Спосіб очистки ксантиноксидази

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано в ферментной технологии и биохимических исследованиях. Наиболее близким к заявляемому является способ очистки ксантиноксидазы из печени быка [Cabre F., Canela E.I. Purification, properties and functional groops of bovine liver xanthine oxidase", Biochem. Soc. Trans. 1987-15, №3,p.511-512]. По этому способу фермент экстрагируют из печени быка, удаляют посторонние белки тепловой денатурацией в течение 30 минут при 56°С и фракционированием (NH4)gSO4 (фракция 0-55% от полного насыщения). Затем ксантиноксидазу осаждают холодным (-18°С) ацетоном (до 42% ацетона). Признаки общие с заявляемым. После этого последовательно проводят ионообменную хроматографию на гидроксилапатите, фенил- сефарозе CL4B, ДЭАЭ-сефацеле. Затем осуществляют гель-фильтрацию через ультрагель АсА 34 с последующим концентрированием путем ионообменной хроматографии на ДЭАЭ – сефацеле. Указанный способ не позволяет получить высокий выход фермента и дает срав-нительно низкую степень очистки, поскольку при ионообменной хроматографии сродство фермента и сорбента основывается на противоположности их зарядов, а при гель-фильтрации разделение основано на разной способности белков проникать через "молекулярные сита". В основу изобретения поставлена задача создать такой способ очистки ксантиноксидазы, в котором путей замены операции ионообменной хроматографии и гель-фильтрации на новые можно было бы увеличить выход фермента и повысить степень его очистки. Поставленная задача решается следующим образом -- в способе очистки ксантиноксидазы, предусматривающем экстрагирование фермента из сырья, тепловую денатурацию, фракционирование посторонних белков сульфатом аммония и осаждение ксантиноксидазы холодным ацетоном, фермент иммобилизуют при 38-42°С и рН 8,1-8,3 на активированной эпихлоргидрином в присутствии 1,0 Μ гидроксида натрия агарозе, к которой ковалентно присоединяют ксантин, находящийся в виде серебряной соли, при 45~60°С в щелочной среде, создаваемой 1,0 Μ гидроксидом натрия с последу-ющей злюцией фермента 0,025-0,2 Μ ірис НСІ буфером при рН 7,4, содержащим 0.9 - 1,1 Μ NaCl. Введение иммобилизации обеспечивает высокую степень очистки с очень высоким выходом фермента из-за высшей степени сродства между ферментом и субстратом. Поэтому большая часть фермента, находящегося в сырье, прочно связывается с активированным сорбентом (агарозой), а посторонние белки легко удаляются, так как не обладают высоким сродством ни к сорбенту, ни к субстрату. Способ осуществляют следующим образом. Пример 1. Печень только что декапетарозанного животного гомогенизируют в двухкратном объеме бидистиллированной воды и оставляют на 1-3 часа. После этого гомогенат центрифугируют в течение 15-20 минут при 4000-5000 об/мин, осадок отбрасывают. Полученный супернатант подвергают тепловой денатурации - помещают его в водяную баню при 56°С на 30-35 минут и затем центрифугируют 15 минут при 4000 об/мин, осадок отбрасывают. К полученному супернатанту добавляют 1/2 объема 3,8 Μ (NH^SOXj и оставляют на 20-30 минут, после чего центрифугируют 15 минут при 10000 об/мин. Осадок отбрасывают. К полученному супернатанту добавляют охлажден-ный до -18°С ацетон (42% объема) и оставляют на холоду (от 0° до 8°С) на 15-20 минут, после чего центрифугируют 15-20 минут при 4000-5000 об/мин. Супернатант отбрасывают, а осадок растворяют в воде из расчета 8-10 мг белка на 1 мл. После этого ксантиноксидазу иммобилизуют на агарозе, к которой ковалентно присоединен ксантин с помощью спейсера - эпихлоргидрина. Присоединение осуществляют следующим образом. К 1,5 г отмытых агарозных шариков добавляют 0,75 мл эпихлоргидрина и 0,75 мл 1,0 Μ NaOH, оставляют на 10-12 часов при комнатной температуре и периодически помешивают. Полученный эпихлор-гидринактивированный гель отмывают 1,0 Μ NaCI, а затем бидистилированной водой. Готовят навеску ксантина (600 мкг) и растворяют в 3 мл 1,0 Μ NaOH, после чего добавляют 1,36 мг АgNО3 и растворяют. В полученном растворе ксантилата серебра суспендируют эпихлоргидринактивированные шарики агарозы. Суспензию помещают в водяную баню при 45°С на 60 минут. После этого гель отмывают 10% HNO3, 1,0 Μ NaCI, а затем бидистиллированной водой. К гелю добавляют 0,02% масc/об. азида натрия для предотвращения роста бактерий. Гель суспендируют в 0,2 Μ боратнем буфере при рН 8,1 из расчета 20 мг/мл. После этого на каждый 1 мл раствора осадка, полученного при осаждении ацетоном, добавляют 1 мл суспензии агарозы, ковалентно связанной с ксантином и тщательно перемешивают, затем помещают на 10 минут в водяную баню при 38°С и непрерывно перемешивают. Через 10 минут центрифугируют в течение 15 минут при 4000 об/мин. Гель элюируют 0,025 Μ трис-НСІ буфером при рН 7,4, содержащим 0,9 Μ из расчета 5 мл буфера на 1 мл геля. Элюат используется в качестве ферментного препарата. Результаты очистки приведены в таблице. Пример 2. Все операции осуществляют так же, как и в примере 1, с той разницей, что присоединение ксантина к эпихлоргидринактивированной агарозе ведут при температуре 50°С, суспендируют гель в 0,2 Μ боратном буфере при рН 8,2, иммобилизацию осуществляют при 40°С, а элюцию - 0,1 Μ трис-НСІ буфером при рН 7,4, содержащим 1,0 Μ NaCI. Результаты очистки приведены а таблице. Пример 3. Все операции осуществляют так же, как и в примерах 1 и 2, с той разницей, что присоединение ксантина к эпихлоргидринактивированной агарозе ведут при температуре 60°С, гель суспендируют в 0,2 Μ боратном буфере при рН 8,3, иммобилизацию осуществляют при 42°С, а Элюцию - 0,2 Μ трис-НСІ буфером при рН 7,4, содержащим 1,1 Μ NaCI. Результаты очистки приведены в таблице.