Ферментний комплекс

Реферат: Винахід належить до ферментного комплексу, отриманого при комбінації продукту експресії, отриманого при ферментації видів мікроорганізмів з роду Trichoderma і одного або декількох ферментів з гриба роду Penicillium, вибраного з ксиланази (EC 3.2.1.8), целюлази (EC 3.2.1.4) і бета-глюканази (EC 3.2.1.6). Винахід також належить до способу одержання зазначеного вище ферментного комплексу, та його застосування. UA 106372 C2 (12) UA 106372 C2 UA 106372 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ГАЛУЗЬ ВИНАХОДУ Винахід стосується поліпшеного ферментного комплексу, що має сукупність видів ферментативної активності продукту експресії, отриманого при ферментації мікроорганізмів роду Trichoderma, в поєднанні з одним або декількома ферментами з інших видів штаму гриба. ПЕРЕДУМОВИ ВИНАХОДУ Використання ферментів у виробництві пива добре відоме. Введення ферментів на стадії затирання для поліпшення здатності до фільтрування затіру і збільшення виходу екстракту описане в WO 97/42302. WO2005118769 і WO2005059084 стосуються стадії затирання і фільтрації в способі виробництва пива, і ферментних композицій для використання в такому способі. WO1999057325 стосується штамів Penicillium funiculosum, нових ферментних сумішей, отриманих з них, і послідовності їх нуклеїнової кислоти. Однак існує необхідність в поліпшених ферментних комплексах, корисних при виробництві харчових продуктів, наприклад, на стадіях затирання, запарювання і фільтрації при виробництві алкогольного напою, такого як пиво або віскі. МЕТА ВИНАХОДУ Метою варіантів здійснення по винаходу є надання поліпшеного ферментного комплексу, що забезпечує поліпшені способи виробництва при отриманні, наприклад, харчових продуктів, наприклад, на стадіях затирання, запарювання і/або фільтрації при виробництві алкогольного напою, такого як пиво або віскі, або біопалива. КОРОТКИЙ ВИКЛАД СУТІ ВИНАХОДУ Автор(и) даного винаходу виявили, що при комбінації продукту експресії, отриманого при ферментації видів мікроорганізмів з роду Trichoderma і конкретних ферментів з будь-якого іншого виду грибів, отримують поліпшені властивості ферментного комплексу. Таким чином, в першому аспекті даний винахід стосується ферментного комплексу, отриманого при комбінації: a. Продукту експресії, отриманого при ферментації видів мікроорганізмів з роду Trichoderma; і b. Одного або декількох ферментів з будь-якого іншого виду мікроорганізмів з царства грибів, вибраного з ксиланази (EC 3.2.1.8), целюлази (EC 3.2.1.4) і бета-глюканази (EC 3.2.1.6); і де щонайменше приблизно 61 % активності бета-1,4-ендоглюкангідролази, як виміряно способом "Аналіз 1", як описано в даному описі, отримують при ферментації мікроорганізмів роду Trichoderma. Потрібно розуміти, що "будь-який інший вид з царства грибів" стосується видів, які відрізняються від видів з роду Trichoderma в (a). У другому аспекті даний винахід стосується ферментного комплексу, отриманого при комбінації: a. щонайменше приблизно 61 % продукту експресії, отриманого при ферментації мікроорганізмів роду Trichoderma; і b. менше, ніж приблизно 39 % продукту експресії, отриманого при ферментації іншого гриба з роду Penicillium; де процентні співвідношення основані на активності бета-1,4-ендоглюкангідролази, як виміряно способом "Аналіз 1", як описано в даному описі. У третьому аспекті даний винахід стосується способу отримання ферментного комплексу, де спосіб включає в себе стадії a. ферментації мікроорганізмів роду Trichoderma в середовищі для отримання ферментаційного бульйону; b. ферментації мікроорганізмів роду Penicillium в середовищі для отримання ферментаційного бульйону, і с. виділення і комбінацій кожного ферментного комплексу, отриманого на стадії a) і b) в формі безклітинного бульйону при вказаних ферментаціях, для отримання ферментного комплексу, де щонайменше приблизно 61 % активності бета-1,4-ендоглюкангідролази, як виміряно способом "Аналіз 1", як описано в даному описі, отримують при ферментації мікроорганізмів роду Trichoderma. У наступному аспекті даний винахід стосується використання ферментного комплексу за винаходом в способі виробництва пивоварного затіру, наприклад, виробництва солодового напою, такого як пиво, такого як солодове пиво, і/або виробництва віскі і/або виробництва біопалива. 1 UA 106372 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У наступному аспекті даний винахід стосується використання ферментного комплексу за винаходом у виробництві фруктового соку, вина, переробці зерна, виробництві паливного спирту і питного спирту. У наступному аспекті даний винахід стосується ферментного комплексу, отриманого при комбінації: a. продукту експресії, отриманого при ферментації видів мікроорганізмів з роду Trichoderma; і b. одного або декількох ферментів з будь-якого іншого виду з царства грибів, вибраних з сімейства ксиланази 11 (EC 3.2.1.8), целюлази (EC 3.2.1.4) і бета-глюканази (EC 3.2.1.6); і де щонайменше приблизно 61 % активності бета-1,4-ендоглюкангідролази як виміряно способом "Аналіз 1", як описано в даному описі, отримують при ферментації мікроорганізмів роду Trichoderma. ПІДПИСИ ДО ФІГУР Фіг. 1. Перше дослідження затіру в лабораторному масштабі, значення β-глюкану і об'єму фільтрату сусла. Фіг. 2. Друге дослідження затіру в лабораторному масштабі - значення об'ємів фільтрату, залишкового β-глюкану і в'язкості сусла (при 12 сП (мПа•с)). Фіг. 3. Дані пілотного дослідження фільтрації пивного сусла - Загальний час фільтрації пивного сусла, Середня швидкість потоку і загальне наростання тиску. А: Негативний контроль, контроль без ферменту; В: LAMINEX® Super при 0,20 кг/тонну; С: The LAMINEX® XG (LAMINEX® Super 1,5+50 % додаткової активності Т. reesei) при 0,133 кг/тонну. ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Пиво традиційно позначають як алкогольний напій, отриманий з солоду, наприклад, солоду, отриманого з ячменю, і необов'язково, добавок, таких як зерно хлібних злаків, і з додаванням хмелю. У термін "пиво" включене будь-яке ферментоване сусло, отримане за допомогою пивоваріння і бродіння матеріалу, що містить крохмаль, в основному, отриманого із зерна хлібних злаків, такого як осолоджений ячмінь. Можна використовувати також пшеницю, маїс і рис. Як застосовують в цьому документі, термін "солодовий напій" включає в себе такі піноутворюючі ферментовані солодові напої, як повністю осолоджене пиво, ель, сухе пиво, безалкогольне пиво, легке пиво, пиво з низьким вмістом алкоголю, низькокалорійне пиво, портер, міцне темне пиво, стаут, солодовий розчин, безалкогольний солодовий розчин і т. п. Термін "солодові напої" включає в себе також пиво, що не піниться, і альтернативні солодові напої, такі як солодові напої з додаванням фруктів, наприклад, з додаванням цитрусів, наприклад, солодові напої з додаванням лимона, апельсина, лайму або ягід, солодові напої з додаванням алкогольних напоїв, наприклад, солодовий розчин з додаванням горілки, рому або текіли, або солодові напої з додаванням кави, такі як солодовий розчин з додаванням кофеїну і т. п. Пиво можна отримувати з різних зерен по суті однаковим способом. Весь крохмаль зерна являє собою гомополімери глюкози, в яких залишки глюкози сполучені або альфа-1,4-, або альфа-1,6-зв'язками, з переважанням перших. Спосіб отримання ферментованих солодових напоїв звичайно позначають пивоварінням. Принциповою сировиною, що використовується при виробництві цих напоїв, є вода, хміль і солод. Крім того, добавки, такі як звичайні кукурудзяні крупи, очищені кукурудзяні крупи, подрібнені пивні дріжджі, рис, сорго, очищений кукурудзяний крохмаль, ячмінь, ячмінний крохмаль, лущений ячмінь, пшениця, пшеничний крохмаль, обсмажені злаки, зернові пластівці, жито, овес, картопля, тапіока і сиропи, такі як кукурудзяний сироп, сироп з цукрової тростини, інвертний цукровий сироп, сиропи з ячменю і/або пшениці, і т. п., можна використати як джерело крохмалю. Крохмаль в кінцевому результаті перетворюється в декстрини і зброджувані цукри. По ряду причин, солод, який в основному отримують з вибраних сортів ячменю, чинить найбільший ефект на загальний характер і якість пива. По-перше, солод є первинною смаковою речовиною пива. По-друге, солод надає основну частину цукру, що зброджується. По-третє, солод надає білки, що роблять внесок в характер тіла і піни пива. По-четверте, солод забезпечує необхідну ферментативну активність під час затирання. Хміль також робить значний внесок в якість пива, включаючи смак. Зокрема, хміль (або складові хмелю) додають бажані речовини, що надають гіркого присмаку до пива. Крім того, хміль діє як преципітуючий білок засобу, надаючи засоби-консерванти і полегшуючи утворення і стабілізацію піни. Спосіб виробництва пива добре відомий в даній галузі, але стисло, він включає в себе п'ять стадій: (a) затирання і/або додаткового запарювання (b) відділення і екстракції сусла (с) 2 UA 106372 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кип'ятіння сусла і додавання хмелю в сусло (d) охолоджування, бродіння і зберігання, і (е) дозрівання, переробки і упакування. Як правило, на першій стадії, розмолотий або роздроблений солод змішують з водою і підтримують протягом деякого періоду часу при температурах, що контролюються, щоб дозволити ферментам, присутнім в солоді, перетворювати крохмаль, присутній в солоді, в зброджувані цукри. На другій стадії затір переносять в "фільтраційний чан" або фільтр для відділення затіру, де рідину відділяють від залишків зерна. Цю солодку рідину називають "сусло", і осад зерен, що залишився, називають "пивна дробина". Затір, як правило, піддають екстракції, яка включає в себе додавання води до затіру для відділення розчинного екстракту, що залишився від пивної дробини. На третій стадії сусло інтенсивно кип'ятять. Це стерилізує сусло і сприяє розвитку забарвлення, смаку і запаху. Хміль додають в тій же самій точці під час кип'ятіння. На четвертій стадії сусло охолоджують і переносять в ферментер, який містить дріжджі, або в який додають дріжджі. Дріжджі перетворюють цукор за допомогою бродіння в спирт і газ діоксид вуглецю; по закінченні бродіння ферментер охолоджують або ферментер можна охолоджувати для зупинки бродіння. Дріжджі випадають в осад пластівцями, і їх видаляють. На останній стадії пиво охолоджують і зберігають протягом періоду часу, в ході якого пиво освітлюється і розвивається його смак, і будь-який матеріал, який може пошкодити зовнішньому вигляду, смаку і терміну зберігання пива, осаджується. Перед упаковуванням пиво насичують вуглекислим газом і, необов'язково, фільтрують і пастеризують. Після бродіння отримують напій, який звичайно містить від приблизно 2 % до приблизно 10 % спирту по масі. Вуглеводи, що не зброджуються, не зазнають перетворення під час бродіння і складають більшість розчинених твердих речовин в кінцевому пиві. Цей залишок залишається через нездатність амілаз солоду гідролізувати альфа-1,6-зв'язки крохмалю. Вуглеводи, що не зброджуються, вносять приблизно 50 калорій на 12 унцій (0,3549 л) пива. Останнім часом відбувалася широко поширена популяризація отриманих способом пивоваріння напоїв, званих легкими видами пива, видами пива із зменшеним вмістом калорій або низькокалорійними видами пива, зокрема, на ринку США. Як визначають в США, ці види пива містять на 30 % менше калорій, ніж "нормальне" пиво виробника. Додаткову інформацію по загальноприйнятих способах пивоваріння, так само як визначення для термінів, що використовуються в галузі технології пивоваріння, для використання за даним винаходом, можна знайти в "Technology Brewing and Malting" Wolfgang Kunze of the Research and Teaching Institute of Brewing, Berlin (VLB), 2nd revised Edition 1999, ISBN 3-921690-39-0 або 3rd edition (2004): ISBN 3-921690-49-8. Визначення Термін "ферментний комплекс", як застосовують в цьому документі, означає в даному контексті по суті безклітинну композицію, що містить декілька ферментів, що мають різну ферментативну активність і/або класифікованих під різними номерами Комісії з ферментів (EC номерами). Коли "ферментний комплекс" отриманий при ферментації, він являє собою по суті безклітинний ферментаційний бульйон, необов'язково, концентрований ферментаційний бульйон, який включений в кінцевий продукт. Потрібно розуміти, що термін "ферментний комплекс" включає в себе також композицію, що містить декілька ферментів, отриманих за допомогою двох або більше окремих процесів ферментації, в яких також можуть брати участь різні мікроорганізми. У деяких варіантах здійснення ферментний комплекс являє собою сумісний з харчовими продуктами ферментний комплекс, що означає, що його можна використовувати для отримання харчових продуктів. У деяких аспектах винаходу ферментний комплекс за винаходом має побічні види активності, необхідні для деградації дуже складних сполук, наприклад, в затірі в процесі пивоваріння. Термін "побічна активність" стосується в даному контексті видів активності ферменту відносно інших субстратів, що не є його головним субстратом, або він стосується інших видів активності, якими може мати ферментний комплекс, що відрізняються від його головної активності. В одному аспекті винаходу ферментний комплекс по винаходу має щонайменше 5 різних видів побічної активності. В одному аспекті винаходу ферментний комплекс по винаходу має щонайменше 10 різних видів побічної активності. В одному аспекті винаходу ферментний комплекс по винаходу має щонайменше 15 різних видів побічної активності. 3 UA 106372 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 В одному аспекті винаходу ферментний комплекс по винаходу має щонайменше 20 різних видів побічної активності. Ксиланази класифікують в EC 3.2.1.8, EC 3.2.1.32, EC 3.2.1.136 і EC 3.2.1.156.; активність можна вимірювати, наприклад, як описано в "Аналізі 2". Ендо-1,4-бета-ксиланазу класифікують як EC 3.2.1.8. Фермент викликає ендогідроліз 1,4бета-D-ксилозидинових зв'язків в ксиланах. Термін "ксиланаза сімейства 11", як застосовують в цьому документі, стосується ендо-1,4бета-ксиланази, що класифікується як EC 3.2.1.8, яка викликає ендогідроліз 1,4-бета-Dксилозидинових зв'язків в ксиланах і яку класифікують як ксиланазу сімейства 11 згідно B. Henrissat, А classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J. 280 (1991), pp. 309-316. В одному аспекті ферментний комплекс по винаходу має активність ендо-1,4-бетаксиланази, як виміряний в "Аналізі 2", як описано нижче під заголовком "Аналізи". "Аналіз 2" можна провести при pH 3,5 або pH 5 і 50 °C з використанням ксилану як субстрату, або його можна провести при різних значеннях pH і температури для додаткової характеризації і специфікації ферментів. Активність ферменту розраховують по збільшенню оптичної густини, викликаному ксилозою, при 540 нм на одиницю часу. Одну одиницю активності ксиланази визначають в цьому документі як кількість ферменту (нормалізовану по загальному об'єму суміші, що аналізується), що дає збільшення -1 ΔOOD540нм·хв в умовах "Аналізу 2" (pH 3,5 і 50 °C). У деяких варіантах здійснення ферментний комплекс по винаходу має активність ксиланази щонайменше приблизно 5000 од./г, наприклад, щонайменше приблизно 6000 од./г, наприклад, щонайменше приблизно 7000 од./г, наприклад, щонайменше приблизно 8000 од./г, наприклад, щонайменше приблизно 8500 од./г, як виміряно в "Аналізі 2". Ферментний комплекс по винаходу має целюлолітичну активність. Систематичним найменуванням целюлази є 4-(1,3;1,4)-β-D-глюкан-4-глюканoгідролаза, і целюлолітичні ферменти або целюлази класифікують в EC 3.2.1.4. Целюлаза здійснює ендогідроліз (1→4)-βD-глюкозидних зв'язків, наприклад, в целюлозі, ліхеніні і β-D-глюканах злаків, і може також гідролізувати 1,4-зв'язки в β-D-глюканах, що містять також 1,3-зв'язки. Целюлаза має також інші назви, такі як ендо-1,4-β-D-глюканaза, β-1,4-глюканаза, β-1,4-ендоглюкангідролаза, целюлаза А, целюлозин AP, ендоглюканаза D, лужна целюлаза, целюлаза А3, целюдекстриназа, 9,5 целюлаза, авіцелаза, панцелаза SS і 1,4-(1,3;1,4)-β-D-глюкан-4-глюканoгідролаза. В одному аспекті винаходу активність целюлази ферментного комплексу по винаходу вимірюють в "Аналізі 1", як описано нижче під заголовком "Аналізи". У наступних аспектах ферментний комплекс по винаходу має активність β-глюканази, що визначається, як описано в "Аналізі 7". Стандартний аналіз проводять при pH 5,0, і його можна провести при різних значеннях pH для додаткової характеризації і специфікації ферментів. Одну одиницю активності ендо-1,3(4)-β-глюканази визначають як кількість ферменту, що утворює 1 мкмоль глюкозних еквівалентів в хвилину в умовах аналізу (pH 5,0 (або як указано) і 50 °C). У деяких варіантах здійснення ферментний комплекс по винаходу має активність βглюканази щонайменше приблизно 10000 од./г, наприклад, щонайменше приблизно 12000 од./г, наприклад, щонайменше приблизно 14000 од./г, наприклад, щонайменше приблизно 15000 од./г, наприклад, щонайменше приблизно 18000 од./г, як виміряно в "Аналізі 7". "β-глюканаза" або "бета-глюканаза", як застосовують в цьому документі, стосується ендо1,3(4)-бета-глюканази EC 3.2.1.6. Каталізує ендогідроліз (1→3)- або (1→4)-зв'язків в бета-Dглюканах, коли залишок глюкози, відновлювальна група якого залучена до зв'язку, що підлягає гідролізу, сам є заміщеним в С-3. У наступних аспектах ферментний комплекс по винаходу має активність ламінаринази, визначеної, як описано в "Аналізі 3". Ламінариназа може являти собою ендо-1,3(4)-бета-глюканазу, класифіковану в E.C. 3.2.1.6, або глюкан-ендо-1,3-бета-D-глюкозидазу, класифіковану в E.C. 3.2.1.39. Ендо-1,3(4)-бетаглюканаза з альтернативними найменуваннями ламінариназа, ендо-1,3-бета-глюканаза, ендо1,4-бета-глюканаза класифікована в E.C. 3.2.1.6. Субстрати включають в себе ламінарин, ліхенін і D-глюкани злаків, і фермент каталізує ендогідроліз (1→3)- або (1→4)-зв'язків в бета-Dглюканах, коли залишок глюкози, відновлювальна група якого залучена до зв'язку, що підлягає гідролізу, сам є заміщеним в С-3. Глюкан-ендо-1,3-бета-D-глюкозидаза з альтернативними найменуваннями (1→3)-бета-глюкан-ендогідролаза, ендо-1,3-бета-глюканаза і ламінариназа 4 UA 106372 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 класифікована в бета-D-глюкозидні зв'язки в (1→3)-бета-D-глюканах, наприклад, в таких субстратах, як ламінарин, парамілон і пачіман. У деяких аспектах ферментний комплекс по винаходу має активність арабінанази. Арабінаназу класифікують як EC 3.2.1.99. Системним найменуванням є 5-α-L-арабінан-5-α-Lарабінанoгідролаза, але вона має дещо інші найменування, такі як арабінан-ендо-1,5-α-Lарабінозидаза і ендо-1,5-α-L-арабінаназа, ендо-α-1,5-арабаназа, ендо-арабаназа, 1,5-α-Lарабінан і 1,5-α-L-арабінанoгідролаза. Арабіназа здійснює ендогідроліз (1→5)-αарабінофуранозидних зв'язків в (1→5)-арабінанах. Арабінаназа також діє на арабінан. В одному аспекті винаходу активність арабінази ферментного комплексу по винаходу вимірюють в "Аналізі 4", як описано нижче під заголовком "Аналізи". Аналіз можна провести при pH 3,5 і 50 °C з використанням арабінану цукрового буряка як субстрату, і його можна провести при різних значеннях pH і температури для додаткової характеризації і специфікації ферментів. Активність ферменту розраховують по збільшенню оптичної густини при 540 нм в одиницю часу. Одну одиницю активності арабінази визначають як кількість ферменту (нормалізовану по -1 загальному об'єму, що аналізується), що дає збільшення ΔOD 540 нм·хв в умовах аналізу (pH 3,5 і 50 °C). У деяких аспектах ферментний комплекс по винаходу має активність бета-Dглюкозидглюкогідролази. Бета-D-глюкозидглюкогідролаза стосується ферментів E.C. 3.2.1.21. У деяких аспектах ферментний комплекс по винаходу має активність β-ксилозидази. "βксилозидаза" або "ксилан-1,4-бета-ксилозидаза" стосується ферментів E.C. 3.2.1.37. βксилозидаза каталізує гідроліз (1→4)-бета-D-ксиланів з видаленням послідовних залишків Dксилози з невідновлювальних кінців. В одному аспекті винаходу активність целобіогідролази ферментного комплексу по винаходу вимірюють в "Аналізі 6", як описано нижче під заголовком "Аналізи". Стандартний аналіз проводять при pH 5,0, і його можна провести при різних значеннях pH для додаткової характеризації і специфікації ферментів. Одну одиницю активності целобіогідролази визначають як кількість ферменту, що утворює 1 мкмоль п-нітрофенолу з п-нітрофеніл-β-D-целобіопіранозиду в хвилину в умовах аналізу (pH 5,0 (або як указано) і 50 °C). У деяких аспектах ферментний комплекс по винаходу має активність целобіогідролази. "Целобіогідролаза" або "1,4-бета-целобіозидаза целюлози" належить до ферментів EC 3.2.1.91. 1,4-бета-целобіозидаза целюлози каталізує гідроліз 1,4-бета-D-глюкозидних зв'язків в целюлозі і целотетраозі, вивільняючи целобіозу з невідновлювальних кінців ланцюгів. В одному аспекті винаходу активність арабінофуранозидази ферментного комплексу по винаходу вимірюють в "Аналізі 5", як описано нижче під заголовком "Аналізи". Стандартний аналіз можна провести при pH 5,0 і 50 °C, і його можна провести при різних значеннях pH і температури для додаткової характеризації і специфікації ферментів. Одну одиницю активності α-N-арабінофуранозидази визначають як кількість ферменту, що утворює 1 мкмоль п-нітрофенолу з п-нітрофеніл-α-L-арабінофуранозиду в хвилину в умовах аналізу (pH 5,0 і 50 °C (або як вказано)). У деяких аспектах ферментний комплекс по винаходу має активністю α-Nарабінофуранозидази. "α-N-арабінофуранозидаза" або "альфа-N-арабінофуранозидаза" належать до ферментів EC 3.2.1.55. α-N-арабінофуранозидаза каталізує гідроліз кінцевих невідновлювальних залишків альфа-L-арабінофуранозиду в альфа-L-арабінозидах. У деяких аспектах ферментний комплекс по винаходу має активність глюкан-1,4-бетаглюкозидази. "Глюкан-1,4-бета-глюкозидаза" або "глюкан-1,4-бета-глюкозидаза" належить до ферментів E.C. 3.2.1.74. Глюкан-1,4-бета-глюкозидаза каталізує гідроліз (1→4)-зв'язків в (1→4)бета-D-глюканах з видаленням послідовних одиниць глюкози. У деяких аспектах ферментний комплекс по винаходу має активність специфічну для ксилоглюкану екзо-бета-1,4-глюканази. "Специфічна для ксилоглюкану екзо-бета-1,4-глюканаза" стосується ферментів E.C. 3.2.1.155. Специфічна для ксилоглюкану екзо-бета-1,4-глюканаза каталізує екзогідроліз (1→4)-бета-D-глюкозидних зв'язків в ксилоглюкані. Ферментний комплекс у виробничому аспекті можна використати в способі, що включає в себе зменшення в'язкості водного розчину, що містить гідролізат крохмалю. Ферментний комплекс можна також використати в способі, що включає в себе фільтрацію водного розчину, що містить гідролізат крохмалю. У деяких варіантах здійснення водний розчин, що містить гідролізат крохмалю, являє собою затір для виробництва пива, і в інших варіантах здійснення водний розчин, що містить гідролізат крохмалю, являє собою композицію для харчового продукту. 5 UA 106372 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Альтернативно, ферментний комплекс за даним винаходом можна використати для виробництва фруктового соку, вина, переробки зерна, виробництва паливного спирту, такого як біоетанол, і питного спирту. У деяких варіантах здійснення біоетанол виробляють з сільськогосподарської вихідної сировини, такої як цукрова тростина, картопля, кукурудза, пшениця, сорго і т. д., або з целюлозного матеріалу, такого як кукурудзяна солома, просо лозиноподібне або інший рослинний матеріал. В обох випадках зброджувані цукри екстрагують із сировини і зброджують за допомогоюмікроорганізмів до спирту, який піддають дистиляції, і який можна використовувати як транспортне паливо. Ферментний комплекс за даним винаходом можна використати в цьому виробництві біопалива. Комплекс ферментів можна додавати, щоб поліпшувати екстракцію полісахаридів з сировини, сприяти деградації полісахаридів до зброджуваних цукрів і/або щоб поліпшувати параметри переробки, такі як відділення рідин від твердих речовин, характеристики текучості і здатність до перекачування. Спосіб по винаходу можна використати в затиранні будь-якої крупки. По винаходу крупка може містити будь-який рослинний матеріал, що містить крохмаль і/або цукор, який можна отримати з будь-якої рослини і частини рослини, включаючи бульби, коріння, стебла, листя і насіння. У деяких варіантах здійснення крупка містить зерно, наприклад, зерно ячменю, пшениці, жита, вівса, кукурудзи, рису, зернового сорго, пшона і сорго, і більш переважно, щонайменше 10 %, або більш переважно, щонайменше 15 %, навіть більш переважно, щонайменше 25 %, або найбільш переважно, щонайменше 35 %, наприклад, щонайменше 50 %, щонайменше 75 %, щонайменше 90 % або навіть 100 % (мас./мас.) крупки сусла отримано із зерна. У деяких варіантах здійснення крупка містить осолоджене зерно, таке як ячмінний солод. Переважно, щонайменше 10 %, або більш переважно, щонайменше 15 %, навіть більш переважно, щонайменше 25 %, або найбільш переважно, щонайменше 35 %, наприклад, щонайменше 50 %, щонайменше 75 %, щонайменше 90 % або навіть 100 % (мас./мас.) крупки сусла отримано з осолодженого зерна. Термін "ферментація" означає в даному контексті продукцію речовин, таких як ферменти, за допомогою вирощування мікроорганізмів в культурі. Як застосовують в цьому документі, термін "солод" розуміють як будь-яке осолоджене зерно злаків, таких як ячмінь. Термін "добавка" розуміють як частину крупки, яка не є ячмінним солодом. Добавка може являти собою будь-який багатий на вуглеводи матеріал. Термін "затір" розуміють як водну суспензію крохмалю, що включає, наприклад, розмолотий ячмінний солод, розмолотий ячмінь і/або іншу добавку, або їх комбінацію, змішаний з водою для подальшого розділення на сусло + пивна дробина. Термін "розділення затіру" розуміють як відділення сусла від пивної дробини, наприклад, фільтрацією пивного сусла або фільтрацією затіру. Термін "фільтрація пива" розуміють як процес розділення, при якому клітини дріжджів і інші матеріали, що викликають каламутність, ще присутні в пиві, видаляють, наприклад, способами з використанням мікрофільтрації або мембрани. Препарат ферментного комплексу, наприклад, в формі інгредієнта харчового продукту, отриманий за даним винаходом, може знаходитися в формі розчину або в формі твердої речовини залежно від використання і/або способу використання і/або способу введення. Форма твердої речовини може знаходитися або в формі порошку висушеного ферменту, або в формі гранульованого ферменту. В одному аспекті винахід стосується препарату ферментного комплексу, що містить ферментний комплекс по винаходу, носій і, необов'язково, стабілізатор і/або консервант для ферменту. У додатковому аспекті винаходу носій для ферменту вибраний з групи, що складається з гліцерину або води. У наступному аспекті препарат містить стабілізатор. В одному аспекті стабілізатор вибраний з групи, що складається з неорганічних солей, поліолів, цукру і їх комбінацій. В одному аспекті стабілізатор являє собою неорганічну сіль, таку як хлорид калію. В іншому аспекті поліол являє собою гліцерин, пропіленгліколь або сорбіт. В іншому аспекті цукор являє собою низькомолекулярний вуглевод, зокрема, будь-який з декількох солодких на смак, таких як глюкоза, фруктоза і сахароза. У додатковому аспекті препарат містить консервант. В одному аспекті консервант являє собою метилпарабен, пропілпарабен, бензоат, сорбат або інші схвалені для застосування в харчових продуктах консерванти або їх суміш. 6 UA 106372 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Конкретні варіанти здійснення винаходу Як описано вище, даний винахід стосується ферментного комплексу, отриманого при комбінації: a. продукту експресії, отриманого при ферментації видів мікроорганізмів з роду Trichoderma; і b. одного або декількох ферментів з будь-якого іншого виду мікроорганізмів з царства грибів, вибраного з ксиланази (EC 3.2.1.8), целюлази (EC 3.2.1.4) і бета-глюканази (EC 3.2.1.6); і де щонайменше приблизно 61 % активності бета-1,4-ендоглюкангідролази, як виміряно способом "Аналіз 1", як описано в даному описі, отримують при ферментації мікроорганізмів роду Trichoderma. У деяких варіантах здійснення щонайменше приблизно 62 %, наприклад, щонайменше приблизно 63 %, наприклад, щонайменше приблизно 64 %, наприклад, щонайменше приблизно 65 %, наприклад, щонайменше приблизно 66 %, наприклад, щонайменше приблизно 68 %, наприклад, щонайменше приблизно 69 % активності бета-1,4-ендоглюкангідролази, як виміряно способом "Аналіз 1", як описано в даному описі, отримують при ферментації мікроорганізмів роду Trichoderma. У деяких варіантах здійснення не більш, ніж приблизно 90 %, наприклад, не більш, ніж приблизно 85 %, наприклад, не більш, ніж приблизно 80 %, наприклад, не більш, ніж приблизно 75 %, наприклад, не більш, ніж приблизно 70 %, наприклад, не більш, ніж приблизно 65 % активності бета-1,4-ендоглюкангідролази, як виміряно способом "Аналіз 1", як описано в даному описі, отримують при ферментації мікроорганізмів роду Trichoderma. У деяких варіантах здійснення один або декілька ферментів з різних грибів в ферментному комплексі по винаходу являє собою продукт експресії, отриманий при ферментації цих різних грибів. У деяких варіантах здійснення різні гриби походять з роду Penicillium. У деяких варіантах здійснення продукт експресії, отриманий при ферментації різних грибів, містить ксиланазу, таку як ксиланаза, що відрізняється від ксиланази, отриманої з мікроорганізмів роду Trichoderma. У деяких варіантах здійснення продукт експресії, отриманий при ферментації різних грибів, містить ксиланазу сімейства 11, таку як ксиланаза сімейства 11, що відрізняється від ксиланази сімейства 11, отриманої з мікроорганізмів роду Trichoderma. У деяких варіантах здійснення ферментний комплекс по винаходу має активність одного або декількох ферментів, вибраних зі списку, що складається з ендо-1,4-β-ксиланази, ендо-1,3(4)-βглюканази, целюлази, ламінаринази, ендо-1,5-α-L-арабінанази, бета-D-глюкозидглюкогідролази, β-ксилозидази, целобіогідролази, глюкан-1,4-бета-глюкозидази, специфічної для ксилоглюкану екзо-бета-1,4-глюканази і α-N-арабінофуранозидази. У деяких варіантах здійснення продукт експресії, отриманий при ферментації видів мікроорганізмів з роду Trichoderma, походить з однієї окремої культури мікроорганізмів виду Trichoderma reesei. У деяких варіантах здійснення продукт експресії, отриманий при ферментації мікроорганізмів видів з роду Penicillium, походить з однієї окремої культури мікроорганізмів виду Penicillium funiculosum. У деяких варіантах здійснення окрема культура, що використовується для ферментації, не є генетично модифікованою. У деяких варіантах здійснення продукт експресії, отриманий при ферментації мікроорганізмів видів з роду Trichoderma, отримують при глибинній ферментації. У деяких варіантах здійснення продукт експресії, отриманий при ферментації мікроорганізмів роду Trichoderma, походить з мікроорганізмів виду Trichoderma reesei. У деяких варіантах здійснення продукт експресії, отриманий при ферментації іншого гриба, походить з однієї окремої культури мікроорганізмів виду Penicillium funiculosum. У деяких варіантах здійснення продукт експресії, отриманий при ферментації, походить з мікроорганізмів виду дикого типу. У деяких варіантах здійснення штам, що використовується для отримання ферментного комплексу по винаходу, являє собою Trichoderma reesei, депонований згідно з Будапештським договором в Американській колекції типових культур (ATCC®) IP, Licensing and Services, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, USA з найменуванням штаму GC Cellulose A83 GICC 0004, M03000004 і позначенням патентного депонування в ATCC PTA-1001, від імені Danisco А/S з датою 5 травня 2009 р., або його похідне або потомство. (Депозит тестований Міжнародним депозитарієм: Американська колекція типових культур (ATCC®), Manassas, VA, USA 14 травня 2009 р. і на цю дату, насіння/штам(и) було життєздатним). 7 UA 106372 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У деяких варіантах здійснення штам, що використовується для отримання ферментного комплексу по винаходу, являє собою Penicillium funiculosum, депонований згідно з Будапештським договором в Міжнародному мікологічному інституті під номером IMI 378536, або його похідне або потомство. У деяких варіантах здійснення ферментний комплекс по винаходу має активність ферменту щонайменше приблизно 3000 од./г, наприклад, щонайменше приблизно 4000 од./г, наприклад, щонайменше приблизно 5000 од./г, наприклад, щонайменше приблизно 6000 од./г, наприклад, щонайменше приблизно 7000 од./г як виміряно в "Аналізі 1", як описано в даному описі, отриманого при ферментації мікроорганізмів роду Trichoderma. У деяких варіантах здійснення ферментний комплекс по винаходу має загальну активність ферментів щонайменше приблизно 4000 од./г, наприклад, щонайменше приблизно 5000 од./г, наприклад, щонайменше приблизно 6000 од./г, наприклад, щонайменше приблизно 7000 од./г, наприклад, щонайменше приблизно 8000 од./г, наприклад, щонайменше приблизно 9000 од./г, наприклад, щонайменше приблизно 10000 од./г, наприклад, щонайменше приблизно 11000 од./г, наприклад, щонайменше приблизно 12000 од./г, як виміряно в "Аналізі 1", як описано в даному описі. У деяких варіантах здійснення ферментний комплекс по винаходу складається приблизно з 3100 од./г з Penicillium funiculosum і приблизно 5200 од./г з Trichoderma reesei, де вказану кількість одиниць/г визначають в "Аналізі 1", як описано в даному описі. У деяких варіантах здійснення ферментний комплекс по винаходу складається приблизно з 2362 од./г з Penicillium funiculosum і приблизно 5315 од./г з Trichoderma reesei, де вказану кількість одиниць/г визначають в "Аналізі 1", як описано в даному описі. У деяких варіантах здійснення ферментний комплекс по винаходу має специфікації продукту "LAMINEX® XG", як визначено в цьому документі. У додатковому аспекті штам Trichoderma reesei, що використовується по винаходу, має характеристики, по суті ідентичні характеристикам Trichoderma reesei, депонованого згідно з Будапештським договором в Американській колекції типових культур (ATCC) з найменуванням штаму GC Cellulose A83 GICC 0004, M03000004, депонованим Danisco А/S на дату 5 травня 2009 р. У наступному аспекті штам являє собою штам Trichoderma reesei, депонований згідно з Будапештським договором в Американській колекції типових культур (ATCC) з найменуванням штаму GC Cellulose A83 GICC 0004, M03000004, депонованим Danisco А/S на дату 5 травня 2009 р. У контексті даного винаходу фраза "характеристики, по суті ідентичні" означає, що штам має одну або декілька (переважно, всі) характеристики Trichoderma reesei, депонованого згідно з Будапештським договором в Американській колекції типових культур (ATCC), Патентний депозитарій, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110 з найменуванням штаму GC Cellulose A83 GICC 0004, M03000004, депонований Danisco А/S на дату 5 травня 2009 р. Як описано вище, даний винахід стосується використання ферментного комплексу по винаходу в способі отримання затіру для пивоваріння, наприклад, у виробництві солодового пива і/або у виробництві віскі. Наступні варіанти здійснення є, зокрема, такими, що стосуються способу отримання пивоварного затіру. У деяких конкретних варіантах здійснення ферментний комплекс за даним винаходом не отримують при комбінації продукту експресії отриманого при ферментації мікроорганізмів виду Trichoderma reesei і продукту експресії, отриманого при ферментації мікроорганізмів виду Penicillium funiculosum, де співвідношення активності бета-1,4-ендоглюкангідролази, що походить з Penicillium funiculosum і з Trichoderma reesei, складає від приблизно 0,25/0,75 до 0,37/0,63, наприклад, від приблизно 0,26/0,74 до 0,36/0,64, наприклад, від приблизно 0,27/0,73 до 0,35/0,65, наприклад, від приблизно 0,28/0,72 до 0,34/0,66, наприклад, від приблизно 0,29/0,71 до 0,33/0,67, наприклад, від приблизно 0,30/0,70 до 0,32/0,68, наприклад, від приблизно 0,31/0,69. У деяких конкретних варіантах здійснення ферментний комплекс за даним винаходом отримують при комбінації продукту експресії отриманого при ферментації мікроорганізмів виду Trichoderma reesei і продукту експресії, отриманого при ферментації мікроорганізмів видів Penicillium funiculosum, де співвідношення активності бета-1,4-ендоглюкангідролази, отриманої з Penicillium funiculosum і з Trichoderma reesei, складає від приблизно 0,25/0,75 до 0,37/0,63, наприклад, від приблизно 0,26/0,74 до 0,36/0,64, наприклад, від приблизно 0,27/0,73 до 0,35/0,65, наприклад, від приблизно 0,28/0,72 до 0,34/0,66, наприклад, від приблизно 0,29/0,71 до 0,33/0,67, наприклад, від приблизно 0,30/0,70 до 0,32/0,68, наприклад, від приблизно 0,31/0,69. 8 UA 106372 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У деяких варіантах здійснення ферментний комплекс використовують в затірі, щоб сприяти фільтрації пивного сусла і/або фільтраціям затіру і/або фільтраціям пива. У деяких варіантах здійснення ферментний комплекс використовують в затірі, щоб сприяти розділенню затіру. У деяких варіантах здійснення присутнє зменшення кількості залишкового β-глюкану в суслі, наприклад, зменшення щонайменше на 10 %, щонайменше на 20 % або щонайменше на 30 % в порівнянні з контролем без ферменту, або щонайменше на 2 %, 5 % або 10 % в порівнянні з контролем з використанням LAMINEX® Super. У деяких варіантах здійснення присутнє зменшення в'язкості, наприклад, в'язкість сусла, наприклад, зменшення щонайменше на 2,5 %, щонайменше на 5 % або щонайменше на 7,5 % в порівнянні з контролем без ферменту. У деяких варіантах здійснення присутнє збільшення циклів пивоваріння/добу, наприклад, збільшення щонайменше на 5 %, наприклад, щонайменше на 10 %, або щонайменше на 20 % в порівнянні з контролем без ферменту, або щонайменше на 2,5 %, щонайменше на 5 %, або щонайменше на 10 % в порівнянні з контролем з використанням LAMINEX® Super з такою ж або порівнянною активністю ферменту на основі компонента Penicillium funiculosum. У деяких варіантах здійснення присутня поліпшена здатність до фільтрування. У деяких варіантах здійснення присутнє поліпшене розділення затіру. У деяких варіантах здійснення присутня збільшена швидкість потоку під час розділення затіру, наприклад, збільшення щонайменше на 10 %, щонайменше на 15 %, або щонайменше на 20 % в порівнянні з контролем без ферменту, або щонайменше на 2,5 %, щонайменше на 5 %, або щонайменше на 10 % в порівнянні з контролем з використанням LAMINEX® Super. Потрібно розуміти, що вказану швидкість потоку визначають як середню швидкість потоку, розраховану за загальним часом розділення. У деяких варіантах здійснення присутнє зменшення часу промивання дробини або екстракції, наприклад, зменшення щонайменше на 5 %, щонайменше на 10 %, щонайменше на 15 %, або щонайменше на 20 % в порівнянні з контролем без ферменту або з контролем з використанням LAMINEX® Super. У деяких варіантах здійснення присутнє зменшення загального часу фільтрації пивного сусла. У деяких варіантах здійснення присутнє зменшення загального часу розділення затіру, наприклад, зменшення щонайменше на 5 %, щонайменше на 10 %, або щонайменше на 15 % в порівнянні з контролем без ферменту, або щонайменше на 2,5 %, щонайменше на 5 %, або щонайменше на 10 % в порівнянні з контролем з використанням LAMINEX® Super. У деяких варіантах здійснення присутнє зменшення середнього ΔP через фільтруючий шар під час рециркуляції затіру понад фільтруючого шару і/або під час процесу фільтрації пивного сусла. Потрібно розуміти, що ΔP стосується падіння тиску на протязі шару. У деяких варіантах здійснення присутнє зменшення середнього ΔP через поверхню розділення під час рециркуляції затіру понад фільтруючого шару і/або під час процесу фільтрації пивного сусла. У деяких варіантах здійснення присутнє зменшення середнього ΔP через поверхню розділення під час процесу розділення затіру, наприклад, зменшення щонайменше на 5 %, щонайменше на 10 %, або щонайменше на 15 % в порівнянні з контролем без ферменту або з контролем з використанням LAMINEX® Super. У деяких варіантах здійснення немає змін в каламутності сусла. У деяких варіантах здійснення присутнє зменшення кількості пентозанів в суслі. У деяких варіантах здійснення присутній поліпшений вихід екстракту. У деяких варіантах здійснення присутня збільшена швидкість потоку під час фільтрації пива. У деяких варіантах здійснення присутнє зменшення тиску, що наростає через фільтр з плином часу під час фільтрації пива, наприклад, зменшення щонайменше на 10 %, щонайменше на 20 %, або щонайменше на 25 % в порівнянні з контролем без ферменту або з контролем з використанням LAMINEX® Super. У деяких варіантах здійснення присутнє зменшення помутніння пива, наприклад, зменшення щонайменше на 10 %, щонайменше на 20 %, або щонайменше на 25 % в порівнянні з контролем без ферменту або з контролем з використанням LAMINEX® Super. У деяких варіантах здійснення не присутній зменшення стабільності піни. У деяких варіантах здійснення присутнє зменшення кількості β-глюкану в пиві, наприклад, зменшення щонайменше на 10 %, щонайменше на 20 %, або щонайменше на 25 % в порівнянні з контролем без ферменту або з контролем з використанням LAMINEX® Super. 9 UA 106372 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У деяких варіантах здійснення присутнє зменшення кількості пентозанів в пиві, наприклад, зменшення щонайменше на 10 %, щонайменше на 20 %, або щонайменше на 25 % в порівнянні з контролем без ферменту. У деяких варіантах здійснення менше, ніж приблизно 0,5 кг ферментного комплексу на тонну крупки використовують в способі отримання пивоварного затіру, наприклад, для отримання солодового пива і/або для отримання віскі. У деяких варіантах здійснення використовують менше, ніж приблизно 0,4 кг ферментного комплексу на тонну крупки, наприклад, використовують менше, ніж приблизно 0,3 кг ферментного комплексу на тонну крупки, наприклад, використовують менше, ніж приблизно 0,25 кг ферментного комплексу на тонну крупки, наприклад, використовують менше, ніж приблизно 0,2 кг ферментного комплексу на тонну крупки, наприклад, використовують менше, ніж приблизно 0,19 кг ферментного комплексу на тонну крупки, наприклад, використовують менше, ніж приблизно 0,18 кг ферментного комплексу на тонну крупки, наприклад, менше, ніж приблизно 0,17 кг ферментного комплексу на тонну крупки, наприклад, менше, ніж приблизно 0,16 кг ферментного комплексу на тонну крупки, наприклад, менше, ніж приблизно 0,15 кг ферментного комплексу на тонну крупки, наприклад, менше, ніж приблизно 0,14 кг ферментного комплексу на тонну крупки, наприклад, менше, ніж приблизно 0,13 кг ферментного комплексу на тонну крупки, наприклад, менше, ніж приблизно 0,12 кг ферментного комплексу на тонну крупки, наприклад, менше, ніж приблизно 0,11 кг ферментного комплексу на тонну крупки. Потрібно розуміти, що штам грибів, що використовується по винаходу, може являти собою культуру вищезазначеного депонованого штаму, але може також являти собою штам, що має властивості, по суті ідентичні властивостям вищезазначеного виділеного і депонованого штаму. У переважному варіанті здійснення штам являє собою депонований штам або його потомство. Продукт експресії, отриманий при ферментації видів мікроорганізмів з роду Trichoderma, що використовується за даним винаходом, може походить з будь-якого Trichoderma, такого як Trichoderma reesei, наприклад, композиція Celluclast®, доступна з Novozymes А/S. Celluclast® чинить виражений ефект зменшення в'язкості на розчинні целюлозні субстрати. Альтернативно, можна використати LAMINEX® BG, комерційний препарат целюлази, продукований Trichoderma reesei і доступний з Danisco А/S. Продукт експресії, отриманий при ферментації видів мікроорганізмів з роду Penicillium, що використовується за даним винаходом, може походити з будь-якого Penicillium, такого як Penicillium funiculosum. У деяких варіантах здійснення штам являє собою Penicillium funiculosum, депонованого згідно з Будапештським договором в Міжнародному мікологічному інституті під номером IMI 378536, або його похідне або потомство. Альтернативно, Penicillium funiculosum є таким, як описано в WO9957325. У деяких альтернативних варіантах здійснення LAMINEX® C2K (отриманий з Danisco А/S), продукт експресії, що походить з Penicillium funiculosum, використовують по винаходу. LAMINEX® Super являє собою ферментний продукт для пивоваріння для використання в затірі, щоб сприяти фільтрації пивного сусла або фільтраціям затіру. Продукт LAMINEX® Super являє собою суміш двох різних ферментних продуктів ферментації - целюлази Penicillium funiculosum і целюлази Trichoderma reesei. LAMINEX® Super отримують з Danisco А/S. Компонент Penicillium funiculosum включають для гідролізу солюбілізованих β-глюканів і ксиланів, зменшення в'язкості сусла і поліпшення фільтрації пивного сусла або фільтрації затіру; компонент Trichoderma reesei включають для отримання низького рівня виміряного (способом аналізу бета-глюканів зі змішаними зв'язками Megazyme) β-глюкану в суслі і для збільшення швидкості фільтрації пива. LAMINEX® BG - продукт(и) Т. reesei, що використовуються для поліпшення фільтрації пива, отримані з Danisco А/S. Продукт LAMINEX® Super визначають, як отриманий з: 1575 од./г (визначено в "Аналізі 1") з концентрату Penicillium funiculosum; 2362 од./г (визначено в "Аналізі 1") з Trichoderma reesei. Це округляють в менший бік до 3900 од./г в кінцевій специфікації продукту LAMINEX® Super Специфікація LAMINEX® Super являє собою: Активність целюлази > 3900 од./г (визначено в "Аналізі 1") pH 3,7-4,2 Мікроорганізми, специфікації стандартні Стабілізований 0,25 % бензоатом натрію. LAMINEX® XG визначають, як отриманий з: ферментного комплексу, отриманого при комбінації продукту експресії, отриманого при ферментації виду Trichoderma reesei, і продукту експресії, отриманого при ферментації виду 10 UA 106372 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Penicillium funiculosum, де співвідношення активності бета-1,4-ендоглюкангідролази, що походить з Penicillium funiculosum і з Trichoderma reesei, складає приблизно від 0,25/0,75 до 0,37/0,63, наприклад, ферментний комплекс, де: приблизно 2363 од./г (активність виміряна в "Аналізі 1") походить з концентрату Penicillium funiculosum; і приблизно 5315 од./г (активність виміряна в "Аналізі 1") походить з Trichoderma reesei. У цьому конкретному варіанті здійснення продукт LAMINEX® XG дає співвідношення Penicillium funiculosum/Trichoderma 0,31/0,69 на основі одиниць активності, як виміряно в "Аналізі 1", як описано під заголовком "Аналізи". ПРИКЛАД 1 Дослідження затіру в лабораторному масштабі 1 Активність ферментів: Продукт LAMINEX® Super, змішаний для цього конкретного експерименту: Номінальна активність: 3937 CMC од./г. Виміряна активність: 3682 CMC од./г (активність виміряна способом "Аналізу 1") в дозі 0,2 кг/тонну крупки, що дає 736400 CMC од./тонну крупки (= 0,736 од./г крупки). Приймаючи визначення продукту LAMINEX® Super 0,40 × продукт Р. funiculosum і 0,60 × продукт Т. reesei на основі активності CMC, як виміряно в "Аналізі 1": - внесок в активність Р. funiculosum-0,295 CMC од./г крупки - внесок в активність Т. reesei-0,442 CMC од./г крупки. LAMINEX® Super (0,200 кг/тонну крупки) + 50 % активності компонента Т. reesei (LAMINEX® XG): 3682 CMC од./г (активність виміряна в "Аналізі 1") в дозі 0,2 кг/тонну крупки + 0,09534 г компонента Т. reesei (12539 CMC од./г, по "Аналізу 1")/г продукту LAMINEX® Super, що дають 975494 CMC од./тонну крупки (= 0,975 од./г крупки) - внесок в активність Р. funiculosum-0,295 CMC од./г крупки - внесок в активність Т. reesei -(0,442+0,239) CMC од./г = 0,681 CMC од./г крупки. Співвідношення внеску Р. funiculosum/Т. reesei в дослідженні затіру з LAMINEX® XG в лабораторному масштабі 1-0,30/0,70. Тестування LAMINEX® Super (0,200 кг/тонну крупки) в порівнянні з LAMINEX® Super (0,200 кг/тонну крупки) + 50 % активності компонента Т. reesei в 10 % ячмінного затіру Fawcett (90 % солоду Fawcett: 10 % ячменю Fawcett): - 50 г крупки в загальній кількості 250 г води. Профіль затирання: використовували 50 г змішаної крупки, розмолотої до 0,5 мм, і додавали 190 мл води при 67 °C. Температурний цикл затирання становив 60 хвилин при 65 °C, потім 10 хвилин при 72 °C. Потім затіри охолоджували, доводили до маси 250 г і фільтрували через гофрований фільтрувальний папір (Ederol 12). У порівнянні з продуктом LAMINEX® Super для ферментного розчину LAMINEX® Super (0,200 кг/тонну крупки) з додаванням 50 % додаткової активності компонента Т. reesei показане: - Зменшена кількість залишкового β-глюкану в суслі (див. фігуру 1). Зменшена кількість залишкового β-глюкану в суслі вказує на можливість зменшення в'язкості і подальшого збільшення розділення/фільтрації сусла і можливість збільшення кількості циклів пивоваріння/добу. - Збільшення фільтрації (див. фігуру 1). Збільшення фільтрації вказує на позитивний потенціал збільшення тривалості циклів фільтрації без переривань (наприклад, розрихлений), що в свою чергу може зменшувати загальний час фільтрації і, таким чином, приводити до збільшення кількості циклів пивоваріння/добу. ПРИКЛАД 2 Дослідження затіру в лабораторному масштабі 2 Активність ферментів: LAMINEX® Super: 4380 CMC од./г (активність розрахована по внеску окремого компонента) в дозі 0,2 кг/тонну крупки, що дає 876000 CMC U/тонну крупки (= 0,876 од./г крупки). Компонент P. funiculosum, що робить внесок 2069 CMC од./г (по "Аналізу 1"), що відповідає 0,414 CMC од./г крупки. Компонент T. reesel, що робить внесок 2311 CMC од./г (по "Аналізу 1"), що відповідає 0,462 CMC од./г крупки. Співвідношення внеску Р. funiculosum/Т. reesei в продукт LAMINEX® Super в цьому дослідженні становить 0,47/0,52. 11 UA 106372 C2 5 10 LAMINEX® XG (LAMINEX® Super, концентрований в 1,5 рази + додавання 50 % додаткової активності компонента Т. reesei): 8304 CMC од./г (активність розрахована по внеску окремого компонента) в дозі 0,133 кг/тонну крупки, що дає 1104432 CMC од./тонну крупки (= 1,104 од./г крупки). Компонент P. funiculosum, що робить внесок 3104 CMC од./г (по "Аналізу 1"), що відповідає 0,413 CMC од./г крупки. Компонент T. reesei, що робить внесок 5200 CMC од./г (по "Аналізу 1"), що відповідає 0,692 CMC од./г крупки. Співвідношення внеску Р. funiculosum/Т. reesei в дослідженні затіру з LAMINEX® XG в лабораторному масштабі 2-0,37/0,63. Тестування LAMINEX® Super (0,200 кг/тонну крупки) в порівнянні з LAMINEX® XG (0,133 кг/тонну крупки) в змішаній крупці - 25,8 % солоду Spitz і 74,2 % солоду Pilsner - затір. Профіль затирання: 50 г крупки осолоджували в 150 г води і слідували програмі затирання, наведеній в таблиці 1: 15 Таблиця 1 Програма затирання в лабораторному масштабі Програма затирання Затирання Витримка Нагрівання Витримка Нагрівання Витримка 20 25 30 35 40 при 50 °C при 50 °C до 65 °C при 65 °C до 76 °C при 76 °C більше 10 хвилин протягом 20 хвилин більше 15 хвилин протягом 30 хвилин більше 15 хвилин протягом 15 хвилин і потім відзатірування У кінці затирання 30 мл гарячої води (при 76 °C) додавали до кожного затіру, і затіри фільтрували гарячими з використанням фільтрувального паперу Ederol 12. У порівнянні з продуктом LAMINEX® Super (в дозі 0,2 кг/тонну крупки), для ферментного розчину LAMINEX® XG (в дозі 0,133 кг/тонну крупки) показали: - Зменшення концентрацій залишкового β-глюкану в суслі (див. фігуру 2). Важливість зменшення концентрації β-глюкану в суслі неясна, однак теорії зв'язують зменшений зміст β-глюкану в суслі із зменшеною в'язкістю сусла. При тому, що розділення затіру є обмежувальним фактором в процесі пивоваріння, отримане позитивне збільшення може збільшити продуктивність броварні за допомогою збільшення кількості циклів пивоваріння/добу завдяки зменшенню часу, витраченого на розділення затіру. - Збільшення об'ємів фільтрації з плином часу (див. фігуру 2). Вищі швидкості фільтрації позитивно зменшують час, витрачений на фільтрацію, що потенційно приводить до збільшення продуктивності броварні за допомогою збільшення кількості циклів пивоваріння/добу. - Зменшення в'язкості сусла (див. фігуру 2). Зменшена в'язкість сусла має позитивний потенціал збільшення швидкостей фільтрації і, таким чином, збільшення продуктивності броварні. ПРИКЛАД 3 Пілотні дослідження пивоваріння Ферментні композиції, такі ж, як в дослідженні затіру в лабораторному масштабі 2. Тестування LAMINEX® Super (еквівалент 0,200 кг/тонну крупки) і LAMINEX® XG (LAMINEX® Super, концентрований в 1,5 рази + додавання 50 % додаткової активності компонента Т. reesei) (0,133 кг/тонну крупки). Пілотне дослідження пивоварного затирання проводили з використанням 31 кг змішаної крупки - 25,8 % солоду Spitz і 74,2 % солоду Pilsner в об'ємі затіру 110 л. Профіль затирання показаний в таблиці 2. 12 UA 106372 C2 Таблиця 2 Пілотний профіль пивоварного затирання Стадія Затирання Витримка Нагрівання Витримка Нагрівання Витримка Час (хв.) 0 10 20 15 30 15 15 Загальний час (хв.) 0 10 30 45 75 90 105 Температура (°С) 50 50 50 65 65 76 76 Пілотні дослідження пивоварного затирання У порівнянні з LAMINEX® Super додавання LAMINEX® XG в процес затирання приводить 5 10 15 20 25 30 35 40 45 до: - Зменшення часу промивання пивної дробини аж до 13 % (див. таблицю 3). Зменшення часу промивання пивної дробини робить позитивний внесок в зменшення часу, затраченого на розділення сусла, і таким чином, має потенціал для збільшення продуктивності броварні за допомогою збільшення кількості циклів пивоваріння/добу. - Зменшення загального часу фільтрації пивного сусла аж до 8 % в порівнянні з LAMINEX® Super і аж до 20 % в порівнянні з водним контролем (без додавання ферменту) (див. таблицю 3 і фігуру 3). При тому, що процес фільтрації пивного сусла є обмежувальним фактором в процесі пивоваріння, зменшення часу фільтрації пивного сусла має потенціал для збільшення продуктивності броварні за допомогою збільшення кількості циклів пивоваріння/добу. - Збільшення середньої швидкості потоку, розрахованої або як середнє для швидкостей потоку, що вимірюються "безперервно" в процесі фільтрації пивного сусла, або як "Загальний профільтрований об'єм" на "Загальний час фільтрації пивного сусла" (див. таблицю 3 і фігуру 3). Збільшення середньої швидкості потоку може позитивно зменшувати загальний час, витрачений на розділення сусла, і таким чином, потенційно збільшувати продуктивність броварні. - Зменшення середнього ΔP через фільтрувальний шар аж до 19 % в процесі фільтрації пивного сусла (див. таблицю 3). Потенційно, зменшення середнього ΔP через фільтрувальний шар може приводити до зменшення необхідності розпушування фільтрувального шару і збільшенню об'єму, профільтрованого з плином часу. Обидва чинники мають позитивний потенціал для зменшення часу фільтрації пивного сусла і таким чином, для збільшення продуктивності броварні. - Зменшення тиску, що наростає, під час рециркуляції затіру над фільтрувальним шаром (аж до 22 %) і під час фільтрації пивного сусла (аж до 24 %) (див. таблицю 3). Зменшення тиску, що наростає, під час як рециркуляції, так і фільтрації пивного сусла, має потенціал робити внесок в збільшення фільтрації, і таким чином, зменшення загального часу фільтрації пивного сусла. І знов це може приводити до збільшення продуктивності броварні. Ефект, що спостерігається, є особливо сильним, оскільки збільшена швидкість фільтрації в нормі пов'язана із збільшенням тиску - і ці дані показують збільшення фільтрації і в той же час зменшення тиску, що наростає. - Відсутності змін в каламутності сусла (див. таблицю 3). Каламутність не змінюється, що є позитивним, оскільки збільшена каламутність може бути чинником, що приводить до вибору запуску розпушування. Розпушування займає багато часу і може збільшувати загальний час розділення сусла і, таким чином, зменшує продуктивність броварні. - Зменшення "загального тиску, що наростає" під час фільтрації пивного сусла аж до 24 % (див. таблицю 3 і фігуру 3). Зменшення "загального тиску, що наростає" під час розділення сусла може збільшувати швидкість фільтрації і таким чином, збільшувати продуктивність броварні за допомогою зменшення часу, витраченого на процес розділення сусла. 13 UA 106372 C2 5 - Відсутності розпушування фільтрувального шару, ініційованого тиском, що наростає. Як визначено (1) внизу таблиці 3, тільки обов'язкове розпушування вводили при включенні LAMINEX® XG на стадії затирання (визначено (1) в таблиці 3). Зменшення часу промивання пивної дробини робить внесок в зменшення загального часу фільтрації пивного сусла і потенційне збільшення кількості циклів пивоваріння/добу. Таблиця 3 Пілотні дослідження пивоварного затирання - узагальнення даних фільтрації пивного сусла Дата Варіння no.: Солод Pilsner Солод Spitz Загальна кількість крупки Час першого сусла Час 1-го промивання пивної дробини Час 2-го промивання пивної дробини Час 3-го промивання пивної дробини Час 4-го промивання пивної дробини Час 5-го промивання пивної дробини Час промивань пивної дробини Загальний час фільтрування пивного сусла Середня швидкість потоку Середня швидкість потоку* Середнє ∆P Наростання Р - рециркуляція Наростання Р - фільтрування пивного сусла Наростання Р - загальне е Розпушування (1 сусло + промивання пивної дробини)** (кг) (кг) (кг) (хв.) Контроль LAMINEX® Super LAMINEX® XG 16- Жовтень-08 21- Жовтень-08 28- Жовтень-08 73 75 79 23,0 23,0 23,0 8,0 8,0 8,0 31,0 31,0 31,0 35,50 25,00 25,50 (хв.) 8,00 7,50 7,50 (хв.) 6,00 17,00 11,17 (хв.) 16,50 6,00 5,83 (хв.) 6,50 6,00 6,00 (хв.) 7,50 8,00 8,17 (хв.) 44,50 44,50 38,67 (хв.) 80,00 69,50 64,17 (л/год.) (л/год.) (бар н.т.) (бар н.т.) 126,3 111,8 169 104 136,8 128,6 179 93 139,4 139,3 145 73 (бар н.т.) 555 396 300 (бар н.т.) 659 489 373 1+1 0+1 0+(1) * По загальному об'єму і загальному часу фільтрації пивного сусла. ** 1 означає розпушування, ініційоване тиском, що наростає, 0 означає відсутність розпушування, (1) означає обов'язкове розпушування, почате з ручного керування на початку 2-го промивання пивної дробини, якщо його не було раніше. 10 15 Результат аналізу зразків сусла із затірів з додаванням LAMINEX® XG в процесі затирання: - зменшення кількості β-глюкану в суслі, як виміряно способом аналізу бета-глюканів зі змішаними зв'язками Megazyme (посилання K-BGLU в каталозі Megazyme, що узгоджується зі стандартним Методом AOAC 995.16) (див. таблицю 4). Зменшення кількості залишкової βглюкану в суслі може приводити до позитивного зменшення в'язкості сусла, таким чином, збільшуючи фільтрацію і продуктивність броварні за допомогою збільшення кількості циклів пивоваріння/добу. - збільшення кількості екстракту аж до 2,3 % (див. таблицю 4). Збільшення кількості екстракту може приводити до позитивного збільшення продуктивності броварні - більше продукту виробляють з такої ж кількості сировину - іншими словами, до збільшення продуктивності броварні більш рентабельним чином. 14 UA 106372 C2 Таблиця 4 Пілотні аналізи пивоварного сусла Дослідження no. Зразок Екстракт (П (Р)) 14,11 14,18 14,34 Комбіноване сусло Комбіноване сусло Комбіноване сусло 73 75 79 [β-глюкан] (мг/л) 1163 588 187 73: Негативний контроль: Контроль без ферменту 75: LAMINEX® Super при 0,20 кг/тонну 79: LAMINEX® XG при 0,133 кг/тонну Пілотна пивоварна фільтрація пива У порівнянні з LAMINEX® Super додавання LAMINEX® XG в процес затирання приводить 5 10 15 до: - Збільшення швидкості потоку під час фільтрації пива (див. таблицю 5). Збільшення швидкості потоку під час фільтрації пива чинить позитивний ефект на збільшення фільтраційної місткості і таким чином, потенційно, на зменшення (обмеження) необхідності в додатковій місткості буферного танка розливу (BBT) (BBT являють собою резервуари під тиском, що використовуються для зберігання пива після фільтрації до розливу. Ці резервуари здатні підтримувати стабільний тиск, виключаючи втрату діоксиду вуглецю і попереджуючи утворення піни). - Значного зменшення тиску, що наростає, через фільтр з плином часу (див. таблицю 5). Зменшення тиску, що наростає через фільтр з плином часу, позитивно збільшує тривалість циклу фільтрації між очищеннями. Це позитивним чином обмежує очищення у витратах простору, води і енергії. Зменшується також кількість необхідного фільтрувального матеріалу, що приводить до економії витрат. Більш тривалі цикли фільтрації між очищеннями позитивним чином зменшують втрату пива, що виникає через запуск і зупинку процесу фільтрації пива. Таблиця 5 Узагальнення даних фільтрації пива при пілотному пивоварінні Об'єм (л) 0,0 2,0 3,0 7,0 11,0 15,0 20,0 25,0 30,0 32,0 33,0 73 Потік (л/ год.) 95,0 60,0 125,0 115,0 109,0 81,0 64,0 52,0 22,0 8,0 0,0 ΔP (бар н.т.) 1,90 4,20 2,30 2,50 4,20 4,10 4,10 4,10 4,20 4,20 4,20 Об'єм (1) 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 40,0 75 Потік (л/год.) 106,0 115,0 123,0 118,0 119,0 116,0 105,0 99,0 92,0 ΔP (бар н.т.) 1,70 2,60 3,20 3,50 3,90 4,20 4,30 4,30 4,20 Об'єм (л) 0,0 5,0 10,0 14,0 18,0 22,0 26,0 30,0 34,0 38,0 42,0 44,0 79 Потік (л/ год.) 130,0 120,0 116,0 116,0 119,0 118,0 119,0 119,0 120,0 118,0 117,0 117,0 ΔP (бар н.т.) 1,00 1,00 0,80 1,40 1,60 1,85 2,10 2,20 2,30 2,45 2,60 2,75 73: Негативний контроль: Контроль без ферменту 75: LAMINEX® Super при 0,20 кг/тонну 79: LAMINEX® XG при 0,133 кг/тонну 20 Аналізи пива при пілотному пивоварінні Аналізи пива, отриманого із затірів з додаванням LAMINEX® XG в процес затирання, показують: 15 UA 106372 C2 5 10 15 - зменшення кількості бета-глюкану в пиві (див. таблицю 6). Зменшення кількості β-глюкану в пиві може позитивним чином зменшувати в'язкість пива і, таким чином, збільшувати цикл фільтрації і зменшувати витрату допоміжного фільтрувального матеріалу і пристосування (зниження витрат). - Зменшення каламутності пива (див. таблицю 6). Основний внесок в каламутність пива може бути пов'язаний з матеріалом, що не належить до бета-глюкану. Зменшена кількість β-глюкану в пиві може також робити позитивний внесок в зменшення каламутності пива, додаючи позитивний зовнішній вигляд пиву. - Відсутність зменшення стабільності пива (див. таблицю 6 - Значення піностійкості). Стабільність піни пива не зменшувалась при використанні "концентрації LAMINEX® Super більше в 1,5 рази + додавання 50 % додаткової активності компонента Т. reesei". Це є позитивним, оскільки може бути присутнім фактор ризику відносно зовнішнього вигляду і якості пива. - Можна чекати зменшення кількості пентозанів в пиві. Зменшення кількості пентозанів в пиві може робити позитивний внесок в збільшення фільтрації пива. Таблиця 6 Аналізи пива при пілотному пивоварінні Питома густина [β-глюкан] (мг/л) Каламутність: Радіометр (EBC) Каламутність: Hach (EBC) Значення піностійкості (с) Тест прискореного старіння (EBC) 73 Контроль 1,0101 389 2,70 2,40 90 1,80 75 Стандарт 1,0114 209 1,55 1,13 108 0,25 79 Тест 1,0111 133 1,00 0,68 136 0,20 73: Негативний контроль: Контроль без ферменту 75: LAMINEX® Super при 0,20 кг/тонну 79: LAMINEX® XG при 0,133 кг/тонну 20 25 ПРИКЛАД 4 Повномасштабні дослідження пивоваріння. Дослідження лінії 1: Дослідження проводили на композиції 31,6 % ячмінної крупки з використанням 9500 кг крупки на варіння (3000 кг ячменю, 6500 кг солоду). Як показано в таблиці 7, хороші результати спостерігали з LAMINEX® XG відносно розділення затіру. Зменшення часу фільтрації пивного сусла має потенціал збільшення продуктивності броварні за допомогою збільшення кількості циклів пивоваріння/добу. Таблиця 7 Продуктивність броварні по розділенню затіру LAMINEX® I - Контроль Super Super II - Тест XG XG AU - Умовна одиниця кг/варіння БРОВАРНЯ Загальний час розділення Час розділення затіру, AU затіру, AU 2 2 100 108 129 100 14 14 93 94 86 87 Дослідження лінії 2: 16 UA 106372 C2 5 10 Дослідження проводили на композиції 28 % ячмінної крупки з використанням 12300 кг крупки на варіння (3500 кг ячменю, 8800 кг солоду). Як показано в таблиці 8, хороші результати спостерігали з LAMINEX® XG відносно фільтрації пива. - Збільшення кількості циклів фільтрації пива між очищеннями має потенціал збільшення продуктивності броварні за допомогою зменшення часу, витраченого на очищення, і збільшення кількості циклів фільтрації пива, пивоваріння/добу. Крім того, збільшення кількості циклів фільтрації пива приводить до економії витрат і зменшеного споживання енергії, і зменшує втрату пива, що виникає через запуск і зупинку процесу фільтрації пива. - Зменшення витрати допоміжного фільтрувального матеріалу і пристосування (зменшення витрати кізельгуру) приводить до безпосереднього зниження витрат. Таблиця 8 Продуктивність броварні по фільтрації пива LAMINEX® кг/варіння I - Контроль Super 2 II - Тест XG 14 XG 14 AU - Умовна одиниця 15 20 25 ФІЛЬТРАЦІЯ ПИВА Час фільтрації, AU Витрата кізельгуру, AU 100 100 148 138 48 76 - Як представлено в таблиці 9, аналізи пива, отримані для лінії 2 з додаванням LAMINEX® XG в процес затирання показали: Зменшення кількості бета-глюкану в пиві. Зменшення кількості β-глюкану в пиві може позитивним чином зменшувати в'язкість пива і, таким чином, збільшувати кількість циклів фільтрації і зменшувати витрату допоміжного фільтрувального матеріалу і пристосування (зниження витрат). - Можна чекати зменшення кількості пентозанів в пиві. Зменшення кількості пентозанів в пиві може робити позитивний внесок в збільшення фільтрації пива за допомогою зменшення в'язкості. - Зменшення динамічної в'язкості пива. Зменшення динамічної в'язкості пива може позитивним чином збільшувати кількість циклів фільтрації і зменшувати витрату допоміжного фільтрувального матеріалу і пристосування (зниження витрат). Збільшення кількості циклів фільтрації може також збільшувати продуктивність броварні за допомогою збільшення кількості циклів фільтрації пива/добу. Таблиця 9 Аналізи пива при повномасштабному пивоварінні, лінія 2 Аналізи LAMINEX® Super-0,163 кг/тонну LAMINEX® Super XG-0,113 кг/тонну (Умовні одиниці) крупки крупки Динамічна в'язкість (7000°) 100 95,7 β-глюкан 100 3,30 30 УЗАГАЛЬНЕННЯ - ДОЗИ АКТИВНОСТІ ФЕРМЕНТУ, ЩО ВИКОРИСТОВУЮТЬСЯ В ДОСЛІДЖЕННЯХ Дані наведені в співвідношенні PF/TR, яке являє собою тільки співвідношення внеску кожного компонента в загальну активність. PF являє собою внесок, зроблений Penicillium funiculosum, і TR - внесок, зроблений Trichoderma reesei. 17 UA 106372 C2 Таблиця 10 Активність ферментів CMC, що використовується в різних дослідженнях/прикладах LAMINEX® Super Співвідношення PF/TR LAMINEX® XG Співвідношення PF/TR 0,4/0,6 0,30/0,70 0,47/0,52 0,37/0,63 0,47/0,52 0,37/0,63 0,4/0,6 0,31/0,69 0,4/0,6 0,31/0,69 Дослідження затіру в лабораторному масштабі 1 Дослідження затіру в лабораторному масштабі 2 Пілотне дослідження пивоваріння Повномасштабне дослідження пивоваріння, лінія 1 Повномасштабне дослідження пивоваріння, лінія 2 5 10 15 20 25 30 35 40 Аналізи Аналіз 1: спосіб активності целюлази з DNS (спосіб з DNS CMC) Систематичне найменування: 1,4-(1,3;1,4)-β-D-глюкан-4-глюканoгідролаза. Номер IUB: EC 3.2.1.4. Принцип Аналіз целюлази оснований на ферментативному ендогідролізі 1,4-β-D-глюкозидних зв'язків в карбоксиметилцелюлозі (CMC), β-1,4-глюкані. Продукти реакції (β-1,4-глюканові олігосахариди) визначали колориметрично за допомогою вимірювання отриманого збільшення кількості відновлювальних груп з використанням реагенту 3,5-динітросаліцилової кислоти. Активність ферменту розраховували по зв'язку між концентрацією відновлювальних груп, як глюкозних еквівалентів, і оптичною густиною при 540 нм. Аналіз проводили при pH 5,0, але його можна провести при різних значеннях pH для додаткової характеризації і специфікації ферментів. Визначення одиниці Одну одиницю активності целюлази визначають як кількість ферменту, що утворює 1 мкмоль глюкозних еквівалентів в хвилину в умовах аналізу (pH 5,0 (або як указано) і 50 °C). Матеріали Карбоксиметилцелюлоза. Постачальник: Megazyme Ltd. No. продукту: CM-Cellulose. 4 М Dглюкоза 'чда'. Постачальник: Merck Ltd (BDH). No. продукту: 10117. 180,16 Ацетат натрію безводний 'чда'. Постачальник: Merck Ltd (BDH). No. продукту: 10236. 82,03. Оцтова кислота ("крижана") 'чда'. Постачальник: Merck Ltd (BDH). No. продукту: 10001. 60,05. 3,5-динітросаліцилова кислота GPR (3,5-динітро-2-гідроксибензойна кислота). Постачальник: Merck Ltd (BDH). No. продукту: 28235. Гранули гідроксиду натрію 'чда'. Постачальник: Merck Ltd (BDH). No. продукту: 10252. 40,00. (+)-тартрат калію-натрію 'чда'. Постачальник: Merck Ltd (BDH). No. продукту: 10219. 282,22. 1,5 % (мас./об. розчин) Розчин карбоксиметилцелюлози (CMC) в буфері 0,1 M ацетату натрію, pH 5,0 (розчин субстрату). Розчин 3,5-динітросаліцилової кислоти (DNS). 20 г/л DNS в буфері, що містить 32 г/л гранул гідроксиду натрію і 600 г/л (+)-тартрату калію-натрію. Стандартний розчин глюкози (0,50 мг/мл). Спосіб Ферментний комплекс розводили з отриманням зразків і отримували стандартну криву для глюкози, як показано на Фіг. 2, з використанням концентрацій глюкози 0, 0,125, 0,25, 0,375 і 0,5 мг/мл. 0,25 мл розчину ферменту змішували з 1,75 мл розчину субстрату (1,5 % мас./об.) при 50 °C, і реакцію зупиняли через 10 хв. додаванням розчину DNS. За цим слідувало нагрівання до 95 °C протягом 5 хвилин. Вимірювали оптичну густину різних зразків при 540 нм (OD 540 нм). Розрахунок Активність ферменту визначають по стандартній кривій, як показано на Фіг. 2. Активність розраховували таким чином: 18 UA 106372 C2 Активність (од.мл1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 55 од.г 1)  Tc 1 1 1 A  10 3    D m 180 .16 V t де: T = ∆OD540 нм ТЕСТ = OD540 нм ТЕСТ - OD540 нм НУЛЬ m = нахил стандартної кривої (приблизно 1,0) с = перетин осі у стандартної кривої (завжди негативне і приблизно -0,02) 180,16 ≡ молекулярна маса глюкози 3 10 ≡ для переводу в мкмоль А ≡ об'єм, що аналізується, в мл V ≡ об'єм ферменту в мл t ≡ час аналізу в хвилинах D = дійсна кратність розведення ферменту (наприклад, для 1,000 г, розведеного до 1 літра, D=1000) Аналіз 2. Ендо-1,4-β-ксиланаза (спосіб з DNS і ксиланом деревини берези) Принцип Реакція, що каталізується ендо-1,4-β-ксиланазою, включає в себе ендогідроліз 1,4-β-Dксилозидинових зв'язків в ксилані (наприклад, ксилані деревини берези або заміщених ксиланах злаків, таких як арабіноксилан пшениці), що утворюють β-1,4-ксиланові олігосахариди. Продукти реакції (β-1,4-ксиланові олігосахариди) визначали колориметрично за допомогою вимірювання отриманого збільшення кількості відновлювальних груп з використанням реагенту 3,5-динітросаліцилової кислоти. Активність ферменту розраховують по зв'язку між концентрацією відновлювальних груп, як ксилозних еквівалентів, і оптичною густиною при 540 нм. Стандартний аналіз проводили при pH 3,5, але його можна провести при різних значеннях pH для додаткової характеризації і специфікації ферментів. Визначення одиниці Одну одиницю активності ендо-1,4-β-ксиланази визначають як кількість ферменту, що утворює 1 мкмоль ксилозних еквівалентів в хвилину в умовах аналізу (pH 3,5 (або як указано) і 50 °C). Матеріали: Див. список матеріалів, наведений вище для аналізу активності целюлази. Ксилан деревини берези. Постачальник: Sigma Chemical Co. No. продукту: X 0502. D(+)-ксилоза 'чда'. Постачальник: Merck Ltd (BDH). No. продукту: 10372 M. W.:150,13. 1,5 % (мас./об. розчин) Розчин ксилану деревини берези в буфері 0,1 ацетаті натрію, pH 4,0 (розчин субстрату). Стандартний розчин ксилози (0,50 мг/мл). Спосіб 1,75 мл розчину ксилану деревини берези змішували з 0,25 мл розведеного розчину ферменту при 50 °C протягом 10 хвилин, реакцію зупиняли додаванням 2 мл розчину DNS з подальшим нагріванням до 95 °C протягом 5 хвилин. Вимірювали оптичну густину при 540 нм (OD540 нм). Стандартну криву отримували для 0,125, 0,250, 0,375, 0,500 мг/мл ксилози. Розрахунок Активність розраховували таким чином: Активність (од.мл1 50 або або од.г 1)  Тс 1 1 1 A  10 3    D m 150 .13 V t де: T = ∆OD540 нм ТЕСТ = OD540 нм ТЕСТ - OD540 нм НУЛЬ m = нахил стандартної кривої (приблизно 1,0) с = перетин осі у стандартної кривої (завжди негативне і приблизно -0,02) 150,13 ≡ молекулярна маса ксилози 310 ≡ для переводу в мкмоль А ≡ об'єм, що аналізується, в мл V ≡ об'єм ферменту в мл t ≡ час аналізу в хвилинах 19 UA 106372 C2 5 10 15 20 25 D = дійсна кратність розведення ферменту (наприклад, для 1,000 г, розведеного до 1 літра, D=1000) Аналіз 3. Ламінариназа (спосіб з DNS і ламінарином) Принцип Реакція, що каталізується ламінариназою, включає в себе ендогідроліз 1,3-глюкозидних зв'язків в 1,3-β-D-глюканах. Субстрати включають в себе ламінарин, парамілон і пачіман. Продукти реакції (β-1,3-глюканові олігосахариди) визначають колориметрично за допомогою вимірювання отриманого збільшення кількості відновлювальних груп з використанням реагенту 3,5-динітросаліцилової кислоти. Активність ферменту розраховують по зв'язку між концентрацією відновлювальних груп, як глюкозних еквівалентів, і оптичною густиною при 540 нм. Аналіз проводили при pH 5,0 і 50 °C, але його можна провести при різних значеннях pH і температури для додаткової характеризації і специфікації ферментів. Визначення одиниці Одну одиницю активності ламінаринази визначають як кількість ферменту, що утворює 1 мкмоль глюкозних еквівалентів в хвилину в умовах аналізу (pH 5,0 і 50 °C (або як указано)). Матеріали Див. матеріали, наведені вище для аналізу активності целюлази. Ламінарин (з Laminaria digitata). Постачальник: Sigma-Aldrich Co. Ltd. No. продукту: L 9634. 1,00 % (мас./об. розчин) Розчин ламінарину (розчин субстрату в буфері 0,1 М ацетаті натрію, pH 5,0). 1,75 мл розчину ламінарину змішували з 0,25 мл розведеного розчину ферменту при 50 °C протягом 10 хвилин і реакцію зупиняли додаванням 2 мл розчину DNS. Стандартну криву отримували з використанням розчину глюкози 0, 0,125, 0,25, 0,5 і 0,75 мг/мл. Вимірювали оптичну густину при 540 нм (OD540 нм). Розрахунок Активність розраховували таким чином: Активність (од.мл1 30 35 40 45 50 55 або од.г 1)  Tc 1 1 1 A  10 3    D m 180 .16 V t де: T = ∆OD540 нм ТЕСТ = OD540 нм ТЕСТ - OD540 нм НУЛЬ m = нахил стандартної кривої (приблизно 1,0) с = перетин осі у стандартної кривої (завжди негативне і приблизно -0,03) 180,16 ≡ молекулярна маса глюкози 103 ≡ для перекладу в мкмоль А ≡ об'єм, що аналізується в мл V ≡ об'єм ферменту в мл t ≡ час аналізу в хвилинах D = кратність розведення ферменту (наприклад, для 1 г, розведеного до 1 літра, D=1000) Аналіз 4. Аналіз арабінази Принцип Аналіз активності арабінази оснований на колориметричному визначенні за допомогою вимірювання отриманого збільшення кількості відновлювальних груп з використанням реагенту 3,5-динітросаліцилової кислоти. Активність ферменту розраховували по зв'язку між концентрацією відновлювальних груп, як арабінозних еквівалентів, і оптичною густиною при 540 нм. Аналіз проводили при pH 3,5, але його можна провести при різних значеннях pH для додаткової характеризації і специфікації ферментів. Визначення одиниці Одну одиницю активності арабінази (Арабінаназа (ендо-1,5-альфа-L-арабінаназа)) визначають як кількість ферменту, що утворює 1 мкмоль арабінозних еквівалентів в хвилину в умовах аналізу (pH 3,5 (або як указано) і 50 °C). Матеріали Арабінан цукрового буряка Megazyme. Арабіноза Sigma A3131 M. W.: 150,1. 20 UA 106372 C2 5 10 15 20 Ацетат натрію безводний 'чда'. Постачальник: Merck Ltd (BDH). No. продукту: 10236. M. W.: 82,03. Оцтова кислота ("крижана") 'чда'. Постачальник: Merck Ltd (BDH). No. продукту: 10001. M. W.: 60,05. 3,5-динітросаліцилова кислота GPR (3,5-динітро-2-гідроксибензойна кислота). Постачальник: Merck Ltd (BDH). No. продукту: 28235. Гранули гідроксиду натрію 'чда'. Постачальник: Merck Ltd (BDH). No. продукту: 10252. M. W.: 40,00 (+)-тартрат калію-натрію 'чда'. Постачальник: Merck Ltd (BDH). No. продукту: 10219. M. W.: 282,22. 1,5 % (мас./об. розчин) Розчин арабінану в буфері 0,1 M ацетаті натрію, pH 3,5 (розчин субстрату). Розчин 3,5-динітросаліцилової кислоти (DNS). 20 г/л DNS в буфері, що містить 32 г/л гранул гідроксиду натрію, і 600 г/л (+)-тартрату калію-натрію. Стандартний розчин арабінази (0,50 мг/мл). Спосіб Ферментний комплекс розводили з отриманням зразків і отримували стандартну криву для глюкози з використанням концентрацій арабінази 0, 0,125, 0,25, 0,375 і 0,5 мг/мл. 0,25 мл розчину ферменту змішували з 1,75 мл розчину субстрату (1,5 % мас./об.) при 50 °C і реакцію зупиняли через 10 хв. додаванням розчину DNS. За цим слідувало нагрівання до 95 °C протягом 5 хвилин. Вимірювали оптичну густину при 540 нм (OD540 нм) різних зразків. Розрахунок Активність ферменту розраховували таким чином: Активність (од.мл1 25 30 35 40 45 50 55 або од.г 1)  Tc 1 1 1 A  10 3    D m 150 .13 V t де: T = ∆OD540 нм ТЕСТ = OD540 нм ТЕСТ - OD540 нм НУЛЬ m = нахил стандартної кривої (приблизно 1,0) с = перетин осі у стандартної кривої (завжди негативне і приблизно -0,02) 150,13 ≡ молекулярна маса арабінази 3 10 ≡ для переводу в мкмоль А ≡ об'єм, що аналізується в мл V ≡ об'єм ферменту в мл t ≡ час аналізу в хвилинах D = дійсна кратність розведення ферменту (наприклад, для 1,000 г, розведеного до 1 літра, D=1000) Аналіз 5. Аналіз арабінофуранозидази Реакція, що каталізується α-N-арабінофуранозидазою, включає в себе гідроліз кінцевого зв'язку α-L-арабінозидів, в невідновлювальному залишку α-L-арабінофуранозиду. Фермент діє на α-L-арабінофуранозиди, α-L-арабінани, що містять (1,3)- і/або (1,5)-зв'язки, арабіноксилани і арабіногалактани. Аналіз α-N-арабінофуранозидази оснований на ферментативному гідролізі п-нітрофеніл-α-Lарабінофуранозиду. Аналіз проводять "двоточковим" способом, а не способом "безперервного моніторування". Розрахунок активності ферменту оснований на вимірюваннях, отриманих тільки на початку і кінці періоду інкубації. Продукт реакції, п-нітрофенол, визначають колориметрично (після доведення pH). Активність ферменту розраховують по зв'язку між концентрацією пнітрофенолу і оптичною густиною при 400 нм. Отримання розчину розведеного ферменту: Отримують всі розчини ферментів, з порошкоподібних або рідких препаратів ферментів, за допомогою дистильованої в скляному посуді води. Мінімізують помилки аналізу при розведенні, виключаючи великі рівні розведення, що включають малі об'єми або масу. При отриманні розведення ферментів більш точним є, навіть у разі рідкого зразка, зважування вихідного зразка ферменту. Якщо це зроблено, у разі рідких зразків, в зв'язку з цим необхідно виміряти питому густину рідини при 20 °C. Оскільки аналіз проводять "двохтоковим" способом, а не способом "безперервного моніторування", є важливим спосіб забезпечення лінійності в межах періоду інкубації з різними ферментними системами і в різних умовах. В умовах аналізу, стандартних відносно 21 UA 106372 C2 5 концентрації субстрату, pH, температурі і часу аналізу, показано, що аналіз є лінійним в діапазоні ΔOD540 нм ТЕСТ (Т)=0,20-1,50. Однак, при належній виробничій практиці, аналіз проводять в певному діапазоні ΔOD540 нм ТЕСТ (Т)=0,400-0,800. Спосіб Для кожного зразка ферменту дослідження включає в себе три аналізи: тестові (ТЕСТ) аналізи в двох повторах і аналіз в нульовій точці (НУЛЬ). У даному способі описаний аналіз одного зразка ферменту. ТЕСТ 1,00 мл 1,00 мл 1,00 мл Буфер 0,2 М ацетат натрію, pH 5,0 Дистильована в скляному посуді вода Розчин п-нітрофеніл-α-L-арабінофуранозиду 10 15 НУЛЬ 1,00 мл 1,00 мл 1,00 мл 0,25 мл розчину розведеного ферменту додавали до розчинів при 50 °C, реакцію зупиняли через 10 хвилин додаванням 4 мл розчину 0,4 М гліцину, pH 10,8 (реагент, що зупиняє). Оптичну густину вимірювали при 400 нм при 25 °C в порівнянні з нульовим значенням для води. - Визначення OD400 нм ТЕСТ для виміряних в двох повторах ТЕСТ. - Визначення OD400 нм НУЛЬ. Розрахунок OD 400нмТЕСТ (Т)  OD 400нм ТЕСТ  OD 400нм НУЛЬ Одиниці (мкмоль.хв1)  20 T V 1   10 6  18300 1000 t Активність од.мл1 або од.г 1  Одиниці  ( 25 30 35 40 1 D E де: Т = OD400 нм ТЕСТ - OD400 нм НУЛЬ 18300 = Молярний коефіцієнт поглинання для п-нітрофенолу (довжина шляху 1 см) V=7,25 (загальний об'єм рідини в тесті в мл) t=10 (хвилин) -1 1 од. = 1 мкмоль.хв Е = 0,25 (об'єм розведеного зразка ферменту в мл) D = кратність розведення ферменту (наприклад, для 1,000 г, розведеного до 1 літра D=1000) Аналіз 6. Аналіз целобіогідролази Принцип Реакція, що каталізується целобіогідролазою, включає в себе гідроліз 1,4-α-D-глюкозидних зв'язків в целюлозі і целотетраозі з вивільненням целобіози з невідновлювальних кінців ланцюгів. Аналіз целобіогідролази оснований на ферментативному гідролізі п-нітрофеніл-α-Dцелобіопіранозиду. Продукт реакції, п-нітрофенол, визначають колориметрично (після доведення pH). Активність ферменту розраховують по зв'язку між концентрацією п-нітрофенолу і оптичною густиною при 400 нм. Аналіз проводять в межах певного лінійного діапазону ΔOD400 нм ТЕСТ (Т)=0,400-0,800. Спосіб Для кожного зразка ферменту дослідження включає в себе три аналізи: тестові (ТЕСТ) аналізи в двох повторах і аналіз в нульовій точці (НУЛЬ). У даному способі описаний аналіз одного зразка ферменту. ТЕСТ 1,00 мл 1,00 мл 1,00 мл Буфер 0,2 М ацетат натрію, pH 5,0 Дистильована в скляному посуді вода Розчин п-нітрофеніл-α-D-целобіопіранозиду НУЛЬ 1,00 мл 1,00 мл 1,00 мл 45 0,25 мл розчину розведеного ферменту додавали до розчину, що тестується, при 50 °C, через 30 хвилин 4 мл розчину 0,4 М гліцину, pH 10,8 (зупиняючий реагент) додавали в кожну пробірку. 22 UA 106372 C2 5 Оптичну густину вимірювали при 20 °C при 400 нм в скляній кюветі 1 см в порівнянні з нульовим значенням для води. - Визначення OD400 нм ТЕСТ для виміряних в двох повторах ТЕСТІВ. - Визначення OD400 нм НУЛЬ. Розрахунок OD 400нмТЕСТ (Т)  OD 400нм ТЕСТ  OD 400нм НУЛЬ Одиниці (мкмоль.хв1)  T V 1   10 6  18300 1000 t 10 Активність од.мл1 або од.г 1  Одиниці  ( 15 20 25 30 35 40 45 50 55 1 D E де: Т = OD400 нм ТЕСТ - OD400 нм НУЛЬ 18300 = Молярний коефіцієнт поглинання для п-нітрофенолу (довжина шляху 1 см) V=7,25 (загальний об'єм рідини в тесті в мл) 1000 = для переводу в літри 6 10 = для переводу в мкмоль t=30 (хвилин) -1 1 од. = 1 мкмоль.хв. Е = 0,25 (об'єм розведеного зразка ферменту в мл) D = кратність розведення ферменту (наприклад, для 1,000 г, розведеного до 1 літра, D=1000) Аналіз 7. Аналіз β-глюканази Принцип Реакція, що каталізується ендо-1,3(4)-β-глюканазою, включає в себе ендогідроліз 1,3- або 1,4-глюкозидних зв'язків в β-D-глюканах, коли залишок глюкози, відновлювальна група якого залучена до зв'язку, що підлягає гідролізу, сам є заміщеним в С-3. Субстрати включають в себе β-D-глюкани, ламінарин і ліхенін злаків. По визначенню цей фермент відрізняється від EC 3.2.1.39 (ендо-1,3-β-глюканаза, або ламінариназа). Аналіз ендо-1,3(4)-β-глюканази оснований на ферментативному гідролізі 1,3- або 1,4глюкозидних зв'язків в β-глюкані ячменю, β-1,3(4)-глюкані. Продукти реакції (β-1,3(4)-глюканові олігосахариди) визначають колориметрично за допомогою вимірювання отриманого збільшення концентрації відновлювальних груп з використанням реагенту 3,5-динітросаліцилової кислоти. Активність ферменту розраховують по зв'язку між концентрацією відновлювальних груп, як глюкозних еквівалентів, і оптичної густини при 540 нм. У цьому аналізі після додавання реагенту DNS і перемішування пробірки, що аналізуються, вміщували в баню з киплячою водою (мінімум 95 °C) і інкубували точно 15 хвилин. Це відрізняється від аналізів ферментів на основі DNS з іншими субстратами, де період інкубації становить 5 хвилин. Ця зміна впливає також на діапазон значень ΔOD 540 нм ТЕСТ (T), прийнятних для тестування. У той час як стандартний аналіз проводять при pH 5,0, його можна провести при різних значеннях pH для додаткової характеризації і специфікації ферментів. У цьому випадку змінюється тільки pH буферних розчинів (вказаних нижче). Необхідні реагенти У всіх випадках, за винятком бета-глюкану, важливими є ідентичність і чистота реагентів, а не постачальник. Бета-глюкан (ячмінь; середня в'язкість), Megazyme Ltd, no. продукту P-BGBM, В'язкість: 20−5 30 сСт (2-3×10 м²/с). D-глюкоза 'чда', Merck Ltd (BDH), no. продукту 10117, 180,16. Ацетат натрію безводний 'чда', Merck Ltd (BDH), no. продукту 10236, M. W. 82,03. Оцтова кислота ("крижана") 'чда', Merck Ltd (BDH), no. продукту 10001, M. W. 60,05. 3,5-динітросаліцилова кислота GPR (3,5-динітро-2-гідроксибензойна кислота), Merck Ltd (BDH), no. продукту 28235. Гранули гідроксиду натрію 'чда', Merck Ltd (BDH), no. продукту 10252, M. W. 40,00. (+)-тартрат калію-натрію 'чда', Merck Ltd (BDH), no. продукту 10219, M. W. 282,22. Реагенти 1,5 % (мас./об. розчин в буфері 0,1 М ацетаті натрію pH 5,0) бета-глюкан (ячмінь). 23 UA 106372 C2 5 10 15 20 Розчин 3,5-динітросаліцилової кислоти (DNS): 10 г DNS, 16 г гранул гідроксиду натрію, 300 г (+)-тартрату калію-натрію розчиняли в 1000 мл дистильованої в скляному посуді води. Буфер 1 М ацетат натрію, pH 5,0. Стандартний розчин глюкози (1,000 мг/мл). Спосіб Для кожного зразка ферменту дослідження включає в себе три аналізи: тестові (ТЕСТ) аналізи в двох повторах і аналіз в нульовій точці (НУЛЬ). Необхідна також стандартна крива для глюкози. 0,25 мл розчину розведеного ферменту додавали до 1,75 розчину бета-глюкану при 50 °C, 2 мл розчину DNS додавали через 10 хвилин, і пробірки вміщували при 95 °C мінімум на 15 хвилин. Охолоджували до 25 °C у воді. Додавали 10 мл дистильованої в скляному посуді води і вимірювали оптичну густину при 540 нм (OD540 нм) з використанням кювети з довжиною шляху 1 см. Визначення OD540 нм ТЕСТ для виміряних в двох повторах ТЕСТІВ. Визначення OD540 нм НУЛЬ. Визначення OD540 нм СТАНДАРТІВ для 0,125, 0,250, 0,500, 0,750 мг/мл глюкози. СТАНДАРТИ порівнювали із зразком СТАНДАРТ з 0,00 мг/мл глюкози (або всі порівнювали з водою). Розрахунок Визначення ΔOD540 нм ТЕСТ (T) = OD540 нм ТЕСТ - OD540 нм НУЛЬ Активність розраховували таким чином: Активність (од.мл1 25 30 або од.г 1)  Tc 1 1 1 A  10 3    D m 180 .16 V t де: Т =∆OD540 нм ТЕСТ = OD540 нм ТЕСТ - OD540 нм НУЛЬ m = нахил стандартної кривої (приблизно 1,0) с = перетин осі у стандартної кривої (завжди негативне і приблизно -0,02) 180,16 ≡ молекулярна маса глюкози 3 10 ≡ для переводу в мкмоль А ≡ об'єм, що аналізується, в мл, використали 2,00 мл V ≡ об'єм ферменту в мл, використали 0,25 мл t ≡ час аналізу в хвилинах, використали 10 хвилин D = кратність розведення ферменту (наприклад, для 1 г, розведеного до 1 літра, D=1000) 35 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 40 45 50 55 1. Ферментний комплекс, отриманий при комбінації: a) продукту експресії, отриманого при ферментації видів мікроорганізмів з роду Trichoderma; і b) одного або декількох ферментів з гриба роду Penicillium, вибраного з ксиланази (EC 3.2.1.8), целюлази (EC 3.2.1.4) і бета-глюканази (EC 3.2.1.6), і де щонайменше приблизно 61 % активності бета-1,4-ендоглюкангідролази, як виміряно ферментативним ендогідролізом 1,4--D-глюкозидних зв'язків у карбоксиметилцелюлозі, отримують при ферментації мікроорганізмів роду Trichoderma. 2. Ферментний комплекс за п. 1, де вказані один або декілька ферментів з гриба роду Penicillium являють собою продукт експресії, отриманий при ферментації вказаного гриба роду Penicillium. 3. Ферментний комплекс за будь-яким з пп. 1, 2, де продукт експресії, отриманий при ферментації вказаного гриба, містить ксиланазу. 4. Ферментний комплекс за будь-яким з пп. 1-3, що має активність одного або декількох ферментів, вибраних зі списку, що складається з ендо-1,4--ксиланази, ендо-1,3(4)-глюканази, целюлази, ламінаринази, ендо-1,5--L-арабінанази, бета-Dглюкозидглюкогідролази, -ксилозидази, целобіогідролази, глюкан-1,4-бета-глюкозидази, специфічної для ксилоглюкану екзо-бета-1,4-глюканази і -N-арабінофуранозидази. 5. Ферментний комплекс, отриманий при комбінації: a) щонайменше приблизно 61 % продукту експресії, отриманого при ферментації мікроорганізмів роду Trichoderma; і b) менше ніж приблизно 39 % продукту експресії, отриманого при ферментації гриба з роду Penicillium; 24 UA 106372 C2 5 10 15 20 25 30 де процентні співвідношення основані на активності бета-1,4-ендоглюкангідролази, як виміряно ферментативним ендогідролізом 1,4--D-глюкозидних зв'язків у карбоксиметилцелюлозі. 6. Ферментний комплекс за будь-яким з пп. 1-5, де вказаний продукт експресії, отриманий при ферментації мікроорганізмів роду Trichoderma, походить з мікроорганізмів виду Trichoderma reesei. 7. Ферментний комплекс за будь-яким з пп. 1-6, де вказаний продукт експресії, отриманий при ферментації гриба, походить з окремої культури виду Penicillium funiculosum. 8. Ферментний комплекс за будь-яким з пп. 1-7, що має активність ферменту щонайменше приблизно 3000 од./г, наприклад щонайменше приблизно 4000 од./г, наприклад щонайменше приблизно 5000 од./г, наприклад щонайменше приблизно 6000 од./г, наприклад щонайменше приблизно 7000 од./г, як виміряно ферментативним ендогідролізом 1,4--D-глюкозидних зв'язків у карбоксиметилцелюлозі, отриманого при ферментації роду Trichoderma. 9. Ферментний комплекс за будь-яким з пп. 1-8, що має загальну активність ферменту щонайменше приблизно 4000 од./г, як виміряно ферментативним ендогідролізом 1,4--Dглюкозидних зв'язків у карбоксиметилцелюлозі. 10. Спосіб отримання ферментного комплексу, де спосіб включає стадії: a) ферментації мікроорганізмів роду Trichoderma в середовищі для отримання ферментаційного бульйону; b) ферментації мікроорганізмів роду Penicillium в середовищі для отримання ферментаційного бульйону, і с) виділення і комбінацій кожного ферментного комплексу, отриманого на стадії a) і b), в формі безклітинного бульйону після вказаних ферментацій для отримання ферментного комплексу, де щонайменше приблизно 61 % активності бета-1,4-ендоглюкангідролази, як виміряно ферментативним ендогідролізом 1,4--D-глюкозидних зв'язків у карбоксиметилцелюлозі, отримують при ферментації роду Trichoderma. 11. Ферментний комплекс, отриманий способом за п. 10. 12. Застосування ферментного комплексу за будь-яким з пп. 1-9 в способі виробництва пивоварного затору, такому як виробництво солодового напою, як пива, наприклад солодового пива, і/або у виробництві віскі, і/або у виробництві біопалива. 13. Застосування за п. 12, де ферментний комплекс використовують в заторі, щоб сприяти фільтрації пивного сусла і/або фільтрації затору, і/або фільтрації пива. 14. Застосування ферментного комплексу за будь-яким з пп. 1-9 у виробництві фруктового соку, вина, переробці зерна, виробництві паливного спирту і питного спирту. 25 UA 106372 C2 Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 26