2 , або С а Ме4СІ, Хаа 5 - 4Aph(Qi) або Aamf(Qi), де Qi HN NH (О-чиіг-Ног} Xaa 6 - D-Aph(Q 2 ), D-Amf(Q 2 ), D-Lys(Nic), D-Cit, D-Hci або D-Pal, де Q 2 - For, Ac, З-амшо-1,2,4тріазол, Q або Qi Xaa 8 - Lys(ipr), Arg, Har, Arg(Et 2 ), або Har(Et 2 ), a Хааю D-Ala-NH 2 , D-Ala-ол, АІа-ол, NHCH 2 CH 3 Gly-NH 2 AzaGly-NH 2 , Ala-NH 2 , AglNH 2 , D-Agl-NH 2 , Agl(Me)-NH 2 , або D-Agl(Me)-NH 2 , за умови, однак, що а-аміногрупа Xaas може, як варіант, бути метилованою, а також, що коли Хаає включає D- чи L-Hor, або D- чи L-lmz, тоді Хаа5 може мати в якості Qi For, Ac або 3-аміно1,2,4-тріазол, а також, що коли Хаає включає Q, Хаа5 також може включати Q Згідно З подальшим аспектом винаходу запропоновано спосіб діагностики in vivo та in vitro станів, при яких GnRH викликає надлишкову гормональну секрецію або ріст пухлин, спосіб включає застосування антагоністичного GnRH пептиду описаного вище типу та спостереження гормональноі'секрецм та розмноження пухлинних клітин Згідно З подальшим аспектом винаходу запропоновано штермедіат для виготовлення антагоністичного GnRH пептиду формули X 1 -D-Nal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser(X 2 )-Xaa 5 -Xaa 6 Leu-Lys(ipr)(X 4 )-Pro-X 6 , де X - протекторна група а-амшогрупи, А-4СІ або 4F, X 2 - Н або протекторна група гідроксилу Хаа 5 - Aph(Qi) або Amf(Qi), де Qi - D- чи Lізомер або суміш DIL-ізомерів груп О (О-чиЬ-Ішг) О Хаа 6 - D-Aph(Q 2 ), D-Amf(Q 2 ) або D-Pal, де Q 2 Ас, Qi карбамоїл або метилкарбамоїл, X 4 - кислотно-лабільна протекторна група ааміногрупи, 58547 X - D-Ala-, Gly-, Ala-, Agl-, D-Agl-NH2, Agl(Me)-, або О-АдІ(Ме)-смопа, N-(Et2)-CMona, амід D-Ala, Gly або Ala, етиламід, AzaGly-NH2, або ОН за умови, однак, що а-аміногрупа Xaas може, як варіант, бути метилованою Ці антагоністи корисні, зокрема, при пригніченні секреції гонадотропінів та регуляторів фертильності у людини, оскільки вони виявляють довготривалу активність, тобто продовжують пригнічувати секрецію LH протягом принаймні 4-х діб Вони мають поліпшену розчинність у водних буферних розчинах при фізіологічних рН та прийнятну побічну дію з огляду на вивільнення гістаміну, тобто є кращими за суперагоністи GnRH, які зараз використовують у КЛІНІЦІ, також вони виявляють мінімальну здатність до гелеутворення при підшкірному введенні у ефективних концентраціях Ці антагоністи GnRH також добре виявляють себе в анафілактоідному дослідженні, викликаючи тільки невеликі пухирі В результаті ці пептиди знаходять часткове застосування для ссавців, особливо людини, як регулятори фертильності та при лікуванні таких патологічних станів, як передчасний статевий розвиток, гормон-залежна неоплазія, дисменорея, ендометрюз, стероід-залежні пухлини, а також при інших коротко-чи довгострокових показаннях, що згадані вище Корисні вони також при діагностиці Внаслідок гарної розчинності цих антагоністів GnRH при фізіологічних рН в межах приблизно 57,4 їх можна формувати та застосовувати у концентрованому стані, зокрема при рН в межах приблизно 5-7 Внаслідок їх полярного характеру вони зокрема придатні для використання у препаратах з уповільненим вивільненням на основі відомих співполімерів Внаслідок ефективного пригнічення цими антагоністами GnRH секреції LH протягом довгого періоду вони також ефективні, зокрема, при контрацепції самиць ссавців (при можливому застосуванні тестостерону) та при лікуванні стероід-залежних пухлин Протягом останніх 10-12 років глибоко вивчили конкретні властивості кожного з 10 залишків у ПОСЛІДОВНОСТІ GnRH з точки зору створення ефективного антагоністу, в результаті такого вивчення виявили, що є різі еквівалентні залишки, які можна вибрати, і що заміни одного з цих еквівалентів на інший не призводять до значного зниження біологічної здатності декапептидних антагоністів GnRH Такі еквівалентні заміни можна зробити в антагоністах GnRH згідно з винаходом Наприклад, спочатку припустили, що введення залишків заміщеного в пара-положенні D-Phe, або 2,4-дихлор-заміщеного D-Phe, або DСаМе4СІРпе, або О-пентаметил(Ме)Рпе у позицію 2 додає значної антагоністичної активності GnRH, однак, природа конкретного замісника у КІЛЬЦІ виявляє тільки невеликий вплив при виборі з нижченаведеного Хлор, Флуор, Бром, нітрогрупа, • метил та алкоксил Тому такі залишки у позиції 2 вважають еквівалентними D-4CIPhe, який тут в основному використовують Phe7 вважають еквівалентним Leu7 Краще, щоб N-закшчення було ацилованим, краще ацетилом (Де), але також і іншими ацильними групами, що мають до 7 8 атомів Карбону, наприклад, формілом (For), акрил їлом (Асг), w-пропюнілом (Рп), бутирилом (Ви), валери-лом (VI), вшілацетилом (Vac) та бензоілом (Bz), інакше, и можна модифікувати заміщеним чи не-заміщеним карбамоілом Інші довші ацильні групи вважають еквівалентними, але менш бажаними, а-амшогрупи залишку в позиції 5 можна, як варіант, метилувати, як це розкрито в патенті США № 5110904, для збільшення розчинності у воді, але така модифікація може призвести до скорочення періоду пригнічення LH та збільшення здатності до вивільнення гістаміну Краще, коли С-закінченням є D-Ala-NH2, D-Ala-ол або Ala-ол, однак, Gly-NH2, NHCH2CH3, AzaGlyNH2, Ala-NH2 Agl-NH2, D-Agl-NH2, Agl(Me)-NH2 та D-Ag(Me)-NH2 можна використати замість них, оскільки їх вважають еквівалентними Як зауважено вище, згідно з винаходом запропоновано сімейство антагоністів GnRH, що представлені формулою X-D-Nal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser-Xaa5-Xaa6-LeuХаає-Рго-Хааю, та їх фармацевтичне прийнятними солями, X - For, Ac, Acr, Pn, By, VI, Vac, Bz або Q, І ДеО.-С=С -NHR, a R - Н чи нижчий алкіл, А-4СІ, 4F, 4Br, 4NO2, 4CH3 4ОСН3, 3,4СІ2, або СаМе4СІ, Хаа5 - Aph(Qi) або Amf(Qi), де О чи {D-чиЬ-Ног) т N H (D-wL-Imz) О Хааб - D-Aph(Q2) D-Amf(Q2), D-Lys(Nic), D-Cit, D-Hci або D-Pal, де Q2- For, Ac, З-амшо-1,2,4тріазол, Q або Qi Xaa8 - Lys(ipr), Arg, Har, Arg(Et2), або Har(Et2), a Хааю D-Ala-NH2, D-Ala-ол, Ala-on, NHCH2CH3 Gly-NH2, AzaGly-NH2 Ala-NH2, AglNH2, D-Agl-NH2, Agl(Me)-MH2, або D-Agl(Me)-NH2, за умови, однак, що а-аміногрупа Xaas може, як варіант, бути метилованою У близько спорідненому сімействі антагоністів GnRH Хаа5 може бути For, Ac або 3-аміно1,2,4-тріазолом в якості Qi при цьому Хаає включає Q2 у формі D- чи L-Hor, або D- чи L-lmz В іншому близько спорідненому сімействі антагоністів GnRH, коли Хаає включає Q, Xaas також включає Q Під D-Nal розуміють D-ізомер аланіну, який по а-атому заміщений нафтилом, тобто позначається також як (-D-Nal чи З-D-Nal Переважно, застосовують D-2Nal, в якому нафталін сполучений в позиції 2 кільцевої структури, але також можна використовувати D-1Nal D-Cpa представляє хлор-D-Phe, а переважно D-4CIPhe, тобто, D4Сра D-Pal представляє D-ізомер аланіну, який по а-атому заміщений піридилом, переважно сполученим в позиції 3 піридинового кільця, тобто позначається також як D-3Pal ((-З-піридил-D 58547 Ala), але також можна використовувати D-2Pal ((2-піридил-О-АІа) 4NH 2 Phe, де амінозамісник на фенільному КІЛЬЦІ знаходиться в позиції 4, 3NH 2 Phe (ЗАрп) вважають його еквівалентом у цих аналогах Більш ТОГО, можна думати, що з точки зору бюздат-ності еквівалентним є також 2NH 2 Phe Під 4Amf розуміють 4NH 2 CH 2 Phe, де наявний метиленовий зв'язок з бічним ланцюгом аміногрупи на фенільному КІЛЬЦІ знаходиться в позиції 4, 3NH 2 CH 2 Phe (3Amf) вважають його еквівалентом Під НОГ L-Hor розуміють L-пдрооротил, а під Imz або L-lmz розуміють І_-2-імідазолідон-4-карбоніл, кожний з них може також бути використаний як Dізомер або D/L-суміш Під atz розуміють 3-аміно1,2,4-тріазол Aph(atz) відомий також під точнішою ХІМІЧНОЮ назвою 4-(3'-амшо-1н-1',2',4'тріазоіл-5'-іл)амінофенілаланш Під Lys(Nic) розуміють N'-НІКОТИНІЛЛІЗИН, тобто а-амшогрупа лізину є ацилованою 3-карбоксипіридином Під DCit розуміють D-ізомер цитруліну, а під D-HCi розуміють D-ізомер гомоцитруліну, який є D-N a карбамоіллізином Під ILys(Nic) або Lys(ipr) розуміють М а -ізопропіллізин, в якому а-амшогрупа лізину є алкілованою Під АІа-ол розуміють ланінол, тобто CH 3 CH(NH 2 )CH 2 OH, а під AzaGly-NH 2 розуміють NHNHCONH 2 Під Наг розуміють гомоарпнін Під Agl розуміють а-амшогліцин П І Д Cbm розуміють карбамоїл, a MeCbm означає С О М Н С Н 3 П І Д НИЖЧИМ алкілом розуміють С1-С5, а переважно - Сі-С 3 , а краще - Сі-С 2 , тобто метил (Me) або етил (Et) Хоча як кращі для вбудови в позицію 6 цих антагоністів GnRH розкрито Dізомери, треба розуміти, що в результаті широких ДОСЛІДІВ протягом двох десятиріч відомо багато еквівалентів D-ізомерів Такі ВІДОМІ фахівцям замісники D- (ізомерів можуть бути сумісними та не зменшуючими бюздатність, надану розкритими тут певними замісниками в позиції 5, і як варіант, їх можна використовувати Кращі представники антагоністів GnRH мають формулу X-D-Nal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser-Xaa 5 -Xaa 6 -LeuLys(ipr)-Pro-Xaaio, та їх фармацевтичне прийнятними солями, Де X - For, Ac, Acr, Pn, By, VI, Vac, Bz або Q, І І д е О - С = С -NHR, a R - Н чи нижчий алкіл, А - 4СІ чи 4F, Хаа 5 - Aph(Qi) або Amf(Qi) де Qi о •сI NH о чиЬ-Ног) О Хаа6 - D-Aph(Q2), D-Amf(Q2), D-Lys(Nic), D-Cit чи D-Pal, де Q2- For, Ac, Q чи Qi, а Хаа і 0 - D-AlaNH 2) D-Ala-ол, Ala-on, NHCH2CH3 або Gly-NH2 Додаткові кращі представники антагоністів GnRH мають формулу X-D-Nal-D-4Cpa-D-Pal-Ser-XaasXaa6-Leu-I_ys(ipr)-Pro-Xaaio, та їх фармацевтичне прийнятними солями, де X -Ас або Q, 10 fleQ-C=C-NHR, a R - Н чи нижчий алкіл, А - 4СІ, 4F, 4Br, 4NO2 4CH3, 4ОСН3, 3,4СІ2, а або С Ме4СІ, Хаа5 - 4Aph(Qi) або 4Amf(Qi), де Qi •с о H N (О-чиЬ-Ног) н ° Хаа6 - D-Aph(Q2), D-Amf(Q2), D-Lys(Nic) або DPal, де Q2- For, Ac, Q або Qi a Хааю - D-NH2, D-Ala-ол або АІа-ол Інші кращі представники антагоністів GnRH мають формулу MeCbm-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)D-Xaa6-Leu-ll_ys-Pro-Xaaio, та їх фармацевтичне прийнятними солями, Де D-Xaa6 - D-Aph(Q2), D-Amf(Q2) або D-3Pal, де Q2- For, Ac, Q або Qi I fleQ-D-Ногабо C=C-NHR, a R - H чи нижчий алкіл, переважно Н чи метил, а Хааю - D-Ala-NH2, D-Ala-ол або АІа-ол Сполуки згідно з винаходом можна синтезувати класичним синтезом пептидів у розчині, який є кращим для великих кількостей продукту Для отримання обмеженої КІЛЬКОСТІ, наприклад, мен шої за 1кг, можливо краще синтезувати їх твердофазним способом Протекторні групи бічних ланцюгів добре ВІДОМІ фахівцям і переважно включені як частина будь-якої амінокислоти, яка має особливо реакційноздатний чи лабільний бічний ланцюг, коли її включено в ланцюг, який приєднаний до смоли Такий синтез забезпечує такий повністю протектований штермедіат пептидосмо-ли, як X1-D-Nal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser(X2)Xaa5-Xaa6-Leu-Lys(ipr)(X4)-Pro-X5 Один з прикладів ХІМІЧНИХ штермедіатів, які можна використовувати в синтезі антагоністів GnRH, що мають потрібні залишки в позиціях 5 та 6, які включають пдрооротил або подібне йому, представлений формулою X1-D-Nal-D-Cpa-DPal-Ser(X2)-Aph(X3)-D-Aph(X3)-l_eu-ll_ys(X4)-Pro-X5 У синтезованому пептидному штермедіаті цієї формули та інших аналогах можна застосовувати групи від X1 до X5, які визначені вище X1 - протекторна група а-амшогрупи відомого типу, яка корисна на практиці при постадійно-му синтезі поліпептидів, і коли X в поліпептиді потрібного складу є окремою ацильною групою, то її можна використовувати як протекторну Серед протекторних груп а-амшогрупи, які охоплюють X1, є (1) протекторні групи ацильного типу, як-то форміл (For), трифлуорацетил, фталоїл, птолуолсульфоніл (Jos), бензоїл (Bz), бензолсульфоніл, дитіасукциноїл (Dts), 0нітрофенілсульфеніл (Nps), тритилсульфеніл, онітрофеноксіацетил, акриліл (Асг), хлорацетил, ацетил (Ас) та (-хлорбутирилом, (2) ароматичні протекторні групи уретанового типу, наприклад, бензилоксикарбоніл (Z), флуоренілметилоксика 58547 12 11 рбоніл (Fmoc), а також такий заміщений бензитидний штермедіат синтезовано як сказано вище, лок-сикарбоніл, як л-хлорбензилоксикарбоніл протекторні групи можуть бути здатними до інди(CIZ), п-нітробензилоксикарбоніл, пвідуального видалення 5 бромбензилоксикарбон та лКоли група X - D-Ala-NH-смола, амідний зв'язок з'єднує D-Ala зі смолою ВНА або МВНА, це метоксибензилоксикарбоніл, (3) такі аліфатичні подібно до випадку, коли на С-закінченні викорипротекторні групи уретанового типу, як mpem5 стовують Agl чи D-Agl Коли X - N-(Et)-CMona, бутилоксикарбоніл (Всю), дмзопропілметоксикаретиламідний зв'язок з'єднує Pro з Nбоніл, ізопропілоксика-рбоніл, етоксикарбоніл та алкіламшометильною смолою (NAAM) алілоксикарбоніл, (4) такі циклоалкільні протекторні групи уретанового типу, як циклопентилоксиКоли N-закшчення є ацилованим, наприклад, 1 карбоніл, адамантилоксикарбоніл та циклогексиможливо, як протекторну групу X для алоксикарбоніл, (5) такі протекторні групи аміногрупи (-D-Nal у позиції 1 застосовувати ацеті оурета нового типу, як фен ІЛТІ о карбоніл, (6) такі тил додаванням його до амінокислоти перед спопротекторні групи алкільного типу, як аліл (АІу), лученням з пептидним ланцюгом, однак, реакцію трифенілметил (тритил) та бензил (Bzl), (7) такі краще проводити з пептидним штермедіатом на тріалкілсиланові групи, як три-метилсиланова смолі Після деблокування а-амшогрупи і поки Кращою протекторною групою а-амшогрупи є потрібні групи бічних ланцюгів залишаються проВос те-ктованими, ацетилування переважно проводять реакцією з оцтовим ангідридом, інакше моX2 - протекторна група гідроксилу бічного лажна провести реакцію з оцтовою кислотою у нцюга серину, наприклад, Ac, Bzl, тритил, 2,6присутності дмзопропіл- або дициклогексилкардихлорбензил (DCS) або бензилетерна група бодмміду (DIC чи DCC) або з іншими відомими (Bzl), переважно Bzl фахівцям придатними реакціями ацилування X3 - протекторна група аміногрупи бічного лаПодібну процедуру застосовують, коли на Nнцюга, яка не видаляється при видаленні протекзакінченні потрібна група карбамоілу або заміщеторної групи а-амшогрупи чи іншої протекторної ного карбамоілу Коли депротектовані аміногрупи групи аміногрупи Ілюстративні приклади вклюбічних ланцюгів модифікують при тому, що заличають (1) такі осново-лабільні групи, як Fmoc, або шок є частиною пептидного ланцюга, реакцію деякі ІНШІ СТІЙКІ в слабких кислотах ароматичні можна провести з використанням прийнятного протекторні групи уретанового типу, (2) тюлізоціанату у присутності прийнятної основи, налабільні групи, як-то дитіасукциноїл (Dte), які моприклад, М,г\І-дмзопропілетиламіну (DIEA), хоча жна видалити чи відщепити тюлізом, (3) пдразинвикористання такої основи не обов'язкове Коли в лабільні групи, як-то фталоїл (РМ), які можна викінцевому продукті потрібна група незаміщеного далити пдразинолізом, (4) нуклеофільно-лабільні карбамоілу, депротектовані аміногрупи бічних групи, як-то о-нітрофенілсульфеніл (Nps) та аналанцюгів можна обробляти бензилізоціанатом, ллогічні, які можна відщепити тюацетамідом або тозилізоціанатом, три-метилсилілізоціанатом або слабкими кислотами чи їх солями, (5) фотоmpem-бутилізоціанатом, кращим є останній При лабільні групи, як, які можна відщепити фотолівикористанні такої стратегії mpem-бутил видалязом, а також (6) придатні для селективного видають при відщепленні від смоли, залишаючи карлення відновленням групи, як-то Dte Для стратебамоільну групу ги Вос SPPS кращою є Fmoc X4- кислотно-лабільна протекторна група первинної чи вторинної аміногрупи бічного ланцюга, як-то Z чи 2CIZ, X5 може бути D-Ala-, Gly-, Ala-, Agl-, D-AglNH2, Agl(Me)-, або О-АдІ(Ме)-смолою чи N-(Et)смолою, амідом D-Ala, Gly або Ala, нижчим алкілзаміщеним амідом, приєднаним безпосередньо до Pro, AzaGly-NH2, або ОН (вільна кислота) ЯкщХаЗб - вільна кислота, штермедіат є нонапептидним фрагментом, призначеним для сполучення з D- чи L-аланшолом з утворенням декапептиду зі спиртом на С-закінченні Критерієм вибору протекторних груп бічних ланцюгів X2 - Х4є вимога загальної їх СТІЙКОСТІ ДО реагенту в реакційних умовах видалення протекторної групи а-амшогрупи (переважно Вос) на кожному етапі синтезу Ці протекторні групи взагалі не повинні відщеплюватися в умовах сполучення, але треба, щоб їх можна було видалити після завершення синтезу потрібної амінокислотної ПОСЛІДОВНОСТІ в реакційних умовах, при яких пептид ний ланцюг не змінюється Переважно, видаляють протекторні групи, що спочатку застосовані до залишків у позиціях 5 та 6, а селективні реакції проводять до відщеплення готового пептиду від смоли, як показано далі Якщо декапеп Згідно З винаходом запропоновано також новий спосіб одержання таких антагоністів GnRH, наприклад, формули Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3PalSer-4Aph(Hor)-D-4Aph(Ac)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2, який включає (а) утворення проміжного пептиду формули Boc-D-4Aph(X3)-Leu-ILys(X4)-Pro-X5, де X3- осново-лабільна, пдразин-лабільна чи інша прийнятне лабільна протекторна група для аміногрупи, X4- кислотно-лабільна протекторна група для бічного ланцюга аміногрупи, а X5- D-Ala-NHсмола, (б) видалення X3 від D-4Aph для депротектування первинної аміногрупи бічного ланцюга цього амінокислотного залишку проміжного пептиду, (в) реакцію цієї депротектованої первинної аміногрупи бічного ланцюга з оцтовим ангідридом, (г) завершення подовження ланцюга для створення штермедіату X -D-2Nal-D-4Cpa-D-3PalSer(X2)-4Aph((X3)-D-4Aph(Ac)-Leu-ILys(X4)-Pro-X6 Д Є і X - Гідроген чи протекторна група ааміногрупи, а X2 - Гідроген чи протекторна група гідроксильної групи Ser, (д) деблокування ааміногрупи на N-закшченні та ацетилування, (є) видалення X3 з 4Aph та обробка депротектованої первинної аміногрупи пдрооротовою кислотою, і (є) відокремлення будь-яких залишених протек 58547 13 торних груп таїабо відщеплення від субстратно!' смоли, що включає X Кінцеву очистку пептиду проводять хроматографічне, переважно, ВЕРХ-ОФ, відомими способами, див J Rivier et al , J Chromatographv 288 303-328 (1984) та С Miller and J Rivier, Biopolymers (Peptide Science), 40, 265-317 (1996) Антагоністи GnRH згідно з винаходом вважають ефективними у рівнях, менших за 10Ог/кг маси тіла, при підшкірному застосуванні приблизно в полудень дня передтічки для попередження овуляції у самиць щурів Для подовженого пригнічення овуляції може бути необхідним використовувати дози в межах 0,1=2,5мг/кг маси тіла Антагоністи ефективні також для затримки сперматогенезу при застосуванні до самців ссавців на регулярній основі, а тому їх можна використовувати як контрацептиви Оскільки ЦІ сполуки зменшуватимуть рівні тестостерону, а тому лібідо (небажаний наслідок для нормальних, сексуально активних самців), може виникнути потреба у вживанні замінних доз тестостерону протягом прийому антагоністу GnRH, щоб досягти азоспермм при підтримці лібідо Ці антагоністи можна також використовувати для регулювання виробки гонадотропшів та статевих стероїдів та інших довгострокових та короткострокових призначень, які згадані раніше, а також їх можна використовувати у ветеринарії в якості контрацептивів для домашніх тварин Пептиди згідно з винаходом частково розчинні при фізіологічних значеннях рН і їх можна сформувати як відносно концентровані розчини для вживання, зокрема підшкірних ІН'ЄКЦІЙ ЦІ пептиди виявляють гарну толерантність в організмі і при підшкірних ІН'ЄКЦІЯХ не мають тенденції в діючих концентраціях до утворення гелю Звичайно фармацевтичні композиції включають такі пептиди та придатні фармацевтичне прийнятні екципієнти, що можна застосовувати внутрішньовенне, штраперитонально, підшкірне тощо в КІЛЬКОСТІ приблизно 0,001-2,5мг/кг маси тіла на добу, достатньо, звичайно, 0,5мг/кгдобу Прийнятні D- чи L-пдрооротиловмісні, карба МОІЛОВМІСНІ таїабо D чи L імідазолідонкарбоніловмісні амінокислоти можна синтезувати, а потім застосувати в синтезі пептиду з подовженим ланцюгом Однак, рівною мірою ефективний синтез також здійснюють вбудовою спочатку прийнятне захищеного залишку Aph, DAph, Amf або D-Amf в потрібне положення в пептидному штермедіаті, для вибору можна застосувати лабораторний синтез, для якого спочатку потрібні тільки невеликі КІЛЬКОСТІ Останню ПОСЛІДОВНІСТЬ ДІЙ завершують послідовним депротектуванням конкретних залишків (негайно або послідовно протягом синтезу), а потім взаємодією депротектованої аміногрупи бічного ланцюга з потрібним реагентом Далі винахід описано прикладами Приклад 1 Було виявлено, що пептид формули Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-Lys(Nic)-DLys(Nic)-l_eu-ll_ys-Pro-D-Ala-NH2 виявляє дуже гарні біологічні властивості як антагоніст GnRH, аналогічно пептиду, який зараз позначають як ацилін і який відрізняється від антиду тільки у 14 позиціях 5 та 6 Виявили, що використовуючи ці молекули як ВИХІДНІ і роблячи ІНШІ заміщення в позиціях 5 та 6, або в позиції 5 декапептиду ациліну отримують антагоністи GnRH з подовженою бюактивністю in vivo 3 огляду на позиції 1 -4 та 710 було помічено, що антид, ацилін та Азалін усі абсолютно однакові Декапептид [4Aph(Hor)5, D-4Aph(Gmb)6]-aHTHfl або [Ac-D-2Nal1 D-4Cpa2, D-3Pal , 4Aph(Hor)5, D4Aph(Gmb)6, ILys8, D-Ala10(-GnRH отримують за допомогою твердофазного синтезу Він має таку формулу Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-D-4Aph(І_-пдрооротил)-О-4Арп(карбамоіл)-І_еиLys(i3onpomn)-Pro-D-Ala-NH2 Спочатку використовують приблизно 0,50г 0,54ммоль/г смоли МВНА (Bachem) і сполучають з нею Вос-протектований D-Ala протягом приблизно 2 годин в диметилформаміді з дихлорметаном, використовуючи приблизно 0,65ммоль Socпохідного та дизопропілкарбодимід (DIC) і безводний 1-пдроксибензотріазол (HOBt) як активатор або сполучний реагент Залишок D-Ala приєднується по залишку МВНА амідним зв'язком Проводячи приєднання кожного амінокислотного залишку, промивку, деблокування і далі приєднання наступного амінокислотного залишку проводять згідно такого ручного режиму синтезу для приблизно 0,5-1 г вихідної смоли г г-. Етап Реагенти та операції ЗМІШ хвил Промивка метанолом, 2(15мл 1 Промивка дихлорметаном, 3(30мл 1 3 50% ТФОК з 1%-ним м-крезолом у дихлорметані-25мл (2 рази) 5,20 4 Промивка ізопропанолом, 2(20мл 1 5 10% тріетиламш удихлорметан 20мл (2 рази) 2 6 Промивка метанолом, 2(15мл 1 7 Промивка дихлор метаном, 3(20мл 1 8 Вос-амшокислота (0,5-1,0ммоль) та МВНА (0,5-1,Оммоль) у 1020мл суміші диметилформаміду або N-метилпіролідону з дихлорметаном в залежності від розчинності конкретної протектованоі амінокислоти + DIC або DCC (0,5-1,Оммоль) в дихлорметані 1-17год 9 Промивка метанолом, 2(15мл 1 10 Промивка дихлорметаном, 3(20мл 1 Вищенаведений режим використовують для приєднання кожної з амінокислот пептиду згідно з винаходом після приєднання першої з них |\1аВос-протектування використовують для кожної амінокислоти, що приєднують протягом синтезу NaBoc-D-2Nal виготовляють добре відомим фахівцям способом, наприклад, детально описаним в патенті США № 4234571, він також комерційне доступний від SyntheTech, Oregon, USA Первинні аміногрупи бічних ланцюгів 4Арп у позиції 5 та D4Арп у позиції 6 протектують Fmoc Як протекторну групу бічного ланцюга для гідроксильної групи Ser переважно використовують бензилестерну 1 2 58547 15 (Bzl), однак, Ser можна приєднувати без протектування бічного ланцюга Для залишку в позиції 8 використовують NaBoc-l_ys(i3onponm, Z) Після додавання D-4Aph для залишку в позиції 6 як NaBoc-D-4Aph(Fmoc) отримують такий штермедіат NaBoc-D-4Aph(Fmoc)-l_euLys(i3onponin)-Pro-D-Ala-NH-[cMona MBHA( Аміногрупу бічного ланцюга залишку в позиції 6 далі модифікують після першого видалення захисту бічного ланцюга Fmoc-протекторну групу видаляють послідовними обробками Юмл 25% піперидину в ДМФ протягом 15 хвилин кожна Після промивки пептидосмоли ДМФ знов вивільнену аміногрупу обробляють 20-кратним надлишком mpem-бутилізоціанату в ДМФ при кімнатній температурі протягом 12 годин або до завершення, що перевіряють нінпдриновим тестом Далі пептидосмолу піддають стандартній промивці і видаляють Вос для додавання наступного залишку Залишок у позиції 5 далі додають як NaBoc4Aph(Fmoc) Далі його бічний ланцюг депротектують, як перед тим, і проводять реакцію з 0,10г (О.ббммоль) L-пдрооротовоі кислоти, 90мг HOBt (О.ббммоль) та О.ббммоль DIC в Змл ДМФ при кімнатній температурі протягом 8 годин або до завершення, що перевіряють нінпдриновим тестом Після промивки та видалення NaBoc синтез декапептиду завершують послідовними реакціями з NaBoc-Ser(Bzl), NaBoc-D-3Pal, NaBoc4Cpa та NaBoc-D-2Nal Після деблокування а-амшогрупи на Nзакінченні з використанням трифлуороцтової кислоти (ТФОК) проводять ацетилування великим надлишком оцтового ангідриду в дихлорметані протягом ЗО хвилин 3 іншого боку, від Fmocпротектування 4Арп не позбавляються доти, поки не буде проведено ацетилування на N-закшченні, а далі проводять реакцію з L-пдрооротовою кислотою Пептидосмолу сушать та наступним додаванням 0,5мл аністизолу як вимивану відщепляють пептид від смоли, а депротектування бічних ланцюгів SerTa Lys проводять приблизно при 0°С в 15мл HF протягом 1,5 годин з видаленням будь-яких залишків mpem-бутильних груп Після видалення HF під вакуумом смолу ДВІЧІ ПО ЮОМЛ промивають діетиловим етером Відщеплений пептид екстрагують кілька разів по ЮОмл 0,2%ТФОК в 25% ацетонітрилі у воді Екстракти поєднують та люфілізують , отримуючи приблизно 600мг порошку сирого пептиду Далі за допомогою високоефективної рідинної хроматографії з оберненими фазами (ВЕРХ-ОФ) здійснюють очистку пептиду відомими фахівцям і конкретно наведеними у J Rivier et al , J Chromatographv 288 303-328 (1984) При першому препаративному відділенні за допомогою ВЕРХ-ОФ використовують буферну систему з фосфатом тріетиламонію (ТЕАФ), а кінцеве розділення проводять, використовуючи градієнт ТФОК 0,1%, як детально описано B_J Chromatographv Пептид (приблизно ЗОмг) (далі його позначено як пептид № 1) оцінюють як практично гомогенний, використовуючи капілярний зональний електрофорез (КЗЕ), а його чистоту оцінюють у 98% Амінокислотний аналіз очищеного пептиду є 16 у згоді з формулою для створеної структури Визначена рідинною вторинноюнною масспектрометрією (РВІМС) молекулярна маса дорівнює 1631,9, що відповідає очікуваній масі 1631,8 для цього пептиду Гідрофільність визначають виміром часу затримки з використанням ВЕРХ-ОФ з градієнтом буферу В 40(70%протягом ЗО хвилин, буфер А є ТЕАФ, рН7,0, а буфер В є сумішшю 70% ацетонітрилута 30% буферу А Пептид № 1 є пдрофільнішим за ацилін, оскільки елююється раніше нього Його розчинність в водному буфері при рН5-7 та СТІЙКІСТЬ до гелеутворення in vivo разом з довготривалою бюздатністю пригнічувати рівні циркулюючого Ш, як описано далі, робить його особливо придатним для застосування при підшкірних ІН'ЄКЦІЯХ у порівнянні з іншими сполуками в основному з близькою біологічною ефективністю Пептид досліджують in vivo для визначення його ефективності відносно зменшення рівнів LH у щурів Виміри рівнів циркулюючого LH у кастрованих самців щурів Sprague-Dawley з введеним підшкірне пептидом проводять згідно опису J Rivier et al , Biol Reproduc 29 374-378 (1983) Пептиди спочатку розчиняють в концентрації 1,010мг/мл в бактеріостатичній воді, а потім розбавляють 0.04М фосфатним буфером з вмістом 0,1% альбуміну бичачої сироватки Наступні розбавлення роблять фосфатним буфером Пептиди вводять підшкірно 5 щурам і під анестезією метотаном відбирають зразки крові (300 (л) Сироватку (50 (л) досліджують на рівні LH у подвоєному виконанні з використанням запропонованих програмою NIDDK (National Pituitary and Hormone Distribution Program) Дослідження показало, що доза в 50 (г на щура пригнічує секрецію LH до рівнів, що значно менші за 50% від контрольних рівнів протягом 96 годин після ін'єкції БІЛЬШ ТОГО, виміряні після 96 годин рівні складають приблизно тільки 30% від рівнів LH, виявлених у щурів, яким аналогічно вводять дозу в 50 (г ациліну Можна вважати пептид № 1 дуже довгодіючим Дослідження щурів показало, що пептид є дуже толерантним, баз помітної схильності до гелеутворення за місцем ін'єкції Отриманий від дослідження великого числа антагоністів GnRH досвід свідчить, що пептид, який виявляє таке довготривале пригнічення LH, буде при дослідах in vivo на зрілих самицях щурів Sprague-Dawley повністю блокувати овуляцію в дозі 2,5 (г Приклад 1А Було повторено синтез з прикладу 1 з заміною NaBoc-D-4Aph(Fmoc) на NaBoc-D4Amf(Fmoc) Реакцію з mpem-бутилізоціанатом проводять після депротектування бічного ланцюга D-4Amf як описано раніше Відщеплення від смоли, депротектування та наступну очистку провели, як описано в прикладі 1 Пептид Ac-D-2NalD-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(1-riflpoopo™-|)-D4Amf(Kap6aMoin)-l_eu-l_ys(i3onpomn)-Pro-D-AlaNH2 отримують після очистки ВЕРХ-ОФ як практично гомогенний з оціненою чистотою вищою за 99% Масспектрометрія показала масу 1645,9Да, що задовільно збігається з розрахованою масою 1645,8Да 3 результатів ВЕРХ можна побачити, 58547 18 17 5 що цей пептид пдрофільніший за ацилін 4Арп(Ног) ]-ацилш Відщеплення від смоли, депротектування та наступну очистку провели, як Дослідження цього пептиду стандартним тесописано в прикладі 1 Пептид Ac-D-2Aal-D-4Fpaтом пригнічення LH у щурів in vivo, свідчить, що О-ЗРаІ-Зег-4Арп(І_-пдрооротил)-О-4Арп(ацетил)при дозі в 50 (г він має ефективність ациліну у Leu-I_ys(i3onpomn)-Pro-D-Ala-NH2 отримують після пригніченні секреції LH протягом 1, 2 та 3 діб очистки ВЕРХ-ОФ як практично гомогенний з оціЧерез 96 годин рівні LH складають приблизно неною чистотою, вищою за 99% Масспектрометтільки 25% від рівнів у щурах, яким уводять ацирія показала масу 1615,1Да, що у згоді з розралін Можна вважати пептид № 1А дуже довгодіюхованою масою 1614,8Да чим Приклад 1Б Способом синтезу з прикладу 1 із Дослідження цього пептиду стандартним тесзаміною mpem-бутилізоціанату на оцтовий ангідтом на щурах in vivo, як у прикладі 1, свідчить, що рид для реакції депротектування бічного ланцюга при дозі в 50 (г він має бюактивність приблизно 5 в позиції 6 одержують аналог 4Арп(Ног) -ацилш як в ациліну протягом 1-4 діб Можна вважати Відщеплення від смоли, депротектування та напептид № 1А дуже довгодіючим при пригніченні ступну очистку провели, як описано в прикладі 1 LH Пептид Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(LПриклад 1Е Було повторено синтез з приклаa a пдрооротил)-О-4Арп(ацетил)-І_еи-І_у5(ізопропіл)ду 1Б з заміною N Boc-D-4Aph(Fmoc) на N Boc-DPro-D-Ala-NH2 отримують після очистки ВЕРХ-ОФ 4Amf(Fmoc), одержують декапептид [4Amf(Hor)5]як практично гомогенний з оціненою чистотою, ацилін Відщеплення від смоли, депротекту-вання вищою за 99% Масспектрометрія показала масу та наступну очистку провели, як описано в при1630,6Да, що у згоді з розрахованою масою кладі 1 Пептид Ac-D-2Aal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser1630,8Да 4Amf(L-riflpoopoTHn)-D-4Aph^eTHn)-l_euLys(i3onpomn)-Pro-D-Ala-NH2 отримують після Дослідження цього пептиду стандартним тесочистки ВЕРХ-ОФ як практично гомогенний з оцітом на щурах in vivo, як у прикладі 1, свідчить, що неною чистотою, вищою за 98% Масспектрометпри дозі в 50 (г він має бюактивність приблизно рія показала масу 1644,7Да, що у згоді з розраяк в ациліну протягом 1-4 діб Можна вважати хованою масою 1644,8Да пептид № 1А дуже довгодіючим при пригніченні LH Дослідження цього пептиду стандартним тесПриклад 1В Було повторено синтез з приклатом на щурах in vivo, як у прикладі 1, свідчить, що ду 1Б з заміною для утворення ізомерних декапри дозі в 50 (г він є бюактивним і має ефективпептидів L-пдрооротовоі кислоти на D/Lність близьку до ациліну протягом 1-4 діб Можна пдрооротову Відщеплення від смоли, депротеквважати пептид № 1А дуже довгодіючим при притування та наступну очистку провели, як описано гніченні LH в прикладі 1 Пептид Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3PalПриклад 1Є Способом синтезу з прикладу 1, Ser-4Aph(D/L -riflpoopoTHn)-D-4Amf(Kap6aMoin)при цьому, однак, замість реакції аміногрупи бічLeu-(i3onpomn)-Pro-D-Ala-NH2 отримують після ного ланцюга D-4Aph з mpem-бутилізоціанатом очистки ВЕРХ-ОФ як практично гомогенну суміш його та залишок 4Арп одночасно обробляють двох сполук без інших домішок Масспектрометпдрооротовою кислотою, одержують декапептид рія показала масу 1630,6Да, що задовільно збіга[4Aph(Hor)5, О-4Арп(Ног)6]-антид Відщеплення ється з розрахованою масою 1630,8Да від смоли, депротектування та наступну очистку провели, як описано в прикладі 1 Пептид Ac-DДослідження цього пептиду стандартним тес2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-riflpoopo™-|)-Dтом на щурах in vivo, як у прикладі 1, свідчить, що 4Aph(riflpoopoTHn)-Leu-l_ys(i3onpomn)-Pro-D-Alaпри дозі в 50 (г він має бюактивність приблизно NH2 отримують після очистки ВЕРХ-ОФ як пракяк в ациліну протягом 1-4 діб Можна вважати тично гомогенний з оціненою чистотою, вищою за пептид № 1А дуже довгодіючим при пригніченні 99% Масспектрометрія показала масу 1728,4Да, LH що у згоді з розрахованою масою 1728,8Да За Приклад 1Г Було повторено синтез з прикларезультатами ВЕРХ-ОФ можна побачити, що цей ду 1Б з заміною для утворення ізомерного декапептид пдрофільніший за Азалін В, який, в свою пептиду L-пдрооротовоі кислоти на Dчергу, пдрофільніший за ацилін пдрооротову Відщеплення від смоли, депротектування та наступну очистку провели, як описано Дослідження цього пептиду стандартним тесв прикладі 1 Пептид Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Palтом на щурах in vivo, як у прикладі 1, свідчить, що Ser-4Aph(D-riflpoopoTHn)-D-4Amt(Kap6aMoin)-l_euпри дозі в 50 (г він є бюактивним і має ефективLys(i3onpomn)-Pro-D-Ala-NH2 отримують після ність близьку до ациліну протягом 1-4 діб Можна очистки ВЕРХ-ОФ як практично гомогенний з оцівважати пептид № 1А дуже довгодіючим при приненою чистотою вищою за 98% Масспектрометгніченні LH рія показала масу 1630,8Да, що задовільно збігаЦей синтез повторюють з заміною NaBoc-Dється з розрахованою масою 1630,8Да 4Aph(Fmoc) на NaBoc-D-4Amf(Fmoc), одержують Дослідження цього пептиду стандартним тесдекапептид [4Aph(Hor)5, D-Amf(Hor) ]-антид, який том на щурах in vivo, як у прикладі 1, свідчить, що в основному є бюздатним при пригніченні секрепри дозі в 50 (г він має довготривалу бюактивції LH ність при пригніченні LH, приблизно як в ациліну, Приклад 1Ж Способом синтезу з прикладу 1, протягом 1-4 діб при цьому, однак, замість реакції аміногрупи бічПриклад 1Д Було повторено синтез з прикланого ланцюга D-4Aph з трет-бутилізоціанатом ду 1Б з заміною NaBoc-D-4CIPhe на NaBoc-Dйого та залишок 4Арп одночасно обробляють D2 4FPhe, одержують декапептид [D-4FPhe , пдрооротовою кислотою, одержують декапеп 19 тид[4АрпС?Ног)5, D-4Aph(D-Hor)6]-am-Hfl Відщеплення від смоли, депротектування та наступну очистку провели, як описано в прикладі 1 Пептид Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Lпдрооротил)-О-4Арп(пдрооротил)-І_еиLys(i3onpomn)-Pro-D-Ala-NH2 отримують після очистки ВЕРХ-ОФ як практично гомогенний з оціненою чистотою, вищою за 98% Масспектрометрія показала масу 1728,7Да, що у згоді з розрахованою масою 1728,8Да За результатами ВЕРХ-ОФ можна побачити, що цей пептид пдрофільніший за Азалін В, який, в свою чергу, пдрофільніший за ацилін Дослідження цього пептиду стандартним тестом на щурах in vivo, як у прикладі 1, свідчить, що при дозі в 50 (г він є бюактивним і має ефективність близьку до ациліну протягом 1-3 діб, але суттєво ефективніший за ацилін на 4-ту добу, і можна вважати пептид № 1А дуже довгодіючим при пригніченні LH Приклад 13 Синтез декапептиду [MeCmb-D2Nal1, 4Amf(Hor) 5 ]^HniH проводять способом з прикладу 1Б, однак, замість безпосереднього видалення Ртостпротекторної групи після додавання NaBoc-D-4Aph(Fmoc) синтез декапептиду на смолі завершують Далі, після деблокування N-закшчення замість реакції з оцтовим ангідридом реакцію проводять з метилізоціанатом з утворенням метил карбамоільної групи на Nзакінченні Тоді Fmoc видаляють , а аміногрупу бічного ланцюга D-4Aph обробляють Lпдрооротовою кислотою, як в прикладі 1Б Відщеплення від смоли, депротектування та наступну очистку провели, як описано в прикладі 1 Пептид метил Kap6aM0in-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser4Amf(L-riflpoopoTHn)-D-4Aph^eTHn)-l_euLys(i3onpomn)-Pro-D-Ala-NH2 отримують після очистки ВЕРХ-ОФ як практично гомогенний з оціненою чистотою, вищою за 99% Масспектрометрія показала масу 1645,7Да, що у згоді з розрахованою масою 1645,8Да За результатами ВЕРХ-ОФ можна побачити, що цей пептид пдрофільніший за Азалін В, який, в свою чергу, пдрофільніший за ацилін Дослідження цього пептиду стандартним тестом на щурах in vivo, як у прикладі 1, свідчить, що при дозі в 50 (г він є бюактивним і має ефективність близьку до ациліну протягом 1-3 діб, але приолизно на 50% за ацилін через 96 годин, і можна вважати пептид № 1А дуже довгодіючим при пригніченні LH Приклад 11 Синтез проводять способом з прикладу 1Б із заміною, однак, NaBoc-D4Aph(Fmoc) на NaBoc-D-3Pal та пропусканням наступної реакції з mpem-BuNCO з утворенням декапептиду [4Aph(Hor)5, О-ЗРаІ6]-антид Відщеплення від смоли, депротектування та наступну очистку провели, як описано в прикладі 1 Пептид ацетил-О^Сра-О-ЗРаІ-Зег^Ат^Ьгідрооротил)D-3Pal-l_eu-l_ys(i3onponin)-Pro-D-Ala-NH2 отримують після очистки ВЕРХ-ОФ як практично гомогенний з оціненою чистотою, вищою за 99% Масс пектро метр ія показала масу 1574,7Да, що у згоді з розрахованою масою 1574,7Да За результатами ВЕРХ-ОФ можна побачити, що цей пептид пдрофільніший за Азалін В, який, в свою 58547 20 чергу, пдрофільніший за ацилін Дослідження цього пептиду стандартним тестом на щурах in vivo, як у прикладі 1, свідчить, що при дозі в 50 (г він є бюактивним і має ефективність близьку до ациліну протягом 3 діб, але через 96 годин він виявляє пригнічення LH до величини приблизно 35% від величини для ациліну, і можна вважати пептид № 1А дуже довгодіючим при пригніченні LH Приклад 1И Синтез проводять способом з прикладу 1Є із заміною, однак, пдрооротової кислоти на mpem-бутилізоціанат з утворенням декапептиду [4Aph(Cbm)5, D-4Aph(Cbm) ]-антид Відщеплення від смоли, депротектування та наступну очистку провели, як описано в прикладі 1 Пептид Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser4Арп(карбамоіл)-О-4Арп(карбамоіл)-І_еиLys(i3onpomn)-Pro-D-Ala-NH2 отримують після очистки ВЕРХ-ОФ як практично гомогенний з оціненою чистотою, вищою за 99% М асе пектро метрія показала масу 1534,9Да, що у згоді з розрахованою масою 1534,7Да Дослідження цього пептиду стандартним тестом на щурах in vivo, як у прикладі 1, свідчить, що при дозі в 50 (г він є бюактивним і має ефективність близьку до ациліну протягом 4 діб, і можна вважати пептид № 1А дуже довгодіючим при пригніченні LH Приклад 1Й Синтез проводять способом з прикладу 16 із заміною, однак, пдрооротової кислоти на метилізоціанат з утворенням декапептиду [4Aph(Cbm)5, D-4Aph(Cbm)6]-am-Hfl Відщеплення від смоли, депротектування та наступну очистку провели, як описано в прикладі 1 Пептид Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser4Арп(метилкарбамоіл)-О-4Арп(метилкарбамоіл)Leu-I_ys(i3onpomn)-Pro-D-Ala-NH2 отримують після очистки ВЕРХ-ОФ як практично гомогенний з оціненою чистотою, вищою за 99% М асе пектро метрія показала масу 1562,8Да, що у згоді з розрахованою масою 1562,8Да Дослідження цього пептиду стандартним тестом на щурах in vivo, як у прикладі 1, свідчить, що при дозі в 50 (г він є бюактивним і має ефективність близьку до ациліну протягом 2 діб, а потім починає дещо втрачати при пригніченні LH Приклад 2 Пептид [4Aph(Hor)5, D-Cit6] -антид, аналог пептиду цетрорелікс, який має формулу Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(LriflpoopoTHn)-D-Cit-l_eu-l_ys(i3onponin)-Pro-D-AlaNH2 синтезують в основному способом з прикладу 1 із заміною в позиції NaBoc-D-4Aph на NaBocD-Cit Альтернативно, в позицію 6 вставляють NaBoc-D-Orn(Fmoc), а подовження ланцюга тимчасово зупиняють на стадії отриманого пептидного штермедіату Boc-D-Orn(Fmoc)-l_eu-l_ys(inp, Z)Pro-D-Ala-NH-[cMona MBHA( Бічний ланцюг аміногрупи на залишку От депротектують далі видаленням РІтюс-протектування способом з прикладу 1, а штермедіат обробляють надлишком третбутилізоціанату в ДМФ протягом б годин при кімнатній температурі для його взаємодії з бічним ланцюгом залишку Огп Синтез штермедіату декапептиду далі завершують, як описано в прикладі 1 Пептидосмолу далі промивають, розщеплю 58547 22 21 ють та депротеїсгують, а далі очищають, як опимасою пептиду 1602,8Да Пептид краще за ацисано в прикладі 1 Пептид Ac-D-2Nal-D-4Cpa-Dлін розчинний у воді 3Pal-Ser-4Aph(L-riflpoopo™-|)-D-Cit-Leu-ll_ys-ProДослідження пептиду провели, як у прикладі D-Ala-NH2 отримують після очистки ВЕРХ-ОФ як 1 Пептид при дозі 50 (г виявляє довготривале практично гомогенний з оціненою чистотою, випригнічення секреції LH, що є практично таким, як щою за 99% Масспектрометрія показала масу в ациліну протягом 96 годин 1583,7Да, що у згоді з розрахованою масою Приклад ЗБ Спосіб з прикладу 3 повторюють, 1583,8Да Пептид пдрофільніший за цетрорелікс застосовуючи замість D/L-lmz надлишок D-2та виявляє довшу бюактивність у порівнянні з імідазолідон-4-карбоновоі кислоти В результаті цетрорелік-сом при дослідженні in vivo пригніченодержали пептид Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Serня секреції LH способом з прикладу 1 Він дещо 4Aph(D-lmz)-D-4Aph(Ac)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2 краще пригнічує протягом 3 діб та помітно краще Визначена рідинною вторинноюнною масспектпротягом 96 годин рометрією (РВІМС) маса дорівнює 1602,6Да, що у згоді з розрахованою масою пептиду 1602,8Да Приклад 2А Аналог пептиду антид Пептид краще за ацилін розчинний у воді [4Арп(Ног)5]-антид синтезують в основному способом з прикладу 1 патенту США 5169935 Після Дослідження проводять, як описано в приприєднання в позицію 6 NaBoc-D-l_ys(Fmoc), його кладі 1 Пептид є бюактивним і при дозі 50 (г він після депротектування обробляють надлишком виявляє пригнічення секреції LH нікотинової кислоти в ДМФ Далі приєднують в Приклад ЗВ Пептид [4Aph(-lmz)5, позицію 6 NaBoc-D-Aph(Fmoc) і бічний ланцюг 4Amf(Cbm) ]-ацилш синтезують, використовуючи аміногрупи на залишку Арп депротектують спокомбінацію способів з прикладу 1А (для введення собом з прикладу 1, а штермедіат обробляють L4Amf(Cbm)6) та ЗА (для введення4Арп(-Ітг)5) пдрооротовою кислотою в ДМФ і синтез інтермеПептид Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Lдіату декапептиду далі завершують, як описано в lmz)-D-4Amf(Kap6aMoin)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2 прикладі 1 отримують після очистки ВЕРХ-ОФ Утворений пептид є практично гомогенним з оціненою чисДалі стандартну промивку, відщеплення від тотою, більшою за 98% Визначена рідинною смоли, депротектування та очистку проводять, як вторинноюнною масспектрометрією (РВІМС) маописано в прикладі 1 Пептид Ac-D-2Nal-D-4Cpaса дорівнює 1617,6Да, що у згоді з розрахованою D-3Pal-Ser-4Aph(L-riflpoopo™-|)-D-Lis(Nic)-l_euмасою пептиду 1617,8Да Дослідження пептиду ILys-Pro-D-Ala-Nbb отримують після очистки проводять, як описано в прикладі 1 Пептид є ВЕРХ-ОФ Його визначають пдрофільнішим за бюактивним і при дозі 50 (г він виявляє довготрицетрорелікс та таким, що виявляє довшу бюактивале пригнічення секреції LH Він практично так, вність у порівнянні з цетрореліксом при досліяк ацилін, пригнічує протягом 3 діб та дещо крадженні in vivo пригнічення секреції LH ще протягом 96 годин Приклад 3 Аналог [4Арп(О^-Ітг) 5 ]-ацилш сиПриклад 4 Пептид [4Aph(Hor)5, Dнтезують в основному способом з прикладу 1Б за 4Amf(MeCbm)6]-aHTHfli який має формулу Ac-Dвинятком заміни L-Hor на D/L-lmz Після депроте2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-D-4Aph-(L-riflpoopo™-|)ктування в позиції 5 4Арп штермедіат обробляD-4Amf(MeCbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2, синтеють надлишком О/І_-2-імідазолідон-4-карбоновоі зують в основному способом з прикладу 1А, але кислоти, приблизно 90мг НОВІ та приблизно замість взаємодії в позиції 6 D-4Amf надлишком О.ббммоль D/C в ДМФ при кімнатній температурі трет-бутилізоціанату в ДМФ його обробляють протягом приблизно 6 годин Далі синтез інтерметилізоціанатом Синтез штермедіату декапепмедіату декапептиду завершують, як описано в тиду далі проводять, як описано в прикладі 1А прикладі 1 Пептидосмолу далі промивають, розщеплюПептидосмолу далі промивають, розщеплюють та депротектують, а далі очищають, як опиють та депротектують, а далі очищають, як описано в прикладі 1 Пептид Ac-D-2Nal-D-4Cpa-Dсано в прикладі 1 Пептид Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D3Pal-Ser-4Aph(L-riflpoopoTHn)-D-4Amf(MeCbm)3Pal-Ser-4Aph(D/L-iMifla3oniflOH-4-Kap6oHHn)-DLeu-ILys-Pro-D-Ala-NH2 отримують після очистки Aph(Ac)-l_eu-ll_ys-Pro-D-Ala-NH2 отримують після ВЕРХ-ОФ як практично гомогенний з оціненою очистки ВЕРХ-ОФ як практично гомогенну суміш чистотою, вищою за 99% Визначена РВІМС маса двох сполук без інших домішок Масспектрометдорівнює 1659,8Да, що у згоді з розрахованою рія показала масу 1602,7Да, що у згоді з розрамасою пептиду 1659,8Да хованою масою пептиду 1602,8Да Дослідження пептиду № 4 стандартним споДослідження пептиду провели стандартним собом на щурах in vivo, показало що при дозі 50 способом на щурах in vivo, як у прикладі 1 Пеп(г він краще пригнічує секрецію LH у порівнянні з тид при дозі 50 (г виявляє подовжену бюактивациліном і виявляє довготривалу бюактивність ність при дослідженні in vivo пригнічення секреції Приклад 4А Синтез з прикладу 4 повторюють, LH Він дещо краще за ацилін пригнічує протягом застосовуючи замість метилізоціанату оцтовий З діб та помітно краще протягом 96 годин ангідрид з утворенням пептиду [4Aph(Hor)5, DПриклад ЗА Спосіб з прикладу 3 повторюють, 4Amf(Ac)6]-aHTHfl Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Serзастосовуючи замість D/L-lmz надлишок L-24Aph(L-riflpoopoTHn)-D-Amf(Ac)-Leu-ILys-Pro-Dімідазолідон-4-карбоновоі кислоти Утворений Ala-NH2 отримують після очистки ВЕРХ-ОФ як пептид є практично гомогенним з оціненою чиспрактично гомогенний з оціненою чистотою, витотою приблизно 99% Визначена рідинною втощою за 99% Визначена РВІМС маса дорівнює ринноюнною масспектрометрією (РВІМС) маса 1644,5Да, що у згоді з розрахованою масою пепдорівнює 1602,5Да, що у згоді з розрахованою 23 тиду 1644,8Да Дослідження пептиду провели, як у прикладі 1 Пептид при дозі 50 (г виявляє довготривалу бюактивність Він однаково з ациліном пригнічує протягом 3 діб та дещо краще протягом 96 годин Приклад 4Б Модифікацію одержаного та дослідженого в прикладі 1А декапептиду проводять, використовуючи на С-закінченні D-аланшол замість D-аланіламіду Спочатку в основному способом з прикладу 1А, але використовуючи смолу Mernfield (хлорметилований поперечно зшитий полістирол), яку можна придоати в Bachem, Inc , синтезують нонапептидний фрагмент, що має на С-закінченні пролін з вільною кислотною групою Після відщеплення, депротектування та очистки одержують нонапептид Ac-D-2Nal-D4Cpa-D-3PalSer-Aph(L-riflpoopoTHn)-D-4Amf(Cbm)-l_eu-ll_ysPro-OH 0,15ммоль повністю депротектованого та очищеного ВЕРХ нанопептиду розчиняють в Змл осушеного ДМФ разом з З.Оммоль D-аланшолу (Lancaster Chemical) Потім додають як сполучний засіб О.бОммоль твердого РуВОР (Novabiochem) і перемішують реакційну суміш при кімнатній температурі протягом ЗО хвилин, потім зупиняють реакцію додаванням 200мл води, створюючи емульсію, яку перетворюють у прозорий розчин доведенням рН до 2,5 льодяною оцтовою кислотою Утворений декапептид Ac-D2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-riflpoopo™-|)-D4Amf(Cbm)-l_eu-ll_ys-Pro-D-Ala-on очищають препаративною ВЕРХ-ОФ, використовуючи як буфер ТЕАФ (рН2,3), а потім очищають, використовуючи як буфер 0,1% ТФОК Утворений пептид оцінюють як практично гомогенний з більшою за 99% чистотою Масспектрометрія показала масу 1632,9Да, що у згоді з розрахованою масою пептиду 1632,8Да Дослідження пептиду провели стандартним способом на щурах in vivo, як у прикладі 1 Пептид при дозі 50 (г є бюактивним і ця бюактивність продовжується принаймні 96 годин, його вважають дуже довгодіючим Приклад 4В Синтез з прикладу 4Б повторюють, застосовуючи замість D-аланшолу З.Оммоль L-аланшолу (Aldndge Chemical) Утворений декапептид очищають способом з прикладу 4Б і оцінюють як практично гомогенний з більшою за 98% чистотою Масспектрометрія показала масу 1632,9Да, що у згоді з розрахованою масою пептиду 1632,8Да Дослідження пептиду провели стандартним способом на щурах in vivo, як у прикладі 1 Пептид при дозі 50 (г є бюактивним і ця бюактивність продовжується принаймні 96 годин, його вважають дуже довгодіючим Приклад 4Г Модифікацію одержаного та дослідженого в прикладі 1 декапептиду проводять, використовуючи на С-закінченні D-аланшол замість D-аланіламіду Спочатку в основному способом з прикладу 1А, але використовуючи SPPS на смолі Mernfield, але в основному способом з прикладу 1 Після відщеплення, депротектування та очистки одержують нанопептид Ac-D-2Nal-D4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-l_euILys-Pro-OH Очищений нанопептид обробляють D-аланшолом, як у прикладі 4Б і утворений дека 58547 24 пептид Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)D-4Aph(Cbm)-l_eu-ll_ys-Pro-D-Ala-on очищають препаративною ВЕРХ-ОФ способом з прикладу 1 Утворений пептид оцінюють як практично гомогенний з більшою за 99% чистотою Масспектрометрія показала масу 1618,9Да, що у згоді з розрахованою масою пептиду 1618,8Да Дослідження пептиду провели in vivo Пептид є бюактивним Приклад 4Д Синтез з прикладу 4Г повторюють, застосовуючи замість D-аланшолу Lаланінол Утворений декапептид Ac-D-2Nal-D4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-l_euILys-Pro-D-Ala-ол очищають препаративною ВЕРХ-ОФ способом з прикладу 4Б і оцінюють як практично гомогенний з більшою за 98% чистотою Масспектрометрія показала масу 1618,9Да, що у згоді з розрахованою масою пептиду 1618,8Да Дослідження пептиду провели in vivo Пептид є бюактивним Приклад 5 Пептид [4Aph(D-Hor)5, D4Amf(Cbm) ]-антид, який має формулу Ac-D2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-D-4Aph-(D-riflpoopo™-|)D-4Amf(MeCbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2, синтезують в основному способом з прикладу 1А, але замість взаємодії в позиції 5 4Арп з Lпдрооротовою кислотою бічний ланцюг обробляють D-пдрооротовою кислотою Синтез інтермедіату декапептиду далі завершують, як описано в прикладі 1А Пептидосмолу далі промивають, а потім проводять відщеплення від смоли та депротектування, а далі очищають, як описано в прикладі 1 Пептид Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-D-4Aph-(DriflpoopoTHn)-D-4Amf(Cbm)-l_eu-ll_ys-Pro-D-AlaNH2 отримують після очистки ВЕРХ-ОФ як практично гомогенний з оціненою чистотою, вищою за 98% Визначена РВІМС маса дорівнює 1645,8Да, що у згоді з розрахованою масою пептиду 1645,8Да Дослідження пептиду стандартним способом на щурах in vivo, показало що при дозі 50 (г він виявляє довготривалу бюактивність у пригніченні секреції LH протягом 2 діб приблизно однаково довго у порівнянні з ациліном, а далі продовжує пригнічувати трохи слабше протягом 72 та 96 годин Приклад 5А Синтез з прикладу 5 повторюють, застосовуючи замість обробки депротектова-ного бічного ланцюга 4Amf mpem-бутилізоціанатом обробку оцтовим ангідридом Пептид Ac-D-2NalD-4Cpa-D-3Pal-Ser-D-4Aph-(D-riflpoopo™-|)-D4Amf(Ac)-l_eu-ll_ys-Pro-D-Ala-NH2 отримують після очистки ВЕРХ-ОФ як практично гомогенний з оціненою чистотою, вищою за 99% Визначена РВІМС маса дорівнює 1644,7Да, що у згоді з розрахованою масою пептиду 1644,8Да Дослідження пептиду провели, як у прикладі 1 Пептид при дозі 50 (г він виявляє довготривалу бюактивність у пригніченні секреції LH протягом З діб приблизно однакову у порівнянні з ациліном та дещо краще пригнічує секрецію LH протягом 96 годин Приклад 6 Пептид [4Amf(D-Hor)5, D4Amf(Ac)6]-aHTHfl синтезують в основному спосо 25 58547 26 бом з прикладу 1 Е, але як залишок в позиції 6 з оціненою чистотою, більшою за 99% Визначена a використовують N Boc-D-4Amf(Fmoc) замість МС маса дорівнює 1658,7Да, що у згоді з розраa N Boc-D-4Aph(Fmoc) Пептид Ac-D-2Nal-D-4Cpaхованою масою пептиду 1658,8Да D-3Pal-Ser-D-4Amf(L-riflpoopo™-|)-DДослідження пептиду провели, як у прикладі 4Amf(aL(eTHn)-l_eu-ll_ys-Pro-D-Ala-NH2 отримують 1 Пептид при дозі 50 (г виявляє близьку до аципісля очистки ВЕРХ-ОФ як практично гомогенний ліну активність на 1 та 2 доби та дещо гіршу у з оціненою чистотою, вищою за 98% Визначена порівнянні з ациліном активність через 3 доби, і МС маса дорівнює 1658,7Да, що у згоді з розрапродовжує суттєво втрачати бюздатність після хованою масою пептиду 1658,8Да цього Приклад 7 Способами з прикладів 1-5 вигоДослідження пептиду провели, як у прикладі товили також такі пептиди, що антагоністичні до 1 Пептид при дозі 50 (г виявляє довготривалу GnRH активність у пригніченні секреції LH, що приблизD-4Amf(Cbmf ProaNHCH2CH3]но однакова у порівнянні з ациліном протягом [4Aph(Hor) перших 2 діб та дещо краще пригнічує секрецію антид 5 e 9 LH протягом 96 годин [4Aph(Hor) , D-4Aph(Cbm) Pro NHCH2CH3]антид Дослідження пептиду № 4 стандартним спо1 [Acr-D-2Nal , 4FD-D-Phe" 4Aph(Hor) ]-ацилін собом на щурах in vivo, показало що при дозі 50 [Bz-D-2Nal1, 4NO2-D-Phe" 4Aph(Hor)' (г він виявляє довготривалу бюактивність у приD4Арп(Ног)6]-антид гніченні секреції LH протягом 2 діб приблизно 1 [For-D-2Nal 4OCH3D-Phe однаково довго у порівнянні з ациліном, а протяD4Amf(Hor) 4Aph(D-Hor)6]-aHTHfl гом 3 та 4 діб виявляє бюздатність, близьку до ациліну [Acr-D-2Nal1 4BrD-Phez, D4Amf(lmz)5, 4Aph(lmz)6]-aHTHfl Приклад 6А Синтез з прикладу 6 повторюють, [Pn-D-2Nal1 4CH3-D-Phe D4Aph(Hor)e застосовуючи обробку депротектованого бічного 4Арп(Ног)6]-антид ланцюга 4Amf mpem-бутилізоціанатом замість [By-D-2Nal1 3,4CI2D-Phe обробки оцтовим ангідридом, як у прикладі 1, з 4Aph(Hor)5 D6 5 4Арп(Ног) ]-антид утворенням пептиду [4Amf(D-Hor) , D4Amf(Cbm)6]-aHTHfl Пептид Ac-D-2Nal-D-4Cpa-DIVI-D-2Nal1, 4NO2D-Phe2,4Aph(Hor)5,D6 3Pal-Ser-D-4Amf(1-riflpoopo™-|)-D3Aph(Cbm) ]- антид 4Amf(Kap6aMoin)-l_eu-ll_ys-Pro-D-Ala-NH2 отриму4Aph (Hor)s, [Vac-D-2Nal1, CaMe4CID-Phe 1 ють після очистки ВЕРХ-ОФ як практично гомоGly ]-ацилш генний з оціненою чистотою приблизно 99% Ви[Pn-D-2Nal1, 3Aph ( mz)5, D-3Amf(Hor)6, Agl10]значена МС маса дорівнює 1659,6Да, що у згоді з антид 8 розрахованою масою пептиду 1659,8Да [Acr-D-2Nal1, 4Aph (Hor)°, Arg (Et2) , D-Agl іи Дослідження пептиду провели, як у прикладі (Ме) ]-ацилш 1 Пептид при дозі 50 (г виявляє близьку до аци[MeCbm-D-2Nal1, 4Aph (Horf, Arg", Agl 1ҐІ ліну активність через 1 добу і приблизно однако(Me) ]-ацилш ву у порівнянні з ациліном активність через 2 до[Cdm-D-2Nal1, 3Amf(lmz)5, АІа10]-ацилш би та дещо гіршу у порівнянні з ациліном (EtCbm-D-2Nal1, 4Amf(Hor)5, Pro9NHCH2CH3]активність через 3 доби, але приблизно однакову ацилін через 4 доби [Acr-D-2Nal1 4Aph(lmz)5, D-4Aph(Cbm)6, Arg8]Приклад 6Б Синтез з прикладу 6А повторюантид [Cbm-D-2Nal1, ють, застосовуючи обробку метил ізоціанатом 4Aph(MeCbm)^ Dзамість обробки mpem-бутилізоціанатом, з утво4Amf(MeCbm)u, Arg (Et2) ]-антид 5 6 ренням пептиду [4Amf(D-Hor) , D-4Amf(MeCbm) ][4Ahp(HorV D-4Ahp (Imz) , D-АдП-антид антид Пептид Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser[Ac-D-Nal , 4Amf(Hor) , D-4Amf(D-Hor)°,Arg°]4Aph(L-riflpoopoTHn)-D-4Amf(L-MeTHnKap6aMoin)антид Leu-ILys-Pro-D-Ala-Nbb отримують після очистки [PrCbm-D-2Nal1, 4Amf(lmz)5, D-4Ahp(EtCbm)6, 9 ВЕРХ-ОФ як практично гомогенний з оціненою Pro NHCH2CH3J-aHTHfl частотою приблизно 99% Визначена МС маса [4Amf(Hor) , D-Lys(Nic)6, AzaGly10]-антид c 6 8 дорівнює 1673,6Да, що у згоді з розрахованою [4Amf(Hor)^ D-Cif , Har (Et2) ]-aHTHfl e масою пептиду 1673,8Да D-Lys(Nic)5, D-Agl10]-aHTHfl [4Aph(Hor) [4Aph(Hor)°, D-Hci , АдІ(Ме)11-антид Дослідження пептиду провели, як у прикладі [4Aph(Hor)5, D-3Pal, Har8, АдҐ0Л]-антид 1 Пептид при дозі 50 (г виявляє близьку до аци[4Aph(Hor)5D-4Aph(For)6,D-Agl(Me)10]-aHTHfl ліну активність у пригніченні секреції LH через 1 [4Aph(Hor)5, D-4Aph(atz)6, Har (Et2) ]-антид добу і приблизно однакову у порівнянні з ацилі[4Aph(Hor)5, D-4Aph(iprCbm)6, О-А䥰]-антид ном активність через 2 доби та дещо гіршу у по[For-D-1Nal1, 4Amf(Hor)5, D-4Amf(atz)6, Gly10]рівнянні з ациліном активність у пригніченні секантид реції LH на 3 та 4 добу [4Amf(Hor)5, D-4Aph(Cbm)6, АІа10-ол]-антид Приклад 6В Синтез з прикладу 6 повторюють, Ці пептиди є бюздатними при інгібуванні секзастосовуючи D-пдрооротову кислоту замість Lреції LH пдрооротової кислоти, з утворенням пептиду [4Amf(D-Hor)5, О-4Агтгї(Ас)6]-антид Пептид Ac-DПриклад 8 Використовуючи спосіб, що зага2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-riflpoopo™-|)-Dльно описаний в прикладах 1-5 та патенті США 4Amf^eTHn)-l_eu-ll_ys-Pro-D-Ala-NH2 отримують № 5,491,217, виготовили також такі пептиди антапісля очистки ВЕРХ-ОФ як практично гомогенний гоністів GnRH 58547 28 27 кукурудзяний крохмаль або желатин, такий дезін[NaMe4Aph(Hor)5, D-4Aph(Cbm)6]-aHTHfl тегратор, як алпнова кислота, таке мастило, як [NaMe4Aph(Hor)5, D-4Aph(Cbm)6]-aHTHfl стеарат магнію Ефективним може бути внутріш[МаМе4Аргі(Ног)5]-ацилін ньовенне введення в ІЗОТОНІЧНИХ фізіологічних, [NaMe4Aph(D-Hor)5]-a4Hnm буферованих фосфатом і т п розчинах [D-4FPhe2, [МаМе4Аргі(Ног)5]-ацилін Фармацевтичні композиції звичайно включа[МаМе4Атт(Ног)5]-ацилш ють ефективну КІЛЬКІСТЬ пептиду в сполученні зі [NaMe4Aph(Hor5), О-4АрИ(Ног)6]-антид звичайними фармацевтично прийнятними носія[NaMe4Aph(Hor5V D-4Aph(D-Hor)6l-aHTHfl ми чи розріджувачами Звичайні дози складають [MeCbm-D-2Nal , МаМе4Арп(Ног)1-ацилін 10(г-2,5мг пептиду на кг маси тіла хазяїна при [NaMe4Aph(Hor)5 О-ЗРаІ6]-антид a 5 6 внутрішньовенному вживанні Властивості цих [N Me4Aph(Hor) , D-4Aph(Cbm) ]-aHTHfl сполук можуть дозволити ефективне пероральне [NaMe4Aph(MeCbm)5, О-4Арп(МеСЬт)6]-антид вживання, однак пероральні дози можуть бути [NaMe4Aph(Hor), D-4Amf(Cbm)6, АІа10-ол]вищими Взагалі, лікування особи цими пептидаантид ми в основному проводять у КЛІНІЧНИХ умовах з використанням інших антагоністів GnRH, викори[NaMe4Aph(Hor), D-4Aph(Cbm)6, D-Ala10-on]стовуючи придатні ноем, в яких сполуки розчинні, антид та застосовуючи достатні для зменшення у паці[NaMe4Aph(Hor) D-4Aph(Cbm)6, АІа10-ол]єнта рівнів LH та FSH дози антид a 6 Може бути бажаним довготривале вивіль[N Me4Aph(Hor), D-Cit (-aHTHfl нення аналогу GnRH, наприклад, протягом 1 тиж[NaMe4Aph(Hor)5, D-Lys(Nic)6]-aHTHfl ня-1 року після одноразового прийому, для чого [NaMe4Aph(D/L-lmz)5]-a4HniH можна використати повільне вивільнення, депо [NaMe4Aph(L-lmz)5J- ацилін або імплантат [NaMe4Aph(D-lmz)5]-a4HniH Ці сполуки можна застосовувати до ссавців [NaMe4Aph(L-lmz)s, D-4Amf(Cbm)6]- ацилін внутрішньовенне, підшкірно, внутрішньом'язово, [NaMe4Aph(Hor)5, D-4Amf(MeCbm)6]-aHTH4 перорально, крізьшкірно, штраназально, внутріш[NaMe4Aph(Hor)5, D-4Amf(Ac)6]-aHTHfl ньолегенево, інтраректально або інтравапнально [NaMe4Aph(Hor)5, D-4Amf(Cbm)6, D-Ala10-on]для досягнення інгібування таїабо регулювання антид фертильності, а також для оборотного пригнічен[NaMe4Aph(D-Hor)5, D-4Amf(Cbm)6]-антид ня гонадної активності, як-то для керування пеa 5 6 [N Me4Aph(D-Hor) , D-4Amf(Ac) ]-антид редчасним статевим розвитком або при радіаційa 5 6 [N Me4Amf(Hor) , D-4Amf(Ac) ]- антид ній та хіміотерапії Вони також корисні при [NaMe4Amf(Hor)5, D-4Amf(Cbm)6]- антид лікуванні стероід-залежних пухлин ДІЮЧІ ДОЗИ a 5 6 [N Me4Amf(Hor) , D-4Amf(MeCbm) )- антид можуть змінюватися від способу вживання та [NaMe4Amf(D-Hor)5, D-4Amf(Ac)6]- антид конкретного виду лікуємого ссавця Деякі з цих Ці пептиди бюздатні інгібувати секрецію LH і сполук мають вищу за 50мг/мл розчинність і їх дуже добре розчинні у воді при фізіологічних знаможна використовувати в розчинах з вмістом 510мг/мл при рН5,4 Прикладом одної типової доченнях рН зованої форми є розчин пептиду в позбавленій Нижченаведені сполуки, які досліджували, від бактерій воді при рН приблизно 6, який застовиявили біологічну здатність пригнічувати LH у совують парентерально в дозі приблизно 0,1ступеню, який щонайменше в основному відпові2,5мг/кг маси тіла на добу Ці сполуки визначені дає відповідному антагоністичному до GnRH пепяк добре толерантні in vivo та СТІЙКІ ДО гелеутвотиду під назвою антид, аналогами якого їх вварення, ВІДПОВІДНО, їх вважають особливо придатжають В результати широких досліджень в цій ними для підшкірного введення в розчині приблиобласті протягом десятиріччя проведене в цьому зно 5% маніту в позбавленій від бактерій воді при широко застосовуваному тестуванні вимірювання рН приблизно 4,9, в концентрації, що вища за пригнічення LH було прийняте як свідоцтво здатприблизно 0,75мг/мл і навіть за 1,0мг/мл, без неності таких сполук пригнічувати секрецію гонадобезпеки гелеутворення в МІСЦІ ін'єкції тропіну, а тому виявляти корисну антигонадну ЦІ антагоністичні GnRH пептиди корисні таантиовуляційну дію На основі СТІЙКОСТІ ДО гелеукож при діагностиці in vivo та in vitro Ці пептиди творення in vivo, гарній розчинності, довготриваможна вводити in vivo з наступним аналізом кролій бюактивності та інших властивостей ці сполувотоку пацієнта для визначення ступеню зменки вважають загально корисними в якості шення гормональної секреції, наприклад, секреції антигонадних засобів для пригнічення секреції LH Аналіз in vitro можна провести для визначенгонадотропінів та інгібування вивільнення стероїня, чи є чутливими до GnRH клітини окремих пудів гонадами, наприклад, як антиовуляційний хлин При цьому культури клітин пухлин обробзасіб ляють Хоча винахід описано з огляду на його Сполуки згідно з винаходом часто вживають найкращі втілення, повинно бути зрозумілим, що у формі фармацевтично прийнятних нетоксичних можна зробити зміни та модифікації, які зрозумілі солей, як-то кислотно-адитивних солей, або комкожному фахівцю, без виходу за рамки винаходу, плексів з металами, ацетату та памоату, краще які представлені доданою формулою винаходу памоату Якщо активний інгредієнт вживають у При тому, що N-закшчення можуть залишатися формі таблеток, останні можуть включати фарнезаміщеними або заміщеними з використанням мацевтично прийнятний нетоксичний розріджуінших ацилуючих груп, кращими є ацетил або вач, який містить таке зв'язуюче, як трагакант, 29 58547 ЗО заміщений чи незаміщений карбамоїл Замість утворені залишки визначають як еквівалентні DAph чи D-Aph можна використовувати в позиціях та L-Aph(Ac) Lys(Bu) та Lys(Ef2) вважають екві5 та 6, ВІДПОВІДНО, Ahp чи D-Ahp Замість Aph(Ac) валентними ILys, однак, ILys є кращим Інші заможна обробити таким іншим ацилуючим засолишки гідрофобних амінокислот також можна бом, як мурашина кислота, p-ala(afz) та узастосовувати в позиціях 1 та 6 (як згадано виаміномасляна кислота(аіг), групу аміноРпе, що ще), переважно у формі D-ізомерів, і їх вважають крім того дає антагоністи GnRH з подовженою еквівалентними описаним дією, як розкрито в патенті США № 5506207, отже Комп'ютерна верстка С Волобуєва Підписано до друку 05 09 2003 Тираж 39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна