Спосіб одержання гідролітичного ферментного препарату “циторецифен-м”

1. Спосіб одержання гідролітичного ферментного препарату, що включає концентрування ферментного комплексу, отриманого при вирощуванні продуценту штаму Streptomyces recifensis var. lyticus 2435/M, який відрізняється тим, що концентрований 3 циторецифен: Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня к. т. н. - К., 2000, 25с.]. Недоліком відомого препарату є незавершеність готової форми (незручність використання), і як наслідок відносно низька стабільність при зберіганні та застосуванні. Задачею корисної моделі є удосконалення гідролітичного ферментного препарату, в якому за рахунок запропонованої обробки утворюється зручна готова форма та збільшується протимікробна ефективність препарату завдяки підвищенню стабільності ферментного комплексу та властивостях підібраного носія. Поставлена задача вирішується запропонованим способом одержання гідролітичного ферментного препарату, що включає концентрування ферментного комплексу, отриманого при вирощуванні продуценту штаму Streptomyces recifensis var. lyticus 2435/M, згідно корисної моделі, концентрований ферментний комплекс іммобілізують на аеросилі і виділяють іммобілізований ферментний комплекс центрифугуванням. Як носій використовують аеросил марки А-300, іммобілізацію здійснюють при температурі 22...25°С, концентрації аеросилу 5...7% мас, та перемішуванні протягом 30...60хв., а центрифугування здійснюють при 5000об./хв. При цьому, концентрація ферментного комплексу становить 5тис. од/мл. Експериментально було встановлено, що виділення ферментного комплексу, іммобілізованого певним чином на такому носії як аеросил, дозволяє підвищити бактеріостатичну дію, вірогідно, завдяки підвищеній стабільності ферменту в реакційному середовищі. В результаті збільшується протимікробна ефективність препарату циторецифен. Спосіб здійснюється таким чином. До концентрованого ферментного комплексу у вигляді культурального фугату штаму Streptomyces recifensis var. lyticus 2435/M (Депозитарій Інституту мікробіології і вірусології, номер 1MB Ас-5001) вносили попередньо підсушений аеросил в кількості 5...7% від маси і перемішували протягом 30...60хв. при температурі 20...25°С до утворення гелю. Частка іммобілізації ферменту висока і становить біля 90%. Утворений гель центрифугували протягом 20...30 хвилин при 5000об/хв і видаляли надосадову рідину. Осад іммобілізованого препарату висушували контактним способом протягом 1...2 годин при температурі 30°С. Приклад. До культурального фугату штаму Streptomyces recifensis var. lyticus 2435/M, отриманого при вирощуванні продуценту протягом 4 діб, з концентрацією ферментного комплексу 5000од./мл вносили попередньо підсушений при температурі 300°С аеросил марки А-300 в кількості 5% від маси і перемішували протягом 60хв. при температурі 25°С. Утворений гель центрифугували протягом 20хв. при 5000об/хв і видаляли надосадову рідину. Осад іммобілізованого препарату висушували 31448 4 контактним способом протягом 1,5 годин при температурі 30°С. Активність препарату аналізували за літичною (ЛА) та протеолітичною (ПА) активностями. У якості тест-культури для визначення літичної активності бактеріолітичного комплексу використовували ліофілізовані клітини Lactobacillus bulgaricus 51 та добові живі культури Staphylococcus aureus, Escherichia coli. Літичну активність (ЛА) іммобілізованого та нативного ферментного препарату визначали за здатністю до лізису суспензії тест-культур та виражали у од/мл. За одиницю ЛА приймали кількість ферменту, яка знижує оптичну густину суспенії тест-культури на 0,001 за 1хв в 1мл реакційної суміші, при розведенні ферменту, що забезпечує лізис суспензії на 25-30%. Визначення проводили турбідіметричним методом у наступній модифікації: до 4мл суспензії тест-культури (оптичною густиною 0,7-0,8ОД при λ=540нм) додавали 0,1-0,3мл розчину ферменту та інкубували впродовж 10хв при 50°С. Розчини препаратів готували у дистильованій воді у змінних концентраціях. У контроль додавали 0,1-0,3мл дистильованої води та інкубували у таких же умовах. За різницею оптичної густини суспензії до (ОДвих) та після (ОДкін) інкубації визначали рівень ЛА. Оптичну густину визначали на фотометрі КФК-3 при λ=540нм у кюветі 0,5см на фоні дистильованої води. Літичну активність визначали за формулою: (ОДп - ОДк ´ С) ´ N , од / мл, ЛА = 0,001´ t де, С - коефіцієнт автолізу (відношення ОДп/ОДк контролю); N - розведення проби в реакційній суміші, раз; t - час інкубації, хв; 0,001 - коефіцієнт перерахунку на одиницю активності; Визначення протеолітичної активності (ПА) проводилось за азоказеїном. Метод заснований на гідролізі субстрату протеолітичними ферментами, зупиненні реакції шляхомдодавання трихлороцтової кислоти, колориметричному визначенні неосаджених забарвлених тирозингістидинвмісних пептидів. За одиницю активності приймають таку кількість ферменту, що за 1хв утворює 1мкмоль вільних аміногруп. Розрахунки проводили за формулою: (ОДд - ОДк ) ´ К , од / мл × хв, , ПА = t де ОДд - оптична густина дослідних розчинів; ОДк - оптична густина контрольних розчинів; К - коефіцієнт перерахунку на мл; т - час інкубації, хв. Порівняльна характеристика бактеріостатичної дії нативного та іммобілізованого препаратів циторецифен наведена у Таблиці. 5 31448 6 Таблиця Концентрація ферменту при вирощуванні на м'ясо-пептонному бульйоні, мг/мл 50 35 25 12,5 6,25 3,1 Контроль % життєздатних клітин Staphylococcus aureus після вирощування Іммобілізований препарат Нативний препарат 0,15 0,5 3,5 10 30 70 100 0,2 14 18 35 75 89 100 Порівняння ефективності нативного та іммобілізованого препарату циторецифен показує підвищену ефективність останнього в межах 1,5-2 рази (по відношенню до різних тест-культур). Отже, як видно з Таблиці, бактеріостатична дія іммобілізованого циторецифену виявляється в Комп’ютерна верстка О. Рябко межах концентрації 35мг/мл, а висока ефективність розпочинається з 25мг/мл, що майже вдвічі ефективніше, ніж при використанні нативного ферментного препарату. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601