Альгінат олігосахариду та його похідні, їх одержання та застосування

1. Похідні альгінату олігосахариду або його фармацевтично прийнятні солі, які відрізняються тим, що згадані похідні альгінату олігосахариду складаються з β-D-мануронової кислоти, сполученої α-1,4 глікозидними зв'язками, в яких відновна кінцева група в положенні 1 є карбоксильним радикалом, як показано в наступній формулі II: C2 2 (19) 1 3 85226 4 де у формулі n означає 0 або ціле число від 1 до 19. 9. Фармацевтична композиція, яка містить ефективну кількість похідних олігосахариду мануронової кислоти за будь-яким з пп. 1-3 та фармацевтично прийнятні носії. 10. Фармацевтична композиція за п. 9, яка відрізняється тим, що згадана композиція є будь-яким засобом, вибраним з групи, яка складається з лікарського засобу для профілактики та лікування хвороби Альцгеймера, інгібітору утворення білка амілоїду-β фібрил, лікарського засобу для профілактики та лікування діабетів, інгібітору утворення білка амілоїду фібрил острівців підшлункової залози та промотору дезагрегації фібрил. Представлений винахід стосується альгінату олігосахариду та його похідних, способу їх одержання та їх застосування для лікування хвороби Альцгеймера (AD) та діабету. На даний час AD і діабет є звичайними та широко розповсюдженими захворюваннями, які становлять серйозну загрозу здоров'ю людства. Зокрема, із збільшенням в світі кількості людей похилого віку захворюваність підвищується рік з роком. Тому профілактика та лікування цих захворювань стають все більш важливими. На даний час засоби для попередження та лікування AD навряд чи здійснюють революцію в лікуванні AD внаслідок того, що їх дія обмежується лише усуненням симптомів, або внаслідок їх сильних побічних ефектів. Ліками, зазвичай використовуваними для лікування діабетів, є головним чином інсулін та інші гіпоглікемічні засоби орального призначення, недоліками більшості з яких є незручність у застосуванні і токсичність. Дослідженнями було показано, що випадки AD та діабету пов'язані з відкладеннями амілоіду-бета (Αβ) та аніліну (IAAP), наступним фібрилогенезом та підвищенням кількості вільних окислювальних радикалів дають привід вважати, що інгібування утворення фібрилів амілоїду-бета та аміліну є перспективним для профілактики та лікування цих захворювань. Альгінати є головними компонентами клітинної стінки бурих водоростей і які є лінійними анюнітовими полісахаридами, що складається з β-Dманнуронової кислоти (МаnА) та α-L-гулуронової кислоти (GuIA), пов'язаних 1-4 глюкозидними зв'язками. Альгінат належить до високомолекулярних полімерів з молекулярною масою від 104 до 106, що отримується з багатьох джерел. Альгінат широко застосовується в харчовому виробництві, хімічній промисловості та медицині. Останні дослідження показали, що альгінат має широкий спектр біологічної активності. Однак, його застосування як лікарського засобу певною мірою обмежено ізза великої молекулярної ваги. Таким чином, олігосахарид, виділений з альгінату шля хом деструкції різними способами, має важливе значення для хімії глікозидів, біології глікозидів, розробки глікозидів та дослідження ліків на основі сахаридів. Способи деструкції альгінату включають ферментну, фізичну та хімічну деструкцію, хоча необхідність в специфічних ферментах обмежує застосування ферментної деструкції. Фізичною деструкцією, яка зазвичай застосовується в комбінації з іншими методами, неможливо легко отримати олігосахариди, оскільки молекулярна маса продукту складає близько 50,000 Da. Хімічна деструкція полісахариду включає кислотний гідроліз і окислювальну деструкцію. Кислотний гідроліз обмежується його можливістю отримувати олігосахариди з молекулярною вагою близько 4000 Da або менше, коли здійснюється при нормальній температурі та при нормальному тиску. Для вирішення вищеописаних проблем з урахуванням глибоких досліджень винахідників було виявлено, що альгінат олігосахариду з молекулярною масою близько 4000 Da або менше може бути одержаний кислотним гідролізом при високій температурі і високому тиску, а його похідні, чиї відновлені кінцеві групи в положенні 1 є карбоксильними радикалами, можна отримати в присутності оксидантів. Винахід здійснено на вищенаведеній основі. Представлений винахід стосується альгінату олігосахариду та його похідних з низькою молекулярною масою або їх фармацевтично прийнятних солей, а також способу їх одержання. Представлений винахід також стосується лікарського засобу для профілактики та лікування AD і діабетів, який містить вищезгаданий низькомолекулярний альгінат олігосахариди або його похідні, або їх фармацевтично прийнятні солі. Представлений винахід стосується альгінату олігосахариди, представленого формулою (І) та його похідних або їх фармацевтично прийнятних солей. Згаданий олігосахарід складається з β-Dманнуронової кислоти, сполученої α-1,4 глікозидним зв'язком. де у формулі n представляє 0 або ціле число серед від 1 до 19. В представленому винаході прикладом згаданих похідних альгінату олігосахариду є сполука, представлена формулою (II), в якій відновлюваною кінцевою групою в положенні 1 є карбоксильний радикал, і в якій n означає 0 або ціле число від 1 до 19. У згаданих формулах (І) і (II) n переважно є у інтервалі від 2 до 10, і більш переважно від 4 до 8. Причина того, що біологічні ефекти тетрасахариду до додекасахариду (переважно, гексасахариду до декасахариду) є кращими залишається незрозумі 5 85226 лою, що може викликатися здатністю цих олігосахаридів розпізнаватися та поглинатися клітинами. Згадані похідні альгінату олігосахариду в подальшому включають, наприклад, похідні, в яких частина гідроксильних груп в маннуроновій кислоті сульфатована. Фармацевтично прийнятні солі згаданого альгінату олігосахариду та його похідних олігосахариду можуть бути, наприклад, натрієвою, калієвою, кальцієвою і магнієвою сіллю і т.п. Серед них перевага надається натрієвій солі. Фармацевтично прийнятні солі можуть бути одержані звичайними способами. Представлений винахід також стосується способу одержання згаданого альгінату олігосахариду або його похідних, в якому розчин альгінату піддають реакції протягом від 2 до 6 годин в автоклаві при рН2-6 і температурі 100-120°C; і рН після закінчення реакції доводять до 7. Продукт окислювальної деструкції отримують шляхом додавання окислювача до розчину альгінату олігосахариду. В переважному втіленні винаходу, 0,5-5%-ний водний розчин альгінату нагрівали протягом 4 годин в автоклаві при рН4 та температурі близько 110°C. Після закінчення реакції реакційну суміш відсмоктували і охолоджували, і потім доводили величину рН до 7 розчином NaOH При перемішуванні фільтрат поволі вливали в промисловий спирт, об'єм якого був в 4 рази більшим, ніж об'єм фільтрату, і залишали на ніч для осадження. Осад відфільтровували у вакуумі до сухого залишку і зневоднювали шляхом промивання абсолютним етанолом. Отримували на фільтрі білий осад, який сушили в сушильній шафі при температурі 60°C з одержанням неочищеного альгінату олігосахариду. Неочищений альгінат олігосахариду переводили в 10%-ний розчин і осаджували 95%-ним етанольним розчином. Осад промивали абсолютним етанолом, сушили і переводили в 5%-ний розчин. Розчин фільтрувати через плівку 3 мкм для видалення домішок, потім знесолювали на Віо-Gel-Р6 колонці (1,6´180см) з 0,2мол/л NH4HCO3 як рухомої фази і збирали продукт в декілька етапів. Елюат досліджували сульфатно-карбазольним методом. Фракції, які містили сахариди, збирали, концентрували при зниженому тиску і знесолювали, та ліофілізували з одержанням альгінату олігосахариду. Одержання похідних, представлених формулою (II), проводили наступним чином: додавали окислювач і реакцію проводили протягом від 15 хвилин до 2 годин при температурі 100-120°C, після чого проводили реакцію альгінатного розчину протягом від 2 до 6 годин в автоклаві при рН2-6 та температурі близько ~100-120°C. В конкретному втіленні винаходу 25мл 5%-ного розчину сульфату міді додавали до 50мл 10%-ного NaOH (водн.), перемішували і відразу ж додавали 40мл 5%-ного розчину альгінату олігосахариду. Одержану суміш нагрівали в киплячій водяній бані до припинення утворення осаду червоно-коричневого кольору. Суміш центрифугували для видалення осаду. Деяку кількість надосадової рідини відбирали і додавали до 10%-ного NaOH (водн.) і 5%-ного розчину сульфату міді у вищезгаданій пропорції для пере 6 вірки будь-якого утворення осаду червонокоричневого кольору. Якщо осад не утворювався, надосадову рідину додавали до промислового спирту, об'єм якого був в 4 рази більшим, ніж об'єм надосадової рідини, і залишали на ніч для осадження. Осад відфільтровували на водоструминному насосі до сухо го залишку, зневоднювали шляхом неодноразового промивання абсолютним етанолом і сушили в сушильній шафі при температурі 60°C. Розділення проводили таким же чином як і у випадку альгінату олігосахариду формули (І). Винахід також стосується фармацевтичної композиції, яка містить ефективну кількість згаданого альгінату олігосахариду або його похідних, або його фармацевтично прийнятних молей та фармацевтично прийнятні носії. Фармацевтична композиція може використовуватися як лікарський засіб для профілактики та лікування хвороби Альцгеймера. Крім того, фармацевтична композиція може використовува тися як інгібітор утворення білка амілоїда-β фібрил і промотор дезагрегації фібрил. Фармацевтична композиція може також використовуватися як лікарський засіб для профілактики та лікування діабетів. Крім того, фармацевтична композиція може використовува тися як інгібітор утворення білка амілоїда фібрил острівців підшлункової залози і інгібітор утворення поліпептида амілоїда острівців підшлункової залози. Приймаючи до уваги труднощі, пов'язані з відсутністю ефективних лікарських засобів для профілактики та лікування AD та діабетів, особливо важливо, що альгінат олігосахариду згідно з представленим винаходом використовують для виробництва лікарського засобу для профілактики та лікування AD та діабетів. Опис малюнків На Фіг.1 показано криву елюювання альгінату олігосахариду згідно з представленим винаходом, розділеного на колонці Bio-Gel-Р6 після кислотного гідролізу. На Фіг.2 показано спектр MALDI-TOF альгінату олігосахариду згідно з представленим винаходом. На Фіг.3 показано криву елюювання продукту окислювальної деструкції альгінату олігосахариду, розділеного на колонці Bio-Gel-P6. На Фіг.4 показано MALDI-TOF спектр продукту окислювальної деструкції альгінату олігосахариди (позитивна методика). На Фіг.5 показано вплив альгінату олігосахариду згідно з представленим винаходом на інкубаційний період виникнення у миші хвороби Альцгеймера, викликаної Aβ1-40. На Фіг.6 показано вплив альгінату олігосахариду згідно з представленим винаходом на похибку виникнення у миші хвороби Альцгеймера, викликаної Aβ1-40. На Фіг.7 показано захисну дію альгінату олігосахариду згідно з представленим винаходом на SH-SY5Y клітини, пошкоджені Aβ25-35 . На Фіг.8 показано захисну дію альгінату олігосахариду згідно з представленим винаходом на SH-SY5Y клітини, пошкоджені Aβ1-40. 7 85226 На Фіг.9 показано інгібувальну дію альгінату олігосахариду згідно з представленим винаходом на нормальне та викликане гепарином утворення фібрил Aβ 1-40. На Фіг.10 показано дестабілізуючу дію альгінату олігосахариду згідно з представленим винаходом на фібрили Aβ1-40. На Фіг.11 показано вплив альгінату олігосахариду згідно з представленим винаходом на структуру розчиненого 250мкг/мл Aβ1-40. На Фіг.12 показано захисну дію альгінату олігосахариду згідно з представленим винаходом на NIT клітини, пошкоджені IAAP. На Фіг.13 показано вплив суміші продуктів окислювальної деструкції альгінату олігосахариду згідно з представленим винаходом на час затримки між стимулом і реакцією у мишей з AD, викликаною Aβ1-40, в дослідженнях з використанням водного лабіринту Моріса. На Фіг.14 показано вплив суміші продуктів окислювальної деструкції альгінату олігосахариду згідно з представленим винаходом на дальність плавання мишей з AD, викликаною Aβ1-40, в дослідженнях з використанням водного лабіринту Моріса. На Фіг.15 показано вплив суміші продуктів окислювальної деструкції альгінату олігосахариду згідно з представленим винаходом на час першого прибуття на платформу мишей з AD, викликаною Aβ1-40, в дослідженнях з використанням водного лабіринту Моріса. На Фіг.16 показано вплив суміші продуктів окислювальної деструкції альгінату олігосахариду згідно з представленим винаходом на кількість переходів через платформу мишей з AD, викликаною Aβ1-40, в дослідженнях з використанням водного лабіринту Моріса. На Фіг.17 показано захисну дію суміші продуктів окислювальної деструкції альгінату олігосахариду згідно з представленим винаходом на NIT клітини, пошкоджені IAAP. 1. Виготовлення альгінату олігосахариду До дистильованої води додавали 1г поліманнануронату натрію (середня молекулярна вага 8,235 Da, виробляється Lantai Pharm. LTD., Ocean University of China) з одержанням 1%-ного розчину, доводили рН до 4 соляною кислотою, поміщали в автоклав і нагрівали протягом 4 годин при температурі 110°C. Після охолодження доводили рН до 7 водним розчином NaOH. При перемішуванні повільно вливали фільтрат в промисловий спирт, об'ємом в 4 рази більшим, ніж фільтрат, залишали на ніч для осадження. Осад відфільтровували до сухого залишку з використанням водоструминного насосу і піддавали дегідратації шляхом промивання абсолютним етанолом. Отримували на фільтрі білий осад і сушили в сушильній шафі при температурі 60°C з одержанням сирого альгінату олігосахариду. Переводили сирий альгінат олігосахариду в 10%-ний розчин і осаджували 95%-ним етанольним розчином. Осад промивали абсолютним етанолом і переводили в 5%-ний розчин після висушування. Розчин фільтрувати через 3мкм плівку для видалення домішок і потім знесолювали на 8 Bio-Gel-Р6 колонці (1,6´180см) з використанням 0,2моль/л NH4HCO3 як рухомої фази та збирали продукт в декілька етапів. Елюат досліджували сульфатно-карбазольним методом і компоненти, які містили сахариди, збирали, концентрували при зниженому тиску і знесолювали їх на колонці G-10. Зовнішній об'ємний компонент в подальшому відокремлювали на Bio-Gel-Р10 колонці (1,6´180см) та ліофілізували з одержанням серії альгінатів олігосахаридів (Фіг.1). 2. Виготовлення продукту окислювальної деструкції альгінату олігосахариду 5г Одержаного вище альгінату олігосахариду переводили в 5%-ний розчин. Додавали 25мл 5%ного розчину сульфату міді до 50мл 10%-ного водного розчину NaOH і одразу ж перемішували та додавали 40мл 5%-ного розчину альгінату олігосахариди. Одержану суміш нагрівали в киплячій водяній бані до припинення утворення осаду червоно-коричневого кольору. Суміш центрифугували для видалення осаду. Частину надосадової рідини відбирали і додавали до 10%-ного водного розчину NaOH та 5%-ного розчину суль фату міді у наведеному ви ще співвідношенні для перевірки утворення осаду червоно-коричневого кольору. Якщо осад не утворювався, надосадову рідину додавали до промислового спирту, об'єм якого був в 4 рази більшим, ніж об'єм надосадової рідини, і залишали на ніч для осадження. Осад відфільтровували на водоструминному насосі до сухого залишку, зневоднювали шляхом неодноразового промивання абсолютним етанолом і сушили в сушильній шафі при температурі 60°C. Таким чином отримували сирий окислений продукт альгінату олігосахариду. Сирий продукт окислювальної деструкції альгінату олігосахариду переводили в 10%-ний розчин і осаджували 95%-ним етанольним розчином. Осад промивали абсолютним етанолом і переводили в 5%-ний розчин після висушування. Розчин фільтрува ти через 3мкм плівку для видалення домішок і потім знесолювали на Bio-Gel-Р6 колонці (1,6´180см) з використанням 0,2моль/л NH4HCO3 як рухомої фази та збирали продукт в декілька етапів. Елюат досліджували сульфатнокарбазольним методом і компоненти, які містили сахариди, збирали, концентрували при зниженому тиску і знесолювали їх на колонці G-10. Зовнішній об'ємний компонент в подальшому відокремлювали на Bio-Gel-Р10 колонці (1,6´180см) та ліофілізували з одержанням серії альгінатів олігосахаридів (Фіг.2). 3. Визначення структури альгінату олігосахариду Визначали структури олігосахаридів, що містяться у фракції, отриманій при одержанні альгінатів олігосахаридів. Біло підтверджено, що олігосахаридами є альгінати олігосахаридів, що складаються з β-D-маннуронової кислоти, зв'язаної 1,4-глікозидними зв'язками. Структурна формула: 9 85226 в якій n представляє 0 або ціле число від 1 до 19. В подальшому фракцію близько 292мл елюата (фракція, позначена як «6», на Фіг.1, згадувана нижче як компонент 6) відбирали як приклад для того, щоб проілюструвати аналіз структури ви щезгаданих олігосахаридів. 3.1 Ультрафіолетова спектрограма абсорбції Фракцію олігосахариду в приблизно 292мл елюата розбавляли до відповідної концентрації і досліджували при довжині хвилі 190-400нм за допомогою спектрофотометра UV-2102 UV-VIS. Було виявлено, що в ультрафіолетовій області ніяких специфічних піків поглинання не спостерігається, що вказує на те, в стр уктурі немає кон'югованих подвійних зв'язків. Проте, при довжині хвилі 190200нм були відмічені неспецифічні піки поглинання. Таким чином, при знесоленні олігосахариду можна проводити онлайнову перевірку у вищезгаданій ультрафіолетовій області. 3.2 Інфрачервона спектрометрія Зважували 0,5мг вищезгаданої фракції олігосахаридів. ІЧ-спектри визначали за допомогою інфрачервоного мікропроцесорного спектрометра NEXUS-470 з таблетками KBr. Піки при 3420,79см1 , 3214,64см -1 та 2924,61см-1 можуть бути віднесені до симетричних коливань розтягування гідроксильної групи; пік при 1600,25см -1 може бути віднесений до симетричного коливання розтягування 10 карбонільної групи карбоксилату; пік при 1406,54см-1 може бути віднесений до симетричного деформаційного коливання гідроксильної групи; пік при 1146,42см -1 може бути віднесений до симетричного коливання розтягування C-O зв'язку карбоксильної групи, пік при 1045,77см-1 може бути віднесений до антисиметричного коливання розтягування безводного етеру; і пік при 804,02см-1 може бути віднесений до антисиметричного коливання розтягування циклічного скелета маннуронової кислоти. Це вказує на те, що така сполука містить карбоксильну групу, гідроксильну груп у та циклічну структур у скелета маннуронової кислоти. 3.3 Mac-спектрометричний аналіз Mac-спектрометричний аналіз здійснювали за допомогою мас-спектрометра MALDI-TOF типу BIFLEX Il від Bruker Daltonics Co. Як видно із спектрів (Фіг.2, таблиця 1), пік 1073,9 (m/z) є піком молекулярного іону [M-H]-1 ; пік 1096,6 (m/z) представляє [M+Na-2H]-1; пік 1028,0 (m/z) представляє [MH2O-CO-H]-1; пік 821,2 (m/z) представляє [М-МаnАСН2О-2Н2О-Н]-1; пік 704,3 (m/z) представляє [М2МаnА-Н2О-Н ]-1; пік 634,4 (m/z) представляє [М2МаnА-2(СН2О)-CO-H]-1; пік 536,5 (m/z) представляє [М-2Н]2-; і пік 357,4 (m/z) представляє [М-3Н]3-. У спектрі ESI-MS ви щезгаданого олігосахариду пік молекулярного іона представляє m/z 1073,9, що вказує на те, що його молекулярна вага складає 1074. Таблиця 1 Аналіз мас-спектрів альгінату олігосахариди (Компонент 6) [M-H]-1 [M+Na-2H]-1 [M-H2 O-CO-H]-1 [М-Мап А-СН 2О-2Н2О-Н]-1 [М-2 МапА-Н 2 О-Н]-1 [М-2 МапА-2(СН2О)-СО-Н]-1 [M-2H]2[М-3Н]3 Осколочний іон m/z 1073,9 1096,6 1028,0 821,1 704,3 634,4 536,5 357,4 3.4 Ядерна магнітно-резонансна спектроскопія альгінату олігосахариду Спектри 1H ЯМР та 13C ЯМР альгінату олігосахариду, представленого формулою (І) (n=4) отри мували на JNM-ECP600 спектрометрі. Результати наведено в таблицях 2 і 3. Таблиця 2 1 H ЯМР аналіз альгінату олігосахариду (компонента 6) rα rβ mα mβ n Н-1 5,21 4,91 4,69 4,64 4,63 Н-2 3,98 3,99 4,03 4,03 3,74 Хімічний зсув (млн. ч.) Н-3 4,03 3,77 3,75 3,75 3,63 Н-4 4,04 3,90 3,93 3,65 3,75 Н-5 4,16 3,77 3,69 3,69 4,01 11 85226 12 Таблиця 3 13 С-ЯМР аналіз альгінату олігосахариду (компонента 6) С-1 93,54 93,74 99,08 100,15 rα rβ m n С-2 70,06 70,42 70,63 68,48 Хімічний зсув (млн. ч.) С-3 С-4 69,02 78,37 71,60 78,28 71,43 78,07 72,47 76,27 Згідно з вищенаведеними результатами аналізів підтверджено, що альгінат олігосахариду, який міститься в вищезгаданій фракції, є гексасахаридом маннуронової кислоти, що має наступну структурну формулу 3.5 Визначення вмісту маннуронової кислоти в альгінаті олігосахариду (1Н-ЯМР спектроскопією) Склад альгінату олігосахариду досліджували за допомогою 1Н-ЯМР високого розділення для кількісного визначення співвідношення маннуронової кислоти до гулуронової кислоти (M/G) в альгінаті згідно з інтенсивністю сигналу протона аномерного вуглецю. Зважували 3-5мг сухого зразка, розчиняли в D2O при нейтральному pD і додавали 0,3мг EDTA. Зразок досліджували ЯМР спектрометром Bruker DPX-300. Спектр реєстрували при 70°C так, щоб пік D2O відійшов далеко від резонансної зони аномерного протону. Відносну інтенсивність сигналу виражали в інтегральних величинах площі піку. Результати вказують, що сигнал Н-1 радикала M з'являється при 4,64млн.ч. та 4,66млн.ч (тобто Н-1 сигнали м радикалу в MM і MG послідовностях, відповідно); усі сигнали Н-1 радикала G з'являються при 5,05млн.ч (подвійний пік). Відносний вміст M i G в зразку може бути виражений за інтенсивностями їх Н-1 наступним рівнянням: І4,64 + І4,66 М% = ´ 100% І4,64 + І4,66 + І5,05 де І представляє інтенсивність піку, виражену в інтегральних величинах площі піку. За даними вищезазначеного способу відносний вміст Dманнуронової кислоти в зразку складає 98,07%, С-5 72,60 76,08 75,90 70,05 С-6 175,84 175,84 175,41 175,27 що вказує на те, що альгінат олігосахариду головним чином складається з маннуронової кислоти. 4. Визначення структури продукту окислювальної деструкції альгінату олігосахариду Визначали структур у продукту окислювальної деструкції олігосахариду у фракції, отриманій в процесі одержання продукту окислювальної деструкції альгінату олігосахариду Було підтверджено, що продукт окислювальної деструкції є похідним альгінату олігосахариду, що складається з βD-маннуронової кислоти, зв'язаної 1,4глікозидними зв'язками, в якій відновна кінцева група в положенні 1 є карбоксильним радикалом. Структурна формула має наступний вигляд де n представляє 0 або ціле число від 1 до 19. Компонент 6 взятий як приклад для ілюстрації структурного аналізу вищезгаданого продукту окислювальної деструкції олігосахариду. 4.1 Ультрафіолетова спектрограма Відповідну кількість продукту окислювальної деструкції розбавляли дистильованою водою до певної концентрації, і проводили дослідження за допомогою ультрафіолетового спектрофотометра Shimdzu LJV-260 (190нм~700нм) при повній довжині хвилі. Було виявлено, що не спостерігається ніяких специфічних піків поглинання в ультрафіолетовому та видимому спектрі світла 4.2 Аналіз інфрачервоних спектрів Інфрачервоний спектр продукту окислювальної деструкції альгінату олігосахариду досліджували за допомогою інфрачервоного мікропроцесорного спектрометра NICOLE NEXUS-470. Результати наведено в таблиці 4. Таблиця 4 ІЧ спектри продукту окислювальної деструкції альгінату олігосахариду Пік абсорбції (см -1) 3400,56 3219,02 2924,65 1599,76 1405,95 1296,26 Вид коливання uOH uOH uOH uOH uC=o uC-o δΟ-Н Група -OH -OH -COOH -COOH -COOH -COOH -OH Інтен-сивність s s m s s m 13 85226 14 Продовження таблиці 4 1037,84 817,14 uas(C-O-C) uas (сахарний цикл) 669,80 γOH безводний етер циклічний скелет маннуронової кислоти -OH 4.3 1Н-ЯМР аналіз 1 H ЯМР і 13C ЯМР спектри продукту окислювальної деструкції отримували за допомогою ЯМР спектрометра Bruker Auance DPX-300. Як видно з 1 H ЯМР спектра, він в основному складається з сигналів шести атомів водню в β-D-маннуроновій кислоті. Після визначення структури кожного сигналу було відзначено, що продукт окислювальної деструкції альгінату олігосахариду головним чином складається з маннуронової кислоти. Якщо відновною кінцевою групою в положенні 1 є альдегідна група, то хімічний зсув Н-1α та Н-1β повинен бути 5,11млн.ч. і 4,81млн.ч., відповідно. Оскільки відновною кінцевою групою в положенні 1 альгінату олігосахариду є карбоксильна група, одержана окисленням з альдегідної групи, Н-1 зникає, таким чином сигнали при 5,11млн.ч. та 4,81млн ч. зникають. Як видно з 13С-ЯМР спектра, він головним чином складається з сигналів шести атомів вуглецю в β-D-маннуроновій кислоті. Після визначення структури кожного сигналу було виявлено, що молекула проміжної сполуки головним чином складається з маннуронової кислоти. У порівнянні зі спектром проміжної сполуки сигнал відновної кінцевої m m m групи С-1 маннуронової кислоти (94млн.ч.) зникає Сигнал відновної кінцевої групи С-1 (175,81млн.ч.) зсувається у напрямку нижчої області. Причина полягає в тому, що відновною кінцевою групою в положенні 1 альгінату олігосахариду є карбоксильна група, одержана окисленням альдегідної групи, і хімічний зсув С-1 змінюється від приблизно 175,81млн.ч. альдегідної групи до 94млн.ч. карбоксильної групи. 4.4 Mac-спектрометричний аналіз Mac-спектрометричний аналіз здійснювали за допомогою мас-спектрометра MALDI-TOF типу BIFLEX III від Bruker Daltonics Co. Результати представлено на Фіг.4. Як видно з Фіг.4, пік 1113,7 (m/z) представляє [M+Na]+1; пік 1113,7 (m/z) представляє [M-O+Na]+1; пік 1083,7 (m/z) представляє [M-CH2ONa]+1 ; пік 1067,6 (m/z) представляє [MCH2O-O+Na]+1; пік 1053,6 (m/z) представляє [M2(CH2O)+Na]+1; пік 979,6 (m/z) представляє [М3(СН2О)-CO2+Na]+1 і пік 921,6 (m/z) представляє [M-4(CH2O)-CO 2-CCHNa]+1. MC аналіз продукту окислювальної деструкції альгінату олігосахариду наведено в таблиці 5. Таблиця 5 MC аналіз продукту окислювальної деструкції альгінату олігосахариди Осколочний іон [M+Na]+1 [M-O+Na]+1 [M-CH2O+Na]+1 [M-O-CH 2O+Na]+1 [M-2(CH2O)+Na]+1 [M-3(CH2O)-CO 2+Na]+1 [M-4(CH2O)-CO 2-CO+Na]+1 В спектрі MALDI-TOF продукту окислювальної деструкції альгінату олігосахариду пік m/z 1113,7 представляє [M+Na]+1, що вказує на те, що молекулярна маса продукту окислювальної деструкції альгінату олігосахариду складає 1090,7. В порівнянні з альгінатом олігосахариду, що піддавався дії кислотного гідролізу, молекулярна вага збільшена на 16, тобто в молекулі додався один атом кисню, можна вважати, що в процесі виготовлення альгінат олігосахариду був окислений. Згідно з вищенаведеними результатами аналізів структура продукту окислювальної деструкції альгінату олігосахариду описується формулою (ІІa): 5. Оцінка альгінату олігосахариду для лікування хвороби Альцгеймера (AD) m/z 1113,7 1097,7 1083,7 1067,6 1053,6 979,6 921,6 Як приклад для ілюстрації активності використовували 6-мер, відокремлений на Віо-Gel-Р6 колонці. Таким чином альгінат олігосахариду згадується як "6-мер" в наступних експериментах. 5.1 Вплив 6-меру на AD у миші, викликану Αβ1-40 Мишей чоловічої статі лінії Balb/c вагою 18-22г (поставлених Laboratory Centre of Shandon University) зважували і поділяли на 6 груп: контрольна група, модельна група, група, оброблена 6мером з низькою концентрацією (15мг/кг); група, оброблена 6-мером з середньою концентрацією (30мг/кг), група, оброблена 6-мером з високою концентрацією (60мг/кг) та група, оброблена Huperzin A (HBY з концентрацією 0,2мг/кг). Мишам орально вводили відповідні ліки на 3 день після розподілення на групи. Ліки призначали один раз на день в дозі 0,5мл/20г безперервно до закінчення експерименту. Мишам з контрольної та моде 15 85226 льної груп одночасно призначали еквівалентну кількість фізіологічного розчину солі. На восьмий день після прийому ліків мишам робили ін'єкції зістареного Αβ1-40 за винятком групи, якій вводили лише наповнювач лікарської форми (без активної речовини) за методом, описаним Jhoo JH та ін. в статті "β-Amyloid (1-42)-induced learning and memory deficits in mice: involvement of oxidative burdens in the hippocampus and cerebral cortex" [Behavioural Brain Research (2004) 155: 185196], для створення моделі AD. Розчин зістареного Αβ1-40 вводили в правий церебральний шлуночок. Результати пробних досліджень з використанням водного лабіринту Моріса показали, що миші, оброблені Αβ, продемонстрували більш тривалий час затримки між стимулом і реакцією (Р