Способи визначення вмісту поліциклічних ароматичних та ароматичних вуглеводнів у продуктах, що містять харчові олії та жири

1. Спосіб визначення вмісту щонайменше одного поліциклічного ароматичного вуглеводню (ПАВ) у зразку, вибраному з харчових олій, харчових жирів і їх компонентів, що включає: (a) приготування вказаного зразка у першому розчиннику, в якому кожний вказаний ПАВ розчинний; (b) нанесення зразка зі стадії (а) на колонку для гелепроникної хроматографії (ГПХ); (c) елюювання зразка, нанесеного на стадії (b), елююючим розчинником для ГПХ, ефективним для одержання фракції, що містить вказаний ПАВ, яка по суті вільна від тригліцериду і компонентів вільних жирних кислот у вказаному зразку; (d) введення одержаної фракції без виділення у систему ГПХ/високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ), причому розчинник, в якому кожний 2 (19) 1 3 82364 4 10. Спосіб за п. 1, де елююючим розчинником для 19. Спосіб за п. 18, де вміст бензо[а]пірену у вкаВЕРХ є градієнт розчинника, який містить змінюзаному зразку менший ніж 10 ррb. вані співвідношення води та ацетонітрилу. 20. Спосіб за п. 18, де вміст бензо[а]пірену у вка11. Спосіб за п. 3, де вміст бензо[а]пірену у вказазаному зразку менший ніж 5 ppb. ному зразку менший ніж 1 ppb. 21. Спосіб за п. 18, де із зразка продукту виділя12. Спосіб за п. 3, де вміст бензо[а]пірену у вказають щонайменше 99 % бензо[a]пірену. ному зразку менший ніж 0,1 ppb. 22. Спосіб визначення вмісту ароматичних вугле13. Спосіб за п. 1, де із зразка продукту виділяють воднів у зразку, вибраному з харчових олій, харчощонайменше 99 % вказаного ПАВ. вих жирів і їх компонентів, що включає: 14. Спосіб за п. 1, де стадію (d) введення і стадію приготування вказаного зразка у першому розчин(е) перенесення починають автоматично програмнику, який вибирають з ТГФ, ацетонітрилу або їх ним регулюванням механізму, що перемикає класуміші; пан. нанесення приготованого зразка на колонку для 15. Спосіб за п. 4, де детектування включає переГПХ; микання автоматичним способом флуоресцентноелюювання нанесеного на колонку зразка за дого детектора на довжини хвиль для кожного вказапомогою ТГФ, з одержанням фракції, що містить ного ПАВ при заздалегідь визначеному ВЕРХ часі ароматичний вуглеводень та по суті вільна від утримування для вказаного ПАВ. тригліцериду і компонентів вільних жирних кислот 16. Спосіб за п. 1, де зразок продукту як ПАВ може вказаного зразка, та містити щонайменше 10 різних ПАВ. визначення вмісту ароматичних вуглеводнів у 17. Спосіб за п. 1, де зразок продукту як ПАВ може фракції за допомогою УФ поглинання. містити щонайменше 20 різних ПАВ. 23. Спосіб за п. 22, що додатково включає стадію 18. Спосіб визначення вмісту бензо[а]пірену у зраоцінки рівня забруднення рідким паливом у вказазку, вибраному з харчових олій, харчових жирів і їх ному зразку за допомогою окремо проведеної кокомпонентів, що включає: реляції між рівнем рідкого палива та інтенсивністю приготування вказаного зразка у суміші розчинниУФ поглинання фракції. ків, яка містить ТГФ, ацетонітрил або їх суміш; 24. Спосіб за п. 22, де першим розчинником є аценанесення приготованого зразка на колонку для тонітрил, і спосіб додатково включає екстракцію ГПХ; вказаного зразка ацетонітрилом. елюювання нанесеного на колонку зразка за до25. Спосіб за п. 22, де вказана фракція ароматичпомогою ТГФ, з одержанням фракції, яка містить них вуглеводнів містить один або більше компонеароматичний вуглеводень та по суті вільна від нтів, вибраних з бензолу, толуолу, етилбензолу, тригліцериду і компонентів вільних жирних кислот ксилолу, нафталіну, метилнафталінів, фенантрену вказаного зразка, і і аценафтену. вимірювання флуоресцентного поглинання вказа26. Спосіб за п. 22, де вміст ароматичних вуглевоної фракції при довжинах хвиль, характеристичних днів у фракції менший ніж 5 ppm. для бензо[а]пірену. Даний винахід стосується аналізу ароматичних вуглеводнів, зокрема, поліциклічних ароматичних вуглеводнів (ПАВ) таких, як бензо[а]пірен (БаП), у харчових оліях, харчови х жирах і споріднених продуктах, таких як дистиляти даних матеріалів. Особливо він стосується способу і апаратури для такого аналізу із застосуванням розташованих лінійно гель-проникаючої хроматографії (ГПХ)/високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ). Описуються визначення суб-ppb рівнів ПАВ і визначення багатьох ПАВ одночасно. Присутність поліциклічних ароматичних вуглеводнів (ПАВ) у харчови х оліях і жирах, наприклад, соняшниковій олії, кокосовій олії, пальмовій олії і т.д., приводить до високих аналітичних витрат при переробці даних матеріалів. Джерело такого забруднення включає в себе сушіння прямим нагріванням з повітрям, яке містить газоподібні продукти згоряння. Використання сушіння копри безпосереднім обігрівом являє собою основне джерело ПАВ, присутніх у сирій кокосовій олії, яка може включати рівні ПАВ, що перевищують 2000мкг/кг. Очищення олії знижує вміст індивідуальних ПАВ до рівня мкг/кг. Визначення і регулювання ПАВ у харчови х оліях і жирах дуже важливе, оскільки багато ПАВ являють собою сильні канцерогени. FEDIOL (Federation del'Industrie d'Huilerie de la Communaute Europeene) затвердило межу у 25ppb (25мкг/кг) для суми ПАВ, 5ppb для важких ПАВ (п'ять і більше кілець) і 1ppb для БаП (бензо[а]пірен) у харчових жирах і оліях. Вказані олії можуть також містити моноциклічні ароматичні вуглеводні (наприклад, бензол, толуол і ксилоли) внаслідок забруднення рідким паливом, яке також звичайно містить значні рівні (приблизно 10000м.ч.) нижчих ПАВ (нафталін, метилнафталін, фенантрен і аценафтен). Звичайно забруднення рідким паливом визначають за допомогою ГХ/МС (газова хроматографія/мас-спектрометрія) визначення аліфатичних вугле воднів. Однак визначений процент даних аліфатичних вуглеводнів природним чином вже присутній у харчових оліях. Відповідно, визначення рівнів рідкого палива за допомогою аналізу ароматичних вуглеводнів, які не присутні у харчовій олії, але представляють близько 35% більшості рідких палив, як очікується, дасть більш правильні результати. 5 82364 6 Пропонувалося багато способів для аналізу ТГФ/ацетонітрил або вода/ацетонітрил. "Розчинбензо[а]пірену (Б[а]П або БаП) та інших поліцикліник, в якому ПАВ мають низьку розчинність," являє чних ароматичних вуглеводнів (ПАВ) у харчових собою, переважно, розчинник, в якому вони розоліях і жирах. Вони звичайно включають в себе чинні менш, ніж на 5%. Такі розчинники включають одну або більше стадій екстракції, збагачення зрав себе від 95:5 до 100:0 вода/ацетонітрил. зка і/або очищення з подальшим кількісним аналіПереважно, даний спосіб здійснюють автомазом, використовуючи Г Х (газову хроматографію) тичним чином. Зокрема, стадії введення і перенеабо ВЕРХ. Способи екстракції, що звичайно застосення, переважно, починають автоматично при совуються для відділення ПАВ від ліпідів, включапрограмному регулюванні механізму перемикання ють розподіл у розчиннику, комплексоутворення з клапана. кофеїном і омилення, за яким часто йде "очищенВ одному варіанті здійснення даного способу ня" для видалення інших компонентів, що потенстадія елюювання включає: прокачування ГПХ ційно заважають, на колонці з силікагелем [дивись розчинника через ГПХ колонку за допомогою перогляд Moret і Conte, 2000, і посилання у ньому]. шого насоса з виходом до джерела при атмосфеДивись також, наприклад, [Sengupta et al. 1093; рному тиску, який може бути детектором за індекMoret et al. 1996, 1998, 2002; Perrin et al. 1993; сом рефракції (IP), і, окремо, прокачування ВЕРХ Vaessen et al. 1988; Myojyo et al. 1995; Germuska et розчинника або суміші розчинників, звичайно виal. 2000; і Cejpek et al. 1995; всі згадані вище]. Прокористовуючи окремий (другий) насос, через петтокол, затверджений FEDIOL, для визначення БаП лю для введення проби і звідти через ВЕРХ колону харчови х оліях поданий у прикладах. ку; стадія введення включає: прокачування ГПХ Більшість з вказаних способів є тривалими (до розчинника, що містить ПАВ, використовуючи пе24 годин або більше), дорогими і часто приводять рший насос, і розчинника, в якому ПАВ мають нидо втрати речовини, що аналізується, і/або забрузьку розчинність, звичайно використовуючи др угий днення зразка, даючи погану відтворюваність. Кінасос, через трійник для змішування у петлю для лькість часу, необхідного для аналізу, також привведення проби з виходом на IP детектор або інше водить до необхідності тривалого зберігання джерело при атмосферному тиску з обведенням великої кількості матеріалу при очікуванні резульВЕРХ колонки; і стадії перенесення та елюювання татів аналізу. включають: прокачування розчинника, в якому Відповідно, існує необхідність забезпечення ПАВ мають низьку розчинність, і потім ВЕРХ розбільш ефективних засобів аналізу таких матеріалів чинника, звичайно використовуючи другий насос, з точки зору часу, вартості і використання матерічерез петлю для введення проби і звідти через алу, так само як і способів, які відтворюються і ВЕРХ колонку. точні при низьких рівнях виявлення. ПАВ можуть бути вибрані з групи, що складаУ першому аспекті, даний винахід забезпечує ється з нафталіну, метилнафталіну, флуорену, спосіб для визначення рівня, щонайменше, одного аценафтену, аценафтилену, фенатрену, антрацеполіциклічного ароматичного вуглеводню (ПАВ) у ну, флуорантену, пірену, бензо[а]антрацену, хризразку, вибраному з харчових олій, харчових жирів зену, бензо[а]флуорантену, бензо[b]флуорантену, і їх компонентів, наприклад, жирних кислот. Даний бензо[k]флуорантену, бензо[а]пірену, бенспосіб включає стадії: зо[ghi]перилену, дибензо[ап]антрацену, індеодержання зразка у першому розчиннику, в но[1,2,3-ссі]пірену, бензо[е]пірену, перилену, бенякому ПАВ розчинний/нні; зоперилену, антантрену, коронену та їх комбінації. нанесення зразка на колонку для гельВ окремих варіантах здійснення ПАВ вибирають з проникаючої хроматографії (ГПХ) та елюювання бензо[b]флуорантену, бензо[k]флуорантену, бензразка ГПХ елююючим розчинником, ефективним зо[а]пірену, бензо[ghi]перилену, дибендля одержання фракції, що містить ПАВ, яка, по зо[аh]антрацену, індено[1,2,3-сd]пірену, бенсуті, вільна від таких компонентів зразка як триглізо[е]пірену, перилену, антантрену, коронену та їх церид і вільна жирна кислота; комбінації. В одному варіанті здійснення визначавведення фракції, без виділення, у ГПХ/ВЕРХ ють єдиний ПАВ, наприклад, бензо[а]пірен. систему, де до фракції додається розчинник, в Перша суміш розчинників, переважно, містить якому ПАВ мають низьку розчинність; тетрагідрофуран (ТГФ); приклад являє собою суперенесення фракції, без виділення, на колонміш ТГФ і ацетонітрилу, переважно, у співвідноку для високоефективної рідинної хроматографії шенні 70:30 або більше, наприклад, приблизно від (ВЕРХ) з оберненою фазою; 70:30 до 75:25. Елююючий ГПХ розчинник, переелюювання фракції спочатку розчинником, в важно, являє собою ТГФ. "Розчинник, в якому ПАВ якому ПАВ мають низьку розчинність; мають низьку розчинність," являє собою, переважокреме елюювання кожного ПАВ, що детектуно, від 95:5 до 100:0 вода/ацетонітрил. ВЕРХ ють, з ВЕРХ колонки ВЕРХ елююючим розчинниелююючий розчинник звичайно являє собою градіком; єнт розчинника, що містить співвідношення води і детектування, щонайменше, одного вказаного ацетонітрилу, що змінюються. ПАВ, звичайно за допомогою флуоресцентного Діставання ПАВ зі зразка становить звичайно, детектування при довжині/ах хвилі, характерній щонайменше, 99%. Даний спосіб може бути викодля вказаного ПАВ, і ристаний для детектування ПАВ, переважно, бенвизначення рівня, щонайменше, одного вказазо[а]пірену, присутнього у зразку при рівні, менш ного ПАВ у зразку. ніж 1ppb, переважно, при рівнях, менш ніж 0,5ppb, Використовуваний тут термін "розчинник" моі більш переважно, при рівнях, менш ніж 0,1ppb же бути сумішшю розчинників, наприклад, (0,1мкг на кг). 7 82364 8 В одному варіанті здійснення для детектуванз рівнем БаП 55мкг/кг з елююванням бення множини ПАВ детектування включає перемизо[а]пірену (і всіх П АВ) протягом приблизно 9,7 кання флуоресцентного детектора на довжини хвилин; хвиль детектування, характерні для кожного ПАВ, Фіг.2 показує калібрувальну криву для БаП у що детектують, при заданому ВЕРХ часі утримумоделі кокосової олії, приготованій за сімома ставання для ПАВ автоматичним чином. Даний спосіб ндартами, що відрізняються за концентрацією від може бути використаний для визначення, щонай12 до 123мкг/кг (ppb); менше, 10 різних ПАВ у зразку або, в інших варіаФіг.3 показує ГПХ хроматограми (накладені), нтах здійснення, для визначення, щонайменше, 20 використані для аналізу бензо[а]пірену у трьох різних ПАВ у зразку. зразках кокосової олії; У відповідному аспекті, даний винахід забезФіг.4 показує накладення ГПХ хроматограм печує швидкий спосіб "за відбитками пальців" для семи стандартів рідкого палива, приготованих завизначення рівня бензо[а]пірену у зразку, вибрабрудненням пальмової олії чистим дизельним паному з харчових олій, харчових жирів і їх компонеливом у концентраціях, що змінюються від 2 до нтів, причому даний спосіб включає: 85мкг/г (ppm); одержання зразка у суміші розчинників, що міФіг.5 являє собою лінійну калібрувальну криву стить ТГФ або ацетонітрил; м.ч. рідкого палива від поглинання при 226нм, нанесення зразка на колонку для гельодержану за допомогою даних Фіг.4; проникаючої хроматографії (ГПХ); Фіг.6А-В являють собою схематичні діаграми елюювання зразка за допомогою ТГФ, ефекінтерфейсу, що перемикає розчинник, у робочому тивного для одержання фракції, що містить ароположенні та у положенні введення проби, відпоматичний вуглеводень, яка, по суті, вільна від тавідно; ких компонентів зразка, як тригліцерид і вільна Фіг.6С являє собою схематичну діаграму розжирна кислота; і ташованої лінійно ГПХ/ВЕРХ системи з інтерфейвимірювання флуоресцентного поглинання сом, що перемикає розчинник, у робочому полоданої фракції при довжині(ах) хвилі, характерній женні (відповідно до Фіг.6А); для бензо[а]пірену, наприклад, 378нм збудженФіг.7 являє собою графік, що порівнює рівні ня/403нм випромінювання. Даний спосіб може бубензо[а]пірену, виміряні у декількох зразках, вити використаний для детектування бензо[а]пірену значені двома комерційними лабораторіями, і віду зразку при рівнях, менш ніж 10ppb і, переважно, повідно до варіанту здійснення даного винаходу; менш ніж 5ppb. Діставання бензо[а]пірену з вказаФіг.8 являє собою ВЕРХ хроматограму, що поного зразка становить переважно, щонайменше, казує розділення різних ПАВ у зразку сирої коко99%. сової олії, одержану за допомогою розташованої Даний винахід також забезпечує спосіб для лінійно ГПХ/ВЕРХ. визначення рівня ароматичних вуглеводнів у таФіг.9 являє собою ВЕРХ хроматограму станкому зразку, причому даний спосіб включає: дарту, що містить 34м.ч. рідкого палива у сирій одержання зразка у першому розчиннику, що пальмовій олії, одержану за допомогою розташомістить ТГФ або ацетонітрил; ваної лінійно ГПХ/ВЕРХ, використовуючи один нанесення зразка на колонку для гельнабір частот детектування для детектування БаП; і проникаючої хроматографії (ГПХ); Фіг.10 являє собою ВЕРХ хроматограму, що елюювання зразка за допомогою ТГФ, ефекпоказує розділення множини ПАВ у зразку харчотивного для одержання фракції, що містить арової олії, одержану за допомогою розташованої матичний вуглеводень, яка, по суті, вільна від талінійно ГПХ/ВЕРХ, використовуючи програмне ких компонентів зразка, як тригліцерид і вільна перемикання частоти детектування для кожного жирна кислота; і детектування рівня ароматичних компонента ПАВ. вуглеводнів у даній фракції за допомогою УФ поДаний винахід забезпечує способи детектуглинання. Звичайно даний спосіб додатково місвання низьких рівнів ароматичних вуглеводнів, тить стадію оцінки рівня забруднення рідким пализокрема бензо[а]пірену і/або інших ПАВ, у сирих і вом у зразку, що базується на окремо визначеній очищених харчових оліях і жирах, так само як і у кореляції між рівнем рідкого палива та інтенсивніспоріднених продуктах, таких як жирні кислоти, стю УФ поглинання фракції. одержані з таких олій і жирів. Дані способи викориКоли перший розчинник являє собою ацетоністовують гель-проникаючу хроматографію (ГПХ), трил, даний спосіб додатково включає екстракцію одну або у комбінації з високоефективною рідинзразка ацетонітрилом, і екстракт зразка наносять ною хроматографією з оберненою фазою (ОФна ГПХ колонку. Елююючий розчинник звичайно ВЕРХ). являє собою ТГФ. Фракція ароматичних вуглеводІ. Сполуки, що аналізуються нів може містити один або більше компонентів, Поліциклічні ароматичні вуглеводні (ПАВ) яввибраних з бензолу, толуолу, етилбензолу, ксилоляють собою органічні сполуки, що містять два або лів, нафталіну, метилнафталінів, фенантрену і більше конденсованих карбоциклічних ароматичаценафтену. них кілець. Вказані сполуки являють собою реЦі та інші цілі і ознаки даного винаходу стануть зультат геохімічних процесів і є також частими більш очевидними після читання подальшого допобічними продуктами неповного згоряння або кладного опису винаходу нарівні з відповідними піролізу органічної речовини. Багато з них відомі кресленнями. як канцерогени. їх можна класифікувати як легкі Фіг.1 показує результат ГПХ (гель-проникаюча ПАВ, що мають від дво х до чо тирьох, звичайно три хроматографія) аналізу зразка сирої кокосової олії або чотири, ароматичних кілець, або важкі ПАВ, 9 82364 10 що мають п'ять або більше конденсованих кілець. групи, як пальмітил, стеарил, міристил і т.д., і звиПерший клас включає в себе, наприклад, нафтачайно також включають фракцію вільних жирних лін, флуорен, аценафтен, аценафтилен, фенаткислот (ВЖК). Харчові олії, харчові жири і їх комрен, антрацен, флуорантен, пірен, бенпоненти, такі як ВЖК, можуть називатися тут разо[а]антрацен і хризен. Останній клас включає в зом як "продукти, що містять харчові олії". себе, наприклад, бензо[а]флуорантен, бенУ сирій кокосовій олії, яка являє собою типову зо[b]флуорантен, бензо[k]флуорантен, бенхарчову олію, середня молекулярна маса триглізо[а]пірен, бeнзo[ghi]пepилeн, дибенцеридного компонента дорівнює 674, і середня зо[аh]антрацен, індено[1,2,3-сd]пірен, молекулярна маса компонента вільних жирних бензо[е]пірен, перилен, антантрен і коронен. Покислот (ВЖК), які, насамперед, являють собою відомлялося, що бензо[а]пірен є найбільш канцеС12 жирні кислоти, дорівнює 200. Середня молерогенним з відомих ПАВ. кулярна маса тригліцеридних компонентів інших Серед вказаних сполук наступні з'явилися у типових харчових олій дорівнює наступному: пасписку FEDIOL : льмова олія, 850; соєва олія, 875; соняшникова - Фенантрен олія, 879; рапсова олія, 880; бавовняна олія, 860; і - Антрацен кукурудзяна олія, 887. - Флуорантен Описані тут способи є прийнятними для будь- Пірен якої матриці, яка досить розчинна у розчинни- Бензо[а]антрацен ку(ах), що використовується для відділення аро- Хризен матичного вуглеводневого компонента від компо- Бензо[е]пірен нентів матриці, що залишилися, за допомогою - Перилен ГПХ, як описано нижче, і чиї компоненти достатньо - Бензо[а]пірен відділяються від ароматичного компонента за до- Дибензо[аh]антрацен помогою описаного ГПХ способу. Матриці, що ма- Бензоперилен ють неповну розчинність у даному розчиннику, - Антантрен також можуть бути використані, як описано у роз- Коронен ділі НІС нижче, де сполуку, що аналізується, екстБудь-які інші ПАВ, які бажано детектувати, тарагують з матриці. Такі типові матриці можуть кож можуть бути детектовані за допомогою спосовключати в себе, наприклад, компоненти харчових бів, описаних тут, якщо час утримування і довжиолій, такі як жирні кислоти, та інші харчові продукна(ни) хвилі детектування відомі або визначені ти, які можуть бути заздалегідь оброблені для видля вибраної сполуки. Даний спосіб може бути далення білків або будь-яких інших компонентів, використаний для детектування алкілзаміщених що заважають. Інші вуглеводеньвмісні матриці, ПАВ, таких як метилнафталін. такі як нехарчові масла, палива і мастильні матеРідкі палива являють собою складні суміші алріали, також розглядаються. канів, алкенів, циклоалканів і ароматичних вуглеIII. Аналітичні способи: ГПХ воднів і також включають в себе невеликий проА. Виділення ароматичних вуглеводнів з матцент сірко-, азот- і кисневмісних сполук. риць за допомогою ГПХ Гель-проникаюча хромаАроматичні сполуки представляють за оцінкою тографія (ГПХ) являє собою різновид рідинної 35% рідких палив і звичайно включають в себе хроматографії, в якій молекули розділяються за бензол, толуол, етилбензол і ксилоли, відомі, задопомогою обміну, що повторюється, між розчингалом, як БТЕК. Рідкі палива також містять приником рухомої фази і розчинником у нерухомій близно 15000м.ч. (1,5%) ПАВ, з яких нафталін, рідкій фазі у порах наповнювача колонки. Діапазон метилнафталіни, фенантрен і аценафтен становрозміру пор матеріалу, що заповнює, визначає лять приблизно 10000м.ч. (1,0%). Оскільки БТЕК, діапазон молекулярних розмірів, в якому може ПАВ і актовані ПАВ, всі присутні у рідких паливах, проходити розділення. Загалом, великі молекули є небезпечними компонентами, оцінка токсичності виключаються з деяких або всіх пористих матриць і підтвердження забруднення рідким паливом опнаповнювача внаслідок їх фізичного розміру, та тимально базувалися б на аналізі вказаних аромаелююються з колонки раніше більш дрібних молетичних сполук краще, ніж на аналізі насичених кул, які мають можливість проникати у більший вуглеводнів, як у звичайній практиці. Крім того, як процент пор заповненої розчинником матриці. ГПХ вказано вище, вказані ароматичні компоненти не розділення також залежить від реального тривиміприсутні природним чином у харчових оліях на рного розміру або форми молекули; таким чином, відміну від насичених вуглеводнів. молекули, що мають близьку молекулярну масу, II. Ма триці але різні форми, часто можуть бути розділені, і Матеріали, що аналізуються способами, опимолекули, що мають різну молекулярну масу, але саними тут, звичайно являють собою харчові жири близькі форми, можуть елююватися разом. або олії, які можуть бути рослинного походження, У випадку харчови х олій повне розділення між включаючи наприклад, кукурудзяну олію, кокосову тригліцеридами, ВЖК і ароматичними вуглеводолію, соняшникову олію, пальмову олію, сафлоронями може бути досягнуто за допомогою ГПХ, як ву олію і продукти какао, або тваринного похоописано тут. Оскільки ароматичні сполуки подібні дження, включаючи наприклад, сало, жир або риза формою, вони звичайно елююються разом, неб'ячий жир. Вказані матеріали, в основному, зважаючи на різницю у молекулярній масі. складаються з різних змішаних тригліцеридів (ТГ); ГПХ колонки комерційно доступні у різноманіттобто жирних алкілових складних триефірів гліценості характеристик за молекулярною масою. Для рину, де жирні алкільні компоненти включають такі даних застосувань розділення проводять на аналі 11 82364 12 тичній колонці, що має відносно низький ефективтенденцію бути сильно флуоресцентними на відний діапазон за молекулярною масою, наприклад, міну від компонентів матриці. Окреме детектуванвід 0 до 1000. Переважний матеріал наповнювача ня за індексом рефракції може бути використане колонки являє собою зшитий полістирол або стидля визначення сумарного введеного зразка, оскірол-дивінілбензольний співполімер (СДВБ). Однільки вихідний сигнал IP детектора залежить тільки від кількості зразка. Тому використання внутрішєю з таких колонок є колонка Waters StyragelÒ-HR нього стандарту не є необхідним. Переважно, коли 0,5 (4,3мм внутрішній діаметр x 300мм; 5мк розмір частинок). Інші відповідні колонки доступні з різних компоненти матриці також легко розчинні у розчинниках зразка і елюювання. джерел, наприклад, [Polymer Laboratoies Inc. або Як вказано вище, ПАВ звичайно елююються Jasco Corporation]. разом у ГПХ процесі харчових олій або подібних Було виявлено, що робота при злегка підвиматриць. Оскільки кожний ПАВ має різні максимущеній постійній температурі поліпшує відтворюваність результатів ГПХ, і також приводить до кращої ми довжин хвиль збудження і випромінювання, флуоресцентне детектування може бути встановрозчинності зразків і меншого тиску у колонці. Пелене для конкретної сполуки, такої як БаП, як пореважно підтримувати температуру колонки приказано на Фіг.1. близно 40°С під час розділення за допомогою заБуло знайдено, що приблизно вісім інших ПАВ стосування термостата колонки. В. Швидкий аналіз "за відбитками пальців" за сполук дають деякий рівень перешкод на БаП при даній установці, як описано у прикладі 1 нижче. допомогою ГПХ Антрацен являє собою єдину сполуку з них, що Відповідно до одного варіанту здійснення видає потенційно значну кількість перешкод при данаходу аналіз "за відбитками пальців" одного ПАВ, них довжинах хвиль. переважне бензо[а]пірену, у сирій олії може проводитися за приблизно 15 хвилин або менше з Фіг.1 показує результати ГПХ аналізу зразка сирої кокосової олії, що має рівень БаП 55мкг/кг, з межею виявлення приблизно 5мкг/кг. У типовому елююванням БаП (і всіх ПАВ) при приблизно 9,7 аналізі олію розчиняють у відповідному розчиннихвилин. Первинні компоненти харчової олії, ТГ і ку, наприклад, суміші ТГФ/ацетонітрил, фільтруВЖК, не детектуються флуоресцентним детектоють через 0,20мкм шприц-фільтр, вводять у систему колонки ГПХ та елююють, переважно ТГФ. ром, як вказано вище. Однак, було помічено, що при використанні детектора за індексом рефракції, Для розчинення зразка і для елюювання виковони елююються при приблизно 6,7 і 7,4 хвилин, ристовують розчинники або суміші розчинників, в відповідно. яких всі речовини, що аналізуються, легко розчиЩоб одержати калібрувальну криву для матняються. Типовим розчинником є ТГФ. Було знайдено, що використання суміші ТГФ:ацетонітрил у риці кокосової олії, були приготовані сім БаП стандартів у діапазоні концентрацій від 12 до 123мкг/кг. співвідношенні приблизно 5:2 за об'ємом для приКалібрувальна крива (одержана з використанням готування зразка і ТГФ для елюювання збільшує програми Cargill Instrument Performance Monitoring) розрізнення і різкість піка ПАВ відносно зразка, показана на Фіг.2. приготованого в одному ТГФ. Дане співвідношення, переважно, лежить між приблизно 70:30 і Три зразки сирої кокосової олії були проаналізовані на БаП з використанням даного ГПХ спосо75:25. Можуть бути використані більш високі частбу. Було зроблено дванадцять дублікатних пробіки ТГФ, наприклад 80% або 90%, до 100% ТГФ, гів, і результати порівнювали з аналізами хоча різкість піка може зменшитися. Великі кільконезалежних лабораторій. Результати, наведені у сті ацетонітрилу не рекомендуються через знижену розчинність сполук, що аналізуються. таблиці 1, показують низьке стандартне відхилення для ГПХ способу і прийнятну згоду із зовнішніФлуоресцентне детектування переважне для ми аналізами. детектування ПАВ, оскільки дані сполуки мають Таблиця 1 Зразок № Б[а]П концентрація, визначена зовнішньою лабораторією Б[а]П концентрація за ГПХ, середнє значення Стандартне відхилення За бажанням, може бути одержана окрема БаП калібрувальна крива для різних матриць у практиці даного ГПХ аналізу, оскільки різні матриці можуть містити різні ПАВ у різних пропорціях. Однак, було показано, що калібрувальна крива, одержана для матриці кокосової олії, дає точні результати при аналізі сирої соняшникової олії. Аналіз трьох зразків соняшникової олії на БаП з рівнями нижче приблизно 10мкг/кг з використанням калібрувальної кривої, одержаної для кокосової олії, показав хорошу кореляцію з кількісними даними зовнішньої лабораторії. Фіг.3 показує накладені хроматограми для даних трьох зразків, де 1 9,5мкг/кг 9,3мкг/кг 0,4 2 21,7мкг/кг 20,4мкг/кг 0,9 3 73,0мкг/кг 70,8мкг/кг 1,1 дані зразки за визначенням зовнішньої лабораторії містять, відповідно, 5,3, 6,3 і 8,9мкг/кг БаП. Визначення за допомогою даного методу з використанням калібрувальної кривої, одержаної для матриці кокосової олії, дало рівні 5,7, 6,4 і 8,1мкг/кг, відповідно. Показано, що вказаний спосіб швидкого аналізу має високу відтворюваність, хоча визначення БаП може залежати від присутності антрацену. Межа виявлення для БаП при використанні даного способу становить приблизно 5ppb (мкг/кг). С. ГПХ аналіз забруднення рідким паливом детектуванням нижчих ароматичних вуглеводнів 13 82364 14 Для аналізу нижчих ароматичних вуглеводнів, харчової олії. Вказані стандарти аналізували після таких як БТЕК (бензол, толуол, етилбензол і ксивідпрацювання, описаного вище (збовтування з лоли), використовують УФ детектування у діапаацетонітрилом), використаного для приготування зоні довжин хвиль 200-750нм. Вказані сполуки зразків. звичайно елююються приблизно разом у ГПХ анаУ сирій пальмовій олії, використаній для прилізі і можуть детектуватися при довжині хвилі приготування стандартів, було знайдено за допомоблизно 226нм. гою зовнішньої комерційної лабораторії згідно з Для посилення детектування вказаних сполук AOCS способом 6мкг/г (6м.ч.) аліфатични х вуглеу харчовій олійній матриці може бути бажано збіводнів. Оскільки незабруднена пальмова олія місльшити їх концентрацію екстракцією матриці ацетить приблизно від 4 до 20м.ч. аліфатичних вуглетонітрилом. Тригліцериди слабо розчинні в ацетоводнів, цю олію прийняли як вільну від нітрилі, тоді як різні ароматичні сполуки у рідкому забруднення рідким паливом на основі даного випаливі (і вільні жирні кислоти) розчинні. Екстракцію значення. проводять збовтуванням суміші сирої олії і ацетоФіг.4 показує накладення ГПХ хроматограм нітрилу (наприклад, один грам олії на 6мл розчинсеми стандартів з УФ детектуванням при 226нм. В ника) протягом декількох секунд і відстоюванням умовах аналізу ароматичні сполуки елюювалися суміші. Ацетонітрильну (верхню) фазу відділяють, при приблизно 12,2 хвилини. фільтрують (наприклад, через 0,45мкм шприцевий Лінійна калібрувальна крива м.ч. рідкого палифільтр) у пробовідбірну пробірку і використовують ва від поглинання при 226нм (Фіг.5) була одержадля введення у ГПХ систему. Дана обробка звина за даними стандартами з використанням Cargill чайно збільшує концентрацію сполук, що аналізуInstrument Performance Monitoring software. Така ються, у матриці харчової олії приблизно у 25 ракалібрувальна крива дає кореляцію між рівнем зів. ТГФ переважний для елюювання зразка. ароматичних вуглеводнів, що визначається за УФ Чисте дизельне паливо (B.C.R. Standard поглинанням, і м.ч. рідкого палива для рідкого па№106, Community Bureau of Reference, Bruxelles) лива складу, подібного використаному для приговикористовували для приготування семи стандартування стандартів. тів рідкого палива у сирій пальмовій олії у діапазоВідтворюваність ГПХ способу для забрудненні концентрацій від 2 до 85мкг/м. Даний діапазон ня рідким паливом тестували, використовуючи концентрацій включає в себе рідке паливо у коншість повторів трьох різних стандартів. Результати центрації 25м.ч., визначеній за угодою між виробподані у таблиці 2. Було знайдено, що межа виявниками як максимальний рівень забруднення рідлення даного способу становить приблизно 2м.ч. ким паливом, прийнятним для виробництва Таблиця 2 Концентрація дизельного палива у стандарті, м.ч. Середнє значення (мкг/г) шести аналізів IV. Аналітичні способи: розташована лінійно ГПХ/ВЕРХ А. Рівень техніки, апаратура і загальний спосіб Розділення сполук за допомогою ВЕРХ, так само як і за допомогою інших різновидів рідкої хроматографії, базується на взаємодії між сполуками, розчиненими у рухомій фазі, і нерухомою фазою, тобто твердим наповнювачем колонки. Рушійна сила розділення полягає у різниці ентальпій взаємодії різних компонентів (сполук, рухомої фази і нерухомої фази). Хроматографія з оберненою фазою (ОФ), яка використовує неполярну (гідрофобну) нерухому фазу і полярну р ухому фазу, є переважною для даних розділень. В ОФВЕРХ первинні взаємодії відповідають за утримування і розділенню не ковалентних асоціацій неполярних компонентів (сполук, що аналізуються, або їх неполярних компонентів і нерухомої фази) у полярному середовищі. Типові рухомі фази, що використовуються в ОФ-ВЕРХ, являють собою водні розчини замінних агентів, таких як ацетонітрил або 1-пропанол. Речовини, що звичайно аналізуються, елююють градієнтом рухомої фази, в якій концентрація замінного агента поступово збільшується. ОФ-ВЕРХ адсорбенти, що найбільш широко використовуються, у даній галузі базуються на діоксиді кремнію, модифікованому вуглеводнем, 15 15,7±0,5 53 53,9±0,6 85 84,5±0,9 звичайно діоксиді кремнію, модифікованому октадецильними (С18) групами. Такі колонки можуть бути позначені як ОДК (октадецил діоксид кремнію) колонки, і багато таких колонок комерційно доступно; наприклад, Waters Bondapack C18. Колонки, що містять діоксид кремнію, зв'язаний з алкілфенілом, також описані як придатні для розділення хімічних сполук, включаючи ПАВ [наприклад, Faizy et al., патент США №5993653]. Для елюювання використовують градієнт розчинників, що складається з полярних розчинників. Типовий градієнт містить ацетонітрил і воду, хоча інші полярні елююючі розчинники, наприклад метанол або етилацетат, також можуть бути використані. Через сильну флуоресценцію, що демонструється більшістю ПАВ, які аналізуються, переважний спектрофлуорометричний детектор. ПАВ фракція, одержана за допомогою ГПХ відділення від матричних компонентів, таких як ТГ і ВЖК, у матриці харчової олії, як описано вище, по суті, вільна від тригліцеридів і ВЖК. "По суті, вільна" означає, що фракція вільна від будь-якого ТГ або ВЖК компонента, що детектують (наприклад, спектрофотометричними детекторами, з'єднаними з апаратом). Вказану фракцію лінійно переносять, тобто без виділення фракції або видалення з апарату, у ВЕРХ систему за допомогою ГПХ-ВЕРХ інтерфейсу. 15 82364 16 Типовий інтерфейс, такий як позначений 10 на працює при атмосферному тиску. Відповідно, тиск Фіг.6А-В, включає в себе перемикальний механізм на ГПХ колонці залишається, по суті, постійним. 12 для введення проби, такої як Rheodyne автомаПісля введення проби (приблизно 1 хвилина) тичний шестипозиційний потоковий процесор, установка клапанів повертається у звичайне потрійник для змішування 14 і петлю 16 для введенложення (Фіг.6А) і вміст петлі 16 для введення ня проби, що переважно має об'єм 2мл. Схематипроби переноситься у ВЕРХ колонку. Через присучне зображення компонентів розташованої лінійно тність доданої води у зразку ПАВ, що аналізуютьГПХ-ВЕРХ системи з інтерфейсом у режимі роздіся, більше не є розчинними і осаджуються у верхлення (як описано нижче) показане на Фіг.6С. ній частині ВЕРХ колонки. ПАВ спочатку елююють, Однією з функцій, що виконуються інтерфейвикористовуючи "не-розчинник", як описано вище, сом, є перемикання розчинників між ГПХ і ВЕРХ з подальшим програмованим градієнтом розчинсистемами. Як описано вище, розчинники, в яких ника, ефективним для роздільного елюювання ПАВ добре розчинні, такі як ТГФ, є переважними кожного ПАВ, що детектують, з ВЕРХ колонки. для ГПХ відділення від інших компонентів матриці. Таким чином, послідовність операцій у типоУ типовому ГПХ відділенні слідових кількостей вому перемиканні розташованого лінійно ГПХПАВ у зразку харчової олії фракцію ПАВ одержуВЕРХ інтерфейсу, яке, переважно, здійснюється ють у приблизно 0,3мл ТГФ. Пряме введення вкаавтоматичним способом, є наступною. заної фракції у ВЕРХ колонку звичайно приводить (1) ГПХ фаза (Фіг.6А): ГП Х розчинник прокадо швидкого елюювання ПАВ, по суті, одним піком. чують через ГПХ колонку (ГПХ насос, не показаДля розділення на колонці для ВЕРХ з оберненою ний) з виходом на IP детектор або інше джерело фазою застосовують, як вказано вище, градієнт при атмосферному тиску; окремо ВЕРХ градієнт полярного розчинника. або "не-розчинник" прокачують (ВЕРХ насос) чеСпарена ГПХ-ВЕРХ система описана у літерарез петлю 16 для введення проби і ВЕРХ колонку. турі. Деякі застосовують подібні розчинники у двох (2) Фаза введення проби (Фіг.6В): ГПХ розчинсистемах (наприклад, Winkle 1990; De Vries 1989), ник, що містить сполуки, що аналізуються (ГПХ так що перемикання розчинника не потрібне. У насос), і "не-розчинник" (ВЕРХ насос) прокачують випадках, коли застосовуються різні розчинники, через трійник для змішування 14 у петлю 16 для контакт ГПХ розчинника з ВЕРХ колонкою описувведення проби з виходом на IP детектор або інше ють як проблематичний. Дивись, наприклад, [Kraak джерело при атмосферному тиску; ВЕРХ колонку et al. 1986 або van Stijn et al. 1996], які відмічають обходять. Введення проби, переважно, здійснюподібну проблему у ДАКХ (донорно-акцепторна ється протягом програмованого або заданого пекомплексна хроматографія)-ВЕРХ спареній систеріоду часу, наприклад, одну хвилину. мі. Kraak et al. вирішили дану проблему у системі (3) Фаза, що розділяє (Фіг.6А): "Не-розчинник" і для видалення білків зі зразків плазми введенням потім ВЕРХ градієнт прокачують через петлю 16 попередньої колонки для адсорбції сполук, щодля введення проби (ВЕРХ насос), переносячи аналізуються, з ГПХ розчинника і потім вивільненвміст у ВЕРХ колонку для елюювання. ня їх у ВЕРХ р ухому фазу. [Williams et al. (1989)] Перемикання від фази (1) до (2) і від (2) до (3), описують спосіб, в якому ГПХ елюат у ТГФ безпепереважно, виконується автоматично (тобто без рервно розбавляється водою, і вибрана фракція необхідності дій оператора) за допомогою програпереноситься в ОФ-ВЕРХ колонку у воді. Дана много регулювання механізму 12 перемикання система описана як така, що має межі виявлення введення проби. Даний пристрій програмується приблизно 50ppb. таким чином, щоб перемикати у режим введення У даний системі, як вказано вище, ГПХ здійспроби (Фіг.6) після заданого часу після введення нюється в органічному розчиннику, такому як ТГФ, проби; цей заданий час базується на заданому тоді як для ВЕРХ розділення звичайно застосовучасі(ах) утримування ГПХ сполук, що аналізуютьється система водного розчинника. Відповідно, ся. Даний пристрій потім автоматично перемикаводний розчинник (наприклад, розчинник, що ється у режим розділення (Фіг.6А) після заданого складається переважно з води) додають до зразка часу введення проби, наприклад, одна хвилина. в інтерфейсі, який містить пристрій перемикання В. Кількісний аналіз бензо[а]пірену за допомоклапанів. Вказаний розчинник являє собою розгою ГПХ-ВЕРХ В одному аспекті даний винахід чинник, в якому ПАВ, що детектують, мають низьку забезпечує спосіб точного визначення єдиного розчинність (що також називається "неПАВ, такого як бензо[а]пірен, у складних матрицях, розчинник"), наприклад, від 95:5 до 100:0 вотаких як харчові олії і жири. Даний спосіб застосода/ацетонітрил. У режимі введення проби, як покавує тандемну, розташовану лінійно ГПХ-ВЕРХ для зано на Фіг.6В, фракція ПАВ у ТГФ (що звичайно виділення і/або кількісного визначення речовини, має об'єм приблизно 0,3мл, як вказано вище) зміщо аналізується. Стадію ГПХ розділення, таку як шується з таким розчинником при, по суті, такому описана вище для швидкого "за відбитками пальж об'ємі і швидкості потоку за допомогою трійника ців" аналізу БаП, використовували як стадію попедля змішування 14 і переноситься у петлю 16 для реднього очищення у даному способі. Застосуванвведення проби. ня ВЕРХ дає можливість виявити "важкі" ПАВ, які Іншою функцією інтерфейсу є захист ГПХ козвичайно не можуть бути виявлені за допомогою лонки від швидких змін тиску, коли зразок ввоспособів газової хроматографії (ГХ) через термічдиться у ВЕРХ-систему. Під час введення проби, не розкладання. Даний спосіб має межу виявлення як показано на Фіг.6В, і ГПХ ТГФ потік і потік ВЕРХ приблизно 0,01мкг/кг і може бути здійснений за вода/ацетонітрил надходять на IP детектор, який приблизно 45 хвилин або менше. 17 82364 18 Як додатково описано нижче, даний винахід же умовах, і результати порівняли з аналізами також забезпечує спосіб точного визначення мнодвох незалежних лабораторій. Передбачалося, що жини ПАВ в одному аналізі. Визначення 20 різних дані лабораторії застосують звичайний протокол, ПАВ виконується за приблизно 100 хвилин або затверджений для визначення рівнів БаП у харчоменше, як описано нижче у розділі D. вих оліях, який представлений нижче як порівняВ ілюстрації ГПХ-ВЕРХ способу для кількіснольний приклад. Як зазначалося вище, вказаний го визначення БаП готували стандарти, що містять звичайний протокол набагато менш ефективний за БаП (Alltech Chemie) з рівнями у діапазоні від 1 до часом, працею і матеріалами, ніж даний описаний 80ppb в очищеній кокосовій олії. Умови, описані спосіб. нижче у прикладі 3, включаючи програму градієнЯк показано у таблиці 3 нижче і графічно на та, знайдену особливо ефективною для виділення Фіг.7, спосіб даного винаходу давав хорошу відпобензо[а]пірену, застосували для ВЕРХ розділення. відність до комерційного тестування. Зразки з №1Калібрувальна крива була одержана для різ12 були зразками кокосової олії, тоді як зразки від них стандартів з подальшими десятьма повторни13 до 15 були соняшниковими оліями, показуючи, ми вимірюваннями 30ppb стандарту. що даний спосіб може бути використаний з різниСереднє значення концентрації БаП, одержами матрицями харчових олій. не з десяти повторних вимірювань 30ppb стандарВказана таблиця також показує величини, ту, становило 29,61ppb зі стандартним відхиленодержані тільки при ГПХ, які часто знаходяться у ням 0,58ppb. хорошій відповідності до більш кількісного спосоУ додатковій ілюстрації способу рівні БаП у бу. декількох природних зразках проаналізували у тих Таблиця 3 Зразок № 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Зразок опис Кокосова олія Кокосова олія Кокосова олія Кокосова олія Кокосова олія Кокосова олія Кокосова олія Кокосова олія Кокосова олія Кокосова олія Кокосова олія Кокосова олія Соняшникова олія Соняшникова олія Соняшникова олія Комерційна лабора- Комерційна лабора- ГПХ і ВЕРХ у лінії торія 1 торія 2 БаП рівень, ppb 15 15 62 63 27 22 23 49 43 41 15 11 10 26 18 19 23 20 92 86 83 15 12 35 36 21 36 35 36 5,3 5,7 6,3 6,6 8,9 8,1 ГПХ одна 23 42 13 21 79 5,7 6,4 У таблиці 4 представлені додаткові порівняльні дані, у цей раз зразки очищеної кокосової олії для аналізу мали рівень БаП, менший ніж 3,0ppb. Таблиця 4 Зразок № 16 17 18 19 20 21 22 23 Комерційна лабораторія 1 0,50 0,00 0,00 0,00 0,20 0,00 На Фіг.8 показане розділення різних ПАВ у зразку сирої кокосової олії з використанням ГПХ/ВЕРХ, як описано вище, з флуоресцентним детектором при 378нм/403нм, як описано у прикладі 3. ВЕРХ градієнт розчинника, показаний у Комерційна, лабораторія 2 БаП рівень у ppb 2,50 1,20 ГПХ і ВЕРХ у лінії 2,50 1,10 0,58 0,24 0,55 0,18 0,34 0,22 прикладі 3, оптимізували для відділення БаП від інших компонентів. У даному прикладі одержували хороше розділення з елююванням БаП у 51,3 хвилини. Сумарний час аналізу, включаючи підготовку зразка, становив приблизно 80 хвилин. За бажан 19 82364 20 ням, градієнт розчинника можна варіювати, щоб 75,50 0,50 0 100 оптимізувати виділення інших окремих ПАВ спо90,00 0,50 0 100 лук. С. ГПХ-ВЕРХ аналіз складної суміші ПАВ: Речовини, що визначають, детектували метовстановлення простого детектування дом флуоресценції при 244/375нм (збудженАроматичні сполуки, виділені з матриці харчоня/випромінювання). вої олії за допомогою ГПХ для визначення забрудСім стандартів, одержаних, як описано у рознень рідким паливом, як описано вище у розділі ділі lllС, що мають від 2 до 85м.ч. рідкого палива у НІС, можуть бути додатково проаналізовані розсирій пальмовій олії, аналізували за допомогою ташованою лінійно ВЕРХ. Для ілюстрації даного ГПХ/ВЕРХ. Фіг.9 показує вихід флуоресцентного способу фракції ГПХ, що містять ароматичні вугдетектування фракції, що містить 34м.ч. рідкого леводні, одержані, як описано у розділі lllС, аналіпалива. Як показано, ВЕРХ часи утримування мезували на метилнафталін, аценафтен і фенанттилнафталіну, аценафтен у і фенатрену становили рен, які являють собою домінуючі ПАВ у рідкому 59,5хв., 60,0хв. і 62,0 хв., відповідно. паливі. Інтерфейс і ВЕРХ апаратура були такі ж, як Одержали калібрувальну криву м.ч. рідкого описані вище у матеріалах і способах. Використопалива від рівня даних трьох ПАВ, і криву викорисвували наступну програму градієнтного елюювантовували для встановлення м.ч. рідкого палива у ня: декількох комерційних зразках при аналізі даних трьох ПАВ розташованої лінійно ГПХ/ВЕРХ. РеПотік, Ацетонітрил 5:95 ACN/вода зультати, включаючи результати, одержані тільки Час, хв. мл/хв. (%) (%) ГПХ, представлені у таблиці 5. 0,00 0,50 0 100 Як показано, при даних низьких рівнях комер9,50 0,50 0 100 ційні результати, одержані при аналізі аліфатичних вуглеводнів, мають тенденцію бути значно 11,40 0,30 0 100 більш високими, ніж результати, одержані при 13,10 0,30 0 100 аналізі ароматичних. Як зазначено вище, це, ймо14,00 0,50 0 100 вірно, обумовлено присутністю у харчови х оліях 55,00 0,50 100 0 природних аліфатичних вуглеводнів. 75,00 0,50 100 0 Таблиця 5 Зразок № (пальмова олія) 24 25 26 27 28 ГПХ аналіз 1м.ч. 0 2 0 0 ГПХ/ВЕРХ аналіз (три ПАВ) 1,5м.ч. 1,0 3,0 0 0,2 D. ГПХ-ВЕРХ аналіз складної суміші ПАВ: встановлення множинного детектування Для оптимального детектування складної суміші ПАВ флуоресцентний детектор може бути включений на специфічну довжину хвилі, як найбільш придатну. Даний спосіб дає можливість швидко визначати рівні у складній суміші ПАВ у зразку в одному аналізі. Калібрувальні стандарти, приготовані введенням чистої олії з відомою кількістю кожного ПАВ, який потрібно визначати, можуть бути використані для визначення часу утримування і відгуку детектора для кожного ПАВ з даною встановленою колонкою і з даними умовами. Зразок, що аналізується, точно зважують і готують, як описано вище, наприклад, розчиненням у 5:2 ТГФ/ацетонітрил, фільтрацією і введенням у ГПХ колонку. Зразок елююють ТГФ, потім вводять у дозувальну петлю, як описано вище, (див. Фіг.6В), де зразок змішується з розчинником, в якому ПАВ має низьку розчинність («не-розчинник», як описано вище) наприклад, 95:5 вода/ацетонітрил. Потім, зразок переносять у колонку ВЕРХ (перемиканням назад до режиму роботи; Фіг.6А), і починається градієнтна ВЕРХ. Елюювання звичайно починається з «нерозчинника», як показано у прикладі 4 нижче. Комерційний аналіз 12м.ч. 6 9 6 7 Флуоресцентний детектор програмує на перемикання відповідної для кожного компонента (ПАВ) довжини хвилі детектування при визначеному заздалегідь часі утримування компонента. Одна така програма показана у прикладі 4 нижче. (Аценафтилен не детектується флуоресценцією, він може бути визначений вбудованим у систему УΦ детектором). Сполуки ідентифікують порівнянням часів утримування із заздалегідь введеним стандартом і кількісно визначають за вимірюванням площі піка. Як ілюстрація, зразок, що містить двадцять ПАВ, які були знайдені у харчових оліях, включаючи тринадцять ПАВ зі списку FEDIOL, аналізували за, приблизно, 100 хвилин, як описано у прикладі 4 нижче. Хроматограма типового аналізу складної суміші ПАВ з використанням декількох встановлених детекторів показана на Фіг.10. В аналізі, описаному тут, подолано багато незручностей, представлених у традиційних способах, наприклад, процедур, що вимагають багато матеріалів і часу, і ризик втрати або забруднень під час приготування зразка. Спрощення стадії очищення зразка при використанні ГПХ перед ВЕРХ аналізом зменшує ризик втрати речовини, що аналізується, або забруднення. Автоматичне 21 82364 22 введення і для складної суміші, що аналізується, колонкою 5мкм, 250x3,0мм, з PhenomenexÒ перемикання установок детектора дає можливість Security Guard CIS (ODS) передколонкою 4x3,0мм. проводити аналіз швидко і зручно. Повністю автоПриклад 1. Швидкий аналіз «відбитків пальматизованим, аналітичним, розташованим лінійно ців» Б[а]П у кокосовій олії за допомогою ГПХ способом 20 різних ПАВ (включаючи в себе 13 Зразок (приблизно 8-12 крапель) сирої кокосоFEDIOL ПАВ) можуть бути проаналізовані за 100 вої олії розчиняли у 7мл 5:2 ТГФ/ацетонітрил, і хвилин, як показано вище. Розташована лінійно розчин фільтрували через 0,20мкм шприцевий ГПХ-ВЕРХ те хнологія різко зменшує час аналізу і фільтр і вводили у Waters StyragelÒ-HR 0,5 ГПХ об'єм розчинників, що витрачаються, і може застоколонку, (4,3мм внутрішній діаметр x 300мм; 5мкм совува тися як рутинний аналіз на безперервній розмір частинок). Зразок елюювали за допомогою основі. ТГФ при швидкості потоку, що дорівнює Приклади 0,30мл/хв., і фракцію, елюйовану у, приблизно, 9,7 Наступні приклади мають на меті проілюструхвилини детектували за допомогою флуоресценвати, але не обмежити винахід. ції. Флуоресцентне детектування проводили при Матеріали і способи 378нм збудження/403нм випромінювання, специГПХ виконували на Waters StyragelÒ-HR 0,5 фічній для бензо[а]пірену. Сумарну кількість ввеГПХ колонці (4,3мм внутрішній діаметр x 300мм; деного зразка визначали одночасно за індексом 5мкм розмір частинок) з використанням ВЕРХрефракції детектування. насоса, модель 515, автосамплера, модель 717, Типова хроматограма подана на Фіг.1. Калібдиференціального рефрактометра, модель 410, рувальна крива інтенсивності флуоресценції від детектора з набором діодів, модель 996 (або інppb Б[а]П, одержана при проведенні аналогічного ший УФ детектор) і флуоресцентного детектора. аналізу семи приготованих стандартів з викорисДля області «відбитків пальців» при аналізі рідкого танням Cargill Instrument Performance Monitoring палива використовували тільки детектор з набоsoftware, подана на Фіг.2. ром фотодіодів. Флуоресценцію деяких інших ПАВ при Для ГПХ/ВЕРХ (кількісного) аналізу застосову378нм/403нм досліджували для визначення можвали ВЕРХ насос, модель 515, автосамплер, моливих перешкод при Б[а]П детектуванні. Дивись дель 717 з 250мкм петлею для зразка, диференцітаблицю 6 нижче, яка показує висоту піка відносно альний рефрактометр, модель 410, детектор з кількості сполуки для серії ПАВ (введених індивінабором діодів, модель 996, флуоресцентний дедуально) з детектування при 378нм/403нм (оптимітектор, що сканує, модель 474, градієнтний насос, зованим для детектування БаП). Як можна бачити, модель 600, Rheodyne 6-позиційний потоковий антрацен являє собою єдину сполуку, що дає пепроцесор і термостат для колонки. A Waters решкоду потенційно значної величини при вказаMillennium Chromatography manager використовуних довжинах хвиль. (Хоча бензо[k]флуорантен вали для одержання, обробки і керування хромапоглинає при вказаній довжині хвилі сильніше, ніж тографічною інформацією. ОФ-ВЕРХ використовуантрацен, він звичайно присутній у дуже низьких вана колонка була BESTER Analytical РАК (ODS) кількостях у порівнянні з антраценом). Таблиця 6 Час утримування (хв.) Легкі ПАВ Флуорен Аценафтен Фенантрен Антрацен Флуорантен Пірен Бензо[а]антрацен Хризен Важкі ПАВ Бензо[b]флуорантен Бензо[k]флуорантен Бензо[а]пірен Дибензо[ghi]перилен Дибензо[аh]антрацен Бензо[е]пірен Перилен Коронен Кількість введеного (нг) Висота піка 378нм/403нм Співвідношення висота піка/кількість 9,37 9,35 9,31 9,48 9,51 9,93 9,29 9,58 73 71 915 41 210 282 75 97 9,32 9,23 9,88 9,89 9,75 9,61 9,78 9,89 30 11 31 20 2,8 16 210 4 21350 1850 241 1280 1254 7120 94126 1870 521 8,8 0,9 17 42 64 3036 94 23 82364 24 Приклад 2. Швидкий аналіз рідкого палива у (приблизно 0,3мл) переносили у розташовану ліпальмовій олії за допомогою ГПХ нійно ВЕРХ систему Bester Analytical РАК ODS Один грам зразка сирої пальмової олії змішуколонка (5мкм розмір частинок, 259x3,0мм) з певали з 6мл ацетонітрилу, і суміш збовтували проредколонкою PhenomenexÒ Security Card C18 тягом декількох секунд і давали можливість від(ODS) (4x3,0мм) введенням за допомогою перемистоятися. Суміш фільтрували через 0,45мкм кального інтерфейсу, що складається з Rheodyne шприцевий фільтр у пробовідбірну пробірку, віддіавтоматичного шести-позиційного потокового проляли ацетонітрил як (верхню) фазу і вводили у цесора, трійника для змішування і петлі для ввеколонку ГПХ, як описано вище у прикладі 1. Зразок дення проби, що має об'єм 2мкл. Під час нормальелюювали ТГФ при швидкості потоку, що дорівнює ної операції, як показано схематично на Фіг.6А, 30мл/хв., фракцію з часом елюювання, що дорівВЕРХ розчинник (ACN/вода) прокачували через нює приблизно 12,2хв., детектували за УФ поглитрійник для змішування і петлю для введення. Під нанням при 226нм. час введення, як показано схематично на Фіг.6В, На Фіг.4 показана схема ГПХ хроматограм сефракція ПАВ у ТГФ змішувалася з ВЕРХ розчинми зразків, введених з різною кількістю чистого ником у трійнику для змішування. Потік розчиннидизельного палива і проаналізованих даним спока, що виходить, під час введення проходив RI собом. Калібрувальна крива поглинання від м.ч. детектор, який працював при атмосферному тиску. дизельного палива, одержана з використанням Відповідно, тиск у ГПХ колонці залишався, по суті, Cargill Instrument Perfomance Monitoring software, постійним. показана на Фіг.5. Після приблизно однієї хвилини інтерфейс пеПриклад 3. Кількісний аналіз бензо[а]пірену у ремикався назад до робочого режиму (Фіг.6А), і харчовій олії за допомогою ГПХ-ВЕРХ зразок елюювали, використовуючи градієнтну проРозчин ПАВ у ТГФ одержували за допомогою граму, представлену нижче: ГПХ розділення компонентів з матриці кокосової олії, як описано вище (приклад 1). Дану фракцію Таблиця 7 Час (хв.) 0,00 9,50 11,40 13,10 14,00 30,00 47,00 47,50 54,00 55,00 Потік (мл/хв.) 0,50 0,50 0,30 0,30 0,60 0,60 0,60 0,60 0,60 0,50 Розчинник А: Ацетонітрил (%) 0 0 0 0 0 100 100 0 0 0 У даних умовах, бензо[а]пірен елюювали за, приблизно, 51,3хв., і детектували за флуоресценцією при 378нм/403нм. Калібрувальну криву одержували за декількома стандартами очищеної кокосової олії, введеної з бензо[а]піреном на рівнях 180ppb. Приклад 4. Детектування складної суміші ПАВ за допомогою ГПХ-ВЕРХ при використанні програмованого детектування Калібрувальні зразки готували введенням стандартної суміші, що містить 16 ПАВ (Restek; product M-610-QC в ацетонітрилі), у чисту олію. Стандарт містив аценафтен, аценафтилен, антрацен, бензантрацен, бензо[а]пірен, бензо[b]флуорантен, бензоперилен, бензо[k] флуорантен, хризен, дибензантрацен, флуорантен, флуорен, інденопірен, нафталін, фенантрен і пірен. Бензо [а] флуорантен, бензо[е]пірен, перилeн і коронен одержували від Alltech Chemie. Стандарти готували при концентрації Б[а]П в інтервалі від 0,2 до 4,2ppb (мкг/кг). Дані зразки використовували для визначення часу утримування і відгуку детектора для кожного компонента, що аналізується. Зразки точно зважували і розчиняли у 6мл 5:2 ТГФ/ацетонітрил. Розчин фільтрували через Розчинник В: 5:95 АСN:вода (%) 100 100 100 100 100 0 0 100 100 100 0,45мкм шприцевий фільтр у пробовідбірну пробірку і використовували для введення. Переважні кількості зразка і об'єм введення для зразків різних типів подані нижче: Зразок Сира олія Дезодорована олія Дистилят Стандарти Кількість зра- Об'єм ввезка дення 0,10г 50мкл 0,20г 100мкл 0,05г 20мкл 0,20г 100мкл Використовувана апаратура описана вище у розділі матеріали і способи. ГПХ і ВЕРХ колонки підтримували при 40°С протягом всієї процедури. Об'єм 100мкл зразка вводили у ГПХ колонку і елюювали ТГФ при швидкості потоку, що дорівнює 0,30мл/хв. Після, приблизно, 11 хвилин інтерфейс перемикали на режим введення (Фіг.6В) протягом однієї хвилини. Зразок потім переносили у ВЕРХ колонку (при перемиканні назад у режим роботи; Фіг.6А) і починали ВЕРХ градієнт, показаний у таблиці 8 нижче. Флуоресцентний детектор програмували на перемикання на відповідну для детектування дов 25 82364 26 жину хвилі для кожного компонента (ПАВ) при завбудованим УФ детектором). Сполуки ідентифікуздалегідь визначеному часі утримування даного вали порівнянням часів утримування із заздалегідь компонента. Одна така програма показана у табвведеними стандартами і кількісно визначали за лиці 9 нижче. (Оскільки аценафтилен не детектувимірюванням площі піка. ється флуоресценцією, він може бути визначений Таблиця 8 Градієнт розчинника Час 0 13,0 65,0 83,0 84,0 90,0 91,0 100,0 Потік, мл/хв. 0,50 0,50 0,50 0,50 0,70 0,70 0,50 0,50 Ацетонітрил, % 0 0 100 100 0 0 0 0 95:5 вода/ацетонітрил, % 100 100 0 0 100 100 100 100 Таблиця 9 Програма час-довжина хвилі для флуоресцентного детектування Речовина, що аналізується Старт Нафталін Аценафтен Флуорен Фенатрен Антрацен Флуорантен Пірен Бензантрацен Хризен Бензо[а]флуорантен Бензо[е]пірен Бензо[b]флуорантен Перилен Бензо[k]флуорантен Бензо[а]пірен Дибензантрацен Бензоперилен Інденопірен Антантрен Коронен Час, хв. Збудження, нм 0 378 57,0 280 62,3 302 302 65,0 244 244 67,9 280 69,2 330 73,0 280 75,0 261 261 76,6 324 324 78,3 430 79,2 378 378 82,9 290 290 85,3 296 88,0 298 298 Порівняльний приклад: офіційний протокол визначення БаП у харчових оліях Наступна процедура взята з "Code of Practice on Polycyclic Aromatic Hydrocarbons" of French Society for Fat Science (FEDIOL). Принцип: відповідну кількість олії або жиру у легкому петролейному ефірі додавали на верх 22г колонки з окисом алюмінію активності 4 (здатної вмістити або втримати приблизно 600/мг олії або жиру) і бензо[а]пірен елюювали з колонки 75мл легкого петролейного ефіру. Остаточний аналіз проводили за допомогою високоефективної рідинної хроматографії з оберненою фазою, використовуючи флуорометричний детектор. Реагенти Випромінювання, нм 403 370 330 330 375 375 460 388 420 400 400 392 392 465 403 403 440 440 500 438 438 Ослабленння Посилення 256 1 8 100 32 10 128 32 10 10 8 100 2 10 - Легкий петролейний ефір або гексан, аналітичної якості, перегнаний над гранулами КОН (4г/л). - Ацетонітрил і ТГФ, LiChrsolvÒ (Merk). - Сульфат натрію, аналітичної якості, гранульований, безводний. - Окис алюмінію, активність 4 ступеню: нейтральний окис алюмінію, активність супер І, одержаний у Woelm, Eschwege, G.F.R., деактивований додаванням 10мл води до 90г окису алюмінію. Приведення до рівноваги протягом 24 годин перед використанням і зберігання у закритій посудині при кімнатній температурі. Бензо[а]пірен, одержаний у Bureau Communautaire des References (BCR), Brussel, Belgium. Приготування стандартного розчину приблизно 0,1мкг/мл у тетрагідрофурані. 27 82364 28 Апаратура Колонка: колонка з оберненою фазою для - Скляна хроматографічна колонка: 30см x ВЕРХ, Vydoc TP-RP, довжиною 25см, внутрішнім 20мм внутрішній діаметр, заповнена спеченими діаметром 4,6мм, розміром частинок 10мкм (ex дисками і верхівками PTEF. Chrompack). - Рідинний хроматограф високого тиску з флуДетектор: довжина хвилі збудження 381нм, орометричним детектором. довжина хвилі випромінювання 403нм. Очищення - Введення 15мкл стандартного розчину бен- Одержати 20% мас./об., розчину зразка олії у зо[а]пірену. легкому петролейному ефірі. - Введення 15мкл зразка. - Заповнити хроматографічну колонку до поРозрахунок ловини легким петролейним ефіром. Швидко зваПри кількості зразка, що дорівнює 400мг, кінжити 22г окису алюмінію, з активністю 4 ступеню, у цевий об'ємі фракції бензо[а]пірену дорівнює лабораторній склянці і негайно перенести окис 25мкл, використовують рівні об'єми (15мкл) зразка алюмінію у колонку. Сприяти розподілу окису і стандарту, і: алюмінію слабким постукуванням по колонці. h1 = висоті піка зразка - Додати безводний сульфат натрію на верх h2 = висоті піка стандарту колонки шаром, приблизно, 3см. с = кількості бензо[а]пірену (нг) у 15мкл стан- Відкрити верхню частину і довести рівень дарту легкого петролейного ефіру до вершини шару соρ = рівню бензо[а]пірену мкг/кг у зразку лі. - Вмістити 10мл мірну колбу під колонку. h1 ´ c 25 ´ 2,5 p= - Ввести з піпетки 2,0мл розчину олії або жиру h2 ´ 15 на колонку з мінімальним розбавленням, даючи можливість шару розчинника увійти у шар сульфаПосилання ту натрію між додатками. 1. Cejpek, K. et al., Int. J. Environmental Anal. Chem. - Елюювати колонку легким петролейним ефі61(l):65-80 (1995). ром і відкинути перші 10мл елюату. 2. Germuska, R. and Michalski, R., Central European - Зібрати наступні 75мл елюату у 100мл кругJournal of Public Health 8 (Suppl.):92-93 (2000). лодонну колбу. 3. Kraak, J.C., Int J. En viron. Anal. Chem. 25 (1-3): - Концентрувати елюат на роторному випарни209-220 (1986). ку до, приблизно, 0,5-1мл і перенести розчин у 4. Moret, S. and Conte, L.S., J. High Resolut. вигин верхньої частини мініпробірки (об'єм 2мл). Chromatogr. 21(4): 253-257 (Apr 1998). - Продовжити випаровування на водяній бані 5. Moret, S. and Conte, L.S., J. Sep. Sci. 25(1-2): 96при 35°С у потоці азоту до висушування. 100 (Jan 2002). - Розчинити осад у 25мкл тетрагідрофурану. 6. Moret, S. et al., J. Chtomatogr. A 750(1-2): 361Закрити мініпробірку шаром TeflonÒ, вмістити в 368 (25 Oct 1996). алюмінієву капсулу і зберегти для ВЕРХ з флуо7. Myoj yo, K. et al., EP632267 A1 (Jan 1995). рометричним детектором. 8. Perrin, J.L. et al., Fett Wiss. Technol. 95(2):40-51 ВЕРХ аналіз (Feb 1993). ВЕРХ обладнання складається з насоса для 9. Sengupta, P. and Sil, S., J. Oil Technol. Assoc. рідини (наприклад, Waters модель 510), пристрою India 15(3):54-55 (Jul-Sep 1983). для введення (наприклад, Waters U6K); колонки з 10. Vaessen, H.A.M.G. et al., Fresenius' Z. Anal. оберненою фазою; флуорометричного детектора Chem. 332 (4):325-332 (Nov 1988). (наприклад, Perkin Elmer 204A) та інтегратора (на11. van Stijn, F. et al., J. Chomatogr. A 750 (1-2): приклад, НР-3390А). Умови ВЕРХ наступні: 263-273 (1996). Елюент: ацетонітрил, швидкість потоку 1мл/хв. 12. Williams, R.A. et al., J. Chromatogr. 477:315-315 (1989). 29 82364 30 31 82364 32 33 Комп’ютерна в ерстка О. Гапоненко 82364 Підписне 34 Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601