Засіб для інгібування репродукції оболонкових вірусів на основі водорозчинної сполуки фулерену та спосіб його одержання

1. Засіб для інгібування репродукції оболонкових вірусів, який характеризується тим, що він є водорозчинною сполукою фулеренполікарбонових аніонів загальної де C60 - фулеренове ядро, -]n, формули C60Hn[NH(CH2)m(O) NH(CH2 )m(O)- - амінокарбоновий аніон m є цілим числом, краще 3 і 5, найкраще 5, n є цілим числом від 2 до 12, краще від 4 до 6, найкраще 6. 2. Спосіб одержання засобу за п. 1, який відрізняється тим, що в розчин фулерену в о C2 2 82528 1 3 82528 4 нуклеозидні і ненуклеозидні інгібітори зворотної стадіях його захворювання, можуть відрізнятися за транскриптази, і інгібітори протеази. При цьому антигенними властивостями і нуклеотидними складніше прогнозувати можливі негативні послідовностями. Спостерігається відмінність взаємодії різних ліків, у результаті - різко штамів у різних кліматогеографічних зонах. Це збільшується імовірність розвитку побічних реакцій ускладнює хіміотерапію, імунотерапію та і ускладнень. У таких випадках необхідний вакцинопрофілактику СНІДу. постійний моніторинг концентрації ліків у сироватці Більшість антивірусних засобів, що крові, що є дорогою процедурою. Необхідність використовувались дотепер для лікування ВПГдоповнення терапевтичного курсу препаратами, інфекцій, і які включають йодоксиурідин, цитозин, які пригнічують активність збудників супутніх арабінозу, аденінарабінозид і трифтортимідин, є інфекцій, ще більше ускладнює лікувальний речовинами, які порушують синтез вірусної ДНК. процес. Ці речовини впливають також і на подібні функції Відомі лікарські препарати дозволяють клітини-хазяїна, що призводить до проблем контролювати перебіг хвороби, але не клітинної токсичності і, як наслідок, неможливості виліковувати пацієнтів, які страждають на СНІД. систематичного використання для людей. В даний Створення лікарських засобів, які можуть час основним лікарським засобом для лікування виліковувати або, принаймні, забезпечувати інфекцій, викликаних ВПГ, є ацикловір, який має кращий захист від смертоносного вірусу сильну противірусну дію і низьку токсичність. продовжується і зв'язане як з пошуком нових Однак слабка розчинність і поява стійких до цих сполук, здатних гальмувати репродукцію вірусу за ліків вірусів обмежує застосування цього засобу. допомогою відомих механізмів, так і з розробкою Дотепер не розроблена вакцина проти нових підходів до рішення задачі. Розширюється спектр препаратів для гепатиту С, а з лікувальних препаратів відомі, в лікування хворих на ВІЛ/СНІД. На даний час на основному, інтерферон або інтерферон у стадії клінічних досліджень знаходяться наступні поєднанні з віразолом. Лікування цими препарати: емтрицитабін, DAPD (нуклеозидні препаратами характеризується високою вартістю і аналоги), каправірин, ТМС-120 (ненуклеозидні). недостатньо ефективне. Відомо, що лише 25-40% Привертають увагу також нові інгібітори протеази: людей, інфікованих ВГС, чуттєві до лікування атазанавір (зривада), типранавір, мозенавір. інтерфероном. СНІДу пов'язана в даний час зі Хіміотерапія Ведуться дослідження зі створення препаратів створенням і застосуванням інгібіторів зворотної зовсім нових класів: інгібітори інтегрази (S-1360), а транскриптази, а також інгібіторів протеази ВІЛ. також інгібітори злиття (пентафузид (Т-20 або Інгібітори зворотної транскриптази (ревертази) ВІЛ Fuzeon)), Т-1249, PRO-542, і інгібітори рецепторів мають або нуклеозидну природу: зідовудин (AZT, хемокінів (SCH-C і PRO-140). Однак результати ретровір), епівір (ЗТС, ламівудин) , відекс (ddl, випробувань неоднозначні. Так, препарат SCH-C дідіанозин), хівід (ddC, зальцитабін), зерит (d4T, викликав збільшення інтервалу QT у ЕКГ здорових ставудін), абакавір (ABC, зіаген), комбівір піддослідних при використанні максимальної дози, (зидовудін+епівір), тризивір що є вказівкою на можливі кардіологічні (абакавір+епівір+зидовудін), або ненуклеозидну: ускладнення. Інгібітори злиття є поліпептидами: Тделавірдин (рескриптор), невірапін (вірамун), 20 складається з 36 залишків природних ефавіренц (сустива), або нуклеотидну: тенофовір, амінокислот, Т-1249 - з 39. Використання цих віреад. У Росії зареєстрований вітчизняний препарат препаратів обмежено внутрішньовенним фосфазид. Ці препарати токсичні і для уведенням; у результаті прийому у деяких хворих, макроорганізму, оскільки вони втручаються в які одержували Т-20, утворювалися підшкірні геномні структури. Зворотна транскриптаза вузлики, епізодично відзначалися підшкірні здійснює синтез вірусної ДНК протягом усього інфекції й абсцеси. уваги також високополімерні Заслуговують терміну захворювання, тому інгібітори ревертази поліаніонні природні сполуки - пептидоглікани, ВІЛ необхідно використовувати довічно. декстрани, полісахариди та ін. Ці сполуки мало Інгібітори протеази ВІЛ представлені на даний токсичні і здатні адсорбувати вірусні частки та час декількома препаратами: саквинавір (інвіраза), служити ксенобіотичною «пасткою» варіонів ВІЛ. індинавір (криксиван), ритонавір (норвір), Показано, що ці речовини інгібують утворення нельфинавір (вірасепт), ампренавір (агенераза), синцитіїв, але прямого впливу цих ліків на калетра (лопинавір+ритонавір). Протеаза ВІЛ інфекційність вірусу не було встановлено відповідає за дозрівання (процесинг) вірусних [Європейські заявки 04065512 і 0467185]. У білків. Порушення прогресингу глікопротеінів відношенні сульфонованої полісечовини призводить до нездатності варіонів ВІЛ висловлене припущення [RU 2160746], що ці приєднуватися часС04-клітини. На даний до існує термін «терапія третьої речовини з молекулярною масою від 2000 до 4000 лінії» для характеристики лікування хворих на пригнічують активність ВІЛ, ВПГ і ЦМВ за ВІЛ/СНІД, у яких збудник виявився резистентним наступним механізмом: аніонні групи синтетичних щонайменше до одних ліків з кожного класу олігомерів зв'язуються з вірусом і/чи клітинною препаратів або у яких лікування з використанням мембраною і, тим самим, переривають здатність двох різних схем терапії виявилося неефективним. вірусу до реплікації. Більшість відомих найбільш небезпечних Таку високо активну антиретровірусну терапію вірусів: ВІЛ, ВПГ, ЦМВ, ВГС, вірус грипу є (ВААРТ) позначають також термінами "мега-ваарт" типовими представниками оболонкових вірусів. або "гіга-ваарт". Терапія третьої лінії включає Інфікування клітини-хазяїна оболонковими застосування одночасно чотирьох вірусами первісно ґрунтується на взаємодії.різних антиретровірусних препаратів з різними рецепторів на поверхні клітини-хазяїна з механізмами блокування репродукції ВІЛ глікопротеінами вірусу. 5 82528 6 Найбільш близькою за технічною сутністю і Потім вірусна і клітинна мембрани результатом, що досягається, є сполука Nзливаються, і вміст віриону вливається в (моногідро)фулеренамінокапронова кислота цитоплазму клітини-хазяїна. Втручання в цей HC6oNH(CH2)5COOH [RU 2124022]. Для її процес могло б запобігти первинній взаємодії одержання до розчину фулерену в о-діхлорбензолі вірусу і клітини-хазяїна і наступному злиттю, а додають водний розчин калієвої солі також гальмувати формування варіонів. амінокапронової кислоти і 18-краун-6. Реакційну У патенті [WO 95/199491995] уперше була масу перемішують 6-8 годин при 60°С. Потім показана можливість впливу однією сполукою на розчинники відганяють, залишок обробляють дві мішені: на протеазу і зворотну транскриптазу насиченим розчином хлористого калію, і залишок ВІЛ. У патенті [RU 2196602] уперше фулеренової похідної промивають водою. Вихід запропонований спосіб одночасного інгібування цільового продукту кількісний. Отримана Nреплікації ВІЛ і ЦМВ-інфекції. Інгібування (моногідро)-фулеренамінокапронова кислота здійснювали за механізмом блокування активного розчинна в диметилсульфоксиді, сайта на молекулі протеази і зворотної диметилформаміді, піридині. Недоліками даного синтезу є: умови реакції транскриптази, і пізнього структурного білка gВ взаємодії фулерену С60 і калієвої солі ЦМВ людини. В обох патентах використовували амінокапронової кислоти в двофазній системі похідні однієї сполуки - фулерену. приводять до збільшення часу процесу, крім того, Останнім часом біологічна активність використовуваний як солюбілізатор 18-краун-6 має фулеренів привертає увагу в зв'язку з можливістю високу вартість. застосування їх у боротьбі проти вірусів. Основна Вихід цільового продукту малий і складає не перешкода на шляху створення лікувальних більше 5% від маси витраченого на синтез препаратів зв'язана з нерозчинністю фулеренів у фулерену. воді, що утруднює пряме їх введення в організм У всіх описаних раніше патентах були людини. отримані продукти -моносполуки амінокислот і Відомі способи одержання водорозчинних пептидів з фулереном. Однак фулерени мають форм фулерену за рахунок утворення адукта з велике число еквівалентних реакційних центрів за полівінілпіролідоном [Kiselev O.I. et al. // Моl. подвійними зв'язками, що дає можливість Materials. 1998. V.ll. P.121; Piotrovsky L.B. et al. // утворення продуктів полісполук. ibidem. 2000. V.13. P.41]. Показана його Метою даного винаходу є створення засобу на ефективність проти вірусу грипу А- і В-типу. основі фулеренполікарбонових аніонів для Відомий також спосіб одержання фулеренів, пригнічення активності оболонкових вірусів при який включає змішування попередньо розчинених лікуванні захворювань, спричинених цими в органічному розчиннику фулеренів з полімерною вірусами. Для вирішення поставленої задачі матрицею в хлороформі, випарювання суміші під запропонована група винаходів, об'єднаних вакуумом до повного видалення розчинників, єдиним винахідницьким задумом: засіб, який є розчинення отриманого комплексу у фосфатносполукою фулеренполікарбонового аніону, спосіб сольовому буфері (рН 7,4-7,6) з наступною його одержання, фармацевтична композиція, яка обробкою продукту ультразвуком [RU 5 2162819, включає зазначений засіб і спосіб інгібування 2001]. При цьому як водорозчинну полімерну реплікації оболонкових вірусів. Сутність винаходу матрицю використовують мембранні кефаліни. полягає в рішенні зазначеної задачі в засобі для Продукти, отримані в результаті таких інгібування репродукції оболонкових вірусів, який є модифікацій, є нестійкими сполуками, водні водорозчинною сполукою фулеренполікарбонових розчини яких є суспензіями, що обмежує аніонів загальної формули можливість їхнього застосування і зберігання. C60Hn[NH(CH2)m(O)O-]n, Перспективним напрямком є створення де С60 - фулеренове ядро, водорозчинних похідних фулерену хімічним NH(СН2 )m(О)О- - амінокарбоновий аніон, синтезом. Аналогами даного винаходу є сполуки, і m дорівнює цілому числу, бажано 3 і 5, способи їх отримання, описані в патентах [WO найкраще 5, n дорівнює цілому числу від 2 до 12, 95/19949, RU 2196602, RU 152124022, US бажано від 4 до 6, найкраще 6. 6613771]. Поставлена задача вирішується також у Відома сполука, яка містить водорозчинну способі одержання засобу для інгібування похідну фулерену з загальною формулою C60репродукції оболонкових вірусів, у якому в розчин Х= НОС(О)(СН2)2С(O)NH(CH2)2 [WO 95/19949, фулерену в о-дихлорбензолі вносять амінокислоту 1995, US 6613771, 2003]. Як замісники у вигляді калієвої натрієвої або солі, далі додають використовуються будь-які алкілові або арил солюбілізатор, обраний із групи алкілові замісники, зокрема ті, котрі заміщаються поліалкіленоксидів: поліетиленгліколі мол маси від азотом або киснем, і містить від 1 до 20 атомів 150 до 400 і вище, а також диметилові ефіри вуглецю. Однак дана сполука має низьку поліетиленгліколів, або 18-краун-6, при цьому розчинність у воді, рівну 1 мг/мл, і спосіб його кількість амінокислоти повинна перевищувати одержання складний. У патенті [RU 2196602] запропонований спосіб кількість фулерену більше ніж у 50 разів, а синтез інгібування репродукції ВІЛ і ЦМВ-інфекції за проводять за температури 60-80°С. допомогою сполук на основі амінокислотних і Для вирішення поставленої задачі також дипептидних похідних фулерену. Як амінокислотні запропонована фармацевтична композиція для похідні фулерену використані натрієві солі інгібування репродукції оболонкових вірусів, яка фулеренмоноамінокапронової і містить водорозчинну сполуку фулеренмоноаміномасляної кислот. 7 82528 8 Співвідношення фулерену й амінокислоти за фулеренполікарбонових аніонів загальної даним винаходом збільшено більше ніж у 50 разів. формули При співвідношенні менше ніж у 50 разів виходять С60Hn[NH(CH2)mC(O)O-]n, сполуки з меншою розчинністю у воді і високою де С60 - фулеренове ядро, токсичністю. NH(СН2 )m(О)O- - амінокарбоновий аніон, Оптимальна температура проведення синтезу m дорівнює цілому числу, бажано 3 і 5, - +(60-80)°С. найкраще 5, Перетворення в бажану фармацевтично n дорівнює цілому числу від 2 до 12, бажано прийнятну сіль, особливо натрієву або калієву, від 4 до 6, найкраще 6 може виконуватися шляхом обробки кислоти в ефективній кількості і фармацевтично придатною основою. Зокрема, нерозчинна у воді прийнятні наповнювачі. Фармацевтична фулеренполікарбонова кислота перетворюється в композиція для інгібування репродукції кращі фармацевтично прийнятні солі, такі як оболонкових вірусів виконана у формі таблеток, натрієва сіль, розчинні у воді. капсул, розчину для ін'єкцій, супозиторіїв. Вихід цільового продукту складає не менше У способі інгібування репродукції оболонкових 150 % від узятого фулерену. Цільовий продукт вірусів використовують охарактеризовану вище даного винаходу характеризується стабільністю фармацевтичну композицію для пригнічення сполуки, вміст у цільовому продукті основної вірусів при лікуванні захворювань, викликаних речовини складає більше 90%. ВІЛ/СНІД, герпес-інфекціями, вірусним гепатитом Сполуки формули (1) - тверді, темно-коричневі С. кристалічні речовини, без запаху, розчинні у воді в У результаті взаємодії фулерену із сіллю сольовій формі і не розчинні у воді в кислотній амінокислоти в середовищі органічного формі. Натрієві солі заявлених сполук при розчинника в присутності поліалкіленоксиду розчиненні у воді утворюють непрозорі розчини отримані водорозчинні фулеренполікарбонові насиченого червоно-коричневого кольору. аніони загальної формули (1). Натрієві солі сполук формули (1) розчинні в льодяній оцтовій кислоті, не розчинні в 96% спирті, С60Hn[NH(CH2)mC(O)O-]n (1) о-дихлорбензолі, толуолі й ацетоні. У кислотній формі заявлені сполуки добре розчиняються в де С60 - фулеренове ядро, DMSO (Приклад 1). NH(CH2 )mC(O)O- - амінокарбоновий аніон, πι Сполуки формули (1) при 400°С і вище дорівнює цілому числу, бажано 5, згоряють повністю на відміну від фулерену, який n дорівнює цілому числу від 2 до 12, бажано при температурі 420°С плавиться. від 4 до 6. Наприклад: Методом ІЧ-спектрометрії в області 399С60H2[NH(CH2)3C(O)O-]2 фулерен-ди4000см-1 підтверджена дійсність заявлених сполук аміномасляний аніон формули (1): збіг за малюнком і наявністю смуг С60H2[NH(CH2)5C(O)O-]2 фулерен-дипоглинання з фулереном склало більше 90%, з амінокалроновий аніон амінокислотою - не менше 80%, відтворюваність у С60H4[NH(CH2)5C(O)O-]4 фулерен-тетрасинтезах - не менш 80%. Для похідних фулерену, амінокапроновий аніон які відрізняються амінокислотними радикалами, С60H6[NH(CH2)5C(O)O-]6 є - фулерен-гексатакої подібності не встановлено (Приклад 2). амінокапроновий аніон Особливістю будови отриманих сполук є С60H6[NH(CH2)7C(O)O-]6 -фулерен-гекса-8наявність у молекулі декількох карбоксильних амінооктановий аніон груп, які залежно від рН середовища, знаходяться Молекулярна вага пов'язана зі значенням піт або в сольовій, або в кислотній формі, виявляючи отриманих сполук: буферні властивості. рН переходу заявлених при n=4 і m=5 С60H4[NH(CH2)5C(O)O-]4 сполук у розчинений стан - 5,0-6,0. (фулерен-тетра-аміно-капроновий аніон) TCX виконувалася на силікагелі 60F254 фірми дорівнює 1240г. "Merck". Найкращі результати з розділення при n=6 і m=5 С60H6[NH(CH2)5C(O)O-]6 є компонентів були отримані із системою елюентів: (фулерен-гекса-аміно-капроновий аніон) EtOH-бензол-Н2О 4:1:1,5. У системі було виявлено дорівнює 1500г. 3 плями з Rf рівні 0,82, 0,71 і 0,47 для похідної Для одержання засобу до розчину фулерену в фулерену з амінокапроновою кислотою, по одній о-дихлорбензолі (толуолі або будь-якому іншому плямі з амінооктановою (Rf=0,82) і аміномасляною прийнятному органічному розчиннику) вносять (Rf=0,47). Проба з нінгідрином показала відсутність амінокислоту у вигляді солі (калієвої або у продукті сполук з первинною аміногрупою натрієвої), потім додають солюбілізатор. Порядок (Приклад 3). внесення в реакційне середовище амінокислоти і 1 Н і 13С-ЯМР спектри розчинів сполук формули солюбілізатора не важливий, можна вносити їх у (1) у дейтрованих розчинниках з різною вигляді комплексу, попередньо змішавши. Як сольватуючою здатністю зняті при 20°С на приладі солюбілізатор використовують різні WM-200 з робочою частотою 200,13МГц за 1Н та поліалкіленоксиди: поліетиленгліколі мол маси від 50,32МГц за 13С. 150 до 400, і вище 400 (наприклад, ПЕГ-1500), а 13 також поліетиленгліколі, які мають заміщені кінцеві С-ЯМР (d, D2O): 25,2 (СН2СН2С(О)О-), 25,4 групи (наприклад, поліетиленгліколь диметиловий (СН2(СН2)2С(О)О-), 26,8 (СН2С(О)О-), 69,5 ефір мол маси 500) або циклічна сполука (CH2NH), 130-160 (С60), 183,7 (С(О)О-). (наприклад, 18-краун-6 для калієвих солей). 9 82528 10 культурі і у присутності препарату. У той же час, у Н-ЯМР (d, CD3OD): 1,16д (1Н, J=6,0Гц, -NH-), присутності заявлених сполук у вивчених 1,26; 1,45 і 1,65 (3м, 1Н, 2Н, 3Н відповідно, -(СН2)3концентраціях (1 і 10мкг/мл) профілі ), 2,18; 2,23 (2с, 0,2Н, -ΝΗ...), 2,34т (2Н, J=7,2Гц, вірусінфікованих клітин за інтенсивністю і СН2С(О)О-), 2,94 ушир.т. (0,4Н, J=6,0Гц, J=1,8 Гц, спектром смуг відповідають контрольній культурі. NCH2-), 3,6м (1Н, J=1,8Гц, J=6,0Гц, С60Н). 1 Інші похідні фулерену: з аміномасляною і 8Н -ЯМР (d, DMSO-d6): 1,02д (0,4Н, J=6,0Гц, амінооктановою кислотами показали NH-), 1,22; 1,32 і 1,52 (3м, 6Н, -(СН2)3-), 1,90; 2,08 противірусну активність у відношенні ВІЛ-1 нижчу (2с, 0,3Η кожен, -ΝΗ...), 2,20т (2Н, J=7,2Гц, в порівнянні з амінокапроновою (Приклад 4). СН2С(О)О-), 2,68кв. (2Н, -NCH2-), 7,46м; 8,17с Заявлена сполука: натрієва сіль (0,5Н кожний, С60Н), 12,08уш.с (1Н, -С(О)ОН)). 1 фулеренполіамінокапронової кислоти в Н -ЯМР (d, D2O): 1,25м; 1,49м (2Н, 4Н, концентрації 10мкг/мл забезпечувала повний відповідно, J=7,8Гц, J=6,9Гц, -(СН2)3-), 1,88д (0,1Н, захист культури клітин, які перевиваються, нирок J=1,6Гц, -NH...), 1,89д (0,1Н, J=5,5Гц, -NH...), 2,05д мавп (VERO) і фібробластів ембріона людини (М(0,1Н, J=1,6Гц, -NH...), 2,24т (2Н, J=7,3Гц, 21) від цитодеструктивної дії вірусу простого СН2С(О)О-), 2,82уш.т (1,5Н, J=1,6 Гц, J=7,5Гц, герпеса (ВПГ-1), узятого в дозі 100 ТЦД50 через 48 NCH2-), 3,49м; (1Н, J=5,5Гц, С60Н). годин після зараження клітинних культур. Наступні властивості запропонованих сполук Протягом того ж часу в контрольних інфікованих зумовлені клітинних культурах, які не зазнали впливу присутністю фулеренового ядра в молекулі. запропонованих сполук, відбувалася 100% Велика кількість ізольованих кратних зв'язків загибель клітин. Сполуки формули (1) - похідні дозволяє вважати фулерен поліолефіновою фулерену з різними амінокислотами системою. Для нього найбільш типове приєднання відрізняються противірусною активністю у по кратному зв'язку. Він легко приєднує відношенні ВПГ-1 (Приклад 5). Оцінку нуклеофіли і вільні радикали, що уможливлює противірусної активності сполук формули (1) використання подібних речовин як антиоксидантів. проводили на експериментальній моделі інфекції, Технічний результат винаходу полягає в тому, викликаній ВГС у культурах клітин нирок, які що створено новий клас сполук перевиваються, ембріона свині (СНЕВ). У роботі фулеpенполікарбонових аніонів загальної використовували цитопатогенний штам вірусу формули (1) за рахунок нуклеофільного гепатиту С, який відноситься до генотипу 1b, у дозі приєднання до фулерену амінокислоти за кількома 10 ТЦД50. Так, натрієва сіль подвійними зв'язками в кількості двох і більше фулеренполіамінокапронової кислоти в амінокислот. Сполуки характеризуються новими концентрації 100мкг/мл забезпечувала 100% властивостями, відмінними від фулерену, кращою життєздатність ВГС-інфікованих клітин на 7-ий розчинністю у воді на відміну від аналогів, що день після зараження. Отримані результати забезпечує високу ефективність дії на інфіковані показали, що препарат у концентрації до клітини і низьку токсичність заявлених сполук. 100мкг/мл не має цитотоксичних властивостей для Особливістю сполук, що заявляються, є культур клітин СНЕВ. У той же час, у культурах широкий спектр противірусної активності у клітин, інфікованих ВГС, уже до 4-го дня відношенні різних вірусів, патогенних для людини, розвивалися цитопатогенні явища, які уражали 30у тому числі ВІЛ, ВПГ, ВГС. 40% моношару, а до 7-го дня, як правило, усі ВГСВ експериментах показано, що при всіх інфіковані клітини гинули. Препарат виявив досліджених способах зараження клітин під дією аналогічну активність і у випадку, коли ВГСсполук формули (1) відбуваються інгібування інфіковані клітини були оброблені препаратом вірусіндукованої цитопатичної дії і зниження рівня через 24-години після зараження. Однак антигену вірусу в культуральній рідині. Так, найбільшу противірусну активність препарат препарат натрієва сіль проявляє при внесенні його одночасно з вірусом: фулеренполіамінокапронової кислоти в титри вірусу в культурах гальмування проліферації Встановлено ефект клітин СНЕВ знижувалися концентрації 1мкг/мл забезпечував повний захист клітин Іg при концентрації препарату 100мкг/мл і на 7,4 епітеліальної карциноми, що лімфобластоїдних клітин людини, які перевиваються, (Приклад 6). Нер2 під впливом 3,0 Іg - 50мкг/мл людини перевиваються, МТ-4 від вірусної цитопатичної дії заявлених сполук. Так, натрієва сіль (ЦПД) ВІЛ-1, узятого в дозі 100 ТЦД50 до 7-10 доби фулеренполіамінокапронової кислоти в спостереження після зараження клітинних культур. концентраціях 10, 50 і 100мкг/мл (найбільш При концентрації препарату 10мкг/мл вірус у виражено при 100мкг/мл) гальмує утворення культуральному середовищі не визначався. При моношару ракових клітин Нер2, що може бути цих концентраціях і вище (до 100мкг/мл) відображенням її впливу на мітотичну активність. цитотоксичної дії препарату на клітини не Гальмування проліферації підтверджена виявлено. Показана відсутність впливу заявлених зниженням швидкості формування моношару, сполук у вивчених концентраціях 1, 10 і 100мкг/мл меншою кількістю білків у пробах, які містять на біосинтетичні процеси в культурі клітин препарат, і зниженням у них кількості нуклеїнових лімфоцитів протягом 96-ти годин, встановлене кислот. Отримано дані, які свідчать про відсутність методом електрофорезу білків і нуклеїнових індукції апоптозу під впливом препарату: не кислот у 12,5% ПААГ з фарбуванням нітрату зафіксовано фрагментації ДНК, не виявлено срібла за відсутністю змін білкових і нуклеїнових перерозподілу розчинної і мембранної форм профілів. У клітинах, інфікованих вірусом мРНК, що свідчить про можливість Fas-залежного імунодефіциту людини, після 24-48 годин апоптозу (Приклад 7). культивування профілі слабші, ніж у нормальній 1 11 82528 12 Фармацевтично готові форми препаратів Можливі поєднання сполук формули (1) з сполук формули (1) можуть бути виконані у іншими антивірусними агентами, лікарській формі для орального або імуномодуляторами, протиінфекційними агентами парентерального призначення для терапії чи або вакцинами в різних комбінаціях з будь-якими профілактики вірусних інфекцій і станів, при яких фармацевтичними сполуками, призначеними для показане застосування антиоксидантів і антидотів. лікування. На Фіг.1 представлений спектр натрієвої солі Сполуки змішують зі звичайними фулеренполіамінокапронової кислоти на ІЧфармацевтичними носіями і ексцепієнтами і спектрометрі «AVATAR 320-FT.IR», NICOLET, використовують у формі таблеток, капсул, свічок, США, із програмним забезпеченням EZ OMNIC, мазей, розчинів для ін'єкцій і т.і. Композиції, які NICOLET, США. включають сполуки формули (1), містять На Фіг.2.1 - підтвердження справжності приблизно 0,1-90% від маси активної сполуки, натрієвої солі фулеренполіамінокапронової найкраще 0,5-10%. Сполуки даного винаходу кислоти методом ІЧ-спектрометрії за допомогою можуть застосовуватися орально, парентерально програмного забезпечення EZ OMNIC, NICOLET, або ректально, включаючи традиційні нетоксичні США (наявність фулеренового ядра). фармацевтично прийнятні носії, стимулятори і На Фіг.2.2 - підтвердження справжності допоміжні агенти. Такі фармацевтичні композиції натрієвої солі фулеренполіамінокапронової можуть випускатися у вигляді орально кислоти методом ІЧ-спектрометрії за допомогою застосовуваних капсул або таблеток; стерильних програмного забезпечення EZ OMNIC, NICOLET, препаратів для ін'єкцій або свічок. Для орального США (амінокапронова кислота). застосування у вигляді капсул і таблеток На Фіг.3 - ІЧ-спектри і смуги поглинання зразків композиції готують відповідно до методів, широко натрієвої солі фулеренполіамінокапронової відомих в області приготування фармацевтичних кислоти, виконані на ІЧ-спектрометрі «AVATAR рецептур, і вони можуть містити мікрокристалічну 320-FT.IR», NICOLET, США, із програмним целюлозу, крохмаль для забезпечення маси, забезпеченням EZ OMNIC, NICOLET, США. стеарат магнію і лактозу і/чи інші ексципієнти, На Фіг.4 - ІЧ-спектри і смуги поглинання зразків зв'язуючі речовини, розширювачі, дезінтегратори, фулеренполіамінокапронової і розріджувачі і змащуючі речовини, відомі у даній фулеренполіаміномасляної кислот, виконані на ІЧгалузі. Розчини для ін'єкцій можуть формуватися спектрометрі «AVATAR 320-FT.IR», NICOLET, відповідно до відомих методів, з використанням США, із програмним забезпеченням EZ OMNIC, нетоксичних, розріджувачів або розчинників, для NICOLET, США. На Фіг.5 - ТСХ сполук формули (1). Показано парентерального застосування таких як маніт, 1,3три плями з Rf 0,82 0,71, 0,47 для зразків натрієвої бутандіол, вода, розчин Рінгера або ізотонічний солі фулеренполіамінокапронової кислоти (АККрозчин хлористого натрію. При ректальному 15, АКК-21, АКК-22 - зазначені номери синтезів), застосуванні у вигляді свічок такі композиції для натрієвої солі фулеренполіаміномасляної можуть готуватися шляхом змішування ліків з кислоти (АМК) - Rf=0,47, для натрієвої солі таким не подразнюючим ексцепієнтом, як какао фулеренполіамінооктанової кислоти (АОК) олія, синтетичні гліцеридні складні ефіри або Rf=0,82, фулерен залишився на старті. поліетиленгліколі, які є твердими речовинами за На Фіг.6 показана дія сполук формули (1) на звичайних температур, але плавляться і/чи біосинтетичні процеси в культурі розчиняються в ректальній порожнині з лімфобластоїдних клітин людини, інфікованих ВІЛвиділенням ліків (Приклад 8). Запропоновані сполуки можуть бути 1, протягом 96-ти годин. Представлені використані для лікування інфекцій, спричинених електрофореграми білків: ВІЛ, ВПГ, ВГС. Лікування інфекційних захворювань а) незараженої клітинної культури; фармацевтично прийнятними дозами сполук б) інфікованої ВІЛ-1; формули 1 діє одночасно на декількох вірусів і в) незаражених клітин у присутності препарату зачіпає різні стадії реплікації вірусу. Показано, що (натрієвої солі фулеренполіамінокапронової лікування супроводжується зниженням стресового кислоти) у концентрації 1мкг/мл; ефекту на введення препарату, посиленням г) ВІЛ-інфікованих із препаратом 1мкг/мл; антиоксидантного захисту організму від інфекцій. д) незаражених клітин у присутності препарату Інтоксикація організму характерна для плину ряду в концентрації 10мкг/мл; вірусних інфекцій і обумовлює тяжкість e) ВІЛ-інфікованих із препаратом 10мкг/мл. захворювання. Розрахункові дані показали, що На Фіг.7 - порівняльна дія сполук формули (1) рівні дозувань порядку 0,1-250 або 2500мг/день (фул) і ацикловіру: захист клітин VERO (А) і М21 можуть використовуватися для лікування або (Б) від цитопатичної дії вірусу герпеса, тип 1. профілактики зазначених вище станів, причому Використано результати, отримані для натрієвої оральне дозування є в 2-5 разів вищим. солі фулеренполіамінокапронової кислоти в Конкретний рівень дозувань і частота прийому концентраціях 10, 50 і 100мкг/мл. ліків для кожного конкретного пацієнта можуть На Фіг.8 - мембранна (а) і розчинна (в) форми змінюватися, і, будуть залежати від великого Fas-антигену при дії натрієвої солі числа факторів, включаючи активність обраної фулеренполіамінокапронової кислоти в сполуки, метаболічну стабільність і час її дії, вік концентраціях 10, 50, 100мкг/мл на культуру пацієнта, вага тіла, загальний стан здоров'я, стать клітин, що перевиваються, епітеліальної пацієнта, тип і час застосування, швидкість карциноми людини Hep 2. Характеристика деяких Приклад 1. Синтез. виведення, лікарські комбінації (Приклад 9). сполук формули (1). 13 82528 14 Навішення фулерену 2,5г розчиняють в оНа хроматограмі виявлені три плями з Rf 0,82, дихлорбензолі (о-ДХБ), додають половину об'єму 0,71, 0,47 10 для фулеренполіамінокапронової, ПЕГ-500 і калієву сіль амінокапронової кислоти в для фулеренполіаміномасляної - 0,47, для мольному відношенні 1:1 з ПЕГ. Реакційну суміш фулеренполіамінооктанової - 0,82, фулерен витримують не менше 4-х годин за температури залишився на старті (Фіг.5). 70°C при перемішуванні. Розчинник видаляють, а ТСХ. Для оцінки вмісту вільної амінокислоти в осад висушують до зникнення запаху о-дхб. препараті. Сполуки в кислій формі одержують шляхом Готують випробовуваний розчин натрієвої солі додавання близько 120мл 8% соляної кислоти, рН фулеренполіамінокапронової кислоти у воді з дорівнює 5,0, а у вигляді солі - шляхом розчинення концентрацією 1мг/мл. в 0,1н гідрооксиді натрію, рН рівний 7,0. Вихід: 5,6г Як порівняння використовують водні розчини продукту, 224% від узятого фулерену. амінокапронової кислоти (АКК) наступних Навіску фулерену 360мг розчиняють у толуолі. концентрацій: 0,05мг/мл (5%) і 0,01мг/мл (1%) . У розчин вносять 16г калієвої солі аміномасляної На лінію старту хроматографічної пластинки кислоти і 50г ПЕГ-500. Далі як описано вище. «Силуфол» розміром 10x15см з товщиною шару Вихід: 540мг, 150% від узятого фулерену. 0,1мм наносять 10мкл (10мкг) випробовуваного Розчинність фулерену і його похідних розчину і по 10мкл розчинів порівняння. приведена в таблиці 1. Пластинку сушать на повітрі протягом 10хв., Приклад 2. потім поміщають у камеру із сумішшю розчинників Спектрометричне дослідження в ІЧ-області спирт н-бутиловий:96% спирт:вода (2:2:1) і спектра сполук формули (1) у вигляді кислоти або хроматографують висхідним способом. Коли їх натрієвих солей проводили в диску з KBr Для фронт розчинників пройде близько 10см від лінії цього 1мг попередньо висушеного препарату старту, пластинку виймають з камери, сушать на змішували в ступці з 150мг спектрометрично повітрі протягом 20хв., потім у сушильній шафі за чистого калію броміду і суміш пресували при тиску температури 95-100°С протягом 10хв. Охолоджену 7,5-10см-1 протягом 2-5хв. пластинку обприскують 0,25% розчином нінгідріну Спектр отриманого зразка знімали на ІЧв ацетоні, сушать на повітрі протягом 5хв., потім у спектрометрі «AVATAR 320-FT.IR», NICOLET, сушильній шафі за температури від 95 до 100° С США, із програмним забезпеченням EZ OMNIC, протягом 5хв. На хроматограмі випробовуваного NICOLET, США. Спектральні параметри: роздільна розчину крім основних плям допускається здатність 4см-1, формат - оптична щільність, наявність плями рожевого кольору, що не діапазон 399-4000см-1, частота вибірки 1,929см-1. перевищує за величиною й інтенсивністю Обробку спектра проводили шляхом корекції лінії забарвлення плями на хроматограмі розчину Н2О/СО2. (Фіг.1). Паралельно за тих же умов порівняння (не більше 5% або 1% відповідно). знімали ІЧ-спектри поглинання фулерену і Приготування 0,25% розчину нінгідріну 0,25г використовуваних у синтезі амінокислот. нінгідріну поміщають у мірну колбу місткістю Для підтвердження присутності в заявлених 100мл, розчиняють у 20мл ацетону, доводять сполуках амінокислоти і фулерену об'єм до мітки і перемішують. Розчин використовували метод вирахування спектрів з використовують свіжеприготованим. наступною обробкою результатів за допомогою Приклад 4. Оцінка противірусної активності програмного забезпечення EZ OMNIC, NICOLET, сполук формули (1) на моделі лімфобластоїдних США (Фіг. 2.1, 2.2). Збіг малюнків ІЧ-спектрів і смуг клітин людини у відношенні ВІЛ-1. поглинання зразків натрієвої солі Клітини. Використовували лімфобластоїдні фулеренполіамінокапронової кислоти і клітини людини, які перевиваються, МТ-4. Клітини фулеренполіамінокапронової кислоти, отриманих культивували в концентрації 3,0-5,0- клітин у 1мл різними синтезами, був вищим за 80% (На Фіг.3 середовища RPMI 1640 з 10% сироватки показані номери синтезів). Збіг малюнків для ембріонів, 100мкг/мл гентаміцину. Життєздатність фулеренполіаміномасляної і клітин визначали фарбуванням 0,4% розчину фулеренполіамінокапронової кислот був суттєво Приклад 3. трипанового синього. нижчим (Фіг.4). ТСХ. Розділення сполук формули (1) методом Віруси. Як джерело вірусу використовували ТСХ. Готують випробувані розчини сполук штам ВІЛ-1899А, з колекції штамів вірусів формули (1): натрієвих солей імунодефіциту людини НДІ вірусології ім. Д.І. фулеренполіамінокапронової кислоти, Івановського РАМН. фулеренполіаміномасляної і Як позитивний контроль використовували фулеренполіамінооктанової у воді з концентрацією ретровір (азидотимідин) фірми GlaxoWellcome 1мг/мл. Фулерен розчиняють у толуолі. На лінію (Великобританія). старту хроматографічної пластинки «Силуфол» Визначення противірусної активності. розміром 10x15см з товщиною шару 0,1мм Дослідження противірусної активності препаратів наносять 10мклсушать на повітрі протягом 10хв., Пластинку (10мкг) випробовуваних розчинів. проводили на моделі лімфобластоїдних клітин у потім поміщають у камеру із сумішшю розчинників пластиковій 24-комірковій панелі. Доза вірусу 100 спирт бензол:96% спирт:вода (1:4:1,5) і ТЦД50 (50% тканинна цитопатична. доза). Культури хроматографують висхідним способом. Коли інкубували при 37°С в атмосфері з 5% СО2 98% фронт розчинників пройде близько 10см від лінії вологості протягом 5-7 днів до моменту старту, пластинку виймають з камери, сушать на підрахування результатів. Визначення активності повітрі протягом 20хв. препарату проводили за інгібуванням вірусіндукованої цитопатичної дії (ЦПД) у 15 82528 16 загибель клітин (Фіг.7). У присутності ПЕГ і культурах клітин і рівнем антигену вірусу в амінокапронової кислоти в концентраціях від 10-4Μ культуральній рідині методом імуноферментного до 10-2Μ захисту клітин від ВПГ не спостерігалося. аналізу. Сполуки формули (1) залежно від Повний захист клітин від вірусного ЦПД амінокислотного радикала мають різну відзначений при дозі препарату (натрієвої солі противірусну активність у відношенні ВПГ-1 фулеренполіамінокапронової кислоти) 122мкг/мл (табл.10). Приклад 6. Оцінка противірусної активності (табл.2). При таких концентраціях цитотоксичної сполук формули (1) на експериментальній моделі дії препарату на клітини не виявлено (табл.3). інфекції, викликаній ВГС у культурах клітин. Визначено концентрацію препарату, при якій У роботі використовували цитопатогенний відбувається зникнення вірусу в культуральному штам вірусу гепатиту С, який відноситься до середовищі (табл.5). Вивчено різні схеми генотипу 1b. Штам був виділений із сироватки введення препарату (табл. 7.1 і 7.2). Показано, що крові хворої хронічним вірусним гепатитом С, ні амінокапронова кислота, ні ПЕГ (таблиця 6) ідентифікований як вірус гепатиту С. У дослідженні подібним чином у відношенні інгібування ВІЛ не використовували інфекційні дози ВГС, рівні 10 діють. Вивчення впливу сполук формули (1) на ТЦД50/20мкл. Дослідження проводилося в біосинтетичні процеси в культурі клітин лабораторії НДІ вірусології ім. Д.І. Івановського лімфоцитів, інфікованих ВІЛ-1, проводили РАМН. Були використані високочутливі до методом електрофорезу білків і нуклеїнових цитопатогенної дії ВГС культури клітин нирок, що кислот у 12,5% ПААГ з фарбуванням нітрату перевиваються, ембріона свині (СНЕВ), отримані з срібла. Після культивування клітини осаджувалися фірми «Нарвак», Росія. Їх використовували у центрифугуванням і поміщалися в розчин, який вигляді одноденного моношару клітин, вирощеного містить: трис, рН 8,0, ЕДТА, тритон Х305, PMSF. в 24-коміркових пластикових панелях. Культури Результати оцінювали за змінами білокклітин СНЕВ вирощували на середовищі 199 з нуклеїнових профілів у вихідній культурі, 10% сироватки ембріона телят з додаванням вірусінфікованій і в присутності препарату в глутаміну й антибіотиків (100ОД/мл). концентраціях 1, 10 і 100мкг/мл при дії на Для титрування залишкової інфекційності незаражені клітини і 1,10мкг/мл - на ВІЛ-інфіковані вірусу використовували ту ж лінію клітин нирки протягом 96-ти годин (Фіг.6). Інші похідні фулерену: натрієві солі ембріона свині (СНЕВ). фулеренполіаміномасляної і У досліді використовували різні розведення фулеренполіамінооктанової кислот показали препарату натрієвої солі противірусну активність у відношенні ВІЛ-1 нижчу фулеренполіамінокапронової кислоти від в порівнянні з фулеренполіамінокапроновою (табл. 100мкг/мл і нижче на середовищі 199. Для 8 і 9). Приклад 5. Оцінка противірусної активності вивчення противірусної активності препарату, його сполук формули (1) на моделі культур клітин, які в різних концентраціях вносили в культури клітин перевиваються, нирки мавп (VERO) і фібробластів СНЕВ у момент зараження і через 24 години після ембріона людини (М-21) у відношенні ВПГ-1. зараження вірусом гепатиту С на комірку в 24Клітини. У дослідженні були використані коміркових пластикових культуральних панелях. культури клітин, що перевиваються, нирки мавп Життєздатність культур клітин СНЕВ, (VERO) і фібробластів ембріона людини (М-21), інфікованих і неінфікованих ВГС, вивчали на 7-й отримані з колекції тканин Інституту вірусології ім. день після зараження. І.Д. Івановського РАМН. Для визначення залишкової інфекційної Віруси. У дослідженні був використаний вірус активності ВГС проби культуральної рідини герпеса простого (Herpes simplex virus), тип 1, відбирали з комірок через три дні після обробки штам Лг, розмножений у клітинах VERO. Як препаратом інфікованих клітин і титрували на позитивний контроль використовували ацикловір культурах клітин СНЕВ. Інфекційну активність ВГС фірми «АЗТ». враховували за результатами титрування на 6-7 Дослідження цитотоксичної дії. Препарат день після зараження, коли розвивалася (натрієву сіль фулеренполіамінокапронової максимальна цитопатогенна дія вірусу, кислоти) вносили в 5 концентраціях 500 і використовуючи формулу Ріда і Менча для 1000мкг/мл у культуральне середовище підрахунку титру вірусу гепатиту С. що препарат у Отримані результати показали, неінфікованих клітин на стадії утворення концентрації до 100мкг/мл не має цитотоксичних моношару. Спостереження за дослідними властивостей для культур клітин СНЕВ (табл.11). культурами протягом 3 доби не виявило Препарат у концентрації 100мкг/мл цитодеструктивної дії досліджуваних речовин. солі Захисний ефект натрієвої забезпечував 100% життєздатність ВГСфулеренполіамінокапронової кислоти в інфікованих клітин на 7-ий день після зараження концентраціях 1,0; 10 і 50мкг/мл вивчався при (табл.12). За цих же умов препарат реаферон внесенні препарату через ЗО і 60 хвилин після індукував також 100% виживаність клітин. У той же зараження культур вірусом при дозі інфікуючого час, у культурах клітин, інфікованих ВГС у дозі 10 вірусу у 100 ТЦД50. Отримані результати показали, ТЦД50/клітину, уже до 4-го дня розвивалися що препарати в концентраціях 10 і 50мкг/мл цитопатогенні явища, які уражали 30-40% забезпечували повний захист клітин VERO і М-21 моношару, а до 7-го дня, як правило, усі ВГСвід цитодеструктивної дії ВПГ-1 через 48 годин інфіковані клітини гинули. Препарат виявив аналогічну активність і у після зараження клітинних культур. На цей момент випадку, коли ВГС-інфіковані клітини були спостереження в контрольних інфікованих оброблені препаратом через 24-години після клітинних культурах, які не зазнали впливу зараження. Однак найбільшу противірусну випробовуваних сполук, відзначалася 100% 17 82528 18 активність препарат проявляє при внесенні його Приклад 8. Як приклади дозованих форм одночасно з вірусом: титри вірусу в культурах відповідно до винаходу приведені наступні клітин СНЕВ знижувалися на 7,4 Іg при сполуки: Супозиторії ректальні, до складу яких входять концентрації препарату 100мкг/мл і 3,0 Іg сполуки формули (1) - 0,1-200мг, звичайно 5-20мг, 50мкг/мл (табл.13). пропіленгліколь до 10%, ліпофільна основа до 2г. Приклад 7. Вплив сполук формули (1) на Капсули: сполуки формули (1) - 0,1-1000мг, проліферацію клітин, які перевиваються, звичайно 50-200мг, крохмаль або його замінник - у епітеліальної карциноми людини Hep 2. необхідній кількості для заповнення капсули. В експериментах використана добова Розчини для ін'єкцій включають сполуки культура клітин Hep 2 14 пасажі - клітини, які формули (1) - 0,1-1,0% від об'єму, звичайно 0,5%, перевиваються, епітеліальної карциноми людини. хлористий натрій 850мг, хлористий 25 калій - 30мг. Ростове середовище містило Вода для ін'єкцій до 100мл. ДМЕМ+глутамін+антибіотики+5% ФБС (фетальна Приклад 9. бичача сироватка). Підтримуюче середовище Хворий А, 1981 року народження, який раніше ДМЕМ/голка з подвійним набором амінокислот і не одержував противірусні препарати. Із серпня вітамінів+глутамін+антибіотики+10% сироватки 2003 року встановлена 3А стадія захворювання. КРС. Діагностували ЦМВ-інфекцію, латентний перебіг, Вивчення впливу препарату на прикладі кандидоз ротоглотки і сечовивідних шляхів, натрієвої солі фулеренполіамінокапронової простий герпес, рецидивуючий перебіг. Супутні кислоти на біосинтетичні процеси в культурі клітин захворювання: хронічний пієлонефрит, показало, що препарат у вивчених концентраціях рецидивуючий бактеріальний, хронічний гепатит С 10, 50 і 100мкг/мл викликав виражене гальмування з низькою реплікацією. Вихідні дані лабораторного проліферації клітин Hep 2. Найбільш виражено аналізу: кількість РНК у плазмі 1200000копій/мл, ефект дії проявився на сьому добу при 100мкг/мл: титр вірусу в лімфоцитах дорівнює 1:8, кількість з'явилися розриви моношару, у культуральному Т4-лімфоцитів 59мм3, наявність антитіл до ВІЛ-1. середовищі багато конгломератів клітин. Виявив добровільне бажання на лікування за Моношар знімали зі скла в об'ємі середовища допомогою препарату відповідно до винаходу. 500мкл. Осаджували клітини з 200мкл, Лікування проводилося за наступною схемою: ρєсуспендували в лізуючому буфері, проводили перший місяць препарат (натрієва сіль електрофорез білків у 12,5% ПААГ з фарбуванням фулеренполіамінокапронової кислоти) - свічки по Кумасі. На другу добу і найбільш яскраво на сьому 20мг ректально щодня по одній свічці протягом 3-х добу спостерігали зниження виразності білкових місяців. Хворий В, 1980 року народження. профілів при вивчених концентраціях препарату в Встановлено ВІЛ-інфекцію 3А стадія із серпня порівнянні з контролем, що може свідчити про 2003 року. Поширена герпетична інфекція з зменшення кількості клітин через гальмування ураженням геніталій, пахових і сідничних мітотичної активності клітин у присутності областей. Кандідоз ротоглотки. ЦМВ-інфекція препарату. На 7 добу дії препарату спостерігали латентний перебіг. Супутні захворювання: зниження кількості ДНК у порівнянні з контролем. хронічний гепатит В інтегративна форма. Вихідні Перевірка наявності фрагментації ДНК показала її лабораторні дані: кількість РНК у плазмі відсутність, тобто, проявів апоптоза не виявлено. 140000копій/мл, титр вірусу в лімфоцитах З метою встановлення впливу препарату на дорівнює 1:4, кількість Т4-лімфоцитів 163мм3, Твнутрішньоклітинні біосинтетичні процеси індекс дорівнює 0,6, загальна кількість лімфоцитів проведений аналіз синтезу і дозрівання в клітинах 0,53x106/мл, наявність антитіл до ВІЛ-1, що Нер2 мРНК Fas-антигену. Fas-антиген є білкомдозволяє зробити висновок про захворювання. рецептором сигналу програмованої загибелі клітин Виявив добровільну згоду на лікування за - апоптоза - і може існувати в двох формах допомогою препарату відповідно до винаходу. мембранній і розчинній. Показано, що в Лікування проводилося за наступною схемою: присутності препарату відбувається перерозподіл свічки по 20мг ректально через три дні по одній альтернативних форм мРНК Fas-антигену, що свічці в день протягом 3-х місяців. Дані клінічних свідчить про вплив препарату на біосинтетичні аналізів пацієнтів приведені в таблиці 14. Використання препарату відповідно до процеси в клітинах Нер2 на рівні транскриптону, винаходу вказує на поліпшення стану пацієнтів. однак, перебудови, які свідчать про можливість реалізації Fas-залежного апоптоза відсутні (Фіг.8). 19 82528 20 21 82528 22 23 82528 24 25 82528 26 27 82528 28 29 82528 30 31 82528 32 33 82528 34 35 Комп’ютерна верстка О. Гапоненко 82528 Підписне 36 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601